МР - Химия природных соединений

ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТФИЛИАЛ ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮЛЖЕТНОГО ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Кафедра органической химии
Э.Т. Оганесян, И.И. Селина, С.Л. Аджиахметова
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ОСВОЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ
«ХИМИЯ ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ИХ
СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ»
ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ПРОГРАММА
«ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, ФАРМАКОГНОЗИЯ»
(подготовка научно-педагогических кадров)
НАПРАВЛЕНИЕ ПОДГОТОВКИ 33.06.01 ФАРМАЦИЯ
учебный план 140402_78-123(4)-3486
ПЯТИГОРСК 2014
УДК
ББК
М
Рецензент:
д.ф.н., профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии Д.А. Коновалов
Э.Т. Оганесян, И.И. Харченко, С.Л. Аджиахметова
М 54 Методические рекомендации по освоению дисциплины «Химия
природных соединений и их синтетических аналогов».
Образовательная программа «Фармацевтическая химия, фармакогнозия».
Направление подготовки 33.06.01 Фармация / Э.Т. Оганесян, И.И. Селина,
С.Л. Аджиахметова. – Пятигорск: ПМФИ – филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ,
2014. – 64 с.
Методические рекомендации разработаны в соответствии с рабочей
программой дисциплины «Химия природных соединений и их синтетических
аналогов» учебного плана 140402_78-14-123(4)-3486 Фармацевтическая
химия, фармакогнозия и предназначены для обучающихся по
образовательной программе подготовки кадров высшей квалификации
«Фармацевтическая химия, фармакогнозия» очной и/или заочной формы
обучения.
УДК
ББК
Печатается по решению ЦМК
ПМФИ- филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава РФ
©ПМФИ – филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ, 2014
2
СОДЕРЖАНИЕ
1. Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
Изучение антиоксидантного действия исследуемых веществ с
помощью прибора "Цвет Яуза-01-АА".
2. Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
ИК-спектроскопия.
Идентификация
функциональных
органических соединений.
групп
3. Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
Спектрофотометрическое определение соединений полифенольной
природы.
4. Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
Количественный анализ флавоноидов методом УФ-спектроскопии.
5. Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
Спектральные методы исследования тритерпеноидов.
6. Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
Гравиметрический
метод
определения
растительном сырье.
полисахаридов
в
7. Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
Качественный и количественный анализ полифенольных соединений.
8. Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
Методы установления строения природных флавоноидов.
9. Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
Способы выделения и идентификации флавоноидов из растительного
сырья.
10.Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
Получение стандартных образцов флавоноидов.
11.Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
Синтез халконов, флавонов и флавонолов.
12.Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
При помощи компьютерной программы «PASS» провести анализ
возможной биологической активности в ряду родственных
соединений и выявить закономерности «структура-активность» в
ряду предложенных соединений.
13.Практическое занятие (продолжительность 2 часа)
Прогноз ГАМК-ергической активности целевых соединений методом
молекулярного докинга. Построение графиков распределения энергии
взаимодействия
лиганд-рецепторов
на
основании
данных
молекулярного докинга.
3
ИНФОРМАЦИОННЫЙ БЛОК ПО ДИСЦИПЛИНЕ
«ХИМИЯ ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ
АНАЛОГОВ»
Флаводоидные соединения встречаются в растениях преимущественно
в виде различных производных. Незамещенный флавон – исключительная
редкость; например, флавон примулетин из мучнистых выделений листа
видов примулы.
По характеру заместителей флавоноиды можно разделить на ряд типов:
гидроксифлаваноиды,
метоксифлавоноиды,
пренилоксифлавоноиды,
С-метил-
и
метилендиоксифлавоноиды,
С-пренилфлавоноиды,
С-
бензилфлавоноиды, ацилфлавоноиды, сложные эфиры флавоноидов с
органическими и минеральными кислотами, гликозиды и др.
Различные заместители и, особенно, гидроксигруппы располагаются в
молекуле флавона в определенном порядке, образуя ряд типов замещения в
соответствии с путями биосинтеза ароматических колец и последующих
этапов преобразования.
В А-кольце большинства флавоноидов гидроксигруппы находятся у С5 и С-7, редко – только у С-7 или С-5. Эта модель замещения обусловлена
биосинтезом А-кольца из трех ацетильных или малонильных остатков с
последующей
таутомерией
трикетоциклогексана
в
тригидроксиароматический (флороглюциновый) радикал.
Кольцо В бывает незамещенным, либо замещенным одним, двумя,
гремя (редко – более) заместителями. Одна из гидроксигрупп чаще всего
находится у С-4', вторая и третья гидроксигруппы вводятся в ортоположение к ней (у С-3' и С-5'), как в ряду: кемпферол - кверцетин мирицетин. Значительно реже замещение проходит по мета-положению (у С2' или С-6'), как в морине или запотинине.
Отдельную
группу
флавоноидов
образуют
В-незамещенные
соединения, которые могут рассматриваться как первичные модели
замещения. Они обнаружены в большинстве подклассов покрытосеменных и
4
характерны как для примитивных, так и для эволюционно наиболее
продвинутых таксонов. Поэтому нахождение В-незамещенных флавоноидов
различных классов является не только признаком примитивности, но и
признаком
развивающегося
таксона
с
неисчерпанным
потенциалом
биохимической эволюции флавоноидов. Примером такого явления может
быть химический состав подземных и надземных органов различных видов
шлемника из семейства губоцветных.
5-Дезоксифлавоноиды характерны для растений семейства бобовых и
встречаются среди различных классов, например, виды солодки содержат 5дезоксифлаваноны (ликвиритигенин и его гликозиды) и им соответствующие
халконы, флавоны и флавонолы.
2'-Гидроксифлавоноиды отличаются необычностью биогенетического
происхождения. Они редко встречаются среди флаванов, флаванонов и
других классов 1,3-дифенилпропаноидов. Но среди изофлавоноидов это
довольно
частые
производные,
предшественниками
в
которые
являются
образовании
своеобразными
птерокарпаноидов,
кумаранохроманоидов, ротеноидов. 2'-Гидроксифлаво-ноиды (или, точнее,
изофлавоноиды) и их различные производные наиболее характерны для
растений семейства бобовых.
Довольно распространенным является гидроксилирование у С-8, С-6 и
С-6
и
С-8
дополнительно
среди
к
1,3-дифенилпропаноидов.
основной
модели
Вводятся
замещения,
эти
группы
например,
при
биохимическом окислении хризина (5,7-дигидроксифлавон) образуется 8гидроксихризин, или норвогонин, и 6-гидроксихризин, или байкалеин. При
систематическом обследовании растений ряда семейств были обнаружены
пары 6- и 8-гидроксиизомеров (скутеллареин и изоскутеллареин, 6- и 8гидроксилютеолин) в эволюционно развитых семействах – губоцветных,
подорожниковых и др.
В растениях семейств вересковых, сложноцветных, мальвовых и др.
чаще находили 6- и 8-гидроксифлавонолы.
5
Наряду с гидроксифлавоноидами, значительное разнообразие обуславливают
их
простые
эфиры
метокси-,
–
метилендиокси-,
изопренилоксипроизводные.
Алкилированию, в первую очередь, подвержены дополнительные к
основной
модели
замещения
(5,7,4'-тригидроксифлавоноиды)
гидроксигруппы – у С-6, С-8, С-3', С-5', затем замещаются гидроксигруппы у
С-7, С-3 и С-4'. Во флавонах 5-гидроксигруппа замещается только в случае
полного метилирования, в то же время во флавонолах эта группа
метилируется
предпочтительнее,
Метоксифлавоноиды
легко
чем
обнаруживаются
3-гидроксигруппа.
при
5-
хроматографическом
анализе по ярко-желтой или голубой флуоресценции (5-метоксифлавонолы
или 5-метоксифлавоны). Эти соединения характерны для растений семейства
вересковых и других древесных растений.
Известно, что алкилирование гидроксифлавоноидов осуществляется на
последних этапах биосинтеза, хотя роль и значение этих процессов и
образующихся веществ не полностью выяснены. Замечено, что в активно
развивающихся органах растений преобладают гидроксифлавоноиды, а в
покоящихся
(смолистые
выделения
почек,
листьев
и
цветков)
–
алкоксипроизводные в виде агликонов.
Метилендиоксифлавоноиды наиболее широко представлены среди 1,2дифенилпропаноидов и особенно в классах ротеноидов и птерокарпаноидов.
В первую очередь, замещаются орто-дигидроксигруппировки у С-3', 4', а
затем у С-7, 8 и С-6, 7. Встречаются такие производные преимущественно в
растениях семейства бобовых.
Нередко алкилирующим реагентом выступает мевалоновая кислота,
которая
в
виде
пренилпирофосфата
участвует
в
биосинтезе
пренилфлавоноидов. Двойная связь в этом заместителе (7А2) может
мигрировать к агликону либо в конец алифатической цепи, может
восстанавливаться, гидратироваться, либо окисляться, образуя моно-, ди- и
тригидрокси, эпокси- или кетогруппировки. При замещении фенольных
6
гидроксигрупп
флавоноидов
трипренилоксифлавоноиды
образуются
с
различными
моно-,
ди-
комбинациями
и
других
заместителей. Пренильные заместители могут находиться либо в виде
открытых цепей, либо они участвуют в образовании циклическиххромановых,
хроменовых,
изопропилфурановых
производных.
Изопропильная группа в фурановых производных при биохимическом
окислении
может
отщепляться
(в
виде
ацетона)
с
образованием
фуранофлавоноидов. Наряду с монозамещением, встречаются флавоноиды с
более длинными цепями, образованными из двух, трех и более пренильных
остатков.
Гидроксигруппы
в
пренильных
заместителях
довольно
реакционноспособны (особенно у-гидроксигруппа), которые наряду с
реакциями циклизации по гидроксигруппам у С-7, С-5, С-З' и С-4', могут
гликолизироваться или ацилироваться.
Пренилоксифлавоноиды обнаружены среди большинства классов, но
особенно многочисленны они в подгруппах изо- и неофлавоноидов. Среди
ротеноидов
с
пренильными
заместителями
даже
выделяют
типы:
пираноротеноиды, пиранометилендиоксиротеноиды, фураноротеноиды и
фуранометилендиоксиротеноиды.
Наиболее
широко
эти
производные
представлены в растениях семейств бобовых, лавровых, тутовых и др.
Но
алкилирование
гидроксигруппам,
но
и
флавоноидов
путем
проходит
замещения
не
водородных
только
атомов
по
у
ароматических А и В-колец. При этом образуются С-метил-, С-пренил-, Сбензилфлавоноиды с заместителями у С-6 и С-8, реже – в других
положениях.
Обнаружены такие соединения в папоротниках, хвойных растениях.
Бензилфлавоноиды рассматриваются как артефакты, образовавшиеся в
результате конденсации флавоноидов с оксикоричными кислотами.
Интересную группу 0, С-замещенных производных представляют
флавоноиды с лигнановым фрагментом (флаволигнаны), которые впервые
обнаружены в плодах расторопши, а в настоящее время найдены в
7
надземной части пикульника, аврана и в других растениях. Эти соединения
образуют
ряды
производных
в
результате
этерификации
между
оксигруппами флавоноидов и кониферилового спирта с последующим
усложнением при циклизации с соседними оксигруппами, или при
окислительной конденсации. Лигнан- и полулигнанфлавоноиды, вероятно,
являются своеобразной биосинтетической ступенью между флавоноидами,
лигнанами и лигнином.
Более редкими производными являются сложные эфиры флавоноидов
с органическими и минеральными кислотами. Первыми представителями
таких соединений были 3-ацетат альпинона, 3-ацетаткверцетина среди
флаванонолов и флавонолов. Галлоильные производные довольно широко
распространены среди катехинов. В настоящее время обнаружены сложные
эфиры гидроксифлавоноидов с оксикоричными, гидроксибензойными и
рядом других кислот. Эти вещества находят в растениях семейств
губоцветных, чайных, молочайных и др.
Оригинальный тип сложных эфиров образует серная кислота, замещая
гидроксигруппу у С-3 флавонолов и образуя водорастворимые соли. Такие
соединения находили в надземной части водяного перца и тамариска, а в
последние годы обнаружена многочисленная группа этих эфиров в растениях
семейства пальмовых. В них, наряду с многозамещенными производными,
встречаются ди- и тризамещенные эфиры по фенольным гидроксигруппам
флавоноидов и спиртовым группам углеводных заместителей в гликозидах.
Уникальную группу составляют флавоноидкарбоновые
кислоты,
обнаруженные в бобах робинии, ряда видов крестоцветных, губоцветных и
других растений. Эти соединения, вероятно, образуются из остатков
малоновой кислоты в биосинтезе А-кольца, поэтому карбоксильная группа
закономерно находится у С-8 и С-6. В клеточном соке флавоноидные
карбоновые кислоты образуют водорастворимые соли, а при выделении
большей частью декарбоксилируются и теряют свою растворимость.
8
Флавоноидные гликозиды
На первом этапе биосинтеза в растениях образуются флавоноидные
агликоны, которые затем, в большей части, преобразуются в гликозиды.
Многообразие гликозидов обусловлено природой агликона, углеводных
заместителей, порядком и последовательностью их присоединения к
агликону и между собой, а также величиной окисного цикла (пиранозы и
фуранозы) и конфигурацией гликозидной связи (а- и β-).
Частота и преимущественность замещения отдельных гидроксигрупп в
агликонах
зависит
от
их
реакционной
способности,
стерических
взаимодействий с соседними заместителями и природы классов, а также
характера растительного объекта и специфики его ферментной системы. Так,
во флавоновых гликозидах углеводные заместители, в первую очередь,
обнаруживаются у С-7, затем у С-4', С-3', реже у С-5 и в других положениях.
Среди флавонолов обычны 3- и 7-гликозиды, затем следуют замещения у
других углеродных атомов. Исключение составляет 5-гидроксигруппа,
которая редко замещается углеводным остатком. Но в последнее время
обнаружены и 5-гликозиды флавоноидов, например, в надземной части
яснотки и других растений.
Углеводные компоненты флавоноидных гликозидов представлены:
глюкозой и галактозой, маннозой и ликсозой, ксилозой, L-рамнозой, Lарабинозой, апиозой, глюкуроновой и галактуроновой кислотами. В
сочетании с агликоном эти моносахариды образуют определенные типы
гликозидов, например, 7-глюкозиды, 7-рамнозиды, 3-галактозиды, 3, 7диглюкозиды и др.
Все известные флавоноидные гликозиды можно разделить на
несколько групп. Основную группу составляют 0-гликозиды, в которых
углеводные остатки связаны с агликоном гликозидной связью через атом
кислорода.
0-гликозиды,
в
зависимости
от
числа
углеводных
(моносахаридных) остатков, положения в агликоне и последовательности
присоединения, делятся на монозиды, ди- и тригликозиды, биозиды,
9
триозиды и олигозиды, а также на более сложные соединения. Монозиды
относятся к наиболее простым образованиям. Биозиды при одном и том же
наборе моносахаридов образуют ряды, различающиеся порядком связи
между сахарами, величиной окисных циклов и конфигурацией гликозидных
связей. Например, рамноглюкобиозиды могут быть образованы при
последовательности от агликона – глюкоза с рамнозой по С-2, С-4 и С-6
глюкозы, как в изомерах рутина или во флаваноновых биозидах губоцветных
или цитрусовых.
В
олигозидах
моносахариды
могут
сочетаться
в
прямых
и
разветвленных цепях, как в антоцианах.
Дигликозиды
образуются
при
замещении
однотипными
или
разнотипными моносахаридами двух различных гидроксильных групп
агликона. Более сложные дигликозиды появляются при замещении одного
или двух гидроксигрупп монозидным и биозидным, биозидными или
триозидными остатками и т.д.
Вторую группу представляют гликофлавоноиды, или С-гликозиды,
которые также разделяются на С-монозиды и С-дигликозиды, С, 0-биозиды и
С, 0-биозодигликозиды и т.д. Углеводные заместители в гликофлавоноидах
обычно замещают водородный атом у С-6, С-8 или у С-6 и С-8, а
дополнительные 0-гликозидные образования проходят как в обычных 0гликозидах, либо по гидроксигруппам агликона, либо С-углеводного
заместителя.
