фгбу «научный центр клинической и экспериментальной
реклама
ФГБУ «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР КЛИНИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ» СО РАМН ОАО «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЦЕНТР «АЛТАЙ» На правах рукописи Медведев Владимир Сергеевич РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИАЛЬДЕГИДДЕКСТРАНОВ ОКИСЛЕНИЕМ ДЕКСТРАНОВ ПЕРМАНГАНАТОМ КАЛИЯ 05.17.08 – Процессы и аппараты химических технологий Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель канд. техн. наук, доцент Певченко Б. В. Бийск – 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 5 ГЛАВА 1 АНАЛИЗ ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ ПО ДЕКСТРАНАМ И ПОЛИАЛЬДЕГИДДЕКСТРАНАМ. ...................................................................... 9 1.1 Актуальность использование полиальдегиддекстранов для получения фармацевтических препаратов............................................................................... 9 1.2 Декстраны и способы их получения. ............................................................ 10 1.3 Производственная линия получения клинического декстрана .................. 18 1.4 Методы получения полиальдегиддекстранов окислением декстранов ..... 21 1.4.1 Окисление декстранов йодной кислотой и периодатами щелочных металлов............................................................................................... 21 1.4.2 Окисление декстранов γ–излучением ........................................................ 24 1.4.3 Окисление декстранов перманганатом калия ........................................... 26 1.5 Молекулярная структура и механизм реакции получения ПАД................ 28 1.6 Аналитические методы определения содержания количества карбонильных групп в полиальдегиддекстранах ............................................... 34 ГЛАВА 2 РАСЧЕТ КИНЕТИЧЕСКИХ И ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПРОЦЕССА ОКИСЛЕНИЯ ДЕКСТРАНА ПЕРМАНГАНАТОМ КАЛИЯ ............................................................................. 37 2.1 Определение термодинамических параметров модели окисления декстрана перманганатом калия. ......................................................................... 37 2.2 Определение кинетических параметров модели окисления декстрана перманганатом калия ............................................................................................ 41 2.3 Влияние высокой молекулярной массы декстрана на параметры модели окисления декстрана перманганатом калия ....................................................... 43 ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОЦЕССА ОКИСЛЕНИЯ ДЕКСТРАНА В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ. ................. 48 3 3.1 Определение влияющих параметров в контрольных технологических точках процесса получения ПАД ........................................................................ 49 3.2 Приготовление клинических декстранов, ПАД и конъюгатов ПАД с 2,4–динитрофенилгидразином и флуоресцеином ........................................... 50 3.3 Определение содержания альдегидных групп в ПАД................................. 53 3.4 Определение времени полуреакции процесса окисления декстрана. ........ 58 3.5 Определение количества окислителя (KMnO4) в реакции получения ПАД ..................................................................................................... 62 3.6 Определение температурного режима реакции окисления декстранов перманганатом калия ............................................................................................ 65 3.7 Определение режима кислотности реакции окисления декстранов перманганатом калия ............................................................................................ 71 3.8 Физико–химический анализ структуры и состава декстранов, полиальдегиддекстранов и их конъюгатов (ИК–спектроскопия, УФ– спектроскопия, ПМР, ЯМР 13С, ВЭЖХ) ............................................................ 76 3.9 Очистка продуктов реакции ПАД с флуоресцеином .................................. 86 ГЛАВА 4 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ОКИСЛЕНИЯ ДЕКСТРАНА В УСЛОВИЯХ ОПЫТНО–ПРОМЫШЛЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА .............. .90 4.1 Определение оптимальных параметров процесса окисления декстрана в промышленном реакторе. .................................................................................. 91 4.2 Определение зависимостей окисления декстрана перманганатом калия в условиях промышленного реактора ................................................................. 96 4.3 Очистка ПАД от диоксида марганца фильтрованием ................................. 99 4.3.1 Описание исследуемой среды…………….……………………….……..99 4.3.2 Описание экспериментальной установки фильтрования…………......100 4.3.3 Методика проведения экспериментов по фильтрации диоксида марганца………………………………………………………………………..102 4.3.4 Результаты экспериментальных исследований процесса фильтрации диоксида марганца…………..……………………………..…....104 4 4.4 Рекомендации по выбору аппаратурно–технического исполнения производственной линии получения ПАД. ...................................................... 106 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ............................................................ 110 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................. 111 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................... 112 Приложение…………………………………………………………………….129 5 ВВЕДЕНИЕ В современной медицине широкое применение нашли препараты на основе декстранов – природных полисахаридов биологического происхождения. К ним относят сульфат декстрана, диэтиламиноэтилдекстран, комплекс железо-декстран, гидрогели на основе декстрана. В качестве плазмозамещающих препаратов в клинической практике используют водные растворы декстранов: реополиглюкин, полиглюкин и др. В настоящее время одним из перспективных веществ на основе декстрана для создания новых фармацевтических препаратов являются окисленные декстраны, а именно полиальдегиддекстран (ПАД). Разработка технологии получения ПАД способствует решению задач создания высокотехнологичного отечественного промышленного фармацевтического комплекса и повышения лекарственной независимости страны, определенной федеральной целевой программой «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу». Наибольшее применение в практике получения полиальдегиддекстранов получили два метода: химический – с использованием периодатов щелочных металлов, и физический – с применением жесткого гамма-излучения. Основными недостатками существующих процессов окисления являются: необходимость применять трудозатратные процессы очистки конечного продукта от неорганических йодпроизводных, наличие которых ограничивает применение ПАД в медицине, нестабильность структуры получаемых физическим методом полисахаридов. Учитывая недостатки существующих методов синтеза ПАД, разработка нового метода получения ПАД и создание технологии окисления декстранов для получения конкурентоспособных фармацевтических препаратов являются актуальными задачами. Исследования по разработке технологии получения полиальдегиддекстранов проводились в рамках реализации Федеральной целевой 6 программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007 2012 годы» по государственному контракту № 16.522.12.2001 «Разработка технологии и создание опытного производства окисленных декстранов». Цель исследования – разработка технологии окисления декстранов при применении перманганата калия в качестве окислителя. Задачи исследований: 1. Исследовать закономерности процесса окисления декстранов перманганатом калия. 2. Разработать методику оценки качества получаемого окисленного декстрана. 3. Изучить влияние технологических параметров процесса окисления декстранов (количество окислителя, температура, рН) на свойства получаемых ПАД. 4. Определить технологические режимы процесса окисления декстранов в условиях опытно-промышленного производства и разработать практические рекомендации по применению результатов работы в производстве ПАД. Объект, предмет и методы исследования. Объектом исследования является процесс окисления декстранов перманганатом калия. Предметом исследования являются параметры, влияющие на эффективность окисления (температура, рН, количество окислителя). В процессе выполнения работы были использованы экспериментальные и расчетно-аналитические методы, методы теоретического и компьютерного моделирования. Научная новизна работы: 1. Для получения ПАД научно-обосновано и впервые использован в промышленном производстве в качестве окислителя перманганат калия. 2. Установлены зависимости выхода ПАД и количества окисленных групп в ПАД от технологических параметров процесса окисления. 7 3. Разработана теоретическая модель процесса окисления ПАД, учитывающая различие в энергиях окисления глюкозных колец. Теоретическая и практическая значимость: 1. Разработана методика определения содержания альдегидных групп для оценки качества получаемых ПАД. 2. Разработан способ окисления декстрана, который позволил обеспечить требуемое качество продукта с заданной производительностью. 3. Разработана аппаратурно-технологическая схема производства ПАД. 4 Разработаны и внедрены в опытно-промышленное производство окисленных декстранов ОАО «ФНПЦ «Алтай» практические рекомендации по получению ПАД. 4. Результаты противотуберкулезного работы положены лекарственного в препарата основу в при рамках создании реализации федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» по государственному контракту 14.N08.12.0007 «Доклинические исследования противотуберкулезной фармацевтической композиции на основе коньюгата гидразида изоникотиновой кислоты и декстрана». Положения, выносимые на защиту: 1. Зависимости производительности процесса окисления и качества ПАД от технологических параметров. 2. Способ окисления декстрана перманганатом калия для получения ПАД. 3. Теоретическая модель процесса окисления декстрана, учитывающая различие в энергиях окисления глюкозных колец декстрана и высокую молекулярную массу объекта. 4. Методика определения содержания альдегидных групп для оценки качества получаемых ПАД. Личный вклад автора. Проведение экспериментальных исследований и теоретического моделирования процесса окисления декстранов, обработка полученных данных разработка плана исследований, обсуждении результатов, 8 формулировка выводов, подготовка публикаций по теме диссертационной работы. Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались на IIIей Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Россия, г. Белгород, 2010 г.), VII-й Всероссийской научно-практической конференции «Управление качеством образования, продукции и окружающей среды» (Россия, г. Бийск, 2013 г.), кафедре «ТГВ ПАХТ» БТИ АлтГТУ, НТС ОАО «ФНПЦ «Алтай», общих семинарах ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН. Публикации. Всего по теме диссертации опубликовано шесть печатных работ, в том числе один патент РФ, и три статьи в изданиях, входящих в перечень рецензируемых изданий и журналов. Представленная диссертационная работа автора содержит ряд материалов, которые выполнены совместно со Шкурупием В.А., Жарковым А.С., Троицким А.В., Глазевым Д.Ю., научным руководителем Певченко Б.В. и др. Автор выражает признательность за содействие в проведении диссертационных исследований и рекомендации при написании диссертации соавторам публикаций. 9 ГЛАВА 1 АНАЛИЗ ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ ПО ДЕКСТРАНАМ И ПОЛИАЛЬДЕГИДДЕКСТРАНАМ 1.1 Актуальность использования полиальдегиддекстранов для получения фармацевтических препаратов Областями активных разработок в тематике создания фармацевтических субстанций на основе ПАД являются: создание новых наногелей и препаратов со свойствами адресной доставки лекарств. Области применения ПАД обширны и включают в себя как методы лечения, так и диагностику заболеваний. Например, в этих целях может инкапсулированными использоваться люминесцентными модифицированный красителями (CdSe декстран – ZnS) с для последующей биологической маркировки. ПАД могут применяться для создания препарата с оксидом железа в целях замены дорогостоящих и токсичных маркеров для томографических исследований. Методики создания различных наногелей на основе декстрана принципиально схожи и состоят из трёх основных этапов: активации декстрана окислением, взаимодействия активированного декстрана с линкером, выделения геля в свободной форме. Процесс получения лекарственных препаратов с адресными свойствами можно разделить на несколько основных этапов: 1. Активация декстрана – обычно процесс заключается в формировании свободных альдегидных групп в составе молекулы декстрана её окислением. Другой способ активации заключается во введении в состав молекулы декстрана активных групп с помощью линкера. Иногда эти методики совмещают. 2. Присоединение лекарственного препарата к активированной молекуле ПАД. Зачастую этот процесс проходит селективно по месту активации и не сопровождается образованием побочных продуктов. 3. Выделение образовавшегося лекарственного препарата. Лекарственные препараты со свойствами адресной доставки имеют невысокую устойчивость 10 в свободной форме и требуют выделения в инактивированной форме. Большое внимание к ПАД как к возможно новому препарату для создания лекарственных форм с направленным действием обусловлено его уникальными свойствами. ПАД, как структурный аналог декстрана не проявляет свойств аллергена и легко перерабатывается в организме. Наночастицы гелей на основе ПАД не отторгаются тканями человека, а возможность варьирования молекулярной массы исходных молекул позволяет увеличить направленное действие препарата. 1.2 Декстраны и способы их получения Декстраны – представители гомополимеров целлюлозы с преимущественным содержанием α–(1–6) связей (50–97) % [1]. На рисунке 1.1 показана структура части основной цепи декстрана, содержащей разветвление на 2, 3 и 4 атомах углерода глюкозных циклов с образованием ответвлений α–(1–2), α–(1–3), α–(1–4) боковых цепей соответственно. Степень и характер ветвления цепи полимера в основном зависит от штамма бактерий–продуцентов [2, 3]. Способность синтезировать содержащую декстран слизистую массу из сахарозы была открыта Луи Пастером в 1861 г. у бактерий, позже названных «Leuconostoc mesenteroides». В дальнейшем способность синтезировать декстран была обнаружена у штаммов Streptococcus и некоторых других [4, 5]. Наиболее изучены среди известных образцов декстрана фракции, полученные от штамма бактерий Leuconostroc mesenteroides (в частности Leuconostroc mesenteroides NRRL B–512(F)), что обусловлено коммерческой доступностью препарата и важностью для медицинского применения ввиду высокого содержания α–(1–6) связей [6]. Современный процесс получения коммерческих декстранов заключается в кислотном гидролизе неорганическими кислотами нативных декстранов, полученных из продуктов жизнедеятельности бактерий, и дальнейшем фракционировании водорастворимых фаз в целях получения чистых продуктов с заданной средней молекулярной массой (МW) [7]. В таблице 1 11 приведены примеры составов цепей нескольких фракций декстрана, произведенных различными штаммами бактерий [8, 9]. Рисунок 1.1 – Структура декстрана Таблица 1 – Количество различных типов гликозидных связей в декстранах разных штаммов бактерий Продуцирующий штамм Виды α–связей, % Растворимость в воде 1→6 Lm NRRL B–512F + 95 5 Lm NRRL B–1355 + 54 46 Lm NRRL B–1299 + 68 Lm NRRL B–742 (фракция 2) – 87 S mutants 6715 + 64 36 S mutants GS5 + 70 30 S downei + 90 10 1→2 29 1→3 1→4 3 13 Предварительные данные о структуре декстранов можно получить методами оптического вращения, инфракрасной спектроскопии и в реакциях 12 окисления периодатами щелочных металлов по методу Смитта [10], а более детальные структурные данные применением реакции метилирования [11]. Процесс заключается в метилировании гидроксильных групп декстранов в присутствии йодистого метила с предварительной их активацией метилсульфонилметилом натрия (рисунок 1.2). 1. NaCH2-SO-CH3 2. CH3I O HO HO OH O O H3CO H3CO H+/H2O H3CO O OH O NaBH4 H3CO H3CO H3CO OH CH2OH OCH3 O O H3CO H3CC O CCH3 OCH3 OH CH2OH O CH2OCCH3 OCH3 H3CO OCH3 ГЖХ-МС OCCH3 H3CCOH2C O O Рисунок 1.2 – Анализ декстрана реакцией метилирования Метилированные декстраны полностью гидролизуются неорганическими кислотами в соответствующие различные моносахариды, которые далее восстанавливаются боргидридом натрия и переацетилируются ангидридом уксусной кислоты. Полученные ацилпроизводные моносахаридов разделяются методом газовой хроматографии и идентифицируются по времени удержания. В частности, комбинированная капиллярная газожидкостная хромато–масс спектрометрия (ГЖХ–МС) является эффективным методом для определения структуры декстрана [12, 13]. Помимо выше перечисленных методов, данные о структуре могут быть получены с использованием деградирующих ферментов, 13 тонкослойной хроматографии, ВЭЖХ и ЯМР–спектроскопии 13С [14, 15]. Однако при использовании таких методов необходимо проводить трудоёмкую химическую модификацию декстранов и расщепление на составляющие компоненты, подразумевающие необратимое разрушение исследуемого образца. Применение физико–химических методов ЯМР– и ИК–спектроскопии позволяет получить необходимые структурные данные без модификации или разрушения образца. Более того, метод ЯМР, по сравнению с прочими методами анализа, дает более подробную информацию о структуре полисахарида [16, 17]. Для ЯМР–спектров, снятых в растворе дейтерированного растворителя ДМСО– D6, химические сдвиги атомов водорода и углерода глюкозного цикла декстрана, имеющего α–(1–6) гликозидную связь, имеют следующие значения: протоны гидроксильных групп, находящиеся у соответствующих атомов углерода 4.10– 4.12 м.д. (OH2), 4.51–4.52 м.д. (OH3) и 4.63–4.64 м.д. (OH4) [18, 19]. В спектре ЯМР–13С находятся шесть сигналов, соответствующие углеродным атомам глюкозных циклов основной цепи декстрана. Атомам углерода соответствуют следующие значения химических сдвигов: С1 – 98.9, С2 – 72.5, С3 – 74.1, С4 – 71.0, С5 – 71.1, С6 – 67.1 [20]. В дополнение к сигналам основной цепи, при наличии высокого содержания боковых цепей в структуре, могут быть установлены и сигналы разветвлений. На ЯМР–спектре декстрана, полученного от штамма бактерий Lm NRRL B–512F, помимо химического сдвига α–(1–6) атома углерода, есть также два малоинтенсивных сигнала при 84,4 м.д. и 100,5 м.д., принадлежащие атомам углерода С3 и С1 связи α–(1–3) соответственно. Ранее с использованием метода на основе реакции метилирования в декстране, полученном от штамма бактерий Lm NRRL B–512F, было установлено наличие 5 % связей α–(1–3) [21]. Определить среднюю молекулярную массу полимера можно методами ультрацентрифугирования, малоуглового рассеяния нейтронов, рассеяние лазерного излучения, оптического рассеяния и вискозиметрии [22]. Метод концевых групп и осмометрический мембранный метод дают информацию о величине средней молекулярной массы полимера. Нативный декстран, как 14 правило, обладает высокой средней молекулярной массой–порядка (0,5–9)·106 кДа и высокой полидисперсностью [23, 24]. Полидисперсность нативного декстрана, полученного от одного штамма бактерий, возрастает вместе с молекулярной массой, что обусловлено увеличением количества боковых цепей. Наибольший интерес для исследований представляет распределение фракций с различными молекулярными массами, полученными от одного штамма бактерий [25]. Такие данные можно получить с применением гель–проникающей хроматографии (ГПХ, SEC) с детектором молекулярной массы. Время удержания фракции напрямую зависит от молекулярной массы молекул в ней и увеличивается пропорционально. На рисунке 1.3 показана ГПХ хроматограмма частично гидролизованного неорганическими кислотами нативного декстрана, полученного от штамма бактерий Lm NRRL B–512F. Рисунок 1.3 – Распределение фракций нативного декстрана по молекулярной массе, полученное методом гельпроникающей хроматографии Физико–химические свойства, такие как вязкость или величина оптического вращения, водных растворов декстрана имеют сложный характер и в значительной степени зависят от молекулярной массы растворенного декстрана и концентрации раствора. Молекулы декстрана с молекулярной массой ниже 2000 Да имеют близкое к линейному строение полимерной цепи, вследствие чего для них зависимость вязкости от концентрации раствора линейна [26]. 