В
качестве
углеводного
заместителя
в
С-гликозидах
обнаруживаются остатки глюкозы, реже галактозы, ксилозы, L-рамнозы и Lарабинозы.
В третью группу гликозидов объединяются представители первых
двух, усложненные ацильными заместителями. Эти заместители могут
находиться как у агликоновых, так и у углеводных остатков. Ацильные
заместители представлены остатками уксусной, малоновой и других жирных
кислот, а также производными бензойной и коричных кислот, реже
10
участвуют в образовании комплексных гликозидов минеральные кислоты
(серная, фосфорная и др.).
Таким образом, флавоноидные соединения различных подгрупп, рядов
и классов представлены многочисленными моделями замещения и природой
заместителей, что обуславливает огромное разнообразие выделенных
соединений (более 4050) при относительно небольшой доле обследованных
высших и низших растений.
Флавоноиды
обнаружены
практически
во
всех
исследованных
растениях – в надземных и подземных органах. В надземной части они, в
первую очередь, накапливаются в листьях, цветках и плодах, а затем в
стеблях (в коре и древесине). Подземные органы содержат либо
незначительные количества флавоноидов, либо отличаются высоким их
содержанием, как, например, в корнях и корневищах солодки (до 6%), в
корнях шлемника и др.
По содержанию флавоноидов растительное сырье можно разделить на
типы с относительно низким (от сотых долей процента до 5%) и с высоким
содержанием (более 5%). К первому типу относится большая часть из
известных сырьевых источников. Отельные же виды растений и их органы
отличаются повышенным содержанием флавоноидов и потому представляют
интерес для практического использования. Например, в бутонах цветков
софоры японской накапливается от 15 до 30% рутина, в корнях шлемника
байкальского – 20% байкалина и т.д..
Таким образом, создаются предпосылки для прогнозирования в поиске
новых лекарственных средств на основе различных классов флавоноидов.
11
Тема:
ИЗУЧИТЬ
АНТИОКСИДАНТНОЕ
ДЕЙСТВИЕ
ИССЛЕДУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ С ПОМОЩЬЮ ПРИБОРА «ЦВЕТ ЯУЗА01-АА»
(продолжительность – 2 часа)
Цель занятия: Определение антиоксидантной активности некоторых
биологически активных веществ (БАВ) лекарственного растительного сырья,
субстанций и лекарственных препаратов.
Задачи: научиться работать с прибором «Цвет Яуза-01-АА»; освоить
методику определения антиоксидантной активности в спиртовых
извлечениях из сырья различной концентрации и в водных извлечениях.
Объекты исследования: экстракты и настои лекарственных трав:
(лекарственные препараты, медицинские препараты, эликсиры, БАДы,
витамины, поливитамины); искусственные фенольные соединения –
антиоксиданты в пищевых продуктах (2,6–ди–третбутил–4–метилфенол
(ВНТ), 3-третилбутил-4-оксианизол (ВНА), пропилгаллат, октилгаллат,
додецилгаллат, нордигидрогваяретовая кислота 2,3-бис (3,4–диоксибензол)
бутан (IV) (NDGA)).
Методика определения:
В НПО «Химавтоматика» создан прибор Цвет Яуза-01-АА,
предназначенный для прямого количественного измерения содержания
антиоксидантов в пробах анализируемых образцов. Функциональная схема
прибора включает емкость для растворителя, насос, дозатор, выполненный в
виде многоходового крана, амперометрический детектор, представляющий
собой термостатируемую электрохимическую ячейку со сменными рабочими
электродами, усилитель тока, аналого-цифровой преобразователь и
устройство регистрации выходного сигнала. Амперометрический детектор
может функционировать в трех режимах: при постоянном потенциале, при
импульсных потенциалах и при сканировании потенциалов во всем
диапазоне. Варьируя полярность электродов и величины приложенных
потенциалов, можно определять не только суммарную антиоксидантную
активность, но и активность отдельных классов биологических соединений.
Прибор работает следующим образом. Насос непрерывно прокачивает
растворитель через всю систему. При положении крана-дозатора «Ввод
пробы» исследуемый раствор с помощью стандартного шприца (1 см3)
подается в дозируемую петлю. Поворотом ручки крана в положение
«Анализ» поток растворителя направляет определенную дозу исследуемого
12
вещества в ячейку детектора. В результате окисления исследуемого вещества
на поверхности рабочего электрода возрастает электрический ток,
протекающий между двумя электродами.
Возникающие электрические токи очень малы, в пределах 10–6 – 10–9 А.
Эти аналоговые сигналы усиливаются, а затем с помощью аналогоцифрового преобразователя преобразуются в цифровой сигнал, который
регистрируется на дисплее компьютера.
Рабочий электрод выполнен из стеклоуглерода – наиболее
универсального материала для определения полифенольных соединений.
Потенциал на электродах можно варьировать от 0 до 2 В, потенциалы
ионизации фенольных соединений изменяются в пределах 100-1000 мВ.
Перед началом работ в день выполнения измерений проводят градуировку
прибора. Для исключения случайных результатов и усреднения данных
выполняют пять последовательных измерений для каждого из пяти
градуировочных растворов кверцетина (природный антиоксидант из группы
флавонолов). За результат принимают среднее арифметическое значение из
пяти измерений (относительное среднее квадратичное отклонение не более
5%). По полученным данным строят градуировочную характеристику.
Y = aХ + b
где X - концентрация кверцетина, мг/л; Y – сигнал кверцетина (площадь
пика).
Сущность
амперометрического
метода
измерения
массовой
концентрации
антиоксидантов
заключается
в
измерении
силы
электрического тока, возникающего при окислении молекул антиоксиданта
на поверхности рабочего электрода при определенном потенциале, который
после усиления преобразуется в цифровой сигнал. Величина возникающей
при этом силы электрического тока будет зависеть как от природы и
концентрации анализируемых веществ, так и от типа материала рабочего
электрода и потенциала, приложенного к электроду.
Исходя из экспериментальных данных, представленных в таблице 1,
можно сделать вывод о том, что максимальное содержание антиоксидантов
выявлено в экстракте из листьев крыжовника отклоненного сорт
«Московский красный», полученном спиртом этиловым 40%.
Методика выполнения измерений содержания антиоксидантов в
напитках и пищевых продуктах, биологически активных добавках,
экстрактах лекарственных растений амперометрическим методом,
разработанная ОАО НПО «Химавтоматика», аттестована ФГУП
Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической
13
службы в соответствии с ГОСТ Р 8.563-96, ГОСТ Р ИСО 5725-2002
(свидетельство об аттестации МВИ № 31-07).
При соблюдении всех регламентированных условий и проведении
анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и
ее составляющих) результатов измерений, не должны превышать значений,
представленных в таблице:
Метрологические характеристики, приведенные в аттестованной
ФГУП ВНИИМС методике
Диапазон измерений массовой
концентрации
(массовой доли),
мг/г
(по кверцетину)
От 0,2 до 4000 вкл.
Показатель
точ-ности
(границы
относительной
погрешности)
±δ, %,
при Р=0,95
28
Показатель
повторяемости
(относительное
среднеквадратическое отклоне-ние
повторяемо-сти),
σr, %
10
Показатель воспроизводимости
(относительное
среднеквадратическое отклонение
воспроизво-димости),
σR, %
14
Предел
повторяем
ости,
r, %,
Р=0,95,
n=2
28
Методика получения анализируемых извлечений: точную навеску
измельченного сырья (около 1 г) помещают в колбу вместимостью 100 мл,
добавляют примерно 30 мл спирта этилового соответствующей
концентрации или воды и кипятят на водяной бане в течение 30 минут. Для
приготовления экстрактов сырье предварительно измельчают и растирают в
ступке. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в мерную
колбу вместимостью 100 мл. Извлечение вышеуказанным способом
повторяют еще 2 раза, фильтр промывают экстрагентом и доводят объем
фильтрата до метки. В случае необходимости пробу разбавляют.
Перед выполнением каждого цикла анализируемых проб проводят
контроль чистоты аналитической системы. Для этого после выхода прибора
на рабочий режим в него в качестве пробы вводят элюент. Если дрейф
фонового тока не превышает 5%, система считается чистой. Для каждой из
проб проводят по пять последовательных измерений выходного сигнала
(площади пика) анализируемого антиоксиданта. Массовую концентрацию
антиоксидантов исследуемого образца, эквивалентную кверцетину,
определяют по градуировочному графику кверцетина. При расчете
результата учитывали разбавление пробы.
Массовую концентрацию Х, мг/г, определяют по формуле:
XГ . Vn . N
X=
m n . 1000 ,
14
Где: Хг – массовая концентрация антиоксидантов, найденная по градуировочному
графику,
мг/л; Vn – объем раствора (экстракта) анализируемой пробы, мл;
mn – навеска анализируемого вещества, г;
N – кратность разбавления анализируемого образца.
Если выполняется условие приемлемости, за результат измерений
принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных
определений:
2 X1 Х 2 .100
(X 1 + Х 2)
r
,
Где: X1, X2 – результаты параллельных определений массовой концентрации (массовой
доли) антиоксидантов, (мг/г);
r – значение предела повторяемости, в данном случае равное 10.
Если условие, представленное выше не выполняется, то получают еще
по два результата в полном соответствии с приведенной МВИ. Тогда за
результат измерений принимают среднее арифметическое значение
результатов четырех определений, если выполняется условие.
4 Xmax Хmin . 100
(X1 + X2 + X3 + Х4)
CR
0,95
,
Где: Хmax, Хmin – максимальное и минимальное значения из полученных четырех
результатов параллельных определений массовой концентрации (массовой доли)
антиоксидантов, мг/г;
CR0,95 – значение критического диапазона для уровня вероятности Р=0,95 и n –
результатов определений, равно: СR0,95 = f(n)⋅
⋅σr,
Где: f(n) – коэффициент критического диапазона, для n=4 равен 3,6.
σr – относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости, равное в данном
случае 10% (таблица).
Таким образом, условие примет для данного метода следующий вид:
4 Xmax Хmin . 100
(X1 + X2 + X3 + Х4)
36
Если данное условие не выполняется, выясняют причины превышения
критического диапазона, устраняют их и повторяют выполнение измерений в
соответствии с требованиями МВИ.
Результаты анализа в документах, предусматривающих его
использование, представляют в виде: X + 0,01 . δ . Х ,
15
при P=0,95
Где: X – среднее арифметическое значение результатов n определений,
признанных приемлемыми по неравенствам; ±δ – границы относительной
погрешности, %.
Текущий контроль:
1. Какие вещества называются антиоксидантами.
2. Перечислите
структурные
особенности,
обуславливающие
антиоксидантные свойства молекул.
3. Каким образом происходит связывание активных форм кислорода,
например, с виниленовой кислотой.
4. Каков механизм прогоркания жира (масла).
Тема:
ИК-СПЕКТРОСКОПИЯ.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГРУПП ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ.
(продолжительность – 2 часа)
Цель: освоить приемы и методы анализа характеристических атомов и
атомных групп с помощью ИК-спектроскопии.
Задачи: освоить работу ИК-спектрофотометра, а также методику
приготовления таблетированных образцов анализируемых веществ.
Научиться расшифровывать ИК-спектры.
Объекты: органические соединения, относящиеся к классу
фенолокислот (салициловая кислота), ароматических кислот (бензойная
кислота), аминофенолов (пара-аминофенол).
Методика определения:
При проведении этого исследования, определение функциональных
групп органических соединений проводят на ИК–спектрофотометре.
Установление строения органического соединения начинается с подготовки
образцов для определения.
Приготовления образцов
ИК-спектры могут быть записаны для газообразных, жидких и твердых
веществ. Для измерения спектров газообразных соединений используются
специальные газовые кюветы.
16
Жидкие соединения наносят в виде пленки на пластинки из материала,
прозрачного в исследуемой области (например, KBr, NaCl). Толщина
поглощающего слоя обычно устанавливается от 0,005 до 0,1 мм.
Инфракрасные спектры могут быть измерены и для растворов. Поскольку не
имеется растворителей, прозрачных по всей области спектра, то обычно
измерения ИК - спектров растворов делаются только для узких областей. Для
исследования водных, кислых и щелочных растворов используют кюветы из
водонерастворимых материалов (флюорит, кремний, германий и другие
материалы, прозрачные в ИК-области).
Съемка
спектров
поглощения
порошкообразных
и
мелкокристаллических веществ усложнена тем, что грани частичек,
расположены хаотично по направлению к падающему свету и от них
происходит отражение и преломление света по всем направлениям, т.е.
происходит рассеяние света. Если пространство между частичками заполнить
жидкостью, показатель преломления, которой близок к их показателю
преломления, то полное внутреннее отражение резко уменьшается и
первоначальный ход лучей не будет искажаться. Такие жидкости называются
иммерсионными. В качестве иммерсионных сред можно использовать и
пластичные твердые вещества, которые под давлением заполняют пустоты
между частичками исследуемого вещества.
Обычно применяются следующие методики: растирание вещества с
инертными жидкостями или прессование таблеток с бромистым калием или
полиэтиленом.
Из твердых веществ приготавливают суспензию в вазелиновом масле,
которую помещают между солевыми пластинками. Для приготовления
взвесей (суспензий или паст) в качестве иммерсионной среды используется
вазелиновое масло – высококипящая фракция углеводородов (за рубежом
используется подобное же масло под названием «нуйол»).
Приготовление взвесей производится следующим образом. Образец (5 10 мг) тщательно растирают в небольшой агатовой или яшмовой ступке в
течение 4 – 10 минут и добавляют в конце растирания 1 – 2 капли
иммерсионной жидкости. Получившуюся суспензию наносят на окно из NaCl
или KBr и прижимают другим окном. При этом необходимо стараться, чтобы
суспензия равномерно растеклась к краям, образуя тонкую пленку без
пузырьков воздуха. Чтобы повысить контрастность спектра, в канал
сравнения ставится кювета сравнения с вазелиновым маслом.
Кроме данной методики используется метод взвесей в KBr,
называемый еще методом прессования таблеток. Он заключается в
тщательном перемешивании тонкоизмельченного образца с порошком KBr
17
(или другим галогенидом щелочного металла) в соотношении 1:100 с
последующим прессованием смеси в пресс-форме. В результате чего
получаются тонкие круглые или прямоугольные, прозрачные или
полупрозрачные таблетки. Растирание образца проводят в агатовой или
яшмовой ступке.
Преимущества метода прессования таблеток следующие: 1) отсутствие
большинства мешающих полос поглощения; 2) возможность контроля за
концентрацией образца; 3) удобство хранения образца.
Недостатками метода является возможное взаимодействие вещества с
атмосферными водой и углекислым газом, а также с KBr в ходе
приготовления таблетки, что приводит к искажению спектра.
Методику прессования таблеток с KBr целесообразно применять для
образцов, которые: 1) нерастворимы в обычных ИК – растворителях; 2)
аморфны или имеют устойчивую кристаллическую структуру; 3) не содержат
ионов, способных к обмену.
Способы изображения ИК спектров
Спектральные данные записываются как зависимость коэффициента
поглощения от длины волны, т.е. выражаются с помощью двух переменных
величин – фактора интенсивности и фактора длины волны. Выбор наиболее
подходящих выражений для этих двух факторов зависит от условий работы,
области исследования, а также от дальнейшего применения полученных
величин.
Фактор интенсивности может быть выражен следующим образом: I/I0 пропускание, доля пропущенного излучения; I/I0⋅100 - пропускание, %; [I0I/I0]⋅100 - поглощение, %; D=lgI0/I - оптическая плотность.
При указанных способах выражения фактор интенсивности, толщина
слоя и концентрация могут быть измерены в любых единицах: толщина - в
мм, см; концентрация - в весовых и объемных процентах, в г/л, мг/л, г/мл,
мг/мл, моль/л и т.д.
В инфракрасной области спектра запись производится обычно в
процентах пропускания или поглощения. Спектр поглощения может быть
охарактеризован следующими величинами: 1) длинами волн максимумов
поглощения и интенсивностью в этих максимумах; 2) длинами волн в
минимумах кривой поглощения и интенсивностью в этих точках; 3) длинами
волн, отвечающих перегибам кривой поглощения, и интенсивностью для
этих точек.
18
Качественный и количественный анализ по ИК спектрам
Определение состава смесей органических и неорганических
соединений (качественный анализ) и установление концентраций
компонентов смеси (количественный анализ) являются одними из важных
задач ИК–спектроскопии.
Для проведения как качественного, так и количественного анализа по
ИК–спектрам необходимо иметь спектры чистых компонентов. При
сравнении спектра со спектром вещества, присутствие которого
предполагается, находят в спектре смеси все полосы поглощения эталонного
вещества. Если спектр анализируемого образца содержит все полосы
поглощения эталонного вещества, можно полагать, что вещество
действительно содержится в образце.
В настоящее время имеются атласы и автоматизированные картотеки
спектров, с помощью которых можно отождествить любое соединение, если
оно было раньше известно и для него получен колебательный спектр.
В случае ИК-спектров, так же как и в случае ультрафиолетовых (УФ) и
видимых спектров (ВИ) поглощения, соотношение между пропусканием
света системой и концентрацией поглощающих веществ выражается законом
Ламберта-Бугера-Бера:
D=lg1/T=lg I0/I=ε⋅с⋅d
где D - оптическая плотность; I0 - интенсивность падающего света; I интенсивность прошедшего света; с - молярная концентрация; d - толщина поглощающего
слоя; ε - молярный коэффициент поглощения для данного волнового числа и
температуры.
Если закон Бугера – Ламберта – Бера выполняется, что бывает далеко
не всегда, то при фиксированной толщине слоя оптическая плотность
линейно зависит от концентрации вещества, что и позволяет легко проводить
количественный анализ. Отклонения от линейной зависимости бывают
связаны или с межмолекулярными взаимодействиями компонентов смеси
(раствор), включая специфические (ассоциация, водородная связь) и
химические взаимодействия или с инструментальными причинами. Играют
роль также эффекты отражения, рассеяния излучения и т.д. Поэтому всегда
проводится проверка выполнения закона светопоглощения и чаще всего для
проведения количественного анализа строятся градуировочные графики по
эталонам.
Для снижения ошибок количественных измерений рекомендуется
работать с пропусканием в пределах 20 … 60% (оптическая плотность в
пределах ∼ 0,1 … 1,0) или, по крайней мере, не выходить за пределы 10 …
19
80% пропускания, когда ошибки резко возрастают. При большом
поглощении необходимо уменьшать либо толщину слоя, либо концентрацию.
Текущий контроль:
1. Какая физическая характеристика лежит в основе ИК-спектроскопии.
2. Какие состояния молекул можно охарактеризовать по ИК-спектрам?
3. Какие частоты называются характеристическими?
4. Объясните разницу между понятиями валентные и деформационные
колебания.
Тема:
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ
СОЕДИНЕНИЙ ПОЛИФЕНОЛЬНОЙ ПРИРОДЫ.
(продолжительность – 2 часа)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Цель: научиться работать на спектрофотометре СФ-103, а также
овладеть методиками приготовления анализируемых растворов.
Задачи: уметь приготовить анализируемый раствор, осуществить
выбор анализируемой длины волны. При необходимости сделать
соответствующие разведения.
Объекты: рутин, кверцетин.
Методика определения:
Определение проводится на спектрофотометре СФ-103 в программе
"Спектр - Spectr-1.0"
Данная программа реализует спектрометрический режим работы
спектрофотометра СФ-103 и предназначена для сканирования спектров
образцов, обработки спектров, сохранению протоколов измерения, созданию
и печати отчётов о проделанных измерениях и полученных результатов.
Порядок работы в программе "Спектр - Spectr-1.0"
Работа в программе сводится к выполнению операций, разделенных на
4 этапа:
1.Ввод параметров измерения;
2.Измерение спектров.
3.Запись результата измерения;
20
4.Формирование отчета по проделанным измерениям.
1. Ввод параметров измерения.
Для перехода к вводу параметров в главном окне программы курсором
манипулятора мыши щелкнуть по корешку "Параметры". Появится таблица
ввода параметров.
Ввод параметров измерения сводится к вводу значений 7-и основных
параметров измерения, 5-и параметров процесса измерения и измерения
базовой линии:
Основные параметры:
1."Дата проведения измерения" - ввод сводится к щелчку указателем курсора
мыши по окну "значения параметров" напротив названия параметра. После
чего появляется окно календаря. Если дата не соответствует
действительности, нажимается кнопка со стрелкой вниз, что разворачивает
календарь. В календаре выбирается в нижней части опция "Сегодня". Дата
текущего дня вводится в таблицу параметров.
2."Время проведения измерения" - выполняется аналогичным щелчком по
окну "значения параметров" напротив названия параметра. Появится окно
ввода параметра. Если значение удовлетворяет, переходят к другому
параметру, если нет, правят соответственно часы, минуты и секунды. Формат
данных времени представляет собой три двухзначных числа, разделенных
между собой двоеточием.
Для правки часов курсором выделить число 18 (провести курсором,
число закрасится в синий цвет) и набрать нужное количество часов.
Аналогично поступают с минутами и секундами. В принципе можно
набирать в произвольном виде.
3. "Название образца пробы" - щелчком по окну "значения параметров"
напротив названия параметра вызывается окно прямого ввода название
образца пробы.
4."Количество образцов" - в данной версии программы количество образцов
всегда равно 1. Для того, чтобы снять спектры с нескольких образцов в
одном окне измерения необходимо:
4.1.Установить один цикл измерения;
4.2.После завершения сканирования спектра и перед следующим
пуском сканирования переместить, каретку держателя кювет позицию, где
стоит следующий образец;
21
4.3.Нажать кнопку "Измерение". Таким образом, можно получить
спектры 8-ми образцов. Записать все спектры в 1-н протокол программа не
позволяет сделать, но сохранить каждый спектр отдельным протоколом
можно. Для этого нужно нажать клавиши "Ctrl+Ins" или запустить опцию
"Вставить из буфера спектров" в меню "Данные" появится панель "Буфер
спектров". В буфере будут хранится все 8 спектров. При входе в панель на
графике спектра пропускания (поглощения) будет представлен спектр
образца №1. Его надо записать в протокол. Для этого нажмите кнопку
"Запись".
Появится панель записи, в которой под любым именем следует
записать спектр в файл. Для того, чтобы записать спектр следующего
образца, в окошке с вертикальными кнопками "Показать спектр" щелкните на
кнопку, имеющей стрелку вверх. В окошке появится цифра "2", что
соответствует спектру 2-го образца, а в окне спектра появится кривая
спектра. Для записи нажать кнопку "Запись" и повторить манипуляции
записи, которые проделывались для образца №2, и т.д. до образца №8.
Спектр 8-го образца измеряется в нулевой кювете.
5."Вид режима измерения" - щелчком по окну "значения параметров"
напротив названия параметра вызывается окно выбора режима измерения.
Кнопкой данного окна вызывается меню списка режимов измерения. Список
состоит из названий 2-х режимов:
%Т - Пропускание;
Abs - Поглощение;
Простым выбором названия режима выполняется ввод режима
измерения.
6."Начальная длина волны" - щелчком по окну "значения параметров"
напротив названия параметра вызывается окно прямого ввода значения
длины волны. Длину волны можно вводить с дробной частью. Дробная часть
отделяется не запятой, точкой ".". Если будет введена запятая, программа
выдаст сообщение об ошибке. Начальная длина волны это длина волны, с
которой СФ-103 начинает старт сканирования спектра.
7."Конечная длина волны" - щелчком по окну "значения параметров"
напротив названия параметра вызывается окно прямого ввода значения
длины волны. Длину волны можно вводить с дробной частью. Дробная часть
отделяется не запятой, точкой ".". Если будет введена запятая, программа
выдаст сообщение об ошибке. Конечная длина волны это длина волны, на
которой СФ-103 заканчивает сканирование спектра.
22
8."Шаг сканирования" - щелчком по окну "значения параметров" напротив
названия параметра вызывается окно прямого ввода значения длины волны.
Длину волны можно вводить с дробной частью. Дробная часть отделяется не
запятой, точкой ".". Если будет введена запятая, программа выдаст
сообщение об ошибке.
Шаг сканирования это шаг, на котором СФ-103 выдает значения %Тпропускания(Abs-поглощения) и длины волны сканируемого спектра, т.е.
шаг получения точек спектра: Параметры процесса измерения.
9."Число циклов сканирования" - щелчком по окну "значения " напротив
названия параметра вызывается окно прямого ввода значения. Число циклов
сканирования позволяет за один пуск измерения получить несколько
спектров, которые можно усреднить, выбрать и вставить протокол
измерения.
10."Время между циклами сканирования" - щелчком по окну "значения
параметров" напротив названия параметра вызывается окно прямого ввода
значения. Это время, которое затрачивается после завершения предыдущего
сканирования перед началом сканирования следующего спектра.
11."Максимальное значение %Т(Abs) Ymax" - щелчком по окну "значения
параметров" напротив названия параметра вызывается окно прямого ввода
значения. Это значение выставляет максимальное значение масштабной
сетки графика спектра по оси ординат.
12."Минимальное значение %Т(Abs) Ymax" - щелчком по окну "значения "
напротив названия параметра вызывается окно прямого значения. Это
значение выставляет минимальное значение масштабной сетки графика
спектра по оси ординат.
13."Время успокоения образца в кювете" - щелчком по окну "значения
параметров" напротив названия параметра вызывается окно прямого ввода
значения.
Время успокоения один из важнейших параметров измерения, который
оказывает влияние на точность измерения. Если спектрофотометр СФ-103
имеет кюветный держатель на 8-мь образцов, то важно ввести время
успокоения. Под временем успокоения понимается время, за которое
успокоятся колебания раствора образца, возникшие в результате движения и
23
останова кюветного держателя. Колебания раствора изменяют оптическую
плотность образца, из-за чего большой разброс значений в результатах
измерений.
После завершения набора значений параметров измерения следует
нажать кнопку "Ввод параметров". При наборе параметров данные уже
автоматически вводятся в прибор и измерительную часть программы,
поскольку может быть введена длина волны ультрафиолетового спектра, где
требуется прогрев дейтериевой лампы, то окончательный контроль
оставляется за нажатием кнопки "Ввод параметров".
14. К вводу параметров перед измерениями образцов относится измерение
базовой линии.
Для выполнения этой операции устанавливают пустую кювету на
нулевую "0" позицию. Нажимают кнопку "Измерение". Измерение около 45
сек. Прибор запоминает измеренный спектр и при измерении образцов
вычитает из их спектров спектр пустой кюветы.
Ясно, что можно поступать так и с кюветой заполненной каким-то
раствором, которым разбавлены образцы.
2. Измерение спектров.
Перед измерениями устанавливают образцы на соответствующие
позиции с №1 по №7. Устанавливают соответствующую позицию. Для этого
надо нажать в панели "Установки" на соответствующий номер индикатора
кюветного держателя (при условии, что СФ-103 имеет 8-ми кюветный
держатель). Далее нажать кнопку "Измерение". После этого начнется
санирование спетра(ов). Программа будет отображать спектр и процессе
отображения по умолчанию будет автомасштабировать график спектра. Если
автомасштабирование
не
требуется,
следует
нажать
кнопку
"Масштабирование". Если было задано циклов сканирования больше 1, то
для удобства просмотра нажать кнопку "Установка вида показа спектров"
или клавиши "Alt+F9". Графики спектров будут отображаться в 3-х мерном
виде. Повторное нажатие этой кнопки переведет отображение в 2-х мерный
вид. При завершении измерения программа выдаст сообщение "Измерение
закончено". Если циклов сканирования было больше 1-го, следует нажать
кнопку "Получить средний спектр" или клавиши "Ctrl+U". После нажатия
кнопки на экране монитора останется один спектр, который будет
отображаться более толстой кривой.
Спектр можно просмотреть и проанализировать, если он
удовлетворяет, то надо выполнить операцию записи.
24
3. Запись результата измерения
1.Если измерение выполнялось с именем файла "NoName.SPR", то для записи
протокола измерения достаточно нажать кнопку "Запись" на верхней
инструментальной доске. Появится диалоговое окно записи протокола
измерения в *.SPR файл. В окне "Имя файла" следует набрать имя файла и
нажать кнопку "Сохранить".
2.Если измерение выполнялось с именем файла не "NoName.SPR", то после
нажатия кнопки "Запись" запись выполнится в установленный файл без
появления окна записи. Если в этом случае надо записать протокол
измерения в файл под другим именем, следует войти в меню файл и нажать
опцию "Сохранить как...". Появится диалоговое окно записи протокола
измерения в *.SPR файл. В окне "Имя файла" следует набрать новое имя
файла и нажать кнопку "Сохранить".
3. Следует помнить, что после записи в любой файл программа еще
записывает протокол измерения в файл "сurrent.SPR". Данный файл полезен,
когда надо войти в протокол последнего измерения.
4. Формирование отчета о проделанных измерениях.
После записи результатов измерения следует приступать к
оформлению отчета о проделанных измерениях и печати отчета. Нажатием
кн."Отчёт" на основной инструментальной "доске" вызывается панель
"Отчёт". Панель "Отчёт" состоит из 2-х окон: "Ввод реквизитов" и "Просмотр
отчета". В панели реквизитов вводятся следующие реквизиты:
1.Название файла протокола измерения;
2.Дата;
3.Название образца(ов) с пробой;
4.Исследуемое вещество;
5.Телефон;
6.Факс;
7.Ф.И.О.
8.Организация.
После ввода реквизитов нажимается кнопка "Ввод". После нажатия
кнопки "Ввод" программа вводит реквизиты в отчет и показывает
содержание отчета.
25
В отчете представлены таблица "Параметры измерения", график
"Спектр поглощения" (Спектр пропускания) и комментарии к измерениям.
Комментарии к измерениям могут быть набраны непосредственно в
панели отчета. Для этого кнопкой "Комментарии" вызывается редактор
комментарий.
В редакторе после набора текста нажимается "ОК", что вызовет ввод
текста комментарий в отчет. Если отчет удовлетворяет, следует нажать
кнопку
"Печать". Нажатие кн. "Печать".
Панель
отчета
предоставляет
пользователю
дополнительные
возможности в оформлении отчета и хранению результатов измерения. На
основной инструментальной "доске" панели имеется кнопка в "в Excel".
Кнопка вызывает программу MS Excel с отчетом сформированным в панели
отчет. В Excel-e можно провести дополнительные операции над
оформлением отчета, просмотреть данные спектра в отдельной таблице,
провести необходимые операции над данными и сохранить отчеты в новом
виде.
В панели отчет для спектров можно вызвать панель настройки графики
отчета, где можно выбрать шрифт, толщину линий, цвет линий для
отображения графика спектра в отчете.
В программе "Спектр - Spectr-1.0" имеются дополнительные следующие
функции:
1."Вызов панели "Позиция кювет";
2."Вставить из файл";
3."Вставить из буфера спектров";
4."Вычитание";
5."Буфер концентрации".
1."Вызов панели "Позиция кювет" - В программе есть панель "Позиция
кювет", где выиграется позиция кювет с образцами и выставляется время
успокоения. Ей удобно пользоваться прежде всего тем, что она вызывается
на любом этапе измерения, но не во время измерения.
2."Вставить из файла" - вставить из файла средство, которое позволяет в одно
окно подгрузить несколько спектров измеренных при одних и тех же
параметрах. Сравнить их между собой. Далее с ними можно провести
операцию вычитания. Опция "Вставить из файл" запускается из меню
"Данные" горячая или быстрая клавиша "Ins". При нажатии этой клавиши
26
вызывается панель загрузки файлов, где можно выбрать файл с одинаковыми
параметрами измерениям и произвести загрузку спектра.
3."Вставить из буфера спектров" - данная функция позволяет загружать
спектры, хранящиеся в буфере (специальном каталоге Buffer), куда они
постоянно записываются во время измерения. Горячая или быстрая клавиша
"Ctrl+Ins". Когда сканируется спектр с одного образца несколько раз
(циклами), то после каждого сканирования полученный спектр
автоматически записывается в файл под своим именем. Если число циклов
сканирования равно 8-ми, то в результате в каталог <Buffer> будет записано
8-мь спектров с именами BUF1.DAT,...,BUF8.DAT).
Данная функция полезна при внезапном прекращении измерения, когда
протокол измерения еще не был записан. В таких случаях создается новый
протокол измерения. Вызывается функция "Вставить из буфера спектров" и
загружаются буферные спектры. Количество должно быть равно количеству
циклов сканирования, которые было сделаны в последнем измерении, после
этого можно либо усреднить спектры, либо из них выбрать наиболее
подходящий и записать его в протокол измерения.
Кроме того, эта функция позволяет измерять в одном протоколе спектры
8-ми образцов при количестве циклов сканирования равного 1. Сканируя
спектр образца 1-н раз, перед переходом к сканированию спектра
перемещается каретка держателя или вставляется кювета с другим образцом.
После получения 8-ми спектров вызывается данная панель,
последовательно выбирается каждый спектр в окне с клавишами "Показать
спектр" и каждый раз записывается в новый протокол измерения под новым
именем.
Полезность данной функции аналогична функции "Вставить из файла",
но в отличии от последней спектры вставляются в протокол из одного места,
что более удобно.
4."Вычитание" - функция обработки спектров. Рассмотрим операцию
вычитания на примере. Операцию вычитания над спектрами возможна, когда
имеется хотя бы 2-а спектра. Спектры должны быть получены для одних и
тех же параметров измерения. Это важнейшее условие для выполнения
операции вычитания. В каталоге <Base> есть два протокола измерения
спектров, сделанных в диапазоне от 190 нм до 600 нм (диапазон
сканирования содержит участок ультрафиолетового диапазона) в режиме
измерения Abs поглощения:
1.файл Fedorov_KITAI_1.SPR;
27
2.файл Fedorov_KITAI2_1.SPR.
Предположим нам надо вычесть спектр файла "Fedorov_KITAI2_1.SPR"
из спектра файла "Fedorov_KITAI_1.SPR". Для этого в начале загрузим 1-й
файл, программа предложит прогреть дейтеривую лампу, но для обработки
нам это не требуется. Нажмем клавишу "Insert", т.е. выполним
опцию"Вставить из файла" меню "Данные". Будет вызвана панель загрузки
файлов и вставим спектр файла "Fedorov_KITAI2_1.SPR". В окне появится
2-й спектр, который будем вычитать. Вызовем панель вычитания спектров.
Для этого нажмем кнопку "Вычитание спектров". Она находится над окном
графика спектра, рядом с кнопкой усреднения спектров. С той же целью
можно воспользоваться меню "Обработка". Там есть опция "Вычитание".
После нажатия появится панель для проведения вычитания спектров с
заголовком:
"Вычитание спектров Файл №1: Fedorov_KITAI_1.SPR".
В этой панели есть две основных страницы:
1.Таблица сравнения параметров спектров;
2.Спектры.
Кнопкой "Открыть" загрузим спектр файла "Fedorov_KITAI2_1.SPR",
который надо вычесть. После загрузки в таблице будут представлены
параметры 2-х файлов. Параметры можно сравнить, что позволяет убедиться
в правильности выполнения операции вычитания. Параметры 2-х спектров
будут представлены в соответственно в графах таблицы:
-"Значение СП№1";
-"Значение СП№2".
На 2-й странице в окне графиков спектра будут находится 2 спектра. Для
вычитания нажмем кнопку "Расчет". В графе "Значение СП. Раз."-значение
спектра разности будут приведены параметры спектра разности, а на графике
появится 3-й спектр разности. Нажатием клавиши "Вставить" спектр
разности будет вставлен в окно спектра программы, а панель вычитания
спектров закроется. Чтобы сохранить спектр разности, с экрана следует
удалить спектры файлов:
1.Fedorov_KITAI_1.SPR;
2.Fedorov_KITAI2_1.SPR.
Для этого раскройте меню-панель "Спектры" на левой инструментальной
"доске". При нажатии кнопки с 2-мя стрелками вверх меню-панель
"Спектры" раскроется, если она была закрыта. В меню-панель "Спектры" в 3х кнопках-окошках будут стоять метки. Далее следует удалить в первых 2-х
окошках метки. С экрана исчезнут спектры файлов:
28
1.Fedorov_KITAI_1.SPR;
2.Fedorov_KITAI2_1.SPR.
Далее войти в меню "Файл" и выполнить опцию "Сохранить как". В
диалоговом окне "сохранить" набрать имя нового файла
"Fedorov_KITAI3_1.SPR".
Спектр разности запишется в файл с новым именем.
5."Буфер концентрации" - эта опция позволяет запоминать значения точек
табличном виде и по ним получать значения концентрации. Так как каждая
точка, зарегистрированного спектра, показывает значения %Т/Abs пропускания (поглощения) на определенной длине волны, то запоминая эти
точки в виде списка значений, их можно использовать для получения
назначения концентрации. Для создания списка значений точек из спектра
вызывается кросс концентрации, т.е. координатный крест, который можно
перемещать по точкам спектра и записывать их значения в буфер
концентрации. Для этого надо нажать кн. "Вкл/Выкл кросс концентрации",
или в меню данные опцию с тем же названием, или нажать клавишу F5.
На спектре появится координатный крест в виде вертикальной и
горизонтальной линии красного цвета и панель для поточечного
перемещения кросса с кнопкой записи в буфер концентрации. Для быстрого
перемещения кросса используются клавиши Shift+Left (перемещение влево)
и клавиши Shift+Right (Перемещение вправо). Установив кросс на нужную
волну следует нажать кнопку записи "в буфер" или нажать клавишу F6. Для
успешной записи в буфер нужно произвести нажатие кнопки записи, хотя бы
2-раза для 2-х точек. Первой нажатие кнопки не регистрируется. Все
последующие регистрируются. Для просмотра содержимого буфера
нажимается клавиша F7. Для обнуления клавиши Shift+Del;
Получить значения концентрации можно не выходя из программы
измерения спектра. Клавишей F7 вызывается панель "Буфер концентрации".
В панели имеются 2-е таблицы. Одна для отображения точек из спектров
пропускания, другая для спектров поглощения. В таблице отображаются
следующие данные:
1. Файл спектра, из которого взята точка для анализа;
2. Название образца;
3. Длина волны в нм;
4. Значение пропускания (поглощения);
5. Название вещества;
6. Единицы измерения концентрации;
7. Значение концентрации.
29
Для проведения расчета концентрации для взятой точки спектра
нажимается кнопка "Расчет". Она вызовет панель загрузки калибровочной
кривой, по которой рассчитывается концентрация. В панели нужно найти
калибровочную кривую, которая соответствовала точке из спектра по
следующим параметрам:
1. Длина волны;
2. Режим измерения (%T/Abs);
3. Единицы измерения концентрации.
Единицы измерения концентрации для точки спектра выставляются под
единицы измерения калибровочной кривой в таблице буфера концентрации.
Если возникает не соответствие в единицах измерения концентрации
калибровочной кривой и точки спектра, то это противоречие преодолевается
установкой нужных единиц в таблице буфера концентрации.
Для этого надо в графе "Ед.изм." щелкнуть курсором по единицу
соответствующей точки спектра. Выкатится меню красного цвета с
единицами измерения:
1. мГ/Л;
2. г/Л;
3. %;
4. моль;
5. ppm.
Если калибровочная кривая есть в программе, то в результате программа
произведет расчет и запишет результат в соответствующее место таблицы
буфера. Программа запишет все зарегистрированные данные в файл с
расширением *.FBC в каталог <BC>. Из этого каталога подгружаются файлы
буфера концентрации. Буфер концентрации вызывается и в программе
"Концентрация - Spectr-1.0". Там загрузив файл с расширением *.FBC по
выбору в таблице точки можно вставлять в программу концентрации и
получать концентрацию. Для этого надо нажать кнопку "Вставить".
Текущий контроль:
1. Какую информацию дают УФ-спектры веществ?
2. Какие типы переходов электронов происходят в молекулах под
влиянием УФ-излучения?
3. Что такое хромофор, ауксохром. Приведите примеры и назовите их.
4. Под
влиянием
каких
факторов
происходят
батохромные
гипсохромные сдвиги максимумов полос поглощения?
30
и
Тема:
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ
МЕТОДОМ УФ-СПЕКТРОСКОПИИ.
(продолжительность – 2 часа)
АНАЛИЗ
ФЛАВОНОИДОВ
Цель: на основании кривой спектра поглощения найти аналитическую
длину волны, максимально свободную от наложения остальных полос.
Задачи: овладеть методиками приготовления основного раствора, на
основе которого далее осуществлять соответствующие разведения.
Научиться проводить расчеты, по определению количественного содержания
анализируемого образца.
Объекты: рутин, кверцетин.
Методика определения:
При оценке качества растительного сырья и фитопрепаратов,
содержащих
флавоноиды,
наибольшее
распространение
получил
спектрофотометрический метод анализа, основанный на использовании
реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом.
Фотометрический метод определения без предварительного разделения
компонентов основан на аддитивности значений оптической плотности всех
компонентов смеси при одной длине волны. Метод достаточно прост в
исполнении, является высокочувствительным и относительно недорогим, что
делает его предпочтительным для использования в контрольноаналитических лабораториях. Использование такого метода позволяет
определить сумму флавоноидов в присутствии других полифенольных
соединений, не образующих комплекса с алюминием хлорида в среде 30-96%
спирта.
В качестве стандарта используется тот флавоноид (рутин, кверцетин,
гесперетин и т.д.), максимум поглощения комплекса которого наиболее
соответствует максимуму поглощения комплекса с хлоридом алюминия
исследуемого образца.
В качестве стандарта используется ГСО рутина или ГСО кверцетина,
так как максимумы поглощения комплексов с хлоридом алюминия
рутина/кверцетина и экстрактов, например, боярышника, пустырника и
календулы наблюдаются при наиболее близких значениях длин волн.
Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре СФ103 в интервале длин волн 408-616 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм.
Оборудование, материалы и реактивы:
-мерная колба объемом 100 мл - 1 шт.;
31
-мерные колбы объёмом 25 мл - 6 шт.;
-пипетки объёмом 1 мл - 3 шт.;
-пипетки объёмом 5 мл - 1 шт.;
-мерный цилиндр объемом 100 см3;
-часы;
-кюветы на 10 мм;
-спектрофотометр СФ-103 Аквилон;
-алюминия хлорид 5%;
-спирт этиловый 70%;
-спирт этиловый 95%;
-экстракты сырья.
Подготовка к анализу:
Приготовление 5%-го раствора алюминия хлорида:
5 г алюминия хлорида х.ч. или ч.д.а. (ГОСТ 3759-75) растворяют в 50
мл 95% спирта этилового в мерной колбе на 100 мл, доводят объём раствора
этим же спиртом до метки и перемешивают.
Срок годности раствора 3 месяца.
Для анализа необходимо подготовит 250 мл 5% раствора алюминия
хлорида в 70% спирте.
Приготовление 70%-го этилового спирта:
Для приготовления 1л 70% этилового спирта смешивают 675 г
этилового спирта 95% и 325 г воды. В объемных единицах 95% этилового
спирта - 855 см3, воды - 325 см3. После приготовления раствора проверяют
его плотность или объемную долю спирта ареометром (ГОСТ 3639-79).
Приготовление экстрактов:
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц,
проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 0,5 г (точная
навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью
100 мл, прибавляют 50 мл 70% спирта этилового. Колбу взвешивают с
погрешностью ±0,01 г, присоединяют к обратному холодильнику и
нагревают в термостате при температуре 60 °С в течение 2 ч. После
охлаждения до комнатной температуры колбу вновь взвешивают и доводят
до первоначальной массы 70% спиртом этиловым. Содержимое колбы
фильтруют через воронку диаметром 7 см с вложенным ватным тампоном,
отбрасывая первые 20 мл фильтрата.
32
Проведение спектрофотометрического анализа
В мерную колбу вместимостью 25 мл, предварительно взвешенную,
переносят с помощью пипетки аликвоту анализируемого экстракта, равную 1
мл, и вновь взвешивают. В колбу с помощью пипетки добавляют 4 мл 5%
раствора хлорида алюминия. Для приготовления раствора сравнения во
вторую колбу вместимостью 25 мл с помощью пипетки переносят аликвоту
(1 мл) анализируемого экстракта, после чего объем обеих колб доводят до
метки 70% спиртом и оставляют на 30 мин. В случае помутнения растворов
их фильтруют через бумажные фильтры в чистые стаканы.
Оптическую плотность измеряют в интервале 408-616 нм на длине
волны максимума поглощения в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10
мм, в рабочую кювету помещают раствор с добавленным хлоридом
алюминия, в кювету сравнения - раствор сравнения. Если максимум
поглощения расположен в области 408-420 нм, в качестве стандарта
используют ГСО рутина. Если максимум поглощения расположен в области
421-435 нм, в качестве стандарта используют ГСО кверцетина.
Массовую долю суммы Р-активных флавоноидов в исследуемых
экстрактах в пересчете на рутин в мг/ 100г (Х) вычисляют по формуле:
с × × 10
Х =
где, с - количество рутина в анализируемой аликвоте экстракта, соответствующее
измеренной оптической плотности по калибровочному графику, г/25 см3; Fр- фактор
разбавления; 105- коэффициент пересчета в мг/100г; М - масса экстракта, г.
Текущий контроль:
1. Как отличаются между собой УФ-спектры флавонов и флавононов?
2. Как относятся между собой интенсивности полос поглощения
агликонов, монозидов и биозидов (дигликозидов).
3. Охарактеризуйте комплексы флавонолов и флавонов с алюминия
хлоридом.
4. Какие наблюдаются изменения в характере спектров поглощения
флавоноидов в присутствии алюминия хлорида.
Рубежный контроль:
5. Перечислите
структурные
особенности,
антиоксидантные свойства молекул.
33
обуславливающие
6. Каким образом происходит связывание активных форм кислорода,
например, с виниленовой кислотой.
7. Какая физическая характеристика лежит в основе ИК-спектроскопии.
8. Какие состояния молекул можно охарактеризовать по ИК-спектрам?
9. Объясните разницу между понятиями валентные и деформационные
колебания.
10.Какие типы переходов электронов происходят в молекулах под
влиянием УФ-излучения?
11.Что такое хромофор, ауксохром. Приведите примеры и назовите их.
12.Под
влиянием
каких
факторов
происходят
батохромные
и
гипсохромные сдвиги максимумов полос поглощения?
13.Как отличаются между собой УФ-спектры флавонов и флавононов?
14.Как относятся между собой интенсивности полос поглощения
агликонов, монозидов и биозидов (дигликозидов).
15.Охарактеризуйте комплексы флавонолов и флавонов с алюминия
хлоридом.
16.Какие наблюдаются изменения в характере спектров поглощения
флавоноидов в присутствии алюминия хлорида.
Тема:
СПЕКТРАЛЬНЫЕ
ТРИТЕРПЕНОИДОВ.
(продолжительность – 2 часа)
МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель: овладеть методикой спектрофотометрического определения
тритереноидов.
Задачи: освоить приемы приготовления растворов тритерпеноидов в
концентрированной серной кислоте.
Объекты: различные тритерпеноиды, имеющиеся в наличии.
Методика определения:
34
Концентрированная серная кислота широко применяется для
идентификации многих органических соединений, особенно при изучении
спектров поглощения сердечных гликозидов и их агликонов.
С тритерпеноидами концентрированная серная кислота в чистом виде,
а также в смеси с другими соединениями дает окрашенные продукты
реакции.
Бриескорн и Капуано установили, что при взаимодействии серной кислоты с
тритерпеноидами происходит дегидратация молекулы тритерпеноида и
образование диеновых производных с сопряженными двойными связями в
кольцах С и D молекулы тритерпеноида.
Рассмотрите возможность идентификации некоторых тритерпеноидов
по спектрам поглощения в УФ-области.
Навески веществ по 0,4 мг растворить в 10 мл конц. серной кислоты.
Полученные растворы термостатируют при температуре 60˚С 15 мин.
Реакционную смесь охлаждают, а затем проводят спектральное исследование
относительно чистой серной кислоты.
В качестве представителей пентациклических тритерпеноидов необходимо
использовать образцы уваола, урсоловой кислоты, β-амирина, олеаноловой кислоты,
лупеола, тараксерола ифриделанола. Указанные тритерпеноиды в концентрированной
серной кислоте имеют характерную полосу поглощения при 310 нм. Это, по-видимому,
обуславливается возникновением сопряжения в кольцах С и D тритерпеноидов. Урсоловая
кислота и уваол – производные α-амирина – проявляют одинаковые изменения в серной
кислоте. Им присущ перегиб на кривой спектра в области 300-305 нм.
Строение урсоловой кислоты и уваола различно вследствие замены карбоксильной
группы при С17 на оксиметиленовую, что видимо, и вызывает появление второго
максимума у уваола при 410 нм.
Олеаноловая кислота, изомерная урсоловой кислоте, отличается от последней
неодинаковым расположением метильных групп в кольце Е. Возможно, такое различие
объясняет отсутствие перегиба у олеаноловой кислоты при 300-305 нм, сто отмечалось у
урсоловой кислоты. Олеаноловая кислота относится к ряду β-амирина. Отсутствие
перегиба в области 300-305 нм наблюдается также и у β-амирина.
Лупеол относится к тритерпеноидам, у которых кольцо Е представлено
пятичленным циклом, а при С19 боковая цепь имеет одну непредельную связь. В области
420 ммк у лупеола появляется второй максимум.
Используя величину оптической плотности сернокислых растворов
препарата
при
максимуме
поглощения,
разработана
методика
количественного определения тритерпеновых соединений в препарате. Для
построения калибровочной кривой точные навески урсоловой кислоты
растворяют в 10 мл концентрированной серной кислоты. Растворы
термостатируют при 60˚С в течение 60 минут. Оптическую плотность
35
определяют при 310 нм. Растворы урсоловой кислоты подчиняются закону
Бера в концентрация от 0,10 до 0,40мг/мл.
По аналогичной методике определяют оптическую плотность раствора
препарата. Расчеты по количественную содержанию тритерпеноидов в
препарате проводят относительно урсоловой кислоты. Спектры снимают на
спектрофотометре в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Раствор
сравнения – концентрированная серная кислота.
Текущий контроль:
1. Спиртовые
растворы
многих
пентациклических
тритерпеноидов
«прозрачны» в УФ-спектре. Почему?
2. Какие изменения претерпевают пентациклические тритерпеноиды в
условиях реакции Брискорна-Капауно.
3. Охарактеризуйте спектр поглощения тритерпеноидов в серной кислоте.
4. Как осуществляется количественное определение тритерпеноидов.
Тема:
ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЙ
МЕТОД
ПОЛИСАХАРИДОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ
(продолжительность – 2 часа)
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Цель: овладеть методикой выделения из растительного сырья
полисахаридов и их фракционирования
Задачи: освоить приемы и методы очистки полисахаридов, разделения
их на фракции, содержащие ВРПС, ПВ, Гц А и Б.
Объекты: любое воздушно сухое растительное сырье, имеющееся в
наличии.
Методика определения:
Общая методология выделения и очистки полисахаридов
При выделении индивидуальных полисахаридов приходится решать
три задачи разной степени сложности (следует отметить, что они редко
являются последовательными этапами выделения):
1) отделение низкомолекулярных веществ;
2) отделение биополимеров неуглеводной природы;
36
3) разделение смесей полисахаридов. При выборе метода для решения
очередной задачи следует учитывать те свойства целевого биополимера, по
которым он отличается от других компонентов исходной смеси; эти различия
и должны выявляться посредством применения искомого метода. Описан ряд
параметров, на основании которых возможно произвести разделение
веществ: молекулярный вес, растворимость, температуры плавления и
кипения, способность вступать в качественные реакции с определёнными
соединениями и т.п.; большинство из них зависит от химической структуры
веществ.
Полисахариды представляют собой линейные или разветвлённые цепи,
состоящие из моносахаридных остатков, соединённых гликозидными
связями. В природных полисахаридах обычно встречаются остатки гексоз
(глюкоза, галактоза, манноза), пентоз (арабиноза, ксилоза), 6 - дезоксигексоз
(рамноза, фукоза), 2-аминосахаров (глюкозамин, галактозамин), уроновых
кислот, а также заместители неуглеводной природы - остатки серной или
фосфорной кислот, уксусной кислоты, метанола и др.; смешанные
биополимеры могут содержать, помимо угдеводного участка, белковый или
липидный компоненты. В зависимости от моносахаридного состава,
различают гомополисахариды (продукты поликонденсации мономеров
одного типа - например, только остатков глюкозы) и гетерополисахариды
(которые, соответственно, включают разные типы моносахаридных
остатков). Каждый моносахарид может находиться в пиранозной или
фуранозной форме и быть присоединённым к любой из свободных
гидроксильных групп соседнего мономера или гликозидной связью, а также
нести один или несколько неуглеводных заместителей (остатки кислот,
спиртов и др.) Основной функциональной группировкой полисахаридов
является гидроксильная группа, превращения которой (прежде всего,
окисление и образование простых и сложных эфиров) оказывают
значительное влияние на условия процесса выделения полисахарида. Другие
функциональные группы также подвержены различным модификациям:
карбоксильные группы уроновых кислот могут быть этерифицированы или
восстановлены, аминогруппы аминосахаров - ацилированы, и др.
Полисахариды высокополярны ввиду наличия большого количества
гидроксильных групп. Соответственно, растворимость полисахарида должна
быть прямо пропорциональна полярности растворителя. Все полисахариды
плохо растворимы в формамиде и диметилсульфоксиде и практически
нерастворимы в спиртах, однако растворимость в воде определяется не
только полярностью, но и степенью упорядоченности строения
макромолекулы. Внеклеточный полисахарид хитин и подобные ему
37
полисахариды с регулярной структурой и линейной конформацией обладают
высокой энергией межмолекулярного взаимодействия, превосходящей
энергию гидратации; поэтому эти соединения всего лишь слабо набухают в
воде. Полисахарид разветвлённого строения (например, разветвлённые
пектиновые кислоты) существует в водных растворах в виде беспорядочно
свёрнутого рыхлого клубка и, благодаря большим размерам и гибкости
макромолекул, связывает огромное количество растворителя (объём такого
клубка во много раз превышает изначальный объём макромолекулы). Кроме
того, полисахариды склонны к образованию ассоциаций в растворах за счёт
межмолекулярных водородных связей; при малых объёмах жидкости это
может привести к возникновению нерастворимых форм.
Ввиду
многообразия
изученных
полисахаридов,
разработка
стандартной процедуры их выделения и очистки не представляется
возможной; тем не менее, вне зависимости от природы целевого соединения
процесс должен быть максимально эффективным, т.е. обеспечивать
максимальный выход продукта; полисахарид не должен подвергаться
деструкции под воздействием химических реагентов, использованных для
его выделения, либо ферментов, присутствующих в составе сырья.
Экстракция. Метод экстракции подразумевает извлечение веществ,
содержащихся в сырье, в раствор, и используется как начальный этап
очистки.
Растворение полисахарида и ряда сопутствующих веществ и отделение
нерастворимых примесей. Чаще всего в качестве растворителя используют
воду, однако полисахариды с большим количеством кислотных
функциональных групп лучше растворяются в разбавленных минеральных
кислотах, а гемицеллюлозы экстрагируют в щелочной среде.
Экстракция полисахаридов сопровождается растворением полярных
низкомолекулярных соединений, некоторых белков и нуклеиновых кислот,
поэтому дальнейшая обработка экстракта предусматривает удаление этих
веществ.
Экстракция требует предварительного измельчения сырья; при этом
часть фибриллярных молекул может быть повреждена либо механическим
путём, либо окислением кислородом воздуха (последнее - в щелочной среде).
Осаждение. Осаждение органическим растворителем, смешивающимся
с водой. Обычно применяют 80% этиловый спирт или 96%, который
растворяет низкомолекулярные примеси, в т. ч. олигосахариды, в то время
как полисахариды выпадают в осадок.
38
Диализ. В процессе диализа раствор экстракта помещают в целлофан,
погружённый в воду; при этом низкомолекулярные примеси диффундируют
через целлофан наружу. Диффузия ускоряется под действием электрического
поля (электродиализ) или при перемешивании. Для удаления катионов из
растворов кислых полисахаридов диализ проводят в подкисленной среде.
Ультрацентрифугирование
(седиментация)
обеспечивает
концентрационное распределение веществ по центрифужной пробирке под
действием центробежной силы. Измерение длины траектории движения
молекул вдоль направления действия центробежной силы называется
определением скорости седиментации; зная эту величину, можно вычислить
коэффициент седиментации - показатель, значение которого зависит от
молекулярной массы и формы частицы.
При непосредственном выделении полисахаридных комплексов
используется методика последовательного фракционного полисахаридов
Н.К. Кочеткова и М. Sinnera. С помощью этой методики полисахаридные
комплексы из растительного сырья делят на фракции, содержащие
водорастворимые полисахариды (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ),
гемицеллюлозы А и Б (ГЦ А и ГЦ Б). Предварительно растительное сырье
обрабатывают хлороформом для удаления красящих веществ и неуглеводных
компонентов . Для получения ВРПС используют воздушно-сухой шрот сырья
после экстракции неуглеводных компонентов. 100 г воздушно-сухого шрота
экстрагируют 1,5 л воды при комнатной температуре и постоянном
перемешивании в течение 12 ч. Полученное извлечение фильтруют,
полисахариды из фильтрата осаждают двойным объемом 96% этилового
спирта. Выпавшие плотные осадки центрифугируют, промывают этиловым
спиртом, затем сушат до постоянной массы и взвешивают. Из шрота,
оставшегося после получения ВРПС, выделяют ПВ. Экстракцию сырья
проводят смесью 0,5% растворов щавелевой кислоты и оксалата аммония
(1:1) при 100 °С в течение 1 ч. Извлечение фильтруют. ПВ осаждают
однократным объемом 96% спирта этилового. Полученный осадок
центрифугируют, промывают этиловым спиртом, сушат до постоянной
массы и взвешивают. Из шрота, оставшегося после выделения ПВ, выделяют
гемицеллюлозу А и Б. Экстракцию проводят 7,5% раствором натрия
гидроксида в 17 часов. Извлечение фильтруют, доводят до pH 6 – 7 ледяной
уксусной кислотой. Осадок ГЦ А отделяют центрифугированием, сушат до
постоянной массы и взвешивают. Надосадочную жидкость после выделения
39
ГЦ А диализуют против воды в течение 24 ч, ГЦ Б осаждают двукратным
объемом 96% спирта этилового. Выделившийся осадок ГЦ Б отделяют
центрифугированием, сушат до постоянной массы и взвешивают. Для
установления моносахаридного состава ВРПС, ПВ, ГЦ А и Б проводят их
гидролиз 2н серной кислотой при температуре 100 ºС в течение 10 ч для
ВРПС и в течение 48 ч для остальных полисахаридных комплексов.
Моносахариды определяют в гидролизатах методом хроматографии на
бумаге FN-4 в системе растворителей н-бутанол–уксусная кислота–вода
(4:1:5) параллельно с достоверными образцами моносахаридов.
Хроматограммы обрабатывают анилинфталатным реактивом и 1%
спиртовым раствором резорцина с 2М кислотой хлористоводородной (1:9).
Моносахариды проявлялись в виде пятен различной окраски.
Текущий контроль:
1. Объясните
смысл
понятий
гомо-
и
гетерополисахарид.
Какие
моносахариды чаще встречаются в составе этих полисахаридов?
2. Охарактеризуйте физические свойства полисахаридов.
3. Какой принцип лежит в основе выделения полисахаридов из
растительного сырья и разделения их на отдельные фракции?
4. Как
устанавливают
моносахаридный
состав
водорастворимых
полисахаридов, пектиновых веществ и гемицеллюлоз.
Тема: КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ
ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
(продолжительность – 2 часа)
АНАЛИЗ
Цель: ознакомиться с перечнем реактивов и методами бумажной и
тонкослойной хроматографии, используемыми для предварительной
характеристики анализируемых флавоноидов.
Задачи: освоить методики приготовления растворов анализируемых
веществ и научиться интерпретировать данные УФ-спектров с
ионизирующими и комплексообразующими добавками.
Объекты: любые флавоны и флавонолы.
40
Методика определения:
Для качественного анализа флавоноидных соединений наиболее
широко применяется бумажная и тонкослойная хроматография с
последующим проявлением пятен на хроматограммах различными
хромогенными реактивами.
Реактив
Аммиак, пары + УФ свет
Карбонат натрия (5% р-р) + УФ свет
1% р-р NaOH в метаноле
1% р-р FeCl3
FeCl3 + K3Fe(CN)6 (1% р-ры 1:1)
Основной ацетат свинца (25% р-р) +
УФ свет
AlCl3 (2% в метаноле) + УФ свет
SbCl3 (10% в CHCl3) + УФ свет
Сульфат церия (70% в H2SO4)
H2SO4 (конц.)
НСl (газ)
Zn + HCl
C2H2O4×2H2O (10% р-р в смеси
ацетон-Н2О; 1:1)
Диазореактивы
Боргидрид натрия (1% р-р в
изопропаноле) + пары HCl или р-р
AlCl3
Гидразид изоникотиновой кислоты
(0,4% р-р в 0,5% HCl в метаноле)
Соединения, которые дают окраску
Большинство флавоноидов
Большинство флавоноидов (кроме
изофлавонов и флаванонов)
Большинство флавоноидов
Большинство флавоноидов
Большинство флавоноидов
Большинство флавоноидов
Большинство флавоноидов
Большинство флавоноидов
Биофлавоноиды
Изофлавоны
Полностью метилированные флавоны
Дегидрофлавонолы
Антоцианы и антоцианидины
Большинство флавоноидов
Флаваноны, изофлаваноны
Флаваноны
Для основных классов флавоноидов определены следующие
максимумы поглощения: для изофлавонов – 225-265 нм, дополнительный
310-330, флаванонов – 275-290, 290-330 нм, дополнительный 310-330 нм,
флавонов – 250-270, 330-350 нм, флавонолов – 250-270, 350-390 нм,
дополнительный 300 нм, халконов – 365-390 нм, дополнительный 240-260
нм, антоцианидинов – 465-560 нм, дополнительный 270-280 нм, ауронов –
370-430 нм, дополнительный 270-280 нм.
Расстоянием
между
основными
максимумами
короткои
длинноволновой части спектра более или менее постоянно (например, для
флавонолов 93-125 нм,
флавонов – 70-97 нм) и может служить
отличительным признаком. Имеет значение и соотношение интенсивности
41
полос. В спектре флавонов этот показатель почти одинаков, тогда как у
изофлавонов максимум первой полосы составляет 15-20% от интенсивности
максимума поглощения второй полосы, а у антоцианидинов – 20-25% от
интенсивности максимума при 440 нм.
Наличие гидроксильных групп вызывает батохромный сдвиг
максимумов в длинноволновой области спектра, а метилирование,
ацетилирование и гликозидирование – гипосохромный сдвиг обоих
максимумов.
Для определения положения гидроксильных групп широко
используется влияние различных реагентов на хромофорную систему
флавоноида. Все гидроксильные группы флавоноидов ионизируются в среде
метилата или этилата натрия. У флавонов или флавонолов при наличии
свободного гидроксила у С4' наблюдается батохромный сдвиг первой полосы
на 40-64 нм без уменьшения интенсивности. Гидроксильная группа у Сзфлавонолов при отсутствии гидроксилирования у С4/ также вызывает
батохромный сдвиг первой полосы на 50-60 нм, но уже с понижением
интенсивности. Гликозидирование в положении С7 может быть установлено
по отсутствию адсорбционного пика при 320-330 нм, который имеется у
соответствующего агликона. Флавонолы, содержащие гидроксильные
группы в положениях 3,4' и (или) 3,3',4', в присутствии метилата натрия
окисляются и дают спектры, в которых максимумы поглощения со временем
понижают свою интенсивность.
Смесь ацетата натрия и борной кислоты позволяет определять наличие
дезоксигруппировки во всех основных группах флавоноидов, за
исключением антоцианов и антоцианидинов.
Текущий контроль:
1. Какие
системы
растворителей
чаще
используются
при
хроматографическом анализе агликонов и гликозидов флавоноидов.
2. Назовите
диагностические
реактивы,
используемые
при
УФ-
спектральном анализе флавоноидов.
3. Какие реакции лежат в основе определения типов замещения в ядре
флавона?
4. При
какой
аналитической
длине
волны
чаще
осуществлять количественный анализ флавоноидов?
42
целесообразно
Тема: МЕТОДЫ УСТАНОВЛЕНИЯ СТРОЕНИЯ ПРИРОДНЫХ
ФЛАВОНОИДОВ.
(продолжительность – 2 часа)
Цель: освоить химические методы
флавоноидов с помощью качественных реакций.
установления
строения
Задачи: научиться проводить качественные реакции: проба Синода, по
Брианту, по Гиббсу, проба Хёрхаммера, с баритовой водой.
Объекты: кверцетин, рутин.
Методика определения:
В данном занятии рассматривается строение основных подгрупп
флавоноидов – эуфлавоноиды, изофлавоноиды и неофлавоноиды. К
подгруппе эуфлавоноидов, или собственно флавоноидов, относятся флаваны,
флавоны, флавонолы, флаваноны, флаванонолы, халконы, дигидрохалконы,
антоцианидины и ауроны. Последние в отличие от других эуфлавоноидов производные 2-бензилиден-кумаранона (2-бензилиден- 3-бензфуранона).
Изофлавоноиды включают производные 3-фенила- или 7-бензпирана,
или пирона, ротеноиды, гомоизофлавоноиды и некоторые другие
соединения.
В растениях помимо мономерных флавоноидов найдены и полимерные.
В 60-х годах в растениях рода Dalbergia были обнаружены соединения производные 4-арилхромона. Позже их стали рассматривать как производные
диарилпропена, и они получили название неофлавоноиды. В настоящее
время они обнаружены только в семействах Hypericaceae (роды Calophyllum,
Mammaea, Mesua), Rubiaceae (род Exostemma) и Fabacea (в родах Dalbergia,
Machaerium,
Haematoxylon).
К
ним
относятся
4-арилкумарины,
дальбергионы, дальбергихинолы, 4-арилхромоны
Анализ флавоноидных соединений
Для качественного анализа флавоноидных соединений наиболее
широко применяется бумажная и тонкослойная хроматография с
последующим проявлением пятен на хроматограммах различными
хромогенными реактивами.
Большинство флавоноидов на хроматограммах из-за малой
концентрации бесцветны, либо слабо окрашены, поэтому их просматривают
в УФ-свете (в коротковолновой и длинноволновой области) и опрыскивают
43
различными хромогенными реактивами.
Используя эти реактивы, можно ориентировочно установить структуру
ядер флавоноидов, определить положение гидроксильных групп у С3, С5, С7,
С8 и наличие диоксигруппировки в боковом фенильном радикале. При
необходимости производятся следующие пробирочные реакции: проба
Синода (Mg + HCl); реакция по Брианту (модификация пробы Синода,
позволяющая по продуктам реакции восстановления Mg + HCl, имеющим
различную растворимость в воде и амиловом спирте, отличить агликоны от
гликозидов); реакция Гиббса (появляется голубая окраска с реактивом при
отсутствии свободного гидроксила в пара-положении); проба Хёрхаммера
(ZrOCl2 + лимонная кислота; желтая окраска указывает на наличие
свободного гидроксила у С3); госсипетоновая реакция (красно-коричневая
окраска указывает на пара-хиноидный тип строения); SrCl2-NH3
(возникающие желтая, коричневая, зеленая, черная окраски указывают на
наличие ортодифенольной группировки); проба с баритовой водой (зеленое
окрашивание - 5,6,7-триоксигруппировка).
УФ-спектроскопия флавоноидных соединений
Данные по УФ-спектроскопии флавоноидных соединений широко
представлены в литературе и позволяют получить солидную информацию об
их строении.
Для основных классов флавоноидов определены следующие
максимумы поглощения: для изофлавонов – 225-265 нм, дополнительный
310-330 нм, флаванонов – 275-290 нм, 290-330 нм, дополнительный 310-330
нм, флавонов – 250-270 нм, 330-350 нм, флавонолов – 250-270 нм, 350-390
нм, дополнительный 300 нм, халконов – 365-390 нм, дополнительный 240260 нм, антоцианидинов – 465-560 нм, дополнительный 270-280 нм, ауронов
– 370-430 нм, дополнительный 270-280 нм.
Для определения положения гидроксильных групп широко
используется влияние различных реагентов на хромофорную систему
флавоноида. Все гидроксильные группы флавоноидов ионизируются в среде
метилата или этилата натрия. У флавонов или флавонолов при наличии
свободного гидроксила у С4' наблюдается батохромный сдвиг первой полосы
на 40-64 нм без уменьшения интенсивности. Гидроксильная группа у С3флавонолов при отсутствии гидроксилирования у С4/ также вызывает
батохромный сдвиг первой полосы на 50-60 нм, но уже с понижением
интенсивности. Гликозидирование в положении С7 может быть установлено
по отсутствию адсорбционного пика при 320-330 нм, который имеется у
соответствующего агликона. Флавонолы, содержащие гидроксильные
44
группы в положениях 3,4' и (или) 3,3',4', в присутствии метилата натрия
окисляются и дают спектры, в которых максимумы поглощения со временем
понижают свою интенсивность.
Флаваноны и дигидрофлавонолы, содержащие гидроксилы в
положениях 5 и 7, дают батохромный сдвиг второй полосы на 35-40 нм,
сопровождающийся повышением интенсивности максимума поглощения.
При отсутствии гидроксила у С5 наблюдается сдвиг на 60 нм. Некоторые
флаваноны, в частности те, у которых нет свободного гидроксила у С5,
изомеризуются в халконы (из-за щелочной реакции среды) и имеют
максимум поглощения при 400 нм.
4/-Оксигруппа ауронов и 4-оксигруппа халконов вызывают батохромный сдвиг первой полосы соответственно на 80-95 и 60-100 нм с
повышением интенсивности пиков. 6-Оксиауроны дают меньший сдвиг (6070 нм), чем 4/-оксиауроны. При наличии в молекуле 6,4'-диокси-6-окси, 4'алкоксигрупп также наблюдается уменьшение величины сдвига.
Халконы, не содержащие гидроксилы у С4/, но имеющие гидроксилы у
С2 или С4/, дают батохромный сдвиг первой полосы на 60-100 нм без
повышения интенсивности.
Из антоцианидинов в присутствии метилата натрия устойчивые
спектры дают только 3-дезоксиантоцианидины (батохромный сдвиг первой
полосы на 50-60 нм). Ацетат натрия в отличие от метилата натрия
ионизирует только наиболее фенольный гидроксил.
Флавоны и флавонолы, содержащие гидроксил у С7, дают батохромный
сдвиг второй полосы на 5-20 нм. Наличие чувствительных к щелочам
(группировок 5,6,7- или 5,7,8- и 3,3',4'-триокси) вызывает со временем
исчезновение максимумов поглощения.
Изофлавоны при наличии оксигруппы у седьмого атома углерода
вызывают батохромный сдвиг полосы на 6-20 нм. У 5,7-диоксифлаванонов и
дигидрофлаванонолов максимумы смещаются на 35 нм, а у 5дезоксифлаванонов и дигидрофлавонолов - на 60 нм.
Смесь ацетата натрия и борной кислоты позволяет определять наличие
дезоксигруппировки во всех основных группах флавоноидов, за
исключением антоцианов и антоцианидинов.
Наличие группировок: 5-окси-4-кето, З-окси-4-кето- и орто-диоксиможно легко определить при помощи хлористого алюминия. В кислой среде
комплексы, образованные орто-диоксигруппировкой, разрушаются.
Следы воды препятствуют образованию алюминиевого комплекса с
диоксигруппировкой. В этом случае используют метанол. При одновременном присутствии в молекуле диоксигруппировки и гидроксила у С3 или у
45
С5 образуют двойные комплексы. При наличии гидроксилов у С3 и С5
образуется комплекс с гидроксилом у С3.
Батохромный сдвиг первой полосы у 5-оксифлавонов при добавлении
АlСl3 + НСl составляет 35-55 нм. Если же сдвиг происходит только на 17-20
нм, то это указывает на наличие гидроксила у С6.
Флавонолы в присутствии АlСl3 + НСl вызывают батохромный сдвиг
первой полосы на 50-60 нм. Если вместо АlС13 использовать ZrOCl2 и
лимонную кислоту, то можно определить наличие З-оксигруппировку в
присутствии 5-оксигруппировки. Наличие диоксигруппировки в боковом
фенильном радикале в присутствии AlCl3 вызывает батохромный сдвиг на
30-40 нм.
У 5-оксиизофлавонов в присутствии AlCl 3 + НС1 происходит
батохромный сдвиг второй полосы на 10-14 нм, а у флаванонов и
дигидрофлавонолов - на 20-26 нм. У 2'-оксихалконов наблюдается
батохромный сдвиг первой полосы на 48-64 нм и у 4-оксиауронов - на 60-70
нм. Антоцианидины и антоцианы, содержащие ортодиоксигруппировку,
дают в присутствии AlCl 3 при pH 2-4 батохромный сдвиг первой полосы на
25-35 нм.
В настоящее время наряду с УФ-спектроскопией для установления
строения флавоноидных соединений широко используется ЯМР-1Нспектроскопия.
Текущий контроль:
1. Какую информацию дают УФ-спектры флавоноидов?
2. На
чем
основано
определение
гидроксигрупп
в
присутствии
диагностических добавок.
3. Можно
ли
по
значению
интенсивностей
поглощения
сделать
однозначный вывод о принадлежности производных флавона к
агликонам, монозидам и/или биозидам (дигликозидам)?
4. Как проводится количественный кислотный гидролиз.
Тема:
СПОСОБЫ
ВЫДЕЛЕНИЯ
И
ФЛАВОНОИДОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ.
(продолжительность – 2 часа)
46
ИДЕНТИФИКАЦИИ
Цель: ознакомиться с наиболее часто используемыми методами
выделения флавоноидов из растительного сырья и разделения их на
индивидуальные соединения.
Задачи: освоить методики расшифровки УФ-спектров флавоноидов с
ионизирующими и комплексообразующими добавками, ИК- и ЯМР-1Н –
спектроскопии.
Объекты: рутин, кверцетин.
Методика определения:
Методы выделения и идентификации.
Флавоноиды содержатся во всех частях растения, и метод выделения
их зависит от характера растительного материала и типа флавоноида,
который необходимо выделить. Лучше всего экстракции подвергается
воздушно-сухое сырье. Если же обрабатывается свежесобранное сырье, то
его помещают в кипящий растворитель, чтобы прекратить действие
ферментов, которые могут вызвать гидролиз гликозидов.
Выбор растворителя для экстракции, как правило, зависит от
полярности флавоноида. Более полярные растворители употребляются для
экстракции гликозидов и антоцианов, менее полярные - для агликонов.
Изофлавоны, флаваноны, дигидрофлаванонолы, сильно метилированные
флавоны или флавонолы экстрагируют бензолом, хлороформом, эфиром или
этилацетатом; гликозиды, сильно гидроксилированные флавоноиды, ауроны,
халконы легко переходят в спирты различной концентрации или в ацетон.
Для очистки сырья от стеролов, каротиноидов, хлорофилла и других
липофильных
примесей
растительный
материал
предварительно
обрабатывают петролейным эфиром или гексаном. Однако и в этом случае
некоторые сильнометилированные флавоноиды и изофлавоноиды могут
переходить в растворитель вместе с липофильными соединениями.
Глюкурониды флавонов и флавон-полисахариды, проантоцианидины и
катехины легко экстрагируются горячей водой. В процессе выделения часто
используют распределение флавоноидов в двух несмешивающихся
растворителях (например, в воде и этилацетате, в воде и н-бутаноле и др.), а
также осаждение флавоноидов ацетатом свинца или солями олова. В
последние годы для предварительной очистки флавоноидов успешно
применяют диализ.
При выделении индивидуальных соединений широко используется
колоночная хроматография. В литературе описано использование
адсорбентов: силикагеля, магнезола, целлюлозы, окиси алюминия,
47
полиамида, сефадексов, ионообменных смол, активированного угля для
разделения и очистки самых различных комбинаций флавоноидов. Наиболее
часто употребляют силикагель, целлюлозу и полиамид. Силикагель обычно
используют для разделения изофлавонов, флаванонов, дигидрофлаванонолов,
высокометилированных или ацетилированных флавонолов и флавонов. В
качестве элюентов применяют мало полярные растворители. Так,
изофлавоны формононетин, афрормозин и тексазин могут быть выделены из
экстракта Baptisia australis хроматографией на силикагеле путем вымывания
колонки смесью хлороформа с увеличивающейся концентрацией эфира или
этилацетата. W. Herz, V. Sudarsanam при хроматографии на силикагеле
экстракта из Iva hayesiana элюцией чистым хлороформом выделили
гиспидулин, а смесью хлороформ - эфир [5:1]-аксиллярин.
Для выделения флавоноидов проводят экстракцию растительного
материала этанолом или метанолом, учитывая растворимость агликонов и
гликозидов флавоноидов в спирте.
Спиртовое извлечение упаривают, к остатку добавляют горячую воду и
после охлаждения удаляют неполярные соединения (хлорофилл, жирные и
эфирные масла.), т.к. при охлаждении они выпадают в осадок, который
отделяют.
Часто для отделения сопутствующих веществ
сырье сначала
обрабатывают хлороформом, т.е. «обезжиривают», а затем уже экстрагируют
спиртом разной концентрации. Спиртовое извлечение исследуют.
Проводят качественный и количественный анализ.
Флавоноиды из водной фазы извлекают последовательно этиловым
эфиром (агликоны), этилацетатом (в основном монозиды) и бутанолом
(биозиды, триозиды).
Для разделения компонентов каждой фракции используют колоночную
хроматографию на силикагеле, полиамидном сорбенте или целлюлозе.
Элюирование веществ проводят смесью хлороформа с метиловым
спиртом с возрастающей концентрацией
метилового спирта, спиртоводными смесями с возрастающей концентрацией спирта, если сорбентом
служит полиамид, или 5-30 %-ной уксусной кислотой в случае целлюлозы.
Для выделения отдельных флавоноидов существуют специфические
методы.
Так, для выделения рутина из бутонов софоры японской экстракцию
проводят горячей водой. При охлаждении водных извлечений рутин
выпадает в осадок, его отфильтровывают и очищают перекристаллизацией из
спирта.
48
Для идентификации флавоноидов используют их физико-химические
свойства:
- определение температуры плавления
- определение удельного вращения гликозидов
- сравнение УФ, ИК, масс-, ПМР спектров со спектрами известных образцов.
УФ спектр флавоноидов характеризуется наличием, как правило, двух
максимумов поглощения. УФ спектроскопия успешно используется для
установления свободных ОН-групп в молекуле флавоноида путем
добавления различных реактивов (ацетата натрия, метилата натрия, борной
кислоты с ацетатом натрия, хлористого алюминия).
При добавлении этих реактивов происходит смещение максимумов
поглощения, характерное для гидроксильных групп в различных
положениях.
В ИК спектре флавоноидов имеются полосы поглощения, характерные
для различных группировок.
Качественное определение
Специфических реакций для всех групп флавоноидов не существует.
Часто используют следующие реакции:
1. Характерной реакцией на флавоноиды – Цианидиновая проба или
проба Синода (проба Chinoda) (основана на восстановление их атомарным
водородом в кислой среде в присутствии магния или цинка).
Флавоноиды при восстановлении магнием или цинком в присутствии
концентрированной хлористоводородной кислоты образуют красное
окрашивание, обусловливаемое образованием антоцианидинов:
OH
O
HO
OH
O
HO
O
OH
Mg+HCl
2H+
O
OH
OH
R
OH
H
OH
OR
хроменол
49
HCl
- H2O
OH
O
HO
+
OH
Cl
-
OH
OH
цианидин хлорид
Реакция очень чувствительна, основана на восстановлении
карбонильной группы и образовании антоцианида.
Халконы и ауроны при помощи цианидиновой реакции не
обнаруживаются, но при добавлении конц. HCl (без магния) образуют
красное окрашивание за счет образования оксониевых солей.
2. Борно-лимонная реакция:
5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы взаимодействуют с борной кислотой в
присутствии лимонной (или щавелевой), образуя ярко-желтое окрашивание с
желто-зеленой флуоресценцией (образование батохромного комплекса):
OH
O
HO
OH
OH
O
O
B
O
O
C=O
O=C
3. Реакция с треххлористой сурьмой:
5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с треххлористой
сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или
красный цвет:
OH
O
HO
OH
OH
O
O
Sb
Cl
Cl
50
4. С раствором аммиака, щелочи флавоны, флаваноны, флавонолы,
флаванонолы дают желтое окрашивание, при нагревании переходящее в
оранжевое или красное; халконы и ауроны тотчас же дают красное или
пурпурное окрашивание. Чистые катехины окрашивания не дают, однако
присутствие даже в небольшом количестве примесей (продуктов окисления)
вызывает появление желтой окраски. Антоцианы в присутствии аммиака или
карбоната натрия дают синее или фиолетовое окрашивание.
5. С 1 %-м раствором ванилина в конц. HCl образуют красномалиновое окрашивание катехины (производные флороглюцина и
резорцина).
6. Флавоны, халконы, ауроны, содержащие свободные ортогидроксильные группировки в кольце В, при обработке спиртовых растворов
средним уксуснокислым свинцом образуют осадки, окрашенные в яркожелтый и красный цвета. Антоцианы образуют осадки, окрашенные как в
красный, так и в синий цвета.
7. С 1-2 %-ным спиртовым раствором AlCl3 желто-зеленое
окрашивание говорит о наличии флавоноидов.
Хроматографические методы анализа
С целью обнаружения флавоноидов в растительном материале
широко
используется хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента.
Обнаружение
компонентов на хроматограмме осуществляется
просматриванием их в УФ свете.
При этом флавоны, флавонол-3-гликозиды, флаваноны, халконы и их 7гликозиды – в виде желтых или желто-зеленых пятен; флавонолы и их 7гликозиды – в виде желтых или желто-зеленых пятен; ксантоны в виде
оранжевых пятен.
Изофлавоны при этом не проявляются.
После просматривания в УФ свете хроматограммы можно обработать
одним из реактивов:
1) 5 %-ным спиртовым раствором AlCl3 c последующим нагреванием
при 105 0С в течение 3-5 минут; (ярко-желтая окраска пятна в видимом свете
и яркую желто-зеленую флуоресценцию в УФ –свете);
2) с 5 %-ной SbCl3 в четыреххлористом углероде (реактив МартиниБеттоло); Желтая или желто-оранжевая окраска указывает на наличие
51
флавонов, флавонолов, флаванонов и изофлавонов; красная или краснофиолетовая – халконов.
3) с 2 %-ным спиртовым раствором щелочи
4) при обработке пятна парами аммиака усиливается голубая
флуоресценция (изофлавоноиды), что позволяет получить зоны с более яркой
флуоресценцией в УФ свете. Реактив Вильсона (раствор борной и б\в
лимонной кислоты в б\в метаноле)
5) Реакция азосочетания – на наличие 7-оксифлаванолов, 7оксиизофлаванолов.
Количественное определение
В последние годы все большее распространение получают различные:
Физико-химические
методы
анализа,
которые
имеют
ряд
существенных преимуществ в сравнении, например, с гравиметрическими и
титрометрическими методами, а именно, быстрота и точность определения,
обнаружение даже незначительных количеств и, что особенно важно,
возможность выделения отдельных флавоноидов из растительного сырья.
К
таким
методам
относятся
фотоэлектроколориметрия,
спектрофотометрия, денситометрия с использованием хроматографии на
бумаге и в тонком слое сорбента.
Сущность хроматоденситометрического метода заключается в
выделении и разделении флавоноидов с непосредственной количественной
денситометрической оценкой окрашенной зоны на хроматограмме.
Метод имеет преимущества в быстроте проведения анализа и точности
определения, так как в данном случае исключается стадия элюирования.
Используется фотоколориметрический метод, основанный на
измерении оптической плотности окрашенных растворов, полученных в
цветных реакциях флавоноидов с солями различных металлов (алюминия,
циркония, титана, хрома, сурьмы), с лимонно-борным реактивом и на
реакции восстановления цинком или магнием в кислой среде.
Известна цветная реакция флавоноидов с азотнокислым и
уксуснокислым уранилом, позволяющая количественно определять рутин в
смеси с кверцетином.
В настоящее время широко используется спектрофотометрический
метод.
52
Текущий контроль:
1. Какие методы используются для выделения и очистки флавоноидов из
растительного сырья?
2. В чем суть цианидиновой пробы.
3. Какие сведения можно подчеркнуть исходя из хроматографического
анализа.
4. Какие
методы
используются
для
количественного
анализа
флавоноидов.
Рубежный контроль:
1. Почему
спиртовые
растворы
многих
пентациклических
тритерпеноидов «прозрачны» в УФ-спектре.
2. Объясните
смысл
понятий
гомо-
и
гетерополисахарид.
Какие
моносахариды чаще встречаются в составе этих полисахаридов?
3. Охарактеризуйте физические свойства полисахаридов.
4. Какой принцип лежит в основе выделения полисахаридов из
растительного сырья и разделения их на отдельные фракции?
5. Как
устанавливают
моносахаридный
состав
водорастворимых
полисахаридов, пектиновых веществ и гемицеллюлоз.
6. Какие
системы
растворителей
чаще
используются
при
хроматографическом анализе агликонов и гликозидов флавоноидов.
7. Какие реакции лежат в основе определения типов замещения в ядре
флавона?
8. При
какой
аналитической
длине
волны
чаще
целесообразно
осуществлять количественный анализ флавоноидов?
9. Какую информацию дают УФ-спектры флавоноидов?
10.На
чем
основано
определение
гидроксигрупп
в
присутствии
диагностических добавок.
11.Какие методы используются для выделения и очистки флавоноидов из
растительного сырья?
53
12.Перечислите методы используются для количественного анализа
флавоноидов.
Тема:
ПОЛУЧЕНИЕ
ФЛАВОНОИДОВ.
(продолжительность – 2 часа)
СТАНДАРТНЫХ
ОБРАЗЦОВ
Цель: освоить приемы и методы получения стандартных образцов.
Задачи: научиться определять
параметры индивидуального соединения.
важнейшие
физико-химические
Объекты: рутин, кверцетин, гесперидин, гесперетин.
Методика определения:
1) Приготовление раствора стандартного образца рутина: около 0,05 г
(точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре
130-135 °С в течение 3 часов, количественно переносят в мерную колбу
вместимостью 50 см3, растворяют в 40 мл 70 % водного спирта при
нагревании на водяной бане. После растворения содержимое колбы
охлаждают до комнатной температуры и доводят 70 % спиртом до метки.
2) Приготовление раствора стандартного образца кверцетина,
гесперидина и гесперетина проводится по методике аналогичной методике
приготовления стандартного образца рутина (см. выше).
Текущий контроль:
1. Каким критериям должен соответствовать стандартный образец?
2. Какие физико-химические методы и приемы используются при
получении стандартов.
3. Можно ли использовать стандартные образцы для качественной
идентификации флавоноидов?
4. Что такое проба смешения и как она проводится?
Тема: СИНТЕЗ ХАЛКОНОВ, ФЛАВОНОВ И ФЛАВОНОЛОВ.
54
(продолжительность – 2 часа)
Цель: освоить методики конденсации Кляйзена. Осуществить синтез
халконов и флавонолов в условиях щелочного катализа.
Задачи: научиться составлять технологический баланс для синтеза
халконов и на их основе – флавонолов, а также выделять целенные
соединения из реакционной среды.
Объекты: орто-гидроксиацетофеноны, ароматические альдегиды.
Методика определения:
Синтез халконов:
Способы синтеза производных халконов основаны на реакции
щелочной конденсации ацетофенонов с ароматическими альдегидами в среде
апротонных растворителей.
I способ: 1 моль ацетофенона и 1 моль альдегида растворяют в 8-10 мл
диметилформамида (ДМФА) и добавляют водный раствор NaOH и смесь
кипятят в течение 8-15 минут. После охлаждения к реакционной смеси
добавляют 200 г холодной воды и при интенсивном перемешивании
подкисляют 10% водным раствором серной кислоты до рН = 4-5. Выпавший
осадок халкона отделяют, промывают водой до нейтральной реакции и
кристаллизуют из этанола.
II способ: 1 моль ацетофенона и 1 моль альдегида растворяют в 8-10 мл
диметилсульфоксида (ДМСО) и добавляют водный раствор NaOH и смесь
кипятят в течение 8-15 минут. После охлаждения к реакционной смеси
добавляют 200 г холодной воды и при интенсивном перемешивании
подкисляют 10% водным раствором серной кислоты до рН = 4-5. Выпавший
осадок халкона отделяют, промывают водой до нейтральной реакции и
кристаллизуют из этанола.
При конденсации ацетофенона с бензальдегидом в среде водного
этанола наиболее оптимальным является следующее соотношение реагентов
в молях: ацетофенон – бензальдегид – NaOH (1:1:1,362). В том случае, когда
исходный альдегид или ацетофенон содержат заместители, реагирующие с
NaOH, то количество последнего эквивалентно увеличивается, в расчете на
соответствующее число этих заместителей. Например, если в конденсацию
вступают о-гидроксиацетофенон и бензальдегид, то мольное соотношение
равно 1:1:2,37. Таким образом, при выборе конкретного примера исполнения
производят обычный стехиометрический расчет, с учетом того количества
NaOH, которое катализирует реакцию незамещенного ацетофенона с
55
бензальдегидом. Для приготовления раствора щелочи исходят из расчета – 1
г натрия гидроксида в 1,5 мл воды.
Синтез флавонов:
Методы синтеза флавонов можно разделить на две группы. В одной из
них промежуточными соединениями являются дикетоны, а в другой –
халконы.
Реакциями получения флавонов через промежуточные дикетоны
являются конденсация по Костанецкому-Робинсину и конденсация по
Кляйзену. Методы получения флавонов через халконы различаются
способами циклизации последних. Флавоны могут быть получены при
гидролизе дибромпроизводных халконов и через стадию образования
флаванонов и флавонолов.
Одним из методов получения флавонов является синтез через соли 4этоксифлавилия. Этот метод имеет ограничения, так как наличие двух и
более гидроксильных групп в ароматическом ядре кетона (резацетофенон,
флорацетофенон) препятствует образованию флавилиевых солей. Поэтому
несомненный интерес представляет применение кетона с несколько иным
расположение
гидроксильных
групп
2,5-диоксиацетофенона
и
резодиацетофенона.
Для получения новых флавилиевых солей и флавонов и расширения
границ применения этого метола использовали в качестве исходного
соединения 2-окси-5-хлорацетофенон, кетон с новым для этой реакции
заместителем – галогеном.
Исходные вещества берут в соотношении 1:3:10:1 (кетон : альдегид :
этилформиат : 70% хлорная кислота). К 0,003 м кетона прибавляют 0,009 м
соответствующего альдегида и приливают 5,5 мл этилформиата. По каплям
добавляют 0,3 мл 70% хлорной кислоты. Происходит покраснение и
разогревание реакционной смеси, которую выдерживают при комнатной
температуре в течение 3 часов. Выпавшие осадки отделяют, промывают
эфиром и кристаллизуют из соответствующего растворителя.
Флавононы получены при кратковременном нагревании солей 4этоксибензопирилия с водой. Пирилиевые соли имеют два электрофильных
центра (α- и γ-положения). При взаимодействии с водой гидроксильная
группа воды атакует γ-положение пирилиевого катиона, затем отщепляется
молекула этилового спирта и образуется ядро флавона.
Перхлорат 4-этоксифлавилия кипятят в 50 мл 50% водного этанола 1015 минут. Осадок флавона фильтруют и кристаллизуют повторно из этанола.
56
41-гидрокси-31-карбоксифлавон.
0,41
г
(0,003
моля)
ортогидроксиацетофенона и 1,53 г (0,009 моля) 5-альдегидосалициловой
кислот смешивают с 4,4 мл ортомуравьиного эфира и к смеси по каплям
приливают 0,6 мл 70% хлорной кислоты и реакционную смесь оставляют на
12 часов. Выделившиеся кристаллы промывают сухим эфиром, сушат и
кристаллизуют из ледяной уксусной кислоты (выход 75%). Далее
полученную пирилиевую соль кипятят в диметилформамиде и после
разбавления водой отделяют кристаллы 41-гидрокси-31-карбоксифлавона.
Повторную кристаллизацию проводят из диметилформамида. Тпл -302303 ⁰С.
6,41-дигидрокси-31-карбоксифлавон. К смеси 0,46 г (0,003 моля) 2,5дигидроксиацетофенона, 1,53 (0,009 моля) 5-альдегидосалициловой кислоты
и 4,4 мл ортомуравьиного эфира по каплям прибавляют 0,6 мл 70% хлорной
кислоты и реакционную смесь оставляют на сутки, после чего выпавший
осадок отфильтровывают, промывают сухим эфиром, сушат и кристаллизуют
из ледяной уксусной кислоты (выход 78%). Полученную пирилиевую соль
гидролизуют кипячением в диметилформамиде. Тпл – 282-283⁰С (из ДМФА).
Синтез флавонолов:
В 10 мл диметилсульфоксида растворяют 1,36 г (0,01 моля) ортогидроксиацетофенона и 1,06 г (0,01 моля) бензальдегида. К реакционной
смеси добавляют раствор, содержащий 1,5 г натрия гидроксида в 4 мл воды и
кипятят в течение 10 минут. После охлаждения прибавляют 5 мл
диметилсульфоксида и при интенсивном перемешивании и охлаждении по
каплям 3 мл 15% водного раствора пероксида водорода.
Реакционную смесь перемешивают в течение 3 часов, после чего
подкисляют 10% раствором серной кислоты и разбавляют водой. Выпавший
осадок фильтруют, промывают водой и сушат. Выход – 90%. Тпл - 168⁰С (из
этанола).
Если в качестве исходных ароматических альдегидов и производных
орто-гидроксиацетофенонов
используют
соединения,
содержащие
гидроксигруппы, то производят пересчет количества натрия гидроксида и
воды, как было указано для синтеза халконов.
Текущий контроль:
1. Одним из способов синтеза флавоноидов является конденсация
Кляйзена. Охарактеризуйте данную реакцию и объясните, какой
продукт образуется.
57
2. Можно
ли
получить
флавон
из
ароилированных
2-
гидроксиарилметилкетонов (перегруппировка Бейкера-Венкатарамана).
3. Как в одну стадию получить соль пирилия и далее перейти к
соответствующему флавону?
4. Как получить халкон? Укажите условия, при которых халкон можно
перевести во флавонол.
Тема: ПРИ ПОМОЩИ КОМПЬЮТЕРНОЙ ПРОГРАММЫ «PASS»
ПРОВЕСТИ
АНАЛИЗ
ВОЗМОЖНОЙ
БИОЛОГИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ В РЯДУ РОДСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ВЫЯВИТЬ
ЗАКОНОМЕРНОСТИ
«СТРУКТУРА-АКТИВНОСТЬ»
В
РЯДУ
ПРЕДЛОЖЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ.
(продолжительность – 2 часа)
Цель: освоить приемы и методы ввода данных по структурам
виртуальных соединений в компьютерную программу PASS.
Задачи: научиться выводить закономерности структура-активность
внутри рядов родственных соединений.
Объекты: производные фенола и анилина.
Методика определения:
Для проведения анализа «структура-активность» в ряду изучаемых
соединений предварительно необходимо создать базу данных из
предварительно отобранных на основании ЛСП (логико-структурный
подход) соединений при помощи программы ISIS-BASE. Далее
сформированная база импортируется в программу компьютерного
прогнозирования PASS. На основании 2D-структуры искомая программа
выдает процент вероятности проявления или не проявления различных видов
активности присущих данным структурам. Полученные данные выгружаются
в виде SDF-файла, который для легкости обработки загружается в программу
FARM-expert, являющуюся логическим продолжением программы PASS.
Наиболее интересные виды активности выбираются исследователем на
основании наибольшего процента проявления активности. В офисной
программе Microsoft Word формируются таблицы, содержащие следующие
пункты (на усмотрение исследователя):
58
1.
2.
3.
4.
5.
Структура вещества
Порядковый номер
Лабораторный (химический) шифр соединения
Наименование активности (на английском или русском языке)
Процент
вероятности
проявления
исследуемого
фармакологический активности
вида
Текущий контроль:
1. Какой принцип лежит в основе логико-структурного подхода для
формирования виртуальной структуры.
2. На чем основана компьютерная программа прогноза биологической
активности.
3. Можно ли количественно оценить закономерности взаимосвязи
структура-активность?
4. Учитывает ли прогностическая программа механизмы взаимодействия
лиганд-рецепторов.
Тема: ПРОГНОЗ ГАМК-ЕРГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЦЕЛЕВЫХ
СОЕДИНЕНИЙ
МЕТОДОМ
МОЛЕКУЛЯРНОГО
ДОКИНГА.
ПОСТРОЕНИЕ
ГРАФИКОВ
РАСПРЕДЕЛЕНИЯ
ЭНЕРГИИ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРОВ НА ОСНОВАНИИ
ДАННЫХ МОЛЕКУЛЯРНОГО ДОКИНГА.
(продолжительность – 2 часа)
Цель: научиться строить прогноз фармакологической активности
соединений методом молекулярного докинга.
Задачи: уметь строить графики распределения энергии взаимодействия
лиганд-рецепторов.
Объекты: ГАМК, мусцимол, габазин.
Методика определения:
Для решения поставленной задачи используют метод молекулярного
докинга, который осуществлялся на основе структуры ГАМКА- рецептора,
59
сведения о котором заимствованы из базы данных протеинов Швейцарского
института биоинформатики (Swiss-Port) База данных. Процедура докинга
является реализованной в программном коде математической процедурой,
моделирующей взаимодействие лиганда с рецептором. При этом сохраняется
подвижность
лиганда
и
аминокислотных
участков
в
центре
комплементарности рецептора. Выбор подвижных остатков аминокислот
основывался на данных биохимических исследований.
В своих исследованиях по выявлению особенностей взаимодействия
лигандов с участком связывания γ-аминомасляной кислоты ГАМКАрецептором нами были использованы 11 антагонистов и 9 агонистов. Для
реализации первой части поставленной задачи рассматривались антагонисты
и агонисты, представленные на рисунке 1.
АНТАГОНИСТЫ
Cl
O
N
O
CH3
N
N
O
Cl
NH
O
O
N
N
N
H3C
O
П и тр азеп и н
Би кукули н
109
O
O
N
O
N
H
Iso-THIP
N
H
Iso-THAZ
N
N
N
H
N N C
H
OH
Pentylenetetrazol
113
112
111
O
HN
HN
R 0 5 -4 8 6 4
110
O
O
HO
SCS
115
114
NH
OH
N
N
O
H
N
O
OH
OH
NH
OMe
Габазин
116
O
HN
HO
R-5135
7m
118
117
60
АГОНИСТЫ
N
O
HN
7s
119
N
O
O
H2 N
O
NH
O
H2 N
ГАМК
120
121
H 2N
4-аминокротоновая кислота
N
HN
OH
O
Изогувацин
THIP
122
H
N
HO
OH
125
HN
OH
Мусцимол
O
O
N
H 2N
O
S
S
NH
Тиомусцимол
124
123
HN
N
H
O
O
OH
OH
S O
O
HN
H2N
IAA
ZAPA
P4S
126
127
128
Рисунок 1 – Структуры и шифры антагонистов и агонистов ГАМКАрецептора
Молекулярный
докинг
осуществляли
с
использованием
полнофункциональной эволюционной версии программы Molegro Virtual
Docker, что позволило получить несколько вариантов встраивания каждого
лиганда в участок связывания рецептора. Для выбора наиболее достоверного
варианта расположения лиганда разработчиками программы предлагаются
различные оценочные функции – Rerank Score, Docking Score, MolDock Score
и др., из числа которых нами выбрана Docking Score, так как при ее
использовании достигается наибольшая дифференциация между агонистами
и антагонистами ГАМКА-рецептора.
Далее с целью оценки и визуализации расположения лиганда на
участке связывания ГАМКА-рецептора были построены графики
распределения энергии взаимодействия с аминокислотными остатками для
каждого приведенного выше агониста и антагониста. На оси Ох указаны
аминокислотные остатки, участвующие во взаимодействии с молекулами
лигандов, причем набор остается неизменным для графика каждого лиганда,
что создает единообразие в их построении. По оси Оy приведены значения
энергии взаимодействия (ккал/моль) лиганда с каждым аминокислотным
остатком. Соединением точек графика формируется кривая, высота пиков
которой пропорцианальна значению энергии взаимодействия. Необходимо
отметить, что подобное качественное и количественное представление
взаимодействия лиганд-рецептор ранее нигде не встречалось. С
определенной долей приближения подобный график распределения энергии
является неповторимым для каждого соединения, взаимодействующего с
данным участком связывания белка.
Ниже в качестве примера представлен график распределения энергии
для бикукулина (Рис.2). Здесь же для сравнения приведены кривые,
соответствующие эндогенному тормозному нейромедиатору – γаминомасляной кислоте и наиболее сильному положительному ГАМКэргическому соединению – мусцимолу, используемому в фармакологических
исследованиях в качестве модельного.
61
5
0
Arg Arg Asn Asp Asp Asp Glu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Phe Phe Ser Ser Thr Thr Tyr Tyr Tyr
-5120 67 88 163 184 95 155 158 118 119 128 86 99 131 200 46 65 156 201 130 202 129 157 205
мусцимол
-10
гамк
-15
бикукулин
-20
-25
-30
Рисунок 2 – График распределения энергии взаимодействия лиганд-рецептор
по аминокислотным остаткам для антагониста ГАМКА-рецептора бикукулина
и агонистов ГАМК и мусцимола
При построении графиков энергии взаимодействия лиганд – ГАМКАрецептор выявлены две отдельные группы по сходным признакам для
антагонистов и агонистов, что является основой для дифференциации между
этими группами ГАМК-ергических соединений.
Анализ полученных графиков позволил определить те аминокислотные
остатки, с которыми антагонисты и агонисты взаимодействуют по-разному
(Таблица 1, Таблица 2).
Таблица 1 - Энергии взаимодействия с отдельными аминокислотными
остатками антагонистов ГАМКА-рецептора
Название лиганда Название аминокислотного остатка
Ser 201
Thr 202
Tyr 205
Бикукулин
-8.08509
-12.862
-11.0018
Питразепин
-13.9229
-11.9919
-10.0102
R05-4864
-9.90903
-13.1558
-9.10698
R-5135
-8.9913
-14.4028
-10.0704
Iso-THIP
0
-7.20747
-6.13157
Iso-THAZ
0
-8.39265
-6.01518
7m
-5.31634
-10.9927
-7.45729
7s
-12.5352
-18.8584
-8.37416
Габазин
-5.34399
-7.85174
-8.47751
Pentylenetetrazol
-2.072222 -8.015961 -14.951884
SCS
-11.0228
-21.5678
-11.3596
Таблица 2 – Энергии взаимодействия с отдельными аминокислотными
остатками агонистов ГАМКА-рецептора
Название лиганда
Мусцимол
ГАМК
Изогувацин
THIP
Тиомусцимол
Название аминокислотного остатка
Ser 201
Thr 202
Tyr 205
0
-4.65482
-3.17352
0
-5.42433
-2.75216
0
-3.79227
-4.2153
0
-3.354
-4.98475
0
-2.872796
-4.035319
62
4-аминокротоновая кислота
IAA
ZAPA
P4S
0
0
0
0
-5.11187
-1.70848
-4.34364
-0.67694
-2.0486
-3.73708
-5.22156
-3.57486
Из данных таблиц 4 и 5 следует, что величина энергии взаимодействия
антагонистов с остатком Tyr 205 всегда больше, чем для агонистов: в случае
антагонистов значения энергий находятся в диапазоне от -6.01518 до 14.951884 ккал/моль, а у агонистов от -2.0486 до -5.22156 ккал/моль.
Наоборот, энергия взаимодействия антагонистов с Thr 202 всегда
больше, чем для агонистов: диапазон энергий у антагонистов – от -7.20747 до
-21.5678 ккал/моль, а агонистов от -0.67694до -5.42433 ккал/моль.
Характерно, что все рассматриваемые агонисты не взаимодействуют с
Ser 201, тогда как для большинства антагонистов, кроме Iso-THIP и IsoTHAZ, наблюдается высокая энергия взаимодействия с данным остатком в
интервале от -5,31634 до -13,9229 ккал/моль. Следует подчеркнуть, что
изменение взаимного расположения гетероатомов в молекуле THIP на
противоположное, приводящее к перераспределению отрицательного заряда,
по-видимому, является причиной появления антагонистических свойств по
отношению к ГАМКА-рецептору. Аналогичные свойства наблюдаются и у
его гомолога –Iso-THAZ .
Сопоставление полученных нами данных позволяет достоверно
выделить 3 аминокислотных остатка как наиболее специфических центров
комплементарности при взаимодействии лигандов с участком связывания
ГАМКА-рецептора, что хорошо согласуется с данными литературы.
На основании полученных данных становится возможным построение
математической модели, которая способна не только соотносить соединение
к агонистам или антагонистам, но и качественно оценивать выявляемую
активность.
Текущий контроль:
1. Какие виды молекулярного докинга существуют на сегодняшний день?
2. В чем принципиальное отличие жесткого и гибкого докинга?
3. Какую оценочную функцию можно использовать при докинге и
последующей дифференциации между агонистами и антагонистами
ГАМКА-рецептора?
4. Что подразумевается под понятиями модельное соединение (препарат)?
И есть ли необходимость в его использовании?
Рубежный контроль:
1. Какие методы используются для количественного анализа?
63
2. Какие сведения можно подчеркнуть исходя из хроматографического
анализа?
3. Как получить халкон?
4. Как в одну стадию получить флавон из ароилированных 2гидроксиарилметилкетонов?
5. Можно ли количественно оценить закономерности взаимосвязи
структура-активность?
6. Учитывает ли прогностическая программа механизмы взаимодействия
лиганд-рецепторов.
7. Какую оценочную функцию можно использовать при докинге и
последующей дифференциации между агонистами и антагонистами
ГАМКА-рецептора?
8. Что подразумевается под понятиями модельное соединение (препарат)?
И есть ли необходимость в его использовании?
Промежуточная аттестация:
1. Перечислите
структурные
особенности,
обуславливающие
антиоксидантные свойства молекул.
2. Каким образом происходит связывание активных форм кислорода,
например, с виниленовой кислотой.
3. Объясните разницу между понятиями валентные и деформационные
колебания.
4. Какие типы переходов электронов происходят в молекулах под
влиянием УФ-излучения?
5. Что такое хромофор, ауксохром. Приведите примеры и назовите их.
6. Под
влиянием
каких
факторов
происходят
батохромные
и
гипсохромные сдвиги максимумов полос поглощения?
7. Как отличаются между собой УФ-спектры флавонов и флавононов?
8. Как относятся между собой интенсивности полос поглощения
агликонов, монозидов и биозидов (дигликозидов).
64
9. Охарактеризуйте комплексы флавонолов и флавонов с алюминия
хлоридом.
10.Какие наблюдаются изменения в характере спектров поглощения
флавоноидов в присутствии алюминия хлорида.
11.Почему
спиртовые
растворы
многих
пентациклических
тритерпеноидов «прозрачны» в УФ-спектре.
12.Объясните
смысл
понятий
гомо-
и
гетерополисахарид.
Какие
моносахариды чаще встречаются в составе этих полисахаридов?
13.Охарактеризуйте физические свойства полисахаридов.
14.Какой принцип лежит в основе выделения полисахаридов из
растительного сырья и разделения их на отдельные фракции?
15.Как
устанавливают
моносахаридный
состав
водорастворимых
полисахаридов, пектиновых веществ и гемицеллюлоз.
16.Какие
системы
растворителей
чаще
используются
при
хроматографическом анализе агликонов и гликозидов флавоноидов.
17.Какие реакции лежат в основе определения типов замещения в ядре
флавона?
18.При
какой
аналитической
длине
волны
чаще
целесообразно
осуществлять количественный анализ флавоноидов?
19.Какую информацию дают УФ-спектры флавоноидов?
20.На
чем
основано
определение
гидроксигрупп
в
присутствии
диагностических добавок.
21.Какие методы используются для выделения и очистки флавоноидов из
растительного сырья?
22.Перечислите методы используются для количественного анализа
флавоноидов.
23.Какие методы используются для количественного анализа?
24.Какие сведения можно подчеркнуть исходя из хроматографического
анализа?
25.Как получить халкон?
65
26.Как в одну стадию получить флавон из ароилированных 2гидроксиарилметилкетонов?
27.Можно ли количественно оценить закономерности взаимосвязи
структура-активность?
28.Учитывает ли прогностическая программа механизмы взаимодействия
лиганд-рецепторов.
29.Какую оценочную функцию можно использовать при докинге и
последующей дифференциации между агонистами и антагонистами
ГАМКА-рецептора?
30.Что подразумевается под понятиями модельное соединение (препарат)?
И есть ли необходимость в его использовании?
66
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА:
Основная литература
1. Определение
строения
органических
соединений.
Таблицы
спектральных данных М.: БИНОМ, 2009
2. Государственная Фармакопея РФ. 12 изд. Ч.1. М.: МЗ РФ, 2007
3. Фармакогнозия. Атлас: учеб. пособие в 3-х - т + [Электронный ресурс].
- Режим доступа: www.pfarma.studmedlib.ru М.: ГЭОТАР-Медиа, 20072010
4. Европейская фармакопея 7.0 том 1 Совет Европы Страсбург, 01/2011
5. Европейская фармакопея 7.0 том 2 Совет Европы Страсбург, 12/2011
Дополнительная литература
6. Функциональный анализ органических лекарственных веществ
Воронеж: ВГУ, 2007
7. Основы органической химии лекарственных веществ М.:Мир;
БИНОМ,2007
Статьи из журналов
8. Известия высших учебных заведений. Северо– кавказский регион.
Естественные науки
9. Растительные ресурсы
10.Химия природных соединений (Khimiia prirodnykh soedinenii)
11.Химия растительного сырья
Электронные образовательные ресурсы
12.Органическая химия. [Электронный ресурс] сост. Н.Ф. Тюкавкина. –
М.: Русский врач, 2005. – (Электронная библиотека для высшего мед. и
фармац. образования). – 1 электрон. оптич. Диск
13.Фармакогнозия. Атлас: учебное пособие: в 3-х томах. - М. : ГЭОТАРМедиа, 2010. - Т. 1. - 192 с. : ил. – [Электронный ресурс]. - Режим
доступа: www.pfarma.studmedlib.ru
14.Фармакогнозия. Лекарственное сырьё растительного и животного
происхождения : учеб. пособие / под ред. Г. П. Яковлева. - 2-е изд.,
испр. и доп. - СПб. : СпецЛит, 2010. - 863 с. : ил. – [Электронный
ресурс]. - Режим доступа: www.pfarma.studmedlib.ru
15.Фармакогнозия. Тестовые задания и ситуационные задачи : учеб.
пособие для студентов мед. вузов / Н. В. Бобкова[ и др.] ; под ред. И. А.
Самылиной. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2011. - 288 с. : ил. – [Электронный
ресурс]. - Режим доступа: www.pfarma.studmedlib.ru
67
Учебное издание
Э.Т. Оганесян, И.И. Селина, С.Л. Аджиахметова
Методические рекомендации по освоению дисциплины
«Химия природных соединений и их синтетических аналогов»
образовательная
программа
«фармацевтическая
фармакогнозия»
(подготовка научно-педагогических кадров)
Направление подготовки 33.06.01 фармация
Учебный план 140402_78-123(4)-3486
Технический редактор
Подписано к печати «____» ___________ 201_ г.
Формат 60х84, 1/16, бумага писчая, белая
Усл. Печ. л.______
Уч.- изд. л._____ Тираж _____ экз. Заказ _____
Пятигорский медико-фармацевтический институт –
филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава Росии
357532, г. Пятигорск, проспект Калинина, 11
68
химия,