15 Исследования методом малоуглового рентгеновского излучения растворов декстранов с молекулярной массой более 2000 Да показали, что молекулы в них находятся в виде глобул и не сочетаются между собой механически [27, 28]. При определённых концентрациях разветвлённые молекулы декстрана с молекулярной массой более 20 кДа переплетаются между собой, образуя четвертичные структуры в виде более плотных глобул. Основное следствие из возникновения процесса межмолекулярного механического взаимодействия молекул декстрана друг с другом это появление у растворов с высокой концентрацией свойств неньютоновских жидкостей [29, 30]. Одним из простых методов оценки размеров молекул декстрана в растворе является радиус инерции молекулы. С увеличением молекулярной массы вещества возрастает и радиус инерции, в тоже время повышение концентрации вещества без изменения его молекулярной массы или появление примесей снижают его радиус инерции [31]. Нативные декстраны, ввиду особенностей нерегулярного строения их полимерной цепи, в основном аморфные. Тем не менее удается получить пластинчатые монокристаллы сокристаллизацей из растворов вода/полиэтиленгликоль при Т = 120–200 ОС [32]. Исследование монокристаллов декстрана комбинированными методами электронной и рентгеновской дифракции показывает, что элементарная ячейка состоит из двух остатков глюкопиранозных колец от двух антипараллельно расположенных полимерных цепей [33]. Как было отмечено выше, структурное разнообразие декстрана обусловлено многообразием производящих декстран штаммов бактерий. Свойства образцов весьма разнообразны и зависят от строения полимерной цепи. Появление в структуре полимера α–(1→6) гликозидной связи, как правило, увеличивает конформационное разнообразие полимерной цепи в растворе и, как следствие, повышает мобильность и растворимость в полярных диметилсульфоксид, диметилформамид, этиленгликоль) жидкостях (вода, [34, 35]. Средняя молекулярная масса фракции декстрана также может влиять на время растворения. Помимо этого, растворимость декстрана также зависит от побочных гетерофазных процессов. Так, в 10 %–м водном растворе декстрана со средней 16 молекулярной массой 40 кДа при хранении на воздухе будет появляться осадок, что указывает на нестабильность раствора [36]. Процесс образования осадка или золирования обусловлен адсорбцией молекул декстрана на границе раздела фаз воздух–жидкость. Локальное увеличение концентрации декстрана в растворе и его взаимодействие с кислородом воздуха приводит к возникновению микроскопических нерастворимых частиц. Стабилизация водных растворов декстрана возможна кипячением или добавлением ДМСО [37]. Растворы декстранов, как и растворы простых моносахаров, проявляют оптическую активность и способны вращать плоскость поляризованного света. Основными факторами, влияющими на оптическую активность, являются растворитель и структурные особенности полимерной цепи конкретного образца [38, 39]. При температуре 25 О С в воде и формамиде отклонение пучка поляризованного света находится в пределах от +195 до +201 ОС, и от + 208 до +233 и О С соответственно. Для оптически активных декстранов концентрация состав раствора могут быть определены с использованием метода мутаротации [40]. Важным аспектом при рассмотрении химических свойств декстрана являются исследования, в первую очередь, реакционной способности экваториально расположенных групп НО–2, НО–3 и НО–4. Это связано с большим содержанием α–(1–6) гликозидных связей в составе молекулы декстрана [41, 42]. Небольшой вклад в химические процессы с участием декстрана вносят первичные гидроксильные группы (около 1,5 %), это значение несколько увеличивается со снижением средней молекулярной массы и повышением числа невосстанавливающихся концевых групп [43]. Для определения реакционной способности вторичных гидроксильных групп на первом этапе проводят реакцию тритилирования для блокады первичных и концевых гидроксильных групп, а полученный продукт вводят в реакцию частичного метилирования [44], исследования по которому выявили следующие относительные реакционные способности экваториально расположенных гидроксильных групп НО–2, НО–3 и НО–4 – k2 : k3 : k4 = 8 : 1 : 3,5. У декстрана, как и у других глюканов, реакционная 17 способность НО–2 к алкилирующим агентам выше, чем у НО–3 и НО–4. Это объясняется большей кислотностью группы НО–2 благодаря близко расположенному аномерному центру [45, 46]. Практические результаты по замещению остатком метилового эфира гидроксильных групп в декстране хорошо сочетаются с теоретическими данными только в случае рассмотрения одного замещения на одну глюкозную единицу. Так, замещение гидроксильных групп при втором и четвертом атомах углерода приводит к увеличению константы реакции для третьего атома углерода в 5,2 раза. В случае, если гидроксильные группы НО–2 и НО–4 ионизированы, реакционная способность НО–3 снижается [47, 48]. Данные о реакционной способности могут применяться на практике для реакций и реагентов родственного типа, в случае же использования других веществ или реакций необходима их корреляция. Процесс ацилирования, в отличие от алкилирования, является термодинамически контролируемый за счет миграции заместителя [49]. Исследования частичного ацилирования декстрана ангидридом уксусной кислоты в пиридине показали, что константы реакции для гидроксильных групп НО–2, НО–3 и НО–4 имеют порядок k2 > k3 = k4 [50, 51]. Такой порядок реакционной способности аналогичен реакции метилирования с небольшим отличием для констант k3 и k4. Однако проведение процесса в водном растворе щелочи приводит к усреднению и выравниванию показателей реакционной способности для всех трёх гидроксильных групп, что может свидетельствовать о миграции ацильного остатка [52, 53]. Исследование распределения сульфатных групп в частично сульфатированных декстранах показало аналогичную для реакции ацилирования зависимость реакционной способности гидроксильных групп [54, 55]. При этом процент дизамещённых пиранозных колец замещения [56]. был достаточно высок даже при низкой степени 18 1.3 Производственная линия получения клинического декстрана Разработка промышленной технологии получения декстранов способом ферментации для дальнейшего использования в медицинских целях относится к 50–м годам XX века [57–59]. Основной отличительной чертой первых технологий получения декстрана для медицины было использование кислотного гидролиза для снижения молекулярной массы нативного декстрана, что приводило к образованию многочисленных биологически активных побочных продуктов [60]. Современные технологии получения декстранов со средней молекулярной массой 35 и 60 кДа в большей мере удовлетворяют требованиям безопасности медицинских препаратов, чем продукты, полученные ранее. За более чем полувековую историю технология получения декстранов претерпела значительные изменения и нововведения [61, 62]. Повышение качества продукта и производительности промышленных линий было достигнуто благодаря введению новых материалов (полиионитные ионообменные очистные колонки) [63], оптимизации технологий, вводу новых методов гидролиза нативных декстранов (ферментативный, ультразвуковой, тепловой) [64, 65]. Масштабной промышленной технологии получения ПАД не существует, в связи с чем на сегодняшний момент исследовательский получение лабораторный ПАД позиционируется метод. Существуют как научно– многочисленные исследования в области процессов окисления декстранов [66, 67], но работы по созданию технологии получения ПАД отсутствуют. Физические свойства ПАД (вязкость, плотность и пр.) с низким содержанием альдегидных групп схожи с таковыми для декстранов [68], вследствие чего определенные блоки производственной линии получения декстранов могут использоваться для создания производственной линии выпуска ПАД. Рассмотрим более детально производственную линию получения декстрана с использованием ферментирующих бактерий в качестве продуцентов основного продукта [69]. В основу ее построения заложен принцип разделения на функциональные блоки. Так как конечный продукт должен обладать высокой 19 степенью чистоты от химических примесей и быть стерильным [70], необходимо территориального разобщить блоки производственной линии (рисунок 1.4). Разделяют этапы, отвечающие за синтез продукта (грязный этап – сырьевая емкость, проточный стерилизатор, ферментёр, осадительная емкость, гидролизер и фильтр) и его очистку (чистый этап – испаритель, ёмкость для растворения, фильтр, стабилизационная ёмкость, распылительная сушка, линия фасовки) [71]. Рисунок 1.4 – Схема производственной линии получения декстрана Помимо этапов синтеза продуктов и их очистки, технология производства декстрана содержит этап фракционирования (фракционная емкость, ёмкость для растворения, ионообменная колонка). Фракционирование декстранов на производстве проводят с применением спиртов, в частности метилового, как наиболее доступного, однако это предъявляет повышенные требования к обеспечению техники безопасности [72, 73]. 20 Процесс производства клинического декстрана начинается с приготовления питательной среды для бактерий–продуцентов. В промышленную емкость в необходимых пропорциях помещают сахарозу, воду, минералы и витамины, перемешивают при нагревании водяным паром и далее стерилизуют на двупластинчатом проточном стерилизаторе. Часть питательной среды (примерно двадцатая часть от общего объема) используется для поддержания колонии бактерий в инкубаторе, остальная часть раствора направляется в ферментер и смешивается с бактериальным материалом для синтеза нативного декстрана. Затем полученную биомассу пропускают через осадитель для отделения декстрана от биоматериала. Грязный нативный декстран подвергают кислотному гидролизу с использованием водного раствора соляной кислоты [74]. Для стабилизации в процессе гидролиза и дальнейшей лучшей очистки в гидролизер добавляют кизельгур [75]. Последующая первичная фильтрация позволяет получать достаточно чистый декстран без содержания биологического материала. Для выделения декстранов с молекулярной массой (35 и 60 кДа) отфильтрованный раствор прогоняют через фракционную емкость. Разделение декстранов на отдельные фракции достигается за счет создания градиента концентрации метилового спирта [76, 77]. Низкомолекулярные фракции (менее 20 кДа) после разделения возвращаются для регенерации метилового спирта, а высокомолекулярные (свыше 100 кДа) снова проходят через гидролизер со следующей партией [78]. Полученные клинические декстраны пропускают через ионообменную колонну, после чего чистый раствор подвергают финальной ультратонкой фильтрации и стабилизации. Сухой клинический декстран производят из раствора, применяя распылительную сушку. Для разделения конечного продукта по степени дисперсности используют систему двухкаскадных циклонов [79–81]. 21 1.4 Методы получения полиальдегиддекстранов окислением декстранов 1.4.1 Окисление декстранов йодной кислотой и периодатами щелочных металлов Наиболее распространен среди методов получения ПАД химический с использованием йодной кислоты или периодатов щелочных металлов [82, 83]. Для проведения процесса окисления непосредственно перед ним готовят водный раствор йодной кислоты растворением кристаллической йодной кислоты в воде. Его нельзя хранить более 24 ч., вследствие разложения окислителя в водных растворах и изменения его качественных характеристик. В случае применения несвежеприготовленного раствора окислителя, его титруют и фильтруют при необходимости [84, 85]. Наиболее важный момент при проведении реакции – правильный выбор окислителя и температуры. При использовании периодатов требования к приготовлению растворов менее жесткие, так как водные растворы солей йодной кислоты достаточно стабильны при комнатной температуре, а первичные растворы солей можно использовать в более концентрированном виде. Наиболее часто используют периодат натрия (NaIO4) ввиду его коммерческой доступности и хорошей растворимости [86]. Использование периодатов натрия в качестве окислителя удобно при проведении реакций в водных или слабых буферных растворах [87], а также в случае применения методов титрования для определения содержания альдегидных групп полученных продуктов [88]. Порядок смешения компонентов и скорость подачи не влияют на количество альдегидных групп, строение и конечный выход продуктов реакции. Количество реагентов определяют теоретически исходя из ожидаемого выхода целевого продукта, из расчета расхода двух молей окислителя на один окисленный глюкозный остаток (закономерность может немного нарушаться при использовании декстрана с высокой степенью разветвленности). Процесс проводят при постоянном перемешивании. Производные йодной кислоты 22 фоточувствительные вещества, поэтому реакцию окисления рекомендуется проводить в изолированной от света стеклянной посуде [89, 90]. Процесс занимает от 4 до 24 ч., в зависимости от температуры реакционной среды и количества окислителя. Глубину прохождения реакции контролируют методом ЯМР, фотометрии или по количеству выделяемой углекислоты [91, 92]. Отдельным и наиболее важным этапом получения ПАД с использованием йодной кислоты или периодатов щелочных металлов является очистка. В большинстве случаев ПАД используется в качестве матриц для переноса лекарственных и диагностических веществ в органы животных, поэтому необходима высокая степень их чистоты от биологически активных побочных йодсодержащих продуктов. Наиболее эффективными методами отчистки остаются анионообменные смолы и мембраны для ультрафильтрации [93]. Высокая реакционная способность позволяет использовать анионообменные смолы средне– и слабоосновных марок Dowex I, Dowex II, АН–3 или их аналоги [94, 95]. Активация смолы проводится по стандартной методике с применением водных растворов хлорида калия или натрия. Количество смолы определяется как полуторакратный избыток емкости смолы по отношение к количеству используемого окислителя. Для отчистки продуктов реакции окисления декстрана со средней молекулярной массой 2–15 кДа рекомендуется применять мембраны с пропускной способностью на 30–40 % меньше средней молекулярной массы продуктов, а для продуктов со средней молекулярной массой 20–100 кДа параметр сепарации молекул может быть уменьшен до 5–10 % от средней молекулярной массы очищаемых ПАД [96, 97]. В современных исследованиях достаточно полно описывается как классический процесс получения ПАД с использованием периодатов щелочных металлов [98] и его механизм реакции, так и усовершенствованные методы. В работе Davide Miksa с соавторами [99] при исследовании методом ЯМР процесса окисления декстрана периодатом натрия в водной среде показано образование одного моля диальдегида и одного моля муравьиной кислоты при использовании двух молей окислителя на один моль ангидрогликопиранозидной субъединицы. 23 Реакция протекает через последовательное ступенчатое образование двух эфиров с участием атомов кислорода периодат иона и атомов углерода пиранозного цикла декстрана. Первый из таких эфиров формируется в результате нуклеофильной атаки атомов кислорода периодат иона по вицинальным гидроксильным атомам углерода С2, С3 и С4, играющей решающую роль в разрыве С–С–связей пиранозного цикла и приводящей к образованию ациклического диальдегида [100, 101]. На второй стадии в реакции с образованием циклического эфира участвуют периодат ион, атом углерода альдегидной группы и соседний с ним. В результате разрыва С–С–связи образуется одна молекула муравьиной кислоты и конечный диальдегид, который находится в растворе в равновесии со своим циклическим аддуктом присоединения одной молекулы воды [102]. На двухступенчатый процесс окисления указывает двукратный расход периодата иона по сравнению с образованием муравьиной кислоты по приведённым кинетическим кривым. Также в статье было показано, что реакции протекает наиболее интенсивно в течение 10 ч., в дальнейшем кинетическая кривая скорости реакции асимптотически уменьшается. Скорость реакции окисления декстрана напрямую зависит от pH реакционной среды [103]. Как было показано в работе Е.В. Новиковой [104] с соавторами, конечное содержание альдегиных групп, приходящихся на моль декстрана, не зависит от pH среды, а только от соотношения количеств окислителя и полисахарида и одинаково как для реакций, проводимых в воде, так и в буферных растворах. Также было установлено, что pH среды влияет на соотношение количества 2,3– и 2,4–окисленных фрагментов в конечных продуктах. К примеру, при изменении pH буфера реакции с 1,9 на 5,6 содержание 2,3–окисленных фрагментов в продуктах увеличивается более чем в два раза (с 15 до 37 %), что в значительной степени влияет на строение конечных продуктов. Линейное изменение значения pH реакции приводит также к линейному изменению соотношения содержания 2,3– и 2,4–окисленных форм, что важно при проведении процесса в водной среде. 24 1.4.2 Окисление декстранов γ–излучением Помимо широко распространенного метода получения ПАД с применением химических окислителей, таких как периодаты щелочных металлов, известен радиационный метод окисления с использованием тормозного γ–излучения [105]. Для этого водные растворы декстрана различной концентрации облучают дозами (2,5–3,5 Мрад). Метод является стандартизованным и запатентованным и отличается высокой воспроизводимостью при получении ПАД с определённым содержанием альдегидных групп [106, 107]. Их количество в продуктах реакции окисления напрямую зависит от концентрации раствора декстрана, подвергшегося облучению, и экспозиции облучения [108]. Механизм разрыва пиранозных циклов декстрана с образованием высокореакционных альдегидных групп под действием излучения носит свободнорадикальный характер и сопровождается рядом цепных реакций. Считается доказанным, что первичный радикал с локализацией неспаренного электрона на атоме углерода С1 имеет следующие альтернативные пути превращения [109, 110]: 1. Изомеризация С1 с расщеплением связи С5–О или С2–С3 в ангидропиранозном цикле; превращение этого радикала по первому маршруту протекает под влиянием УФ–воздействия на радикалы по цепочке атомов С1 → С5 → С6 → СНО, одновременно с появлением формильного радикала возникает дезоксигруппа при атоме углерода С5; 2. Превращение радикала С1 по второму маршруту, изомеризация с расщеплением связи С2–С3 и образованием радикала винильного типа сопровождается, в конечном счёте, образованием разрыва в полимерной цепи. В работах отечественных исследователей было показано, что в облучаемых образцах декстранов первичные свободные радикалы образуются в основном по реакции между радикалом водорода (или гидроксирадикалом) и протоном оксиметиленового звена пиранозного кольца с его дальнейшим отрывом и образованием радикальной частицы декстрана и молекулы водорода (или воды) [111]. Гидратированный электрон не вносит вклада в разложение полимерной 25 цепи декстрана, если он не содержит альдегидных, кето– или карбоксильных групп, но захватывается гидроксилами полисахарида, в результате чего увеличивается время жизни такой частицы, и она может участвовать в реакциях восстановления первичных радикалов [112]. Второй немаловажный аспект радиационного механизма окисления декстранов – это образование вторичных радикалов (алильных, ацильных, формильных) – продуктов превращения первичных радикалов (алкильных или алкоксильных) по реакциям дегидратации (α– и β– элиминирование) и изомеризации при расщеплении связей С–О и С–С в ангидропиранозном цикле. Восстановление радикалов алильного типа объясняется образованием дезоксикетогрупп в составе облученных полисахаридов. По содержанию дезоксикетогрупп в анаэробно полученных образцах может быть оценена величина выхода радикалов алильного типа, способная достигать 10 % суммарного выхода разложения исходных соединений [113]. Присутствие кислорода в облучаемой системе отражается на процессах образования вследствие конкуренции за "Н" и "е" с макромолекулой и превращения макрорадикалов. Молекула кислорода реагирует с первичными и вторичными макрорадикалами в зависимости от того, успевают ли пройти реакции изомеризации или дегидратации первичных радикалов до того момента, как к ним диффундирует молекула кислорода. В реакциях радикалов с кислородом образуются органические пероксидные радикалы типа RO2. Образование альдегидных и карбоксильных групп в составе полимера – превалирующий процесс радиолитической модификации углеводов. Выход их существенно возрастает при переходе от облучения вакуумированных образцов к облучению в присутствии кислорода. Пероксидные радикалы образуются при оксигенации алильных радикалов. На долю процесса оксигенации алильных радикалов приходится до 50 % общего выхода разложения полимера [114, 115]. Однако при получении ПАД с использованием радиационного излучения имеют место пострадиационные эффекты и их влияние на живые организмы. Деструктивные процессы в облученных в присутствии кислорода ПАД 26 продолжаются и после прекращения облучения. В присутствии кислорода они протекают и в сухих препаратах, и в водных растворах. При хранении ПАД на воздухе, при температуре 22–25 О С, в образце накапливаются и распадаются пероксидные соединения (H2O2, ROOH, ROOR), протекают процессы разрыва полимерной цепи и образование межмолекулярных сшивок, низкомолекулярных кетосоединений и кислот, карбонильных и карбоксильных групп в составе полимерной цепи полисахарида. Так, в анализе лиофилизированного после облучения декстрана были обнаружены алкоксильные и два вида пероксидных радикалов, количество которых со временем хранения на воздухе увеличилось. В такой ситуации для получения стабильной и воспроизводимой формы ПАД в конечные продукты реакции необходимо добавлять акцепторы свободных электронов [116, 117]. 1.4.3 Окисление декстранов перманганатом калия Для эффективного использования ПАД в составе лекарственных препаратов исходный полиальдегиддекстран не должен содержать токсичных примесей и примесей, взаимодействующих с активным веществом лекарственного препарата, что приводит к снижению его активности. В приведённых выше методиках получения ПАД существуют недостатки, в частности при окислении декстрана периодатами щелочных металлов в получаемом продукте остаются высокореакционные йодсодержащие примеси, которые могут повлиять как на стабильность препарата, так на его свойства биологической активности. Окисление декстрана радиационным способом приводит к получению малостабильных продуктов, изменяющих свои свойства при хранении [118, 119]. Процесс окисления декстрана перманганатом калия схож с аналогичным процессом для периодатов щелочных металлов ввиду близости строения и химических свойств ионов MnO4– и IO4–. Различие химических свойств центральных атомов периодат и перманганат ионов приводит к появлению более сильных окислительных свойств у перманганата калия по сравнению с 27 периодатами щелочных металлов, что, в свою очередь, сказывается на строении продуктов реакции окисления. Процесс окисления полиспиртов перманганатом калия, так же как и периодатами щелочных металлов, сопровождается разрывом углерод–углеродной связи по месту реакции. В отличие от периодатов щелочных металлов реакция окисления полиолов перманганатом калия не останавливается на этапе образования альдегидных групп и может протекать дальше с образованием карбоновых кислот [120, 121]. Технически процесс проводят в 5–15 %–х водных (или водно–солевых) растворах декстранов со средней молекулярной массой 20–75 кДа. В качестве источников протонов в реакции используют водные растворы уксусной или муравьиной кислот концентрацией 5–35 % об. в количестве 0,5–2,0 % от исходного раствора декстрана. Для окисления применяют 0,5–10 %–й водный раствор перманганата калия в количестве 1–6 % от объема раствора декстрана. Реакцию проводят при температуре 80–100 ОС. По окончании реакции, о котором свидетельствует обесцвечивание раствора и прекращение выпадения осадка диоксида марганца, раствор фильтруют и осаждают продукт этиловым спиртом [122]. Такой способ получения ПАД позволяет получать чистый продукт без примесей органических побочных продуктов с невысоким содержанием альдегидных групп, однако при этом метод не дает возможность достигнуть высокого содержания альдегидных групп в продуктах увеличением количества вносимого в реакцию окислителя, так как это приводит к деструкции полимера. Оптимальная кислотность реакционной среды pH 3–5. Так как при уменьшении pH ниже 3 сопровождается частичной деструкцией полимерного остова декстрана, что снижает среднюю молекулярную массу и выход продуктов реакции, а увеличение pH до 5 и выше приводит к образованию манганат ионов и загрязнению конечных продуктов реакции [123, 124]. Способ окисления декстрана перманганатом калия для получения биологически активных субстанций изучается сравнительно недавно и поэтому требует дополнительных исследований, как механизмов реакции, так и получаемых продуктов. 28 1.5 Молекулярная структура и механизм реакции получения ПАД Декстраны, являясь производными глюкозы, могут быть рассмотрены как циклические полиспирты. Процесс окисления многоатомных спиртов солями йодной кислоты известен достаточно давно и протекает через присоединение молекулы йодной кислоты к двум вицинальным гидроксильным группам, приводя к расщеплению углерод–углеродных связей [125]: RCHOHCHOHHR’ + NaIO4 → RCHO + R’CHO + H2O + NaIO3 Окисление карбонильных соединений было объяснено [126, 127] на основании образования гем–диола – гидратированной формы карбонильной группы гликолиего вида >С(ОН)2. Эта гипотеза применима для результатов реакции окисления соединений типа RCHOHCHO, ведущих себя как α–гликоли. Было установлено, что механизм окисления α–гликолей йодной кислотой схож с аналогичным процессом для тетрацетата свинца, приводящим к расщеплению углерод–углеродной цепи и проходящим в три стадии. Первая стадия (рисунок 1.5) сопровождается этерификацией гидроксильной группы молекулой ортойодной кислоты (H5IO6 или HIO4·2H2O) с дальнейшим перераспределением электронной плотности углерод–углеродной связи в образовавшемся переходном комплексе, приводящим к её разрыву [128–132]. C OH C OH C O + H5IO6 - H2O C OH IO5OH4 C O - H2O C O O + HIO3 + H2O 2 IO4H3 Рисунок 1.5 – Механизм окисления многоатомных спиртов с расположением гидроксильных групп у соседних атомов углерода Механизм аналогичен окисления механизму декстрана окисления периодатами полиолов. щелочных Ввиду металлов конформационных особенностей расположения гидроксильных групп в пиранозном цикле периодат ион реагирует с атомами углерода с вицинальным расположением гидроксильных групп с разрывом С3–С4 или С3–С2 углерод–углеродных связей и образованием 29 альдегидных групп при С3, С4 и С3, С2 атомах углерода соответственно [133–135]. Также возможно дальнейшее взаимодействие альдегидной группы при атоме углерода С3, полученного диальдегида с образованием нового диальгегида, с расположением альдегидных групп при атомах углерода С2 и С4. Полученные в результате продукты содержат высокореакционноспособные альдегидные группы, способные вступать во внутримолекулярные реакции с пространственно близкими гидроксильными группами с образованием циклических лактолов различной структуры [131, 132]. При окислении декстрана со средней молекулярной массой 60 кДа различными количествами периодата натрия физико–химическими методами было установлено, что в полученных продуктах не содержатся свободные альдегидные группы. При анализе образцов методом ИК–Фурье–спектроскопии слабые сигналы альдегидной группы (1730 см–1) были обнаружены только у сильно окисленных образцов, что указывает на низкое содержание свободных альдегидных групп. В ЯМР–спектрах зафиксировать сигнал альдегидной группы (при ~ 9,7 м.д.) удавалось лишь на первых минутах реакции окисления, затем он исчезал. Данный факт объясняется взаимодействием альдегидных групп, полученных при окислении, и внутримолекулярных гидроксильных групп с образованием полуацеталей [133, Реакции 134]. между альдегидной и гидроксильной группами возможны как внутри окисленного пиранозного цикла, так и с близко расположенными соседними циклами. Исследования [135, 136] продуктов окисления декстрана периодатом натрия методом двумерного ЯМР показали возможность образования циклических лактолов I, II и III (рисунок 1.6). Для этого в диальдегиде Ia атом кислорода гидроксильной группы при атоме углерода С2 взаимодействует с атомом углерода альдегидной группы С4, а кислород гидроксильной групп соседнего пиранозного кольца при атоме углерода С4 реагирует с атомом углерода альдегидной группы С3 диальдегида с образованием циклического лактола Iб. В формировании лактолового кольца у продукта IIб взаимодействуя участвует с атом атомом углерода кислорода альдегидной группы при С2, гидроксильной группы соседнего 30 пиранозного цикла при атоме углерода С4, а также атом кислорода альдегидной группы при С2 и атом углерода С3 диальдегида IIа. Лактол IIIб образуется из фрагмента диальдегиддекстрана, полученного при окислении пиранозного кольца двумя молями окислителя, присоединением атома кислорода гидроксильной группы соседнего пиранозного цикла при атоме углерода С4 к атому углерода С2 диальдегида и атома кислорода альдегидной группы при С2 к атому углерода альдегидной группы С4 [137] соответственно. O O O OH O OH O O HO HO O OH Iа IIIа O OH O O O HO HO OH O HO Iб O O O O HO HO O O O HO OH O O IIа O HO O HO HO O O O O HO O O O O O HO HO O O OH O O HO IIб IIIб Рисунок 1.6 – Механизм образования циклических лактолов в диальдегиддекстранах: Iа – при С3, С4 атомах углерода, IIа – при С2, С3 атомах углерода, IIIа – при С2, С4 атомах углерода В водных растворах ПАД наряду с процессами внутримолекулярной циклизации с участием альдегидных и гидроксильных групп, приводящими к образованию циклических лактолов, возможен конкурирующий процесс гидратирования альдегидных групп, механизм которого сильно зависит от рН среды раствора. Так, исследования [138, 139] ПАД с расположением альдегидных групп при атомах углерода С2 и С4 с применением ЯМР–спектроскопии и квантовомеханических расчетов энергий образования гидратированных форм показали, что гидратированные формы II – IV (рисунок 1.7) энергетически более выгодны, чем негидратированная форма I. Математические расчеты показали, что среди гидратированных форм наиболее выгодно существование альдегидных групп в форме III, а наименее 31 выгодно – в форме альдоенола II. Таким образом, pH среды в которой был получен ПАД значительно влияет на конечную структуру продукта. При значении pH среды менее 5,34 в получаемом продукте полностью отсутствуют негидратированные формы альдегидных групп и преобладают в основном в виде гидратированной формы (III) и полуацеталей (IV). Содержание гидратированной формы III уменьшается в образцах, полученных с ростом pH реакционной смеси от 2,57 до 4,88. Форма альдоенола II может присутствовать в образцах ПАД, полученных при pH 2,57 – 5,34, и его количество увеличивается с ростом pH. O HO HO HO HO O 2H O 2 III -H2O O H2O H 2O O HO O IV O O I OH O O O HO HO HO O II Рисунок 1.7 – Формы гидратированого диальдегиддекстрана в водных растворах: I – негидратированная форма ПАД, II – альдоенол, III – гидратированная форма ПАД, IV – полуацеталь Способ окисления полисахаридов периодатами щелочных металлов был исследован Смитом с сотрудниками [140] и лег в основу широко применяемого аналитического метода определения структуры и состава полисахаридов. В настоящее время окисление периодатом применяется практически во всех случаях установления строения полисахаридов. Это объясняется простотой метода, небольшими затратами исследуемого вещества и ценностью получаемых данных. В результате полного окисления полисахарида периодатом расщепляются все α– гликольные группировки, причем расходуется эквимолекулярное количество окислителя. В зависимости от строения декстрана, средней молекулярной массы и характера линейности структуры возможно выделение некоторого количества муравьиной кислоты или формальдегида, при этом сам декстран превращается в максимально окисленный полиальдегид с нерасщепленными гликозидными 32 связями [141]. Процесс окисления проводят при температуре 22–25 О С в разбавленных водных растворах с pH, близким к нейтральному. Ход реакции контролируют, определяя через некоторые промежутки времени расход окислителя и появление в реакционной смеси формальдегида и муравьиной кислоты. Данные об изменении концентрации окислителя и количестве выделившейся муравьиной кислоты могут служить для оценки степени разветвленности полисахаридов, полученных из разных источников. Основные данные о строении исследуемого декстрана дает изучение образующегося в результате реакции полиальдегида. Для дальнейшего анализа полученный его полиальдегид восстанавливают боргидридом натрия, в процессе все альдегидные группы в структуре превращаются в гидроксильные. Слабая реакционная способность гидроксильных групп позволяет восстановленный полиальдегид подвергнуть кислотному гидролизу без последствий прохождения побочных реакций. Одно из главных преимуществ анализа полисахаридов по методу Смита – это возможность частичного гидролиза полигидроксильного производного. Поскольку гликозидные связи тех моносахаридных звеньев, циклическая форма которых разрушена окислением, превращаются в обычные ацетальные, их чувствительность к кислотам резко возрастает. Гидролиз серной кислотой позволяет полностью расщепить ацетальные связи, не затрагивая сохранившиеся гликопиранозидные. В результате кислотного гидролиза, наряду с низшими оксиальдегидами и полиолами, получаются и их гликозиды. Установление строения этих гликозидов дает сведения о последовательности моносахаридных звеньев, конфигурации гликозидных связей и их количестве [142]. Процесс окисления остатка глюкопиранозы протекает всегда одинаково, а продукты реакции зависят исключительно от положения заместителя в кольце. Так, при окислении глюкопиранозного остатка с заместителем во втором положении расходуется 1 моль периодата, и после восстановления и полного гидролиза образуется глицерин и D–глицериновый альдегид. Остаток глюкопиранозы с заместителем в положении 3 не окисляется периодатом и после гидролиза дает глюкозу. Из остатка глюкопиранозы с заместителем в положении 4 в этих 33 условиях образуется эритрит и гликолевый альдегид, а замещенный в шестом положении, также как и не содержащий заместителей, поглощает два моля окислителя с образованием 1 моля муравьиной кислоты и после восстановления и гидролиза дает глицерин и гликолевый альдегид. Таким образом, все указанные типы окисленных пиранозных колец можно обнаружить и различить между собой по продуктам полного гидролиза восстановленного полиальдегида [143]. Было установлено, что профили растворимости ПАД при различной температуре с низким процентным содержанием окисленных пиранозных остатков (5–10 %) слабо отличаются от профиля растворимости декстрана, в то время как профили растворимости продуктов с высоким содержанием окисленных пиранозных остатков (25–40 %) в разы больше аналогичных значений для декстрана [144]. Исходя из определения вязкости данный параметр должен уменьшаться для ПАД с увеличением количества окисленных пиранозных остатков в структуре вследствие уменьшения молекулярной массы молекул. При исследовании вязкости растворов с низкой концентрацией вещества (5 %) было показано незначительное изменение для ПАД с различным содержанием альдегидных групп. Тем не менее реакции, сопровождающиеся образованием полуацеталей в растворах с высокой концентрацией ПАД, приводят к обращению тенденций вязкости вследствие межмолекулярных взаимодействий и увеличения молекулярной массы молекул. Было показано, что вязкость 20 %–х растворов ПАД с содержанием окисленных пиранозных остатков 25 % меньше, чем у аналогичных растворов декстрана, а вязкость растворов ПАД с содержанием окисленных пиранозных остатков 40 % в два раза выше [145, 146]. В процессе окисления декстрана периодатами щелочных металлов происходит деструкция полимерного остова молекул и, как следствие, уменьшение молекулярной массы в сочетании с происходящими внутримолекулярными реакциями, что в значительной степени изменяет физико– химические свойства получаемых продуктов. В основном это отражается на таких физических свойствах, как растворимость, стеклование и вязкость растворов. Изменение структуры окисленных пиранозных остатков также влияет и на 34 реакционную способность окисленных групп в реакциях присоединения, в особенности по отношению N–нуклеофилам. 1.6 Аналитические методы определения количества карбонильных групп в полиальдегиддекстранах Альдегидные группы в ПАД играют важную роль как в физико–химических свойствах, так и в структурных особенностях. Способность образовывать межмолекулярные связи с участием альдегидной и гидроксильной групп и супрамолекулярные структуры в значительной степени определяет физико– химические свойства декстрана. Появление в полимерном остове ПАД окисленных глюкозных колец приводит к увеличению степеней свободы и, как следствие, к изменению конформации с линейной на глобулярную (особенно выражено для декстранов с невысокой молекулярной массой). Определение точного содержания современными карбонильных методами групп модификации в ПАД лекарственных также обусловлено препаратов. При использовании в качестве активации декстранов периодатов щелочных металлов конечное содержание присоединенных фармацевтических групп к остову ПАД будет соответствовать количеству альдегидных групп в ПАД. Для определения содержания количества альдегидных групп в ПАД, полученных с использованием в качестве окислителя периодатов щелочных металлов, существует ряд известных аналитических методик [147, 148]. Зачастую получаемые таким способом ПАД содержат высокое количество альдегидных групп (10–50 %). Наибольшее распространение получили физико–химические и аналитические методы, такие как титриметрические с использованием 3,5–динитросалициловой кислоты, бисульфита натрия или гидрохлорида гидроксиламина [149, 150]. Методика анализа количества альдегидных групп с использованием гидрохлорида гидроксиламина заключается в обратном потенциометрическом титровании выделившейся соляной кислоты в результате реакции гидрохлорида гидроксиламина с ПАД. Методика экономически выгодна при массовом анализе, 35 так как не требует дорогостоящих реагентов или оборудования. Её существенным недостатком можно считать низкую чувствительность, обусловленную химической природой гидроксиламина, реакция ингибируется при низких значениях pH из–за большой основной силы. Проводя анализ ПАД с низким содержанием альдегидных групп, нельзя применять кислотно–основные индикаторы, способные внести значительную погрешность в его результаты. Эффективность использования в качестве аналитического реагента 3,5–динитросалициловой кислоты была показана при анализе различных поли– и моносахаров. Суть процесса заключается в прямом титровании исследуемого вещества раствором 3,5–динитросалициловой кислоты в присутствии соли Rochelle до образования пурпурно–красной окраски. Недостатками методики можно считать низкую чувствительность (до 10–4 М), сильную зависимость аналитической реакции от температуры и бризантные свойства 3,5–динитросалициловой кислоты. Анализ содержания альдегидных групп с применением в качестве аналитического реагента бисульфита натрия используется в основном для моно– и олигосахаридов. Методика заключается в получении нерастворимого в воде бисульфитного комплекса с карбонильным соединением с его дальнейшем титриметрическим разложением. Её основной недостаток – слабая реакционная способность бисульфита по отношению к пространственно–затруднённым карбонильным группам, приводящая к высокой погрешности при анализе ПАД с низким содержанием альдегидных групп. Также при определении количества альдегидных групп в ПАД использование 3,5–динитросалициловой кислоты возможно в фотометрических методиках, а бисульфита натрия – в гравиметрических [151]. Помимо титриметрических методик, применяются фотометрические с применением Purpald реактива или гидразида N–(2,4–динитрофенил)–β– аланилглицилглина [152]. Технически процесс анализа с применением Purpald реагента отличается простотой исполнения. Анализируемый ПАД вводят в реакцию с Purpald реагентом в присутствии водного раствора щелочи, дальнейшее окисление кислородом воздуха или периодатами щелочных металлов 36 приводит к появлению ярко–фиолетовой окраски анализируемого комплекса. Преимущество методики – определение малых (до 10–5 М) количеств альдегидных групп в растворе, а также простота и скорость анализа. Из недостатков следует отметить слабую реакционную способность Purpald реагента по отношению к циклическим полуацеталям, образующимся из альдегидных групп при получении ПАД. Проведение анализа в растворе щелочи приводит к гидролитической деструкции полимерного остова ПАД и появлению свободных альдегидных групп, не связанных с процессом окисления ПАД. Такие недостатки в значительной степени увеличивают погрешность методики и ставят под сомнение его использование для анализа ПАД с малым содержанием альдегидных групп [153]. Таким образом, основной проблемой современных методов анализа содержания карбонильных групп в полисахаридах является малый предел точности определения (в среднем до 10–4 – 10–5) либо опасные для постоянного использования аналитические реагенты. Современные методы определения содержания карбонильных групп в окисленных полисахаридах применимы для веществ с высоким содержанием альдегидных групп и высокой устойчивостью к долгому воздействию агрессивных сред. Рассмотрев существующие способы получения ПАД и технологическую линию получения декстранов, выявив основные недостатки и преимущества рассмотренных способов, была определена цель исследования, сформулированы задачи и выбраны методы исследования. 37 ГЛАВА 2 РАСЧЕТ КИНЕТИЧЕСКИХ И ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПРОЦЕССА ОКИСЛЕНИЯ ДЕКСТРАНА ПЕРМАНГАНАТОМ КАЛИЯ Математическое моделирование процесса окисления декстрана перманганатом калия в кислой среде включает в себя три основных этапа: Определение основной реакции в процессе окисления, вычисление 1. кинетических и термодинамических параметров с использованием методов окислительно–восстановительных реакций; Моделирование процесса окисления глюкозного остатка на основании 2. теоретических моделей химического окисления полисахаридов; Оценку влияния пространственно–конформационных особенностей 3. молекулы декстрана на кинетические параметры процесса окисления. 2.1 Определение термодинамических параметров модели окисления декстрана перманганатом калия Основная реакция, протекающая в процессе окисления декстрана в кислой среде в условиях низкого содержания окислителя представлена ниже: 3 Dex + 2 KMnO4 + 2 HCl → 3 DOx + 2 MnO2 + 2 KCl + 4 H2O (1) Суммарная реакция окисления декстрана (∼C6H12O6∼) перманганатом калия может быть представлена в виде двух окислительно–восстановителных полуреакций: окисления глюкозного кольца молекулы декстрана: ∼C6H12O6∼ – 2 e — → ∼C6H10O6∼ + 2 H+ /·3 (2) и восстановления перманганат иона в кислой среде до оксида марганца (VI): MnO—4+ 4 H + 3 e — → MnO2 + 2 H2O /·2 (3) Стандартный потенциал электродной реакции восстановления перманганат иона в кислой среде ( электроду ( ), по отношению к стандартному водородному ) равен 1,7 В. Для определения энергии Гиббса ( восстановления воспользуемся уравнением: ) полуреакции 38 , где n – (96485,34 число (4) передаваемых Кл/моль); электронов; – F стандартные – постоянная потенциалы Фарадея электродов; = – 492073,5 Дж/моль Полная энергия Гиббса электродной реакции окисления глюкозы с образованием ПАД и двух протонов была рассчитана как сумма двух процессов: двухступенчатой ионизации глюкозного кольца и разрыва углерод–углеродной связи с образованием ПАД. В качестве модели для расчета параметров апротонизации и разрыва углерод–улеродной связи глюкозного кольца была выбрана модель глюкозного кольца с фиксированными гидроксильными группами для имитации концевого глюкозного юнита (рисунок 2.1, а) и глюкозного юнита в основной цепи молекулы декстрана (рисунок 2.1, б). В качестве инертных «фиксаторов», имитирующих участки основной цепи молекулы, применялись объемные частиц с высокой молекулярной массой (35 и 60 кДа) и слабовыраженным индуктивным эффектом (индукционная энергия (0,018 ± 0,005) эрг·см6). В используемых моделях не учитывается изменение конформаций соседних глюкозных циклов и пространственного изменения формы молекулы, что сказывается на точности вычисляемых параметров. а б а – в конце цепи молекулы декстрана, б – внутри цепи молекулы декстрана Рисунок 2.1 – Глюкозный остаток 39 Энергия апротонизации глюкозного кольца была вычислена с применением программы ACDLabs/pKa dB. В расчете второй ступени программой использовались справочные = (12,12±0,07). Энергию Гиббса данные для = (13,59±0,07) первой ступени определяли по формуле: , (5) где R – газовая постоянная, Дж/(моль·К); Т – температура, К. = 8,31·298·(12,12+13,59)·2,3=146601,7 Дж/моль. Расчет энергии разрыва углерод–углеродной связи глюкозного кольца вычисляли в программе ChemBioOffice/ChemBio3D Ultra, определяя как разность полных минимальных энергий неокисленного глюкозного кольца и окисленного в виде диальдегида. В процессе моделирования проводили разрывы углерод– углеродных связей между вторым и третьим ( четвертым ( ), а также между третьим и ) атомами углерода глюкозных циклов с образованием по месту разрыва альдегидных групп (таблица 2). Таблица 2 – Расчетное значение энергий Гиббса (кДж/моль) образования диальдегида из глюкозного кольца в молекуле декстрана Модель Концевого глюкозного остатка Глюкозного остатка в середине основной цепи , кДж/моль , кДж/моль 34,3903 16,7558 85,9003 79,6755 Из представленных в таблице 2 данных следует, что в молекуле декстрана не все глюкозные кольца имеет равную вероятность вступить в реакцию с окислителем. Таким образом, если не учитывать пространственный фактор расположения глюкозных остатков в молекуле декстрана и предположить кинетический характер регулирования процесса реакции окисления, можно сделать выводы, что первыми в реакцию окисления будут вступать концевые 40 глюкозные остатки, и чем дальше от конца молекулы находится глюкозное кольцо, тем меньше вероятность его окисления. Расчет полной энергии Гиббса и константы Ka реакции окисления декстранов перманганатом калия будет проведен для двух возможных вариантов – реакции по концевому глюкозному остатку ( ( ) и реакции по глюкозному остатку в середине основной цепи ). Формула для расчета полной энергии реакции с учетом стехиометрии полуреакций: , (6) , = – 467,623 кДж/моль, = – 295,978 кДж/моль, (7) =9,33·1081; =7,62·1051. Полученные данные для констант реакции и указывают на существование в молекуле декстрана глюкозных колец с различной энергией и склонностью к окислению в зависимости от их местоположения в молекуле. Глюкозные кольца в молекуле декстрана, находящиеся в конце основной цепи или её разветвлений, более склонны к окислению, чем глюкозные кольца в середине молекулы. Таким образом, в молекуле декстрана можно выделить два типа связей при окислении перманганатом калия – легко окисляемые и трудно окисляемые. Среднюю степень окисленности молекул ПАД (Oxср) после окончания реакции можно выразить через величины: nобщ – общее среднее число глюкозных остатков, в том числе окисленных, в молекуле ПАД; nOx – среднее количество окисленных глюкозных остатков в молекуле ПАД: , (8) Во всех экспериментах по окислению декстрана перманганатом калия используется недостаток окислителя по отношению к количеству окисляемых глюкозных колец. Концентрация кислоты в процессе окисления уменьшается, поэтому для поддержания постоянного значения рН её количество также берут в 41 избытке. Основываясь на используемых допущениях, можно сделать вывод, что процесс окисления проходит как реакция первого порядка по окислителю. И учитывая наличие различающихся по реакционной способности глюкозных колец, степень окисленности можно вычислить через уравнения: , (9) где α и β – коэффициенты пропорциональности для легко– и трудноокисляемых глюкозных колец (зависящие от структуры, степени разветвленности декстрана); – количество легко– и трудноокисляемых глюкозных колец соответственно. В соответствии с предложенной математической моделью и учитывая прямую зависимость расхода окислителя от содержания альдегидных групп в ПАД, при низких концентрациях окислителя зависимость количества окисленных глюкозных колец ( в ПАД от количества используемого окислителя ( может быть представлена в первом приближении как параметрическое линейное уравнение: , где и (10) – линейные коэффициенты пропорциональности для легко– и трудноокисляемых глюкозных колец; – количество окислителя в процессе окисления; const – константа, зависящая от строения декстрана. Показатели коэффициентов и зависят от значения соотношения количества используемого окислителя и количества легкоокисляемых глюкозных остатков в составе исследуемого декстрана. Искомые коэффициенты могут быть найдены экспериментальным путем для конкретного типа декстрана. 2.2 Определение кинетических параметров модели окисления декстрана перманганатом калия Коэффициенты α и β являются уникальными для каждого из декстранов, 42 полученных от различных штаммов бактерий или с помощью способов гидролиза, проводимых в целях снижения молекулярной массы продукта. Вычисление коэффициентов α и β это трудоемкая задача с применением эмпирических данных. Так как мы определили реакцию окисления декстрана перманганатом калия, как реакцию первого порядка, то скорость её прохождения , или скорость образования альдегидных групп можно выразить уравнениями: , где (11) – константа скорости реакции окисления декстрана перманганатом калия; – концентрация окисленных глюкозных остатков; τ – время реакции. Интегрируя обе части уравнения, получаем: , (12) и, переходя от концентраций к количеству окисленных глюкозных колец и считая, что их начальная концентрация равна нулю, получаем уравнения для и где и – : , константы скорости (13) реакций окисления легко– и трудноокисляемых связей в молекуле декстрана. Для нахождения констант скоростей реакций окисления и можно воспользоваться уравнением Аррениуса: , (14) , где и (15) – предэкспоненциальные множители в уравнениях Аррениуса для легко– и трудноокисляемых связей в молекуле декстрана; и – энергии соответствующие легко– и трудноокисляемым связям в молекуле декстрана. Все наиболее важные кинетические или термодинамические параметры реакции окисления декстранов перманганатом калия в кислой среде могут быть получены при решении системы уравнений: 43 , (16) 2.3 Влияние высокой молекулярной массы декстрана на параметры модели окисления декстрана перманганатом калия Известно, что ввиду своей природы высокомолекулярные соединения в водных растворах не всегда подчиняются законам идеальных молекул. Отклонения, к примеру, в уравнениях Вант–Гоффа для высокомолекулярных соединений могут иметь значительный характер и обусловливать не ньютоновский характер поведения. Для определения характера влияния высокой молекулярной массы на кинетические параметры процесса окисления декстранов был выполнен расчет минимизации потенциальной энергии и определена зависимость последней от конформации молекулы. В расчетах зависимости потенциальной и полной энергий молекулы декстрана от пространственной конфигурации была использована молекула декстрана с молекулярной массой около 4 кДа. Первичную минимизацию энергии молекулы декстрана проводили в математическом базисе ММ2, предназначенном для расчёта s– и p–элементов, имеющих гибридные орбитали. Молекулярную динамику рассчитывали в математическом базисе PM3, учитывающем влияние окружающей среды (растворителя) и Ван–дер–Ваальсовы взаимодействия внутри объекта. Градиент температуры 0–78 °С (конечная точка с температурой 93 °С), шаг итерации температуры 0,5 °С. Для более точного определения молекулярной динамики брали по пять точек энергии на точку итерации температуры. Процесс изменения конформации молекулы декстрана в порядке увеличения температуры представлен на последовательности рисунков 2.2, 2.3 и 2.4, и соответствует 44 температурам 0, 78 и 93 ОС соответственно. Рисунок 2.2 – Начальная линейная конформация молекулы декстрана, Т = 273 К, метод минимизации энергии MM2 Рисунок 2.3 – Промежуточная спиралевидная конформация молекулы декстрана при Т = 351 К 45 Рисунок 2.4 – Конечная глобулярная конформация молекулы декстрана при Т = 366 К Как видно из приведенных на рисунках конформаций, молекула декстрана с увеличением температуры стремится изменить свою вторичную структуру от линейной к глобулярной. Изменение пространственной упаковки происходит не линейно и в значительной степени ускоряется с увеличением температуры. В процессе «схлопывания» молекула декстрана проходит конформацию правозакрученной спирали (Т = 351 К), что, по–видимому, объясняется α–D–формой глюкозных колец. Таким образом, с увеличением температуры происходит уменьшение количества легкодоступных для окисления глюкозных колец, приводящее к снижению реакционной способности молекулы декстрана и, как следствие, к отклонению от модели идеальной молекулы в расчетах уравнений. С изменением конформации молекулы декстрана от линейной к глобулярной потенциальная энергия линейно уменьшается, происходит экспоненциальный рост полной энергии молекулы за счет возрастания кинетической энергии в системе (рисунки 2.5 и 2.6). 46 Рисунок 2.5 – Полная энергия молекулы декстрана в зависимости от температуры Рисунок 2.6 – Потенциальная энергия молекулы декстрана в зависимости от температуры Таким образом, система уравнений (16) описывает процесс окисления декстранов перманганатом калия с кинетической точки рассмотрения. Исходя из сделанных допущений можно заключить, что логарифм концентрации альдегидных групп в процессе окисления будет линейно возрастать со временем. Такие параметры, как температура и кислотность среды, вносят меньший вклад в кинетику процесса окисления. Температура и кислотность среды входят в состав коэффициентов в виде линейных множителей, вследствие чего будут добавлять 47 линейную поправку к экспоненциальной зависимости скорости окисления. В соответствии с установленной зависимостью потенциальной энергии молекулы декстрана от температуры можно сделать вывод, что при повышении температуры реакционной массы приращение скорости реакции будет снижаться. 48 ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОЦЕССА ОКИСЛЕНИЯ ДЕКСТРАНА В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ Исследуя процесс окисления декстранов перманганатом калия в лабораторных условиях, использовали в качестве сырья: инфузионные растворы декстранов с молекулярной массой 35 и 60 кДа, перманганат калия, уксусную кислоту. В аналитических исследованиях применяли: 2,4–динитрофенилгидразин, боргидрид натрия, соляную кислоту, орто–фталевый альдегид, гидразид изоникотиновой Растворителями кислоты, флуоресцеин служили: и дистиллированная 1,1–карбонилдиимидазол. вода, диметилсульфоксид, диметилформамид. В состав оборудования для экспериментов входят: набор химической лабораторной посуды, термостат, весы, рН–метр, мешалка, мембранные модули для ультрафильтрации. Аналитическое оборудование включает в себя: УФ–, ИК–, ЯМР–спектрометры, жидкостный хроматограф, капиллярный электрофорезер, оборудование для проведения элементного анализа. Процесс окисления в опытно–промышленных условиях исследовали в промышленном реакторе объемом 50 л, оборудованном механической мешалкой и водяной тепловой рубашкой. Исследования процесса окисления декстрана перманганатом калия включают в себя модифицированные методики органической химии: окисление перманганатом калия в водных растворах, кислотный гидролиз, восстановление боргидридом натрия, фильтрование, декантация, ультрафильтрация, осаждение полимеров спиртом. Аналитические методики были разработаны на основе известных методов анализа органических веществ: спектрометрии (ЯМР, ИК, УФ), гель–проникающей хроматографии, капиллярном электрофорезе, элементном анализе. Для получения статистически достоверных результатов каждый эксперимент проводился трижды (если не указанно иное). Для обработки полученных результатов использовали программное обеспечение фирмы MicroCal Origin 8,0, ACDLabs Solution, Microsoft Office Excel. Достоверность различий в 49 группе определяли по U–критерию Манна–Уитни с параметром уровня статистической значимости p<0,01. Достоверность математической модели процесса окисления проверяли в экспериментальных условиях с определением кинетических (время полуреакции) и термодинамических (выход продукта реакции) характеристик. 3.1 Определение влияющих параметров в контрольных технологических точках процесса получения ПАД Технологический процесс получения ПАД состоит из шести основных технологических операций (ТО) (рисунок 3.1), которые в основном представлены процессами выделения, очистки или приготовления исходных веществ. Рисунок 3.1 – Схема технологического процесса получения ПАД Технологические операции приготовления исходных веществ напрямую зависят от выбранных материалов и внешних условий среды и не требуют детального исследования; ТО выделения побочных продуктов рассматривается отдельно от основного процесса окисления по причине незначительного влияния 50 на состав и строение ПАД; ТО окисления декстранов зависит от времени процесса, температуры, рН, типа мешалки, влияния растворителя. Пересечение множества параметров в ТО №4 дает возможность оптимизации всего технологического процесса за счет оптимизации одной ТО. Также ТО №4 наиболее затратный по времени этап, и его оптимизация в значительной степени ускорит весь процесс получения ПАД. Влияющие параметры в ТО №4 (количество используемого окислителя, частота вращения мешалки (турбинной), время реакции, температуры и кислотность реакционной массы) определяли исходя из предварительных экспериментов. Оптимальные условия реакции окисления декстранов перманганатом калия позволяют получить ПАД с наибольшим возможным содержанием карбонильных групп при минимальной деструкции полимерного остова молекул за наименьшее время при минимальных затратах ресурсов. Кинетические параметры реакции изучали, используя параметр времени полуреакции, определяемый как время, за которое половина всего окислителя (KMnO4) переходит в восстановленную форму (MnO2). Термодинамические параметры реакции окисления декстрана устанавливали методами спектрофотометрии и гравиметрии. 3.2 Приготовление клинических декстранов, ПАД и конъюгатов ПАД с 2,4–динитрофенилгидразином и флуоресцеином В качестве источников декстрана со средней молекулярной массой 35 кДа использовали плазмозамещающий раствор «реополиглюкин» по ФСП 42–0088063400 (производства ОАО «Красфарм», Россия), который представляет собой 10 %–й раствор декстрана, выделенного из штамма бактерий Leuconostock mesenteroides, в 0,14 М растворе хлорида натрия. Молекулярная масса декстрана в растворе «реополиглюкин» составляет от 30 до 40 кДа. В качестве источника декстрана со средней плазмозамещающий молекулярной раствор массой «полиглюкин» 60 кДа 67/554/195 использовали от 19.11.1998 51 (производства ОАО «Биохимик», Россия), который представляет собой 6 %–й водный раствор декстрана, выделенного из штамма бактерий Leuconostock mesenteroides, в 0,14 М растворе хлорида натрия. Молекулярная масса декстрана в растворе «полиглюкин» составляет от 50 до 70 кДа. Образцы клинических декстранов со средней молекулярной массой 35 кДа и 60 кДа получали осаждением 95 %–м раствором этилового спирта из водных растворов декстранов, реополиглюкин (ОАО «Красфарма») и полиглюкин (ОАО «Биохимик») соответственно. В 100 мл охлажденного до 6–8 О С раствора реополиглюкина (полиглюкина) при перемешивании прибавляли 200 мл охлажденного до 6–8 ОС 95 %–го этилового спирта. Суспензию, содержащую белый хлопьевидный осадок, перемешивали в течение 3–5 мин. Осадок отфильтровывали на пористом стеклянном фильтре и дважды промывали 20 мл 30 %–го водного раствора этилового спирта. Полученный продукт высушивали при температуре 22–25 ОС в течение 48 ч. Выход продукта: реополиглюкин 9,6 г (96 %); полиглюкин 5,64 г (94 %). Получение ПАД со средней молекулярной массой 35 кДа и 60 кДа, с различным содержанием альдегидных групп. Сухой декстран 10,0 г растворяли в 100 мл дистиллированной воды и нагревали на кипящей водяной бане, при перемешивании прибавляли 5 мл 33 %–й уксусной кислоты (здесь и далее х.ч., производства ОАО «Реактив», ГОСТ 61–75 (изм. 1–3)) и 2 %–й водный раствор перманганата калия (здесь и далее ГОСТ 20490–75, массовая доля марганцовокислого калия не менее 99,3 (поставщик ООО «ТК «Химресурс») в количествах 0,5–4 мл (таблица 3). Выдерживали на водяной бане до полного обесцвечивания раствора и выпадения коричневого хлопьевидного осадка диоксида марганца. Раствор отфильтровывали через бумажный фильтр Enderol filter № 2, Binzer и охлаждали до 6–8 ОС. Выделяли ПАД осаждением 200 мл охлажденного до 6–8 ОС, 95 % этилового спирта. Осадок отфильтровывали на пористом стеклянном фильтре, дважды промывали 20 мл 30 %–го водного раствора этилового спирта и сушили при t ≈ 50 ОС. 52 Таблица 3 – Выход продукта реакции окисления декстрана с M W = 35 кДа и 60 кДа при использовании различного количества перманганата калия (N – количество альдегидных групп, приходящиеся на молекулу декстрана) № Об– раз– ца 1 Расчетное Кол–во содержание окис– альдегидных лителя, групп M W = 35 мл кДа, (N) 0,5 5,9 Расчетное Выход содержание продукта альдегидных M W = 35 кДа, групп M W = 60 (N) кДа, (N) 9,1 / 91 5,16 Выход продукта M W = 60 кДа, (N) 9,4 / 94 2 1 11,7 8,9 / 89 10,33 9,2 / 92 3 2 23,4 8,9 / 89 20,65 9,3 / 93 4 4 46,8 8,3 / 83 41,3 9,1 / 91 Для получения конъюгата ПАД с 2,4–динитрофенилгидразином (здесь и далее CAS № 119–26–6, Sigma содержание основного продукта не менее 97 %) брали ПАД с M W = 35 кДа и 60 кДа, m=10,0 г и растворяли в 100 мл дистиллированной воды. В раствор вносили соляную кислоту (здесь и далее ГОСТ 3118–77 (изм. 1), ОАО «Реактив», х.ч.) до получения рН = 3,5–4,0, и 50 мг 2,4–динитрофенилгидразина (многократный избыток по отношению к количеству перманганата калия, использованного для получения образца ПАД). Реакционную массу нагревали до 60 ОС на водяной бане и перемешивали в течение трёх часов, непрореагировавший 2,4–динитрофенилгидразин отфильтровывали через бумажный фильтр (Enderol filter № 3, Binzer). Фильтрат охлаждали до 6–8 ОС и осаждали конъюгат ПАД и 2,4–динитрофенилгидразина 150 мл охлажденного до 6–8 ОС 95 %–го этилового спирта. Осадок отфильтровывали через бумажный фильтр (Enderol filter № 2, Binzer) и промывали 20 мл 30 %–го водного раствора этилового спирта, сушили при t ≈ 50 ОС. Выход продукта 8,9 г (89 %). Для получения конъюгата ПАД с флуоресцеином навеску декстрана или ПАД с M W = 35 кДа и 60 кДа, m=1,0 г растворяли в 10 мл 25 мМ боратном буфере с рН 9. К приготовленному раствору прибавляли флуоресцеин (здесь и далее CAS № 2321–07–5, Fluka содержание основного продукта не менее 97 %) m=0,0177 г и 53 1,1’– карбонилдиимидазол (здесь и далее CAS № 530–62–1, Sigma, содержание основного продукта не менее 97 %) m = 0,047 г. Реакционную массу перемешивали, и оставляли в защищенном от света месте при t = 22–25 ОС на 24 часа. Полученный конъюгат очищали от побочных низкомолекулярных продуктов ультрафильтрацией, на мембранных модулях Vivaflow 200 с параметром сепарации 10 кДа, для декстрана и ПАД с M W = 60 кДа, и 5 кДа для декстрана и ПАД с M W = 35 кДа. Расход концентрата 8–10 мл/мин. Процесс очистки включал в себя 27 циклов полного концентрирования. Степень очистки контролировали методами спектрофотомерии и капиллярного электрофореза. Выход продукта 0,32–0,45 г (32–45 %). 3.3 Определение содержания альдегидных групп в ПАД Для определения содержания альдегидных групп в ПАД была разработана фотометрическая методика с использованием 2,4–динитрофенилгидразина в качестве хромофорной группы, с учетом особенностей ПАД, получаемых окислением перманганатом калия. Использование существующих способов определения количества альдегидных групп с применением бисульфита натрия или гидроксиламин гидрохлорида давало недостоверные результаты в основном из–за недостаточной чувствительности при малом содержании альдегидных групп в исследуемых образцах. Спектрофометрические методы определения альдегидных групп обладают высокой чувствительностью (до 10–6 М) и при этом менее трудоемки. В серии предварительных экспериментов по определению альдегидных групп в ПАД установили кинетическую нестабильность анализируемого окрашенного комплекса в водном растворе, обусловленную, по–видимому, малой кинетической устойчивостью сольвентной оболочки, а также деструкцией молекул декстрана в сильнощелочных растворах (свыше 0,5 М), приводящую к разрушению основной цепи полимерных молекул. Для выбора растворителя в анализе провели серию экспериментов с различными составами растворов: 54 дистиллированная вода (раствор № 1), 2/3 дистиллированной воды + 1/3 диметилформамида (ДМФА) (раствор № 2), 2/3 дистиллированной воды + 1/3 диметилсульфоксида (ДМСО (здесь и далее ТУ 6–09–3818–89 (изм. 1), ОАО «Реактив»)) (раствор № 3). При рассмотрении кинетических кривых образования анализируемого вещества (рисунок были 3.2) установлены следующие закономерности. Рисунок 3.2 – Кинетические кривые образования и устойчивости окрашенного комплекса ПАД № 3 ( M W = 35 кДа) с ДНФГ в дистиллированной воде (1), 2/3 дистиллированной воды + 1/3 ДМФА (2), 2/3 дистиллированной воды + 1/3 ДМСО (3) В водном растворе (график №1) достаточно быстро образуется комплекс, но затем быстро разрушается, конечная величина оптической плотности незначительно превышает первоначальную, что указывает на разрушение значительного количества окрашенного комплекса. На кинетической кривой №2 вначале содержалась область со сниженной оптической плотностью, образующаяся в результате разбавления и низкой скорости окрашивания комплекса в дальнейшем. Малое увеличение конечного значения величины оптической плотности по отношению к первоначальному также квалифицирует раствор №2 как неподходящий. Кинетическая кривая №3 указывает на быстрый процесс образования окрашенного комплекса, достигая максимума оптической 55 плотности уже через 6 с. В дальнейшем кинетическая кривая не претерпевает значительного изменения, что указывает на кинетически устойчивую окраску раствора и стабильность определяемого комплекса. Таким образом, для анализа наиболее подходит смесь 2/3 дистиллированной воды и 1/3 ДМСО, а используемый раствор КОН в концентрации 0,1 М и отношении 1/3 объемных частей к раствору исследуемого вещества. Количество карбонильных групп в ПАД со средней молекулярной массой 35 кДа определяли для образцов № 1 – 4 (таблица 3). Готовили 10 %–е растворы в ДМСО. В кюветы для спектрофотометра помещали по 1 мл анализируемого раствора, прибавляли по 2,3 мл 0,1 М водного раствора КОН, встряхивали и проводили анализ. В качестве холостой пробы использовали растворитель. УФ–спектры растворов снимали на приборе «СФ–2000» на длине волны λ = 430 нм в режиме «концентрация» (таблица 4) и в области 300–700 нм в режиме «спектр» (рисунок 3.3). λ, нм Рисунок 3.3 – Оптические спектры поглощения анализируемых образцов ПАД 35 кДа с ДНФГ с различным содержанием карбонильных групп. Номера спектров соответствуют номерам образцов ПАД Содержание альдегидных групп в исследуемых образцах ПАД определяли по формуле: 56 , (17) где N – количества альдегидных групп на молекулу декстрана; Dобр – оптическая плотность образца; mобр – масса образца; Vобр – объем пробы образца; – средняя молекулярная масса образца; D1, D2, C1, C2 – оптические плотности и концентрации двух произвольных точек на градуировочной кривой. Таблица 4 – Оптические плотности для конъюгатов ПАД № 1 – 4 (35 кДа) с ДНФГ № D при λ=430 Расчетное N нм N по N по фотометрической элементному методике анализу 1 0,248 8,85 6,8 7,3 2 0,402 17,7 12,3 13,5 3 0,832 35,4 23,2 23,8 4 1,379 70,8 32,8 32,6 В качестве вещества сравнения был использован орто–фтальальдегид–бис– [(2,4–динитрофенил) гидразон], синтезированный по проверенным литературным данным [8] и прошедший аналитический контроль. Орто–фталевый альдегид (здесь и далее PN № 32800, Serva, содержание основного вещества не менее 98 %) массой 0,3 г растворили в 50 мл 95 %–го этилового спирта. Приготовили раствор 1,11 г 2,4–динитрофенилгидразина в нагретом до 60 ОС 95 %–м этиловом спирте. К нему при перемешивании медленно прибавили раствор орто–фталевого альдегида. Полученный в результате реакции осадок отфильтровали на стеклянном пористом фильтре и промыли небольшим количеством 95 %–го этилового спирта, нагретого до 60 ОС. Продукт – кристаллы кирпично–красного цвета – очищали перекристаллизацией из раствора ДМСО/этиловый спирт – 1:1, высушивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Точка плавления – 274–276 ОС (прибор М–5000). Для стандартизации показаний оптической плотности прибора СФ–2000 была произведена градуировка. В качестве стандарта для построения 57 градуировочного графика использовали орто–фтальальдегид–бис– [(2,4–динитрофенил) гидразон], его окрашенный комплекс в щелочной среде характеризуется как устойчивый. Характеристический пик поглощения окрашенного комплекса в УФ–спектре находится при длине волны λ=427 нм, что близко к характеристическому пику поглощения окрашенного комплекса конъюгата ПАД с ДНФГ, равного λ=430 нм (рисунок 3.4). λ, нм Рисунок 3.4 – Спектры поглощения окрашенных комплексов орто– фтальальдегид–бис–[(2,4–динитрофенил) гидразон] (1) и конъюгат ПАД № 3 (35 кДа) с ДНФГ (2) Для построения градуировочного графика готовили раствор стандарта. В мерной колбе на 50 мл растворяли орто–фтальальдегид–бис–[(2,4–динитрофенил) гидразона], 0,0168 г в ДМСО (М = 6,8·10–4 моль/литр). В кюветы для фотометра набирали три серии раствора стандарта по восемь аликвот объемом 10, 30, 40, 50, 80, 100, 150 и 250 мкл. Объем в каждой кювете доводили ДМСО до 1 мл. Прибавляли 2,3 мл 0,1 М водного раствора КОН. Раствор сравнения 1 мл ДМСО и 2 мл 0,1 М водного раствора КОН. Анализ проводили через 60 с, при λ= 430 нм. На основе полученных данных был построен график зависимости оптической плотности от концентрации альдегидных групп в виде аппроксимированной прямой (рисунок 3.5). 58 , моль/л Рисунок 3.5 – Градуировочная кривая для спектрофотометра СФ–2000, стандарт – орто–фтальальдегид–бис–[(2,4–динитрофенил) гидразон], λ=430 нм Показатели содержания альдегидных групп, рассчитанные из данных, полученных полученными с использованием элементным фотометрии, анализом. коррелируют Небольшое с занижение данными, результатов фотометрического анализа (в среднем на 1,2 %) обусловлено наличием низкомолекулярных азотсодержащих примесей в анализируемых образцах, которые не определяются фотометрически, но регистрируются элементным анализом. Отличия между экспериментальными данными и теоретическими, особенно для образца № 4, в основном обусловлены частичной окислительной деградацией молекул декстрана, возрастающей при увеличении используемого окислителя. Для подтверждения этого предположения были проведены дополнительные анализы структур получаемых ПАД и их конъюгатов с ДНФГ. 3.4 Определение времени полуреакции процесса окисления декстрана Важными данными для построения эффективной модели технологического процесса являются кинетические и термодинамические параметры реакции. Исследование кинетических характеристик, таких как скорость реакции и время полуреакции, дают возможность смоделировать оптимальный процесс получения 59 продукта в оптимальные сроки. Время полуреакции – важный кинетический параметр, позволяющий оценить скорость реакции без использования дорогостоящей аппаратуры и трудоемких методов анализа. Наличие изобестической точки в анализируемых спектрах многокомпонентных систем свидетельствует о наличии равновесного перехода между формами веществ. Так, любое вещество в форме «А», способного переходить со временем (или в процессе реакции) в форму «Б» и имеющего отличный от формы «А» максимум поглощения в спектральном анализе, будет иметь изобестическую точку. В реакции окисления клинических декстранов перманганатом калия в водных растворах существует следующее равновесие: KMnO4 ↔ MnO2·[n H2O] → осадок MnO2 В процессе реакции перманганат калия, окисляя декстран, превращается в комплексное соединение – мультигидрат оксида марганца (IV), а из–за низкой растворимости и склонности к агрегации диоксид марганца со временем, неравновесно выпадает в осадок. Длину волны изобестической точки пары KMnO4 – MnO2 определяли с использование спектрофотометра СФ–2000 в режиме снятия спектра поглощения. В колбе на 250 мл к 10 мл 10 %–го водного раствора клинического декстрана с средней молекулярной массой 35 кДа прибавляли 5 мл 33 %–й уксусной кислоты и 2 %–й водный раствор перманганата калия в количестве 0,1 мл. Реакционную массу доводили дистиллированной водой до 100 мл, отбирали аликвоту в объёме 2 мл и помещали в кювету для фотометрирования. Процесс съемки образца проводили при комнатной температуре в области длин волн 200–600 нм, с интервалом времени в десять минут. В качестве раствора сравнения использовали 1 %–й водный раствор декстрана со средней молекулярной массой 35 кДа. На рисунке 3.6 представлены оптические спектры поглощения реакционной массы, реакции окисления клинического декстрана со средней молекулярной массой 35 кДа в различные промежутки времени: 1 – 0 мин, 2 – 10 мин, 3 – 20 мин, 4 – 30 мин, 5 – 40 мин, 6 – 50 мин, 7 – 60 мин, 8 – 90 мин. 60 λ, нм Рисунок 3.6 – Оптические спектры поглощения в области λ = 340–600 нм для пары KMnO4–MnO2 Из рисунка 3.6 видно, что изобестическая точка для пары KMnO4 ↔ MnO2 находится при λ = 494 нм. С течением времени максимум в спектрах поглощения при 518–521 нм, соответствующий перманганату калия, уменьшается, свидетельствуя о его расходе. Накопление диоксида марганца в реакционной массе можно проследить по возрастающему максимуму спектров в области 325–450 нм. Смешение максимума поглощения для мультигидрата диоксида марганца обусловлено, по–видимому, изменением рН реакционной массы с течением времени. Необходимо отметить, что спектры № 1–7 образуют изобестическую точку, в то время как интенсивность поглощения спектра № 8 в области 494 нм значительно ниже значения для изобестической точки. Такое явление обусловлено процессом агрегации частиц диоксида марганца в реакционной массе, которое сопровождается значительным снижением оптической плотности раствора. Время реакции, при котором кривая оптической плотности проходит ниже изобестической точки, соответствует времени полного превращения перманганата калия в диоксид марганца. 61 Данные об изобестической точке реакции можно использовать для определения времени полуреакции. Известно, что для изобестической точки справедливо равенство коэффициентов экстинкции ε обоих форм, участвующих в равновесии , где и (18) – коэффициенты экстинкции на λ = 494 нм для перманганата калия и гидратированного диоксида марганца соответственно. Считая толщину оптического слоя фотометрируемого образца равной единице (10,01 мм), переходим к следующей форме для оптической плотности: и , где (19) – оптические плотности исследуемого образца, перманганата калия и гидратированной формы диоксида марганца соответственно. , где и (20) – равновесные концентрации перманганата калия и двуокиси марганца соответственно. Полагая отсутствие побочных реакций и численно решая систему дифференциальных уравнений с краевыми условиями для изобестической точки, получаем, что равенство концентраций перманганата калия и оксида марганца (VI) возможно при равенстве нулю тангенса угла наклона касательной к графику оптической плотности в точке с λ=494 нм. Таким образом, время полуреакции для процесса окисления клинического декстрана перманганатом калия определяется как время, в течение которого кривая оптического поглощения в изобестической точке имеет тангенс угла наклона касательной, равный нулю. 62 3.5 Определение количества окислителя (KMnO4) в реакции получения ПАД Процесс определения оптимального количества окислителя в реакции получения ПАД состоял из двух серий, в каждой из которых исследовали по 15 образцов (по 3 образца на одно определение) декстранов со средней молекулярной массой 35 и 60 кДа. В качестве окислителя использовали 2 % по массе водный раствор перманганата калия, в количествах: 0,5; 1,0; 1,5; 3,0 и 5,0 % об. процентов от объема растворов декстранов. В ходе анализа к 1 мл исследуемой пробы водного раствора ПАД с концентрацией 10 мг/мл прибавляли 1 мл насыщенного раствора 2,4–динитрофенилгидразина в 95 %–м растворе этанола и 20 мл концентрированной соляной кислоты. Пробирки с реакционной смесью встряхивали, выдерживали в кипящей водяной бане в течение 5 мин, а затем охлаждали до комнатной температуры. К реакционной смеси прибавляли по 4 мл 0,1 М водного раствора гидроксида калия и перемешивали. Через две минуты определяли оптические плотности растворов при λ = 480 нм. В качестве раствора сравнения использовали контрольную пробу, приготовленную одновременно с опытной, в которой применяли раствор клинического декстрана в эквивалентной концентрации. Концентрацию карбонильных групп в мкМ/мл определяли по градуировочному графику, построенному с использованием в качестве стандарта орто–фтальальдегид–бис–[(2,4–динитрофенил) гидразона]. Содержание карбонильных групп в анализируемых растворах ПАД со средней молекулярной калибровочного графика массой для 35 и 60 кДа определяли посредством орто–фтальальдегид–бис–[(2,4–динитрофенил) гидразон] на λ=430 нм. Значения оптических плотностей для соответствующих растворов ПАД и использованных количеств окислителя приведены в таблице 5. По данным оптической плотности (см. таблицу 5) и калибровочному графику для орто–фтальальдегид–бис–[(2,4–динитрофенил) гидразона] было рассчитано содержание альдегидных групп в получаемых образцах ПАД (35 кДа и 60 кДа) в единицах мкМ/мг (по карбонильной емкости) (рисунки 3.7, 3.8). 63 Таблица 5 – Значения Dср для растворов ПАД 35 и 60 кДа с различной степенью окисленности Dср, ПАД 35 кДа Dср, ПАД 60 кДа 0,202±0,010 0,502±0,030 0,895±0,043 0,942±0,018 1,052±0,064 0,073±0,013 0,213±0,018 0,341±0,031 0,731±0,021 0,773±0,029 Альдегидные группы, мкМ/мг Количество окислителя, % об. 0,5 1,0 1,5 3,0 5,0 1 – ПАД 35 кДа; 2 – ПАД 60 кДа; 1 a, 1 – ПАД 35 кДа; 2 – ПАД 60 кДа, 2 b – матмодели 35 кДа и 60 кДа пунктир – аппроксимация по Гаусу Рисунок 3.7 – Влияние Рисунок 3.8 – График количества окислителя на производной зависимости содержание альдегидных групп в альдегидных групп (DOx) от ПАД количества окислителя (Ox) Как видно из рисунков 3.7 и 3.8, график зависимости содержания альдегидных групп в ПАД для декстрана со средней молекулярной массой 60 кДа более пологий по сравнению с аналогичным графиком для декстрана со средней молекулярной массой 60 кДа. В то же время выход графиков на плато, обусловленный окончанием процесса накопления альдегидных групп и сопровождающийся дальнейшей деструкцией полимерного остова декстрана, для ПАД со средней молекулярной массой 35 кДа наступает раньше, чем для ПАД с 64 средней молекулярной массой 60 кДа. Такой характер зависимости для графиков процесса окисления может быть обусловлен подвижностью молекул декстрана в водных растворах. Большая молекулярная масса и склонность к образованию глобулярных структур для декстрана со средней молекулярной массой 60 кДа по сравнению с декстраном со средней молекулярной массой 35 кДа обусловливают меньшую подвижность молекул и термодинамический контроль реакции. Эмпирическая зависимость количества окислителя от содержания альдегидных групп в продуктах реакции окисления была аппроксимирована в соответствии с представлением математической модели – в виде двух линейных участков. Погрешность определения не превышает 5 % для ПАД со средней молекулярной массой 35 кДа и 7 % для ПАД со средней молекулярной массой 60 кДа. Адекватность экспериментальных данных и аппроксимирующих графиков указывает на эффективность разработанной математической модели. Основываясь на предложенной теоретической модели процесса окисления и полученных результатах, были определены коэффициенты для уравнения (16): , (21) Декстран 35 кДа: , Декстран 60 кДа: Критериями для выбора оптимального количества окислителя в процессе получения ПАД служили качество получаемых продуктов и расход сырья. Таким образом, количество окислителя считается оптимальным при минимальном расходе перманганата калия и получении максимально окисленного ПАД без деструкции полимерного остова. Количество окислителя в точках выхода на плато графиков на рисунке 3.7 соответствуют оптимальным для получения максимально окисленного продукта без деструкции остовов молекул декстрана. 65 Значение точек выхода на плато было определено как максимум второй производной графика зависимости содержания альдегидных групп от количества используемого окислителя (рисунок 3.8). Экспериментально установлено, что оптимальным количеством окислителя является 1,5–2 % об. (2 %–го водного KMnO4) для ПАД со средней молекулярной массой 35 кДа и 2,5–3 % об. для ПАД со средней молекулярной массой 60 кДа. Увеличение рекомендуемого количества окислителя выше нормы приводит к деструкции полимерного остова, и как следствие, к образованию побочных продуктов и снижению качества основного продукта. 3.6 Определение температурного режима реакции окисления декстранов перманганатом калия К 10 %–му водному раствору декстрана со средней молекулярной массой 35 или 60 кДа в количестве 10 мл прибавляли 5 мл 33 %–й уксусной кислоты. Для определения времени полуреакции при различной температуре (23, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 92 и 98 ОС) подготовленные пробы термостатировали в течение 15 мин и прибавляли 0,5 мл 2 %–го водного раствора перманганата калия. Реакционную массу перемешивали, аликвоты по 0,2 мл отбирали с интервалом 5 мин до приближения ко времени полуреакции и через 1 минуту во время наступления полуреакции. Аликвоты помещали в кюветы для фотометрирования и доводили общий объем дистиллированной водой до 2 мл. Пробы анализировали на спектрометре СФ–2000 в режиме снятия спектра поглощения в интервале λ = 470–520 нм. Результаты определения зависимости времени полуреакции от температуры приведены на рисунке 3.9. Графики функций, приведенные на рисунке 3.9, были аппроксимированы до графиков на рисунке 3.10 уравнением вида: , (22) 66 что дает значения коэффициентов: a = (0,939 ±0,00225) и b = (1,8527±0,0656) для 35 кДа, a = (1,15 ±0,0415) и b = (1,9081±0,1759) для 60 кДа. (t2-t1)/10 1 – ПАД 35 кДа; 2 – ПАД 60 кДа; 3 – математическая модель Рисунок 3.9 – Зависимость времени полуреакций окисления 1 – ПАД 60 кДа; 2 – ПАД 35 кДа; пунктир – аппроксимация по Гаусу Рисунок 3.10 – Зависимость производной времени полуреакции декстранов от разности температур от температуры окисления Учёт влияния температуры в математической модели процесса окисления декстрана имел ряд начальных условий: 1) концентрация KMnO4 намного меньше концентрации глюкозных колец; 2) процесс окисления происходит равновесно; 3) начальная концентрация KMnO4 для каждой из точек эксперимента одинакова. Исходя из сделанных допущений процесс окисления декстрана перманганатом калия можно представить как реакцию псевдопервого порядка и описать кинетическим уравнением вида: , где – скорость реакции первого порядка; (23) – константа скорости реакции; – концентрация перманганата калия в реакционной массе. Тогда искомое время полуреакции , (24) 67 Учитывая, что температурный интервал в котором протекает реакция находится в диапазоне 0–100 °С можно предположить, что зависимость скорости реакции от температуры подчиняется правилу Вант–Гоффа: , где и и (25) – температуры реакционной массы для двух экспериментов; – скорости реакции при и соответственно; γ – температурный коэффициент реакции. Окончательное уравнение, связывающее время полуреакции и температуру имеет вид: , где и (26) – время полуреакций для двух экспериментов. Зависимость времени полуреакции процесса окисления декстранов перманганатом калия от температуры, рассчитывали с учетом равенства начальных концентраций KMnO4 для каждого из экспериментов. В качестве начальной точки ( было взято значение времени полуреакции и температуры первого эксперимента. Как видно из данных параметров аппроксимации графиков на рисунке 3.9 отношение времен полуреакций при t = 23–75 ОС (0–6,5 в координатах ) уменьшается примерно в два раза при повышении температуры реакции на 10 ОС, что приблизительно соответствует эмпирической зависимости для правила Вант–Гоффа. Коэффициент а в уравнении аппроксимации показывает степень точности приближения экспериментальных данных к уравнению реакции первого порядка и стремится к единице. При нагревании реакционной массы свыше 75 ОС зависимость выходит на плато, что определяется отклонением в поведении молекул декстрана от идеальной молекулы. Отклонение от правила Вант–Гоффа характерно для высокомолекулярных биологических объектов, таких как полисахариды или белки, зачастую обусловлено внутримолекулярным и межмолекулярным взаимодействием макромолекул. Для водорастворимых 68 полисахаридов и декстрана, в частности, характерна агрегация в растворах при высоких температурах. Дальнейший процесс окисления происходит на поверхности микрочастиц, что, в свою очередь, приводит к снижению скорости реакции. Помимо кинетических характеристик процесса получения ПАД, были найдены термодинамические параметры – выходы продукта реакции. Определяли выход продукта в реакции окисления декстрана для двух степеней окисленности, используя различное количество перманганата калия: средней (1 и 2 % об.) и высокой (4 % об.). Что бы остановить влияние температуры на выход ПАД готовили водные растворы клинических декстранов с содержанием декстрана 10 % масс. К трём аликвотам раствора декстрана по 10 мл прибавляли по 5 мл 33 %–м уксусной кислоты и термостатировали на водяной бане при t = 23, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 92 и 98ОС. К каждой аликвоте, в зависимости от серии эксперимента, прибавляли 2 %–й водный раствор перманганата калия в количествах: 100, 200 или 400 мкл, выдерживали при заданной температуре до полного обесцвечивания и выпадения коричневого хлопьевидного осадка диоксида марганца. Раствор отфильтровывали через бумажный фильтр Enderol filter № 2, Binzer и охлаждали до 6–8 ОС. Выделение ПАД проводили осаждением 30 мл, охлажденного до 6–8 О С, 95 %–го этилового спирта. Осадок декантировали, дважды промывали в 10 мл 30 %–го водного раствора этилового спирта и сушили при t ≈ 50 ОС и относительной влажности не выше 30 %, взвешивали через 24 ч на аналитических весах OHAUS EP 214 C. Результаты гравиметрического исследования влияния температуры на выход продукта в реакции окисления клинических декстранов представлены на рисунках 3.11 (ПАД со средней молекулярной массой 35 кДа) и 3.12 (ПАД со средней молекулярной массой 60 кДа). Как видно из рисунка 3.11, кривая 1 и 2, соответствующие средней степени окисленности ПАД, проявляют низкую зависимость выхода продукта реакции от температуры. В то же время, при избыточном количестве окислителя (кривая 3) реакция сопровождается деструкцией полимерного остова, что приводит к общему снижению выхода 69 продукта реакции. Помимо этого, для реакции с избыточным количеством окислителя характерно снижение выхода продукта реакции с повышением % масс. температуры более 75 ОС. Рисунок 3.11 – Влияние температуры на выход продукта в реакции окисления декстрана со средней молекулярной массой 35 кДа. Образцы с использованием соответствующего количества окислителя (в % об.): 1 – 1 % об., 2 – 2 % об., 3 – 4 % об. Реакция окисления декстрана со средней молекулярной массой 60 кДа (рисунок 3.12), так же как и реакция окисления декстрана со средней молекулярной массой 35 кДа, имеет слабовыраженную зависимость выхода реакции от температуры. Так, для реакций со средним количеством окислителя (кривые 1 и 2), выход реакции слабо изменяется и почти не превышает теоретически рассчитанные значения. В реакции окисления с использованием максимального количества, происходит снижение параметра выхода реакции, но также остающееся в допустимых пределах статистической обработки. % масс. 70 Рисунок 3.12 – Влияние температуры на выход продукта в реакции окисления декстрана со средней молекулярной массой 60 кДа. Образцы с использованием соответствующего количества окислителя (в % об.): 1 – 1 % об., 2 – 2 % об., 3 – 4 % об. Опираясь на полученные данные, можно сделать вывод, что выход продукта (ПАД) в реакции окисления клинических декстранов слабо зависит от температуры. Наибольшее отрицательное влияние на выход продукта реакции оказывает высокая температура (80–100 О С) при малой молекулярной массе субстрата. Учитывая слабое влияние температуры на выход продукта в реакции окисления декстранов перманганатом калия, при выборе оптимального режима руководствовались приоритетом кинетических параметров над термодинамическими. Критерием оптимального температурного режима была выбрана наибольшая скорость реакции (наименьшее время полуреакции) при максимальном качестве продукта. Рабочий температурный режим процесса окисления был определен как максимум второй производной функции отношения температур по нормированной разности температур (рисунок 3.10). Оптимальная 71 температура проведения процесса 75–82 °С, при ее дальнейшем увеличении снижаются темпы роста скорости реакции и качество продукта вследствие поверхностного окисления макромолекул декстрана. 3.7 Определение режима кислотности реакции окисления декстранов перманганатом калия К 10 %–му водному раствору клинического декстрана со средней молекулярной массой 35 или 60 кДа в количестве 10 мл прибавляли раствор 20 %–й соляной кислоты в количествах, необходимых для получения начального значения рН: 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1. Реакционную массу термостатировали на водяной бане до температуры 80 °С и прибавляли 0,5 мл 2 %–го водного раствора перманганата калия. Из реакционной массы при перемешивании обирали аликвоты по 0,2 мл с интервалом 5 мин до приближения ко времени полуреакции и через 1 мин незадолго до наступления времени полуреакции. Аликвоты помещали в кюветы для фотометрирования и доводили общий объем дистиллированной водой до 2 мл. Пробы анализировали на спектрометре СФ–2000 в режиме снятия спектра, поглощение определяли в интервале длин волн 470–520 нм. В теоретических расчётах кинетики реакции окисления клинических декстранов перманганатом калия в условиях постоянной и изменяющейся кислотности можно предположить, что процесс протекает как реакция псевдопервого порядка. Изменение активационного барьера реакции и константы реакции будет происходить в соответствии с уравнением Бренстеда: , (27) где ka – константа реакции; k0 – константа скорости не катализируемой реакции; α – константа, характеризующая реакционную серию и чувствительность скорости реакции; Ka – константа кислотности кислоты. 72 Результаты определения зависимости скорости реакции окисления клинических декстранов перманганатом калия (времени полуреакции) от водородного показателя среды приведены на рисунках 3.13 и 3.14. 1, 2 – экспериментальные кривые для 1 – ПАД 35 кДа; 2 – ПАД 60 кДа; ПАД 35 и 60 кДа; 1 a, 2 b – расчетные пунктир – аппроксимация по Гаусу кривые для 35 и 60 кДа Рисунок 3.13 – Влияние кислотности среды на время полуреакции окисления декстранов Рисунок 3.14 – Зависимость производной времени полуреакции от кислотности среды (рН) График зависимости времени полуреакции от показателя рН для реакции окисления декстрана перманганатом калия имеет пропорционально ниспадающий характер и разделяется на две почти линейные области. При рН 7–4 параметр времени полуреакции линейно снижается с уменьшением значения рН, что может свидетельствовать о большой зависимости скорости реакции при переходе от нейтральной к кислой области рН в реакционной массе. Процесс уменьшения скорости реакции обусловлен частичным расходом ионов гидроксония в процессе окисления за счёт образования щелочного диоксида марганца. С уменьшением значения рН реакции ниже 4 характер снижения параметра времени полуреакции почти не изменяется, что свидетельствует о насыщении реакционной массы ионами гидроксония. Концентрация ионов гидроксония намного выше концентрации перманганата калия и может считаться равновесной. Дальнейшее 73 увеличение концентрации соляной кислоты в реакционной массе в условиях низкого содержания окислителя не увеличивает эффективность окисления, что полностью согласуется с теоретической моделью. Используя данные о зависимости времени полуреакции процесса окисления клинических декстранов перманганатом калия, применяя формулу Бренстеда и полагая, что процесс проходит как реакция псевдопервого порядка, можно рассчитать такие кинетические параметры, как константу скорости не катализируемой реакции k0, каталитическую константу реакции ka и константу, характеризующую реакционную серию и чувствительность скорости реакции к смене катализатора α. Полагая, что в условиях реакции при рН 7 процесс окисления протекает без протонирования перманганат-иона, приходим к выражению для константы k0: , (28) для декстранов со средней молекулярной массой 35 и 60 кДа соответственно получаем: . Значения для и вычисляем аналогично, значению α, используя формулу: , (29) где Ka – константа кислотности кислоты, для соляной кислоты равная 107 моль/дм3. Получаем и α35=0,23; α60=0,31. Для определения влияния рН среды на выход ПАД отбирали аликвоты объемом 10 мл, 10 %–х водных растворов клинических декстранов. Аликвоты термостатировали на водяной бане при 25 О С и прибавляли раствор 10 %–й соляной кислоты до значений рН: 7, 6, 5, 4, 3, 2. К каждой аликвоте в зависимости от серии эксперимента прибавляли 2 %–й водный раствор перманганата калия в количествах 200 или 400 мл. Реакционную массу выдерживали при заданной температуре до полного обесцвечивания раствора и выпадения коричневого хлопьевидного осадка диоксида марганца. Раствор отфильтровывали через 74 бумажный фильтр (Enderol filter № 2, Binzer) и охлаждали до 6–8 ºС. При необходимости рН растворов приводили к нейтральному значению насыщенным раствором гидрокарбоната натрия. Выделение ПАД проводили осаждением 30 мл, охлажденного до 6–8 ºС, 95 %–го этилового спирта. Осадок декантировали, дважды промывали в 10 мл 30 %–го водного раствора этилового спирта и сушили при Т ≈ 50 ºС и относительной влажности не выше 30 %. Взвешивали через 24 ч на аналитических весах OHAUS EP 214 C. Изменение кислотности обычно оказывает высокое влияние на скорость течения реакции. Однако, как видно из рисунка 3.15, увеличение кислотности в реакции окисления декстранов со средней молекулярной массой 35 кДа перманганатом калия не дает большого различия в показателе выхода продукта реакции. Изменение значения рН, из нейтральной области в сильнокислую, снижает выход основного продукта всего на 1,5–2,0 % и находится в пределах статистической погрешности. Наиболее вероятно, что общее снижение выхода продукта реакции обусловлено частичной кислотной деградацией клинических декстранов и образующихся ПАД. Изменение показателя выхода продукта реакции от рН в реакции окисления декстрана со средней молекулярной массой 60 кДа (рисунок 3.16), так же как и для декстрана со средней молекулярной массой 35 кДа, имеет слабовыраженный характер в пределах 2,0–2,5 %. Исходя из результатов исследований зависимости выхода продуктов в реакции окисления декстранов перманганатом калия в качестве условия, определяющего оптимальное значение кислотности реакционной массы, был выбран кинетический контроль. Оптимальное количество кислоты, вводимое в реакционную массу, было определено по точке экстремума производной функции кислотности среды по рН, представленной на рисунке 3.14. Оптимальный режим кислотности процесса окисления декстрана при рН 3,7–4,1. Использование в процессе кислоты в большем количестве, чем в точках выхода на плато, приводит к снижению выхода конечного продукта за счет деструкции и увеличению расхода сырья без значительного улучшения производственных показателей. % масс. 75 Рисунок 3.15 – Влияние кислотности среды на выход продукта в реакции окисления декстрана со средней молекулярной массой 35 кДа перманганатом % масс. калия. Количество окислителя: 1 – 2 % об., 2 – 4 % об. Рисунок 3.16 – Влияние кислотности среды на выход продукта в реакции окисления декстрана, со средней молекулярной массой 60 кДа перманганатом калия. Количество окислителя: 1 – 2 % об., 2 – 4 % об. 76 3.8 Физико–химический анализ структуры и состава декстранов, полиальдегиддекстранов и их конъюгатов (ИК–спектроскопия, УФ–спектроскопия, ПМР, ЯМР 13С, ВЭЖХ) Спектры УФ поглощения водных растворов клинических декстранов и ПАД в целях определения структуры были записаны на приборе СФ–2000 в режиме снятия спектра в области 190–350 нм. В качестве раствора сравнения использовали дистиллированную воду. Концентрации анализируемых веществ 10 % для декстранов и ПАД со средней молекулярной массой 35 кДа и 6 % для декстранов и ПАД со средней молекулярной массой 60 кДа. Водные растворы клинических декстранов и ПАД представляют собой бесцветные жидкости, почти не поглощающие излучение в видимой части спектра. Как следствие, наиболее информативная часть спектра поглощения располагается в УФ области 200–300 нм. Спектры поглощения для клинических декстранов представлены на рисунках 3.17 и 3.18, для ПАД на рисунках 3.19 и 3.20. Спектры поглощения в области 190–350 нм для клинических декстранов со средней молекулярной массой 35 кДа и 60 кДа имеют схожую форму и характеризуются невысоким уровнем поглощения и наличием максимума в области 240–280 нм. Наличие максимума в коротковолновой области поглощения характерно для насыщенных органических соединений без сопряженных кратных связей с возможным содержанием окси– и алкоксисвязей. Как и для клинических декстранов, спектры поглощения водных растворов ПАД находятся в основном в коротковолновой области. Это может свидетельствовать о том, что в реакции не образуются сопряженные кратные связи, вследствие протекания процесса в разрозненных точках полимерного остова молекулы. ИК–спектры записывали на спектрометре Bruker Vector 22 FT–IR в таблетках KBr при концентрации исследуемого вещества 1:150 или в тонком слое и использовали для определения структурных свойств ПАД. 77 Оптическая плотность 3 2 1 1190 240 2 290 2 360 длина волны, нм Рисунок 3.17 – Спектр поглощения водного раствора клинического декстрана со средней молекулярной массой 35 кДа Оптическая плотность 3 2 1 0 2 210 260 2 310 3 360 410 3 длина волны, нм Рисунок 3.18 – Спектр поглощения водного раствора клинического декстрана со средней молекулярной массой 60 кДа Оптическая плотность 78 1,1 0,6 0,1 190 19 240 24 290 29 360 длина волны, нм Рисунок 3.19 – Спектр поглощения водного раствора ПАД со средней молекулярной массой 35 кДа Оптическая плотность 1,1 0,6 0,1 190 19 240 24 290 29 360 длина волны, нм Рисунок 3.20 – Спектр поглощения водного раствора ПАД со средней молекулярной массой 60 кДа Для подтверждения присоединения ДНФГ к остову ПАД с образованием соответствующего основания Шиффа были сняты ИК–спектры клинического декстрана с M W = 35 кДа (1), ПАД № 3 с M W = 35 кДа (2) и конъюгата ПАД № 3 с 79 M W = 35 кДа и ДНФГ (3) (рисунок 3.21), для проведения сравнительного анализа. Все три ИК–спектра мало различаются в области 150–400 см–1, содержащей полосы поглощения, характерные для колебаний связей полимерного остова декстрана. Однако на ИК–спектре ПАД (2) есть слабая по величине полоса поглощения при 1712 см–1, отсутствующая на спектре клинического декстрана и соответствующая валентным колебаниям двойной –С=О связи в альдегидной группе. В ИК–спектре конъюгата ПАД с ДНФГ (3) есть средняя по величине полоса поглощения при 1598 см –1 , отсутствующая в спектрах клинического декстрана и ПАД, соответствующая валентным колебаниям –C=N связи, характерной для оснований Шиффа, указывающий на наличие крепкой ,% ковалентной связи между полисахаридной матрицей ПАД и ДНФГ. Рисунок 3.21 – ИК–спектры клинического декстрана с M W = 35 кДа (1), ПАД № 3 с M W = 35 кДа (2) и конъюгата ПАД № 3 с M W = 35 кДа и ДНФГ (3) Спектры–ЯМР 1 Н записывали на спектрометре Bruker AM 400 (400.132 МГц) с 10 % растворов исследуемых веществ в D2O. В качестве стандарта использовали сигналы остаточных протонов растворителя. Спектры– ЯМР 13 С были сняты в j–модуляции на спектрометре Bruker AM 400 (400.132 МГц), растворитель D2O. Все данные были получены без подавления сигналов, их использовали для определения структурных свойств ПАД. 80 Спектр–ЯМР 1Н (400 MHz, D2O) клинического декстрана с M W = 35 кДа содержит характеристические химические сдвиги протонов глюкозных циклов молекулы (рисунок 3.22). Химические сдвиги: С2,4 – 3,10 м.д., С3 – 3,29 м.д., С5,6 – 3,47 м.д., С1 – 4,54 м.д. На спектре не содержатся химические сдвиги посторонних веществ и примесей, что указывает на чистоту полученного продукта. OH 4 HO HO 5 3 1 2 OH O 6 HO OH O HO HO O 7 8 OH O Рисунок 3.22 – Спектр–ЯМР клинического декстрана с M W = 35 кДа На спектре–ЯМР 1Н образца ПАД № 3 с M W = 35 кДа (рисунок 3.23) в D2O (400 MHz) содержатся характеристические химические сдвиги протонов глюкозных циклов молекулы в области 3–5 м.д., имеющие схожую с спектром– ЯМР 1Н клинического декстрана картину распределения. Набор химических сдвигов при 7,68–8,94 м.д. соответствует сигналам различных форм альдегидных групп глюкозных колец, получившиеся в результате деструкции и дальнейшего гидратирования и циклизации. Учитывая, что в начале реакции окисления рН среды менее 5,0 и постепенно переходит в нейтральную область, то можно предположить наличие в образце ПАД трёх форм альдегидных групп. Химические сдвиги при 8,81 м.д. и 8,94 м.д. принадлежат негидратированным альдегидным группам (I) и их гидратированной форме (III), а пики при 7,68 м.д. и 8,16 м.д. – полуацеталям (IV). Так как выделение продукта, содержащего 81 альдегидные группы в конформации альдоенола (II), возможно только при рН < 3, то очевидно их отсутствие в исследуемых образцах. Отсутствие химических сдвигов протонов карбоксильных групп на спектре свидетельствует о «мягкой» деструкции молекул ПАД при окислении декстрана (образец № 3). CH2 O O CH2 O HC H2O O HC O HC I O HO OH II 2H2O CH2 O CH HO OH HC O H2O CH2 O O -H2O HO O HO OH III OH IV Рисунок 3.23 – Спектр–ЯМР 1Н ПАД № 3 с M W = 35 кДа Спектр–ЯМР 13 С (400 MHz, D2O) ПАД с M W = 35 кДа (рисунок 3.24) содержит характеристические химические сдвиги углеродных атомов глюкозных колец полисахарида. Химические сдвиги: С6 – 65,00 м.д., С4 – 69,66 м.д., С5 – 69,03 м.д., С2 – 70,92 м.д., С3 – 72,92 м.д., С1 – 97,17 м.д. Важным является отсутствие сигналов, принадлежащих С7 и С8 углеродным атомам в области 81 и 100,5 м.д. соответственно, что свидетельствует о деструкции остова молекул в области ответвления. Таким образом, можно сделать вывод, что в процессе окисления происходит «отгорание» боковых цепей молекулы с дальнейшим окислением глюкозных колец, к которым присоединялись боковые цепи. Положение окисленных глюкозных колец в молекулах ПАД будет соответствовать местам разветвления в исходной молекуле декстрана. Спектр–ЯМР 1Н (400 MHz, D2O) конъюгата ПАД № 3 ( M W = 35 кДа) с ДНФГ содержит характеристические химические сдвиги протонов глюкозных циклов молекулы (рисунок 3.24). Пики: С2,4–(3,33-3,39) м.д., С3–3,53 м.д., С5–3,72 м.д., С6–3,80 м.д. и С1–4,65 м.д. Сигналы хорошо разрешены вследствие наличия в 82 составе молекулы остатков 2,4–динитрофенилгидразина. В спектре содержатся химические сдвиги дийтерорастворителя HDO химический сдвиг при 4,79 м.д., и сигналы этилового спирта, триплет при 0,99 м.д. и квартет на 3,46 м.д. При 7,50 м.д. содержится сигнал протона гидразидной группы, указывающий на наличие в соединении крепкой ковалентной связи между остатком ДНФГ и полимерным остовом ПАД. Рисунок 3.24 – ЯМР 13С (400 MHz, D2O) ПАД № 3 с M W = 35 кДа Анализы высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) проводили на автоматизированном комплексе Shimadzu (2*LC–20AD, DGU–20A3, SPD–M20A) с колонкой для гель–фильтрующей фроматографии BioSep–SEC– S3000, параметры элюирования – элюент 0,1 М фосфатный буфер с рН 6,8, поток элюента – 1 мл/мин, длина волны детектора 220 нм. Регистрация в многоволновом режиме (рисунок 3.25). Водные растворы образцов предварительно фильтровали через целлюлозно–ацетатный микрофильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Использовали для определения структурных свойств ПАД и анализа продуктов реакции окисления клинических декстранов перманганатом калия. 83 Рисунок 3.25 – ЯМР 1Н (400 MHz, D2O) конъюгата ПАД № 3 ( M W = 35 кДа) с ДНФГ Образцы для ВЭЖХ получали из сухого ПАД с M W = 35 кДа, растворяя в 10 мл дистиллированной воде в количестве m=1 г. К раствору при перемешивании добавили 10 мл 0,2 н серной кислоты. ПАД гидролизовали в течение трёх часов, после чего нейтрализовали 0,5 М водным раствором гидроксида калия (здесь и далее ГОСТ № 6–01–301–74, ОАО «Реактив», содержание гидроксида калия не менее 95 %). Продукты гидролиза восстанавливали эквимолярным по отношению к окислителю количеством боргидрида натрия (здесь и далее ТУ 1–92–162–90, ОАО «Авиабор», содержание боргидрида натрия не менее 99,3 %). Водные растворы образцов перед анализом фильтровали через целлюлозно–ацетатный микрофильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Перманганат калия в кислой среде является сильным окислителем, и в отношении к полиолам окисление происходит с деструкцией –С–С– связей молекулы. В процессе окисления, в зависимости от рН среды, количества окислителя и строения окисляемой молекулы, деструкция может сопровождаться образованием концевых альдегидных или карбоксильных групп. Для определения характера течения реакции, окисления декстрана перманганатом калия были синтезированы, выделены и подготовлены к анализу образцы ПАД № 2 – 4 84 (хроматограмы I) и продукты их гидролиза (хроматограмы II) (рисунок 3.26). В соответствии с физико–химическими свойствами используемой в анализе гель– фильтруюшей колонки все вещества на хроматограмах можно разделить по молекулярной массе на три группы: «А» – исходные ПАД и продукты гидролиза ПАД с M W = 35 кДа; «Б» – продукты гидролиза ПАД с M W = 20 кДа; «В» – продукты гидролиза ПАД с молекулярными массами 180-8000 Да. Время выхода τ, мин Рисунок 3.26 – ВЭЖХ хроматограмы ПАД с M W = 35 кДа, с различным содержанием альдегидных групп и их продуктов гидролиза Для образца ПАД № 2 характерно неполное окисление всех молекул декстрана, о чём свидетельствует относительно большой пик хроматограмы «II» на 11–й минуте, соответствующий группе «А». Также видно, что используемого количества окислителя для получения ПАД недостаточно для окисления основного остова молекул декстрана и реакция окисления проходит в основном по концевым глюкозным остаткам, о чём свидетельствует отсутствие продуктов гидролиза в группе «Б» и пик на 22,5–й минуте в группе «В», соответствующий мономерным глюкозосодержащим остаткам. Таким образом, можно отметить недостаток окислителя в реакции получения ПАД № 2 для достижения максимально возможного количества альдегидных групп в составе продукта. Незначительное содержание продуктов гидролиза на хроматограме «II» образца ПАД № 3 в группе «А» указывает на отсутствие молекул декстрана, не 85 прореагировавших с окислителем и сопровождающихся деструкцией полимерного остова. Количество используемого окислителя для получения ПАД достаточно для образования альдегидных групп в основной цепи молекул декстрана, о чём свидетельствуют пики олигомеров различной молекулярной массы на хроматограме «II» в группе «В» на 18, 19,5 и 20,5–й минутах. Реакция получения ПАД не сопровождается окислительной деструкцией, о чём свидетельствует пик хроматограмы «II» на 21–й минуте, соответствующий низкомолекулярным глюкозосодержащим олигомерам. Процесс получения ПАД № 4 сопровождается окислением всех молекул декстрана, на что указывает отсутствие продуктов гидролиза в области «А» на хроматограме «II». Малое содержание продуктов гидролиза в области «Б» в сочетании с отсутствием олигомеров в области «В» свидетельствует о частичной окислительной деструкции полимерного остова молекулы. Используемое количество окислителя является избыточным, что, наряду с получением ПАД с более высоким содержанием альдегидных групп в составе, также приводит к деструкции и уменьшению молекулярной массы молекул. Исходя из данных ВЭЖХ хроматографии можно схематично представить процесс окисления молекулы декстрана перманганатом калия с использованием различного количества окислителя (рисунок 3.27). В левой части схемы показана полимерная молекула декстрана, а в правой части – возможные макромолекулярные структуры продуктов реакции для образцов ПАД № 2–4. Представленный механизм реакции окисления объясняет отличия в содержании альдегидных групп в ПАД, полученных теоретически и практически. Занижение практических результатов обусловлено в основном деструкцией полимерного остова декстрана, а также расходом окислителя на окисление побочных низкомолекулярных продуктов. Анализы методом капиллярного электрофореза выполняли на приборе «Капель 105М». Все электрофореграммы записывали в одинаковых условиях – 25 мМ боратный буфер с pH=9,5, напряжение на электродах 20 кВ, положительная полярность, ввод пробы 10 мбар · 15 с в автоматическом режиме, 86 λ = 202 нм, параметры капилляра – диаметр 75 мкм, Lреал/Lэфф = 60/50 м. В качестве растворов сравнения использовали свежеприготовленные растворы флуоресцеина и карбонилимидата флуоресцеина в 25 мМ боратном буфере. [O] [O] [O ] + 2 ец № з а обр образец №3 обр аз + ец №4 + Рисунок 3.27 – Механизм окисление декстрана: – концевой остаток глюкозы, – окисленный остаток глюкозы, зигзагом обозначена полимерная цепь, состоящая из глюкозных остатков 3.9 Очистка продуктов реакции ПАД с флуоресцеином В процессе создания способа получения меченных флуоресцеином декстранов и ПАД была использована ранее известная реакция. Основной задачей был выбор оптимальных условий реакции и флуоресцентной метки. В ряде предварительных экспериментов по определению влияния растворителя на ход реакции было установлено, что в качестве растворителя более эффективно использовать раствор 25 мМ боратного буфера, чем ДМСО. Основными недостатками использования ДМСО по сравнению с боратным буфером были: малая скорость реакции и дороговизна растворителя. Также не водный растворитель требовал больших затрат на очистку продуктов реакции с использованием полупроницаемых мембран [160–165]. Предварительно оценивали качество продуктов реакции ПАД с 1,1’–карбонилдиимидазолом, используя метод спектрофотометри. Пробы для анализа отбирали в процессе очистки на полупроницаемых мембранах. На каждом 87 цикле фильтрации брали пробу концентрата и фильтрата в объеме ~ 2 мл и помещали в кюветы спектрофотометре для СФ–2000 спектрофотометра. в режиме снятия Анализ спектра проводили на поглощения, на λ = 300–600 нм, в качестве раствора сравнения использовали дистиллированную воду. После окончания анализа пробы возвращались для дальнейшей очистки. Пробы для анализа чистоты продуктов взаимодействия ПАД с 1,1’–карбонилдиимидазолом брали в процессе очистки реакционной массы на полупроницаемых мембранах. Для конъюгатов ПАД со средней молекулярной массой 35 кДа были взяты пробы концентратов и фильтратов на 12 и 18 циклах очистки, а для конъюгатов ПАД со средней молекулярной массой 60 кДа – на 18 и 26 циклах. Объем анализируемой пробы ~1,5 мл помещали при помощи пластикового шприца в эпиндорф и проводили анализ. Для оценки эффективности очистки на полупроницаемых мембранах были синтезированы меченные флуоресцеином декстраны и ПАД № 3 с M W = 35 кДа и 60 кДа. На рисунке 3.28 приведены пакеты УФ–спектров, соответствующие результатам 6, 12 и 18 циклов концентрирования для ПАД № 3 с M W = 35 кДа (а) меченного флуоресцеином, и 13, 18, 22 и 27 циклам концентрирования для ПАД № 3 с M W = 60 кДа (б) меченного флуоресцеином. Буквами «К» отмечены концентрируемые растворы, содержащие меченные флуоресцеином ПАД, буквами «Ф» – растворы фильтратов, содержащие непрореагировавший флуоресцеин и низкомолекулярные продукты. Из приведенных данных видно, что интенсивность максимумов в спектрах К6 – К18 и К13 – К27 соответственно в области 491–-498 нм снижается, что свидетельствует о значительной скорости процесса очистки реакционной массы от непрореагировавшего флуоресцеина. Малое значения максимумов для спектров Ф18 на первом изображении (рисунок 3.28) и Ф27 на втором, а также незначительное изменение максимума в области 491–498 нм для результатов циклов отмывки после К18 и К27 соответственно показывают почти полное отсутствие флуоресцеина в фильтратах и свидетельствуют о возможности окончания процесса отмывки. Dср Dср 88 λ, нм λ, нм а б Рисунок 3.28 – Спектры поглощения концентратов и фильтратов – результатов процесса очистки ПАД № 3, меченных флуоресцеином с M W = 35 кДа (а) и 60 кДа (б) Для более точного определения степени чистоты полученных ПАД № 3, меченных флуоресцеином, конъюгаты анализировали методом капиллярного электрофореза (рисунок 3.29). Концентраты меченных флуоресцеином ПАД № 3: К12 (электрофореграмма № 3) и К18 (электрофореграмма № 4) для ПАД № 3 с M W = 35 кДа, а также К18 (электрофореграмма № 5) и К26 (электрофореграмма № 6) для ПАД № 3 с M W = 60 кДа, 0,24 мМ раствор сравнения флуоресцеина в 0,25 мМ боратном буфере (электрофореграмма № 1). Как видно из электрофореграммы № 1, в данных условиях пик, принадлежащий флуоресцеину, появляется на 19–й минуте (отмечен буквой «а»). На второй электрофореграмме представлена смесь 0,15 мМ карбонилимидата флуоресцеина (на рисунке 3.29 отмечен буквой «b») и 0,09 мМ флуоресцеина в боратном буфере на 6,5 и 19–й минутах соответственно. Отсутствие пика в области 19–й минуты на электрофореграммах № 4 и 6, соответствующих концентратам ПАД № 3 с MW = 60 кДа и 35 кДа, меченных флуоресцеином, после очистки на полупроницаемых мембранах, указывает на отсутствие не связанного с ПАД 89 флуоресцеина в конечном продукте. Более того, отсутствие аналогичного пика на электрофореграмме № 5, принадлежащей раствору концентрирования К18, для ПАД № 3 с M W = 60 кДа, указывает на возможность завершения процесса очистки Оптическая плотность, D уже на 18–м цикле, как и для ПАД № 3 с M W = 35 кДа. Время выхода τ, с Рисунок 3.29 – Электрофореграммы растворов На рисунке 3.29 представлены электрофореграммы растворов: 1 – флуоресцеина; 2 – флуоресцеина и карбонилимидата флуоресцеина; 3 – фильтрат реакционной массы ПАД № 3 с M W = 60 кДа, меченным флуоресцеином, на 18–м цикле очистки; 4 – фильтрат реакционной массы ПАД № 3 с M W = 60 кДа, меченным флуоресцеином, на 26–м цикле очистки; 5 – фильтрат реакционной массы ПАД № 3 с M W = 35 кДа, меченным флуоресцеином, на 12–м цикле очистки; 6 – фильтрат реакционной массы ПАД № 3 с M W = 35 кДа, меченным флуоресцеином, на 18–м цикле очистки. На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что очищенные на полупроницаемых мембранах флуоресцентномеченные декстраны и ПАД № 3 с M W = 35 кДа и 60 кДа обладают достаточной чистотой для применения их в исследованиях на культурах клеток. 90 ГЛАВА 4 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ОКИСЛЕНИЯ ДЕКСТРАНА В УСЛОВИЯХ ОПЫТНО–ПРОМЫШЛЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА Лабораторные исследования реакции окисления декстрана позволили установить оптимальные режимы проведения процесса. Следующим шагом стало исследование и отработка процесса на опытно–промышленной установке. Для этого было необходимо определить степень влияния основных параметров на процесс окисления в полном факторном эксперименте, границы которых были определены исходя из результатов однофакторных экспериментов. На основании результатов проведенных экспериментов были представлены рекомендации по составу аппаратов технической линии получения ПАД окислением перманганатом калия. Отрабатывали технологию окисления декстрана в целях получения ПАД в промышленных условиях на реакторе Р50.130–00.000 производства ООО «Артлайф–техно» (г. Юрга) объемом 50 л (рисунок 4.1), который входит в технологическую линию получения ПАД в ОАО «ФНПЦ «Алтай». Рисунок 4.1 – Промышленный реактор 91 Дополнительно исследовали влияние параметров фильтрующего материала на процесс очистки и качество получаемых ПАД. Для прогнозирования объема изготовления продукта были рассчитаны материальный баланс годовой производительности опытно–промышленной линии и нормы расхода сырья на 1 кг продукции. 4.1 Определение оптимальных параметров процесса окисления декстрана в промышленном реакторе Исходя из данных лабораторных исследований в качестве основных влияющих параметров процесса окисления декстрана в промышленном реакторе были исследованы: количество используемого окислителя, температура реакционной массы и кислотность среды. Больший объем реактора, по сравнению с лабораторными условиями, обусловливает неравномерное распределение реагентов по объему, вследствие чего появляется необходимость изучения влияния времени реакции от частоты вращения мешалки. Технически эксперименты, поставленные в условиях промышленного реактора, схожи с аналогичными лабораторными экспериментами. Оптимальное количество окислителя в процессе получения ПАД на опытно– промышленном реакторе определяли следующим образом. В реактор помещали 10 %–й водный раствор декстрана с молекулярной массой 35 кДа в объеме 50 л. Прибавляли 33 %–ю уксусную кислоту из расчета 4 % об. на загрузку. Реакционную массу термостатировали до 75 ºС. При перемешивание реакционной массы с частотой вращения мешалки 180 об./мин (при проведении однофакторного эксперимента, в качестве поискового, было выбрано среднее значение частот вращения аппарата), прибавляли 2 %–й водный раствор перманганата калия в количествах – 0,5; 1,0 и 2,0 % об. (для трёх серий экспериментов). Пробы для анализа содержания альдегидных групп в продуктах реакции отбирали каждые десять минут в течение одного часа. Анализ результатов, представленных на рисунке 4.2, показывает, что оптимальным 92 временным промежутком для проведения реакции является 30–40 мин. Оптимальное время проведения процесса окисления определялось по точке перегиба на графике для эксперимента с количеством окислителя, равным 2,0 % об. Учитывая, что скорость реакции окисления декстрана перманганатом калия в условиях эксперимента может быть охарактеризована как реакция псевдопервого порядка, можно определить взаимную зависимость скоростей реакций. Отношение скоростей реакций для двух экспериментов будет равно отношению тангенсов угла наклона касательных для графиков зависимостей содержания альдегидных групп в ПАД от времени реакции для этих экспериментов. Вычисляя касательные к графикам и определяя тангенсы угла наклона касательных, можно определить как τ0,5 = 0,38 τ 2,0 и τ 1,0=0,71τ2,0, где τ 0,5, τ 1,0, τ 2,0 – времени реакций для экспериментов с использованием окислителя Содержание альдегидных групп, мкМ/мг в количестве 0,5; 1 и 2 % об. соответственно). 0,6 0,4 0,2 0 0 20 0,5 % об. 40 1,0 % об. τ, мин 60 2,0 % об. Рисунок 4.2 – Выход альдегидных групп от времени окисления для различных значений количества окислителя Далее определяли оптимальный температурный режим процесса окисления декстрана в промышленном реакторе. Для этого в реактор помещали 50 л 10 %–го водного раствора декстрана и термостатировали при температуре 40, 60 и 75 ОС. В реакционную массу добавляли 33 %–ю уксусную кислоту из расчета 4 % об. на 93 загрузку. Реакционную массу так же перемешивали с частотой вращения 180 об./мин. В реактор загружали водный 2 %–й раствор перманганата калия из расчета 2 % об. на загрузку. Пробы для анализа отбирали каждые десять минут в течение одного часа. Результаты анализа зависимости содержания альдегидных Содержание альдегидных групп, мкМ/мг групп от времени для различных температур приведены на рисунке 4.3. 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 τ, мин О 40 оС С О 60 оС С О 75 оСС Рисунок 4.3 – Выход альдегидных групп от времени окисления для различных значений температуры реакционной массы Анализируя графики зависимости (см. рисунок 4.3) можно сделать вывод, что оптимальной температурой процесса реакции окисления декстрана в промышленном реакторе, из исследуемых, является τ =75 ºС, так как выход соответствующего графика на плато происходит быстрее, чем для графиков зависимостей при 60 и 40 ºС. Определяя точки перегиба как показатель окончания процесса окисления для соответствующих графиков можно определить время окончания реакции: t75=38,2 мин, t60=42,4 мин и t40=57,8 мин (для процессов, проводимых при t = 75, 60 и 40 ОС соответственно). Значение времени выхода на плато графиков зависимостей для экспериментов, проводимых при 40 и 60 ºС, больше, чем аналогичный показатель для эксперимента, проводимого при t = 75 ºС. Такая зависимость времени выхода графиков на плато от температуры 94 реакции свидетельствует о значительном снижении скорости реакции при уменьшении температуры реакционной массы. Для определения влияния кислотности среды на содержание альдегидных групп в продуктах реакции окисления декстрана от времени в условиях промышленного реактора использовали декстран с молекулярной массой 35 кДа. Водный 10 %–й раствор декстрана в объёме 50 л помещали в реактор, термостатировали при t = 75 ºС и перемешивали механической мешалкой с частотой вращения 180 об./мин. В реакционную массу приливали 10 %–ю соляную кислоту в объеме, достаточном для создания заданного начального значения кислотности среды: рН = 2, 3, 4 и 5. После тщательного перемешивания в реакционную массу вводили 2 %–й водный раствор перманганата калия из расчёта 2 % об. на загрузку. Отсчёт времени начинали с момента введения окислителя. Пробы для анализа отбирали каждые десять минут в течение одного часа (рисунок 4.4). Содержание альдегидных групп, мкМ/мг 0,6 0,4 0,2 0 0 20 рН 2 рН 3 40 60 τ, мин рН 4 рН 5 Рисунок 4.4 – Выход альдегидных групп от времени окисления для различных значений кислотности среды Исходя из данных, представленных на рисунке 4.4, можно сделать вывод, что кислотность раствора влияет на скорость реакции окисления декстрана. Увеличение концентрации протонов в реакционной массе сопровождается ростом скорости реакции, что обусловлено увеличением константы скорости реакции за 95 счет повышения электродного потенциала реакции восстановления перманганатиона. Однако процесс увеличения скорости реакции в значительной степени замедляется после рН 4. Такое поведение системы обусловлено каталитическим насыщением системы, которое приводит к фиксации значения скорости реакции при дальнейшем увеличении кислотности среды. Оптимальное значение рН можно принять равным 4,0–4,5. Оптимальное время проведения процесса определяется как точка перегиба на графике для эксперимента со значением рН 4 и составляет 30 мин. Наибольшее различие скоростей реакций для различных значений рН реакционной массы наблюдается в области 30 мин и наиболее выгодно для рН 4,0–4,5. Лабораторные эксперименты по определению зависимости содержания альдегидных групп от количества используемого окислителя, а также исследования механизма реакции окисления декстрана показали, что локальный избыток окислителя может привести к переокислению продукта реакции с дальнейшим образованием побочных продуктов и уменьшением выхода целевого продукта. Такие результаты исследований вкупе с фактом использования промышленного реактора (объемом 50 л) делают очевидной необходимость изучения влияния интенсивности перемешивания реакционной массы на время реакции. Для этого исследовали реакцию окисления для декстрана с молекулярной массой 35 кДа. Водный 10 %–й раствор декстрана, объёмом 50 л помещали в реактор, термостатировали при t = 75 ºС и прибавляли раствор водной 33 %–й уксусной кислоты из расчёта 4 % об. на одну загрузку. Устанавливали один из определяемых скоростных режимов вращения мешалки: 60, 120, 180 или 240 об./мин, затем в реактор прибавляли 2 % об. водного 2 %–го раствора перманганата калия. Началом времени отсчёта считали момент введения окислителя в реакцию. Процесс проводили в течение одного часа, пробы для анализа отбирали через каждые 10 минут (рисунок 4.5). Содержание альдегидных групп, мкМ/мг 96 0,6 0,4 0,2 0 0 60 об./мин 20 120 об./мин τ, мин 40 180 об./мин 60 240 об./мин Рисунок 4.5 – Выход альдегидных групп от времени окисления для различных значений частот вращения мешалки Результаты исследования (см. рисунок 4.5) подтверждают влияние скорости вращения мешалки на процесс окисления. Установлено, что он оптимально протекает при частоте вращения мешалки 180 и 240 об./мин и завершается через 30–32 минуты с выходом графиков на плато. Оптимальным режимом вращения мешалки можно считать частоту 180 об./мин, так как ее уменьшение заметно увеличивает время окисления декстрана в промышленном реакторе. Увеличение времени реакции, обусловленное снижением частоты вращения мешалки при условии локального избытка окислителя приводит к переокислению декстрана, о чем свидетельствует снижение асимптот графиков на рисунке 4.5. 4.2 Определение зависимостей окисления декстрана перманганатом калия в условиях промышленного реактора Для определения зависимостей процесса окисления декстрана проводился полный факторный эксперимент. На основании полученных результатов однофакторных экспериментов, в качестве влияющих параметров полного факторного эксперимента были выбраны: количество используемого окислителя, температура реакционной массы, кислотность среды, частота вращения мешалки и время проведения реакции. В качестве отклика системы было выбрано 97 содержание альдегидных групп в продуктах реакции. Границы значений полного факторного эксперимента были следующие: количество окислителя – оптимальное значение 2 % об., границы 1,5–2,5 % об.; температура реакционной массы – оптимальное значение 75 ºС, границы 72–85 ºС; кислотность реакционной массы – оптимальное значение 4, границы 3,0–5,0 единиц рН. Частота вращения мешалки – оптимальное значение 180 об./мин, границы 100–200 об./мин.; границы времени в полном факторном эксперименте определяли как максимальное и минимальное значение оптимального времени в однофакторных экспериментах (±5) мин., т.е. границы 20–40 мин. В соответствии с условиями полного факторного эксперимента для пяти независимых факторов число экспериментальных точек должно быть равно 32. Результаты и параметры матрицы эксперимента представлены в таблице 6. Данные, полученные при проведении полного факторного эксперимента, обрабатывались при помощи комплекса «Statistica 6.1». Параметры модели полного факторного эксперимента – линейная регрессия с доверительной вероятностью не менее 90 %. В результате было получено эмпирическое уравнение зависимости количества альдегидных групп от технологических параметров процесса: А=0,034 + 0,1С + 0,15τ + 0,0013Cτ + 0,004n – 0,004рH + 0,0036t + 0,0008tCτ, (30) где А – количество альдегидных групп, мкМ/мг; τ – время проведения процесса, мин; n – частота вращения мешалки, об./мин; t – температура раствора, ОС; С – количество окислителя, % об.; рН – водородный показатель. Значимость коэффициентов уравнения регрессии соответствует доверительной вероятности 95 %. На основании результатов полного факторного эксперимента основными критериями для оптимизации режимов процесса окисления декстрана были выбраны минимальное время реакции и максимальное количество альдегидных групп в образующихся ПАД. Количество используемых окислителя не вошло в перечень оптимизируемых параметров по причине прямой зависимости количества альдегидных групп в ПАД от количества используемого окислителя. 98 Таблица 6 – Матрица планирования полного факторного эксперимента и результаты эксперимента рН t, ºС Количество окислителя, % об. 3 3 3 3 3 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 3 5 72 72 72 72 85 72 72 72 85 72 72 72 85 85 85 85 85 85 72 85 85 85 72 85 72 72 85 85 85 72 85 85 1,5 1,5 1,5 2,5 1,5 1,5 1,5 2,5 1,5 1,5 1,5 2,5 1,5 2,5 2,5 1,5 2,5 1,5 2,5 2,5 2,5 1,5 2,5 1,5 1,5 2,5 2,5 2,5 1,5 2,5 2,5 2,5 Частота вращения мешалки, об./мин 100 100 300 100 100 100 300 100 100 100 300 100 100 300 100 300 300 100 300 300 100 300 300 100 300 100 300 100 300 300 300 300 Время окисления, мин 20 40 20 20 20 20 40 40 40 40 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 40 40 40 40 40 40 20 40 40 40 40 40 Количество альдегидных групп в ПАД, мкМ/мг 0,2271 0,3411 0,2311 0,3113 0,2309 0,2231 0,3457 0,4638 0,3451 0,3396 0,2268 0,3091 0,2272 0,3182 0,3141 0,2369 0,3146 0,2273 0,3115 0,3179 0,4679 0,3492 0,4674 0,3409 0,3413 0,4604 0,3142 0,4636 0,3449 0,4639 0,4712 0,4682 99 Количество альдегидных групп в ПАД рассматривается в технологии окисления декстрана как показатель качества получаемого продукта, а время окисления – как характеристика производительности процесса. Таким образом, для опытно–промышленного производства в ОАО «ФНПЦ «Алтай» для получения ПАД с содержанием альдегидных групп 2–5 % масс. при минимальной производительности процесса были установлены следующие режимы: количество используемого окислителя (2 % KMnO4) С = 2–2,5 % об., рН 4,1, температура реакционной массы t = 78 °С, частота вращения мешалки 180 об./мин, время процесса окисления 40 мин. В качестве сырья использовали 10 %–й водный раствор декстрана с молекулярной массой 35 кДа. 4.3 Очистка ПАД от диоксида марганца фильтрованием 4.3.1 Описание исследуемой среды Конечный продукт получения ПАД должен соответствовать нормам качества для фармацевтического сырья и заявленным характеристикам: степень чистоты – не менее 99 %, содержание неорганических примесей (зольность) – не более 0,1 %. Соответствие качеству продукта по зольности достигается его очисткой на стадиях производства. Основной вклад в образование неорганических примесей вносит перманганат калия. В процессе окисления декстрана введенный в реакцию перманганат калия восстанавливается до нерастворимого оксида марганца (VI). Продукт необходимой чистоты можно получить механическим фильтрованием. Для выбора фильтрующего материала частицы осадка диоксида марганца анализировали на растровом электронном микроскопе (рисунок 4.6). Средний размер частиц осадка составил 0,9 мкм. Таким образом, был исследован раствор декстраналя концентрацией 10 % с примесью диоксида марганца со средним размером частиц 0,9 мкм, кислотность среды рН 6. 100 Рисунок 4.6 – Осадок двуокиси марганца при увеличении в 50 и 10 000 раз 4.3.2 Описание экспериментальной установки фильтрования Для экспериментальных исследований процесса фильтрования диоксида марганца, определения свойств его осадка и выбора мембраны, отвечающей наибольшей производительности при минимальном проскоке частиц осадка, использовали установку, технологическая схема которой представлена на рисунке 4.7. Она включает в себя друк–фильтр 1, компрессор 4, кран 5, манометр 6, мерный стакан 7. В качестве фильтрующего элемента на ложном днище 2 размещали мембрану 3. Рисунок 4.7 – Технологическая схема установки для определения свойств осадков 101 Конструкция друк–фильтра, показанная на рисунке 4.8, включает в себя корпус с днищем и крышкой. Ложное днище изготовлено в виде металлического диска толщиной 4 мм с несколькими отверстиями диаметром 2 мм и соединяющими их канавками. Все детали друк–фильтра выполнены из стали марки 12Х18Н10Т. Компрессор создает избыточное давление внутри фильтра, которое регулируется с помощью крана и контролируется с помощью манометра. Мерный стакан используется для приема и замера объема фильтрата. Установки, подобные описанной, используются для предварительного исследования свойств осадков и фильтровальных материалов. Рисунок 4.8 – Внешний вид друк–фильтра В экспериментах использовали микрофильтрационные мембраны марок МФАС–ОС–2 (размер пор 0,45 мкм), МФАС–ОС–4 (размер пор 0,6 мкм), МФАС–ОС–3 (размер пор 0,8 мкм) производства ЗАО НТЦ «Владипор». Материал мембран – фторопласт, поверхность фильтрации 7,06 см2. 102 4.3.3 Методика проведения экспериментов по фильтрации диоксида марганца а) Определение удельного сопротивления и плотности осадка В экспериментах по определению удельного сопротивления и плотности осадка диоксида марганца использовали мембрану МФАС–ОС–2. Прежде чем приступить к определению свойств осадка, необходимо установить экспериментальным путем гидравлическое сопротивление мембраны. Для этого в друк–фильтр заливали дистиллированную воду и создавали избыточное давление 0,1 МПа. Время процесса фильтрации определяли по секундомеру. Каждые 2,5 мин мерным стаканом замеряли объем фильтрата. Количество проб для каждого эксперимента равно шести. По полученным данным объемов фильтрата рассчитывали скорость фильтрации по формуле [154, 155]: , (31) скорость фильтрации, м3/м2ч; где площадь фильтрации, м2; время фильтрации, с. Затем определяли скорость фильтрации, рассчитывая сопротивление фильтровальной перегородки по формуле [154, 155]: , где (32) гидравлическое (мембраны), м–1; сопротивление фильтровальной перегородки перепад давления на друк–фильтре, Па; µ – коэффициент динамической вязкости среды, Па·с. Удельное сопротивление осадка диоксида марганца определяли, используя метод с непрерывным возрастанием слоя осадка. В друк–фильтр заливали раствор ПАД с установленной концентрацией приготовленного раствора составляла 23 диоксида марганца. Температура О С. Компрессором в друк–фильтре создавали давление 0,1 МПа, и каждые 2,5 мин замеряли объем фильтрата. Для анализа отбирали шесть проб. По полученным объемам фильтрата рассчитывали скорость фильтрации по формуле (31). 103 После завершения процесса фильтрации мембрану с осадком диоксида марганца извлекали из друк–фильтра, высушивали и микрометром замеряли высоту осадка. По полученным данным рассчитывали удельное сопротивление осадка по закону Дарси [156, 157]: , где (33) удельное сопротивление осадка, м–2; высота слоя осадка, м. Сухой осадок взвешивали на весах и далее рассчитывали его плотность, используя формулу [158, 159]: , где плотность осадка, кг/м3; (34) масса сухого осадка, кг; площадь фильтрации, м2. б) Исследование мембран различных марок Для определения марки мембраны, при которой процесс фильтрации протекал бы с наибольшей скоростью и при этом обеспечивал большую степень очистки раствора от частиц диоксида марганца, использовали мембраны марок МФАС–ОС–2 (размер пор 0,45 мкм), МФАС–ОС–4 (размер пор 0,6 мкм), МФАС–ОС–3 (размер пор 0,8 мкм). Данные мембраны выбрали исходя из среднего размера частиц диоксида марганца 0,9 мкм. В друк–фильтр заливали раствор ПАД с примесью диоксида марганца и создавали давление 0,1 МПа. Для контроля времени применяли секундомер. Каждые 2,5 мин мерным стаканом замеряли объем фильтрата. На каждой мембране отобрали шесть проб. По полученным данным объемов фильтрата рассчитывали скорость фильтрации по формуле (31). Полученный фильтрат анализировали на предмет остаточного содержания примеси диоксида марганца. 104 4.3.4 Результаты экспериментальных исследований процесса фильтрации диоксида марганца а) Удельное сопротивление и плотность осадка На первом этапе определяли гидравлическое сопротивление чистой мембраны МФАС–ОС–2. Его величина составила 9,8·109 м–1. Далее определяли удельное сопротивление и плотность осадка диоксида марганца. Для этого 200 мл тестового водного раствора, содержащего 5 мг/мл диоксида марганца, фильтровали на друк–фильтре, затем мембрану с осадком высушивали и измеряли высоту осадочного слоя по разнице толщин мембраны с осадком и «чистой мембраны» при помощи микрометра с ценой деления 1 мкм – она составила 0,00076 м. На основе полученных данных рассчитали удельное сопротивление осадка диоксида марганца по формуле (33), которое составило 1,83·1013 м–2. После взвешивания массы осадка, которая составила 0,002 кг, стало возможным рассчитать его плотность по формуле (34). Ее значение составило 3600 кг/м3. б) Исследование мембран различных марок В результате фильтрации раствора ПАД от диоксида марганца были получены графические зависимости скорости фильтрации WФ от времени τ (рисунок 4.9). Использовали мембраны марок МФАС–ОС–2 (размер пор 0,45 мкм), МФАС–ОС–4 (размер пор 0,6 мкм), МФАС–ОС–3 (размер пор WФ, л/м2ч 0,8 мкм). 20000 10000 0 0 – МФАС-ОС-2 5 – МФАС-ОС-3 10 τ, мин 15 – МФАС-ОС-4 Рисунок 4.9 – Зависимость скорости фильтрации раствора ПАД от времени 105 Из рисунка 4.9 видно, что фильтрацию раствора окисленного декстрана после окисления предпочтительно вести на мембране марки МФАС–ОС–3, так как на ней достигнута наибольшая производительность. В производственной линии получения ПАД единовременно фильтруется 20 л раствора окисленного декстрана. При использовании мембраны МФАС–ОС–3 данная стадия занимает около 4 минут (вертикальная линия на рисунке 4.9). Раствор ПАД после фильтрации анализировали на содержание примеси диоксида марганца (рисунок 4.10) 15,7 Содержание MnO2, мг/л 16 12,3 12 9,1 8 4 0 МФАС-ОС-2 МФАС-ОС-4 МФАС-ОС-3 Рисунок 4.10 – Содержание диоксида марганца в растворе ПАД после фильтрации на мембранах разных марок Судя по диаграмме, при использовании для фильтрации мембраны с наибольшим размером пор, содержание примесей диоксида марганца максимальное. Однако такое содержание примесей допустимо с точки зрения норм технологического процесса, так как эти примеси удаляются на последующих этапах очистки раствора ПАД. Таким образом, из фильтров, соответствующих требованию чистоты продуктов, наибольшей производительностью обладает МФАС–ОС–3. 106 4.4 Рекомендации по выбору аппаратурно–технического исполнения производственной линии получения ПАД В результате проведенных исследований процесса окисления декстрана перманганатом калия в промышленном реакторе был сформулирован ряд рекомендаций для производства ПАД: 1) оптимальная температура процесса окисления составляет 78 °С и позволяет использовать промышленный реактор с водяной тепловой рубашкой. Применение в качестве теплоносителя горячей воды, а не пара, дает возможность упростить процесс конструирования и создания производственной линии; 2) мешалка, используемая в реакторе окисления, может обеспечить гомогенизацию реакционной массы при частоте ее вращения 180 об./мин; 3) в процессе фильтрации раствора декстраналя от диоксида марганца рекомендуется использовать фильтрующий материал с размером пор не более 0,8 мкм. Процесс производства ПАД включает в себя следующие этапы: 1) приготовление растворов исходных реагентов: декстрана, перманганата калия и уксусной кислоты; 2) окисление раствора декстрана и получение ПАД; 3) фильтрование реакционной массы с отделением побочных продуктов реакции (диоксида марганца); 4) очистка готового продукта, сушка и расфасовка. При исследовании процесса окисления были проработаны вопросы по построению технологических этапов опытно–промышленного производства. В основе построения производственной линии по получению ПАД (рисунок 4.11) содержатся аппараты, заимствованные из технологии производства декстранов, описанной в литературном обзоре. При выборе расположения функциональных блоков производства необходимо учитывать разграничение «чистых» и «грязных» зон. Так как в производстве ПАД используются растворы кислоты (уксусной) и сильного окислителя (перманганата калия), то это требует: использования 107 коррозионно-защищённого оборудования; соблюдения техники безопасности при работе с кислотами и окислителями. Процесс окисления декстранов перманганатом калия и их последующая очистка не требуют применения высокого давления. Давление в системе трубопроводов, связывающих отдельные блоки производственной линии, определяется необходимым потоком применяемых насосов. Рисунок 4.11 – Принципиальная схема технологической линии получения ПАД Рассмотрим более подробно возможное аппаратурное исполнение производственной линии получения ПАД. Основным сырьем для его получения являются сухие порошки и готовые 10 %–е водные растворы декстранов. В качестве реактора окисления можно использовать цилиндрический реактор с вертикальной загрузкой из нержавеющей стали, оборудованный нагреваемый горячей водой рубашкой и механической мешалкой. На следующем этапе реакционная масса после завершения реакции окисления проходит очистку от взвеси диоксида марганца на микрофильтре. Очищенный от механических примесей продукт поступает на ионообменную колонку в случае, если фильтрования было не достаточно и в растворе присутствуют примесные неорганические ионы. Конечный продукт высушивают, используя распылительную сушку. Сухой порошкообразный продукт упаковывают в 108 полиэтиленовые мешки. Для определения экономических показателей производственной линии был рассчитан материальный баланс (таблица 8). В качестве основных параметров производственной периодический, линии ПАД были производительность заложены одного цикла следующие: процесс 2 годовая кг/цикл, производительность участка 500 кг/год. Таблица 8 – Материальный баланс годовой производительности Приход Масса, кг Декстран Вода очищенная Марганцовокислый калий Уксусная кислота Итого: 500,50 6905,00 6,00 61,00 7472,50 Расход Масса, кг 1 Диальдегиддекстран 2 Двуокись марганца 3 Отходы всего, в том числе: вода уксусная кислота пыль диальдегиддекстрана Итого: 500,00 6,00 6905,00 61,00 0,5 7472,50 Нормы расхода сырья на 1 кг продукта в условиях опытно–промышленного производства представлены в таблице 9. Таблица 9 – Норма расхода сырья на 1 кг продукта Сырье Декстран Двуокись марганца Кислота уксусная Вода Норма расхода, кг 1,05 0,012 0,122 13,8 При реализации процесса образуются следующие отходы: твердые отходы (ветошь, использованные фильтры), двуокись марганца и жидкие отходы. 109 Твердые отходы, образующиеся в процессе производства, можно утилизировать путем упаковывания в полиэтиленовые или бумажные мешки и по мере накопления отправлять на уничтожение методом сжигания. Двуокись марганца, так как оно является веществом II класса опасности и содержит марганец, по мере накопления необходимо отправлять на специализированное предприятие для переработки. Жидкие отходы: слабые растворы кислот, получаемые при регенерации ионообменных смол, воду, получаемую после промывки оборудования, необходимо нейтрализовать и очистить, и, после соответствующей проверки, слить в канализацию. 110 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ В результате проведенной работы была разработана и освоена технология получения полиальдегиддекстранов методом окисления декстранов перманганатом калия. Так же при выполнении диссертационной работы были получены следующие результаты: 1. Исследованы закономерности процесса окисления декстранов перманганатом калия, на основании которых разработана теоретическая модель процесса окисления декстранов, учитывающая различия в энергиях окисления глюкозных колец. 2. Разработана оригинальная фотометрическая методика контроля качества ПАД, получаемых в процессе окисления декстранов перманганатом калия, которая позволила производить оценку продукта с малым содержанием альдегидных групп. 3. Изучено влияние технологических параметров процесса окисления на свойства ПАД и в результате установлены экспериментальные зависимости количества окислителя, температуры и кислотности реакционной среды на время реакции и качество получаемых окисленных декстранов. 4. Установлено эмпирическое уравнение зависимости количества альдегидных групп от технологических параметров, позволившее определить оптимальные режимы окисления декстрана при получении ПАД в ОАО «ФНПЦ «Алтай»: количество окислителя KMnO4 1,65 % об., кислотность реакционной массы рН 3,0, температура проведения процесса 70 °С. Предложены рекомендации по применению результатов исследований при проектировании стадий окисления и фильтрации технологического процесса получения ПАД. 111 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПАД – полиальдегиддекстран ДНФГ – 2,4–динитрофенилгидразин ГИНК – гидразид изоникотиновой кислоты КДИ – 1,1’–карбонилдиимидазол ФИТЦ – флуоресцеин изотиоционат (FITC) ГПХ – гель проникающая хроматография ЯМР – ядерный магнитный резонанс ИК – инфракрасная спектроскопия УФ – ультрафиолетовая спектроскопия ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография 112 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Taylor, C. Application of high–performance liquid chromatography to a study of branching in dextrans / C. Taylor, N.W.H. Cheetham, G.J. Walker // Carbohydrate Research. – 1985. – № 137. – P. 1–12. 2. Sidebotham, R.L. Dextrans / R.L. Sidebotham // Advanced Carbohydrate Chemical Biochemistry. – 1974. – № 30. – P. 371–444. 3. Dextran / G.H. Bixler, G.E. Hines, R.M. McGhee, R.A. Shurter // Industrial and Engineering Chemistry. – 1953. – Vol. 45. – P. 692–705. 4. Van Tieghem, P. On sugar–mill gum / P.Van Tieghem // Annual Science Nature Botanic Vegetable Biology. – 1878. – № 7. – P. 180–203. 5. Samassa, M.G. The manufacture of dextran / M.G. Samassa // S.A. Medical Journal. – 1954. – P. 549–550. 6. Characterization of dextransucrases from Leuconostoc mesenteroides NRRL B–1299 / M. Dols, M. Remaud–Simeon, R.M. Willemot [et al] // Application Biochemical Biotechnol. – 1997. – № 62. – P. 47–53. 7. Seymour, F.R. Metylation structural analysis of unusual dextrans by combined gas–liquid chromatography–mass spectrometry / F.R. Seymour, E.C.M. Chen, S.H. Bishop // Carbohydrate Research. – 1979. – № 68. – P. 113–121. 8. Сиггиа, С. Количественный органический анализ по функциональным группам: Перевод с английского / С. Сиггиа, Дж.Г. Ханна. – М.: Химия, 1983. – 672 с. 9. An improved procedure for the methylation analysis of oligosaccharides and polysaccharides / P.J. Harris, R.J. Henry, A.B. Blakeney, B.A. Stone // Carbohydrate Research. – 1984. – № 127. – P. 59–73. 10. Six unusual dextrans: methylation structural analysis by combined g.l.c. – m.s. of per–O–acetyl–aldononitries / F.R. Seymour, M.E. Slodki, R.D. Plattner, A. Jeanes // Carbohydrate Research. – 1977. – № 53. – P. 153–166. 113 11. Metylation analyses of NRRL dextrans by capillary gas–liquid chromatography / M.E. Slodki, R.E. England, R.D. Plattner, W.E. Dick // Carbohydrate Research. – 1986. – № 156. – P. 199–206. 12. Metylation analyses of NRRL dextrans by capillary gas–liquid chromatography / M.E. Slodki, R.E. England, R.D. Plattner, W.E. Dick // Carbohydrate Research. – 1986. – № 156. – P. 199–206. 13. Leuconostoc dextransucrase and dextran: production, properties and application / M. Naessens, A. Cerdobbel, W. Soetaert, E.J. Vandamme // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. – 2005. – Vol. 80. – P. 845–860. 14. Hare, M.D. Characterization of the extracellular, water–insoluble glucans of oral streptococci by methylation analysis, and by enzymic synthesis and degradation / M.D. Hare, S. Svensson, G.J. Walker // Carbohydrate Research. – 1978. – № 66. – P. 245–264. 15. Gagnaire, D. Etude par 13 C NMR et 1H NMR du dextrane et de ses derives acetyles et denzyles / D. Gagnaire, M. Vignon // Die Makromolekulare Chemie. – 1977. – Vol. 178. – P. 2321–2333. 16. Cheetham, N. W. H. Dextran structural details from high–field proton NMR spectroscopy / N.W.H. Cheetham, E. Fiala–Beer // Carbohydrate Polymers. – 1991. – № 14. – P. 149–158. 17. Seymour, F.R. Determination of the structure of dextran by 13C–nuclear magnetic resonance spectroscopy / F.R. Seymour, R.D. Knapp, S.H. Bishop // Carbohydrate Research. – 1976. – № 51. – P. 179–184. 18. Gilmore, K. S. Analysis of the Streptococcus downei gtfS gene, which specifies a glycosyltransferase that synthesizes soluble glucans / K.S. Gilmore, R.R. Russell, J.J. Ferretti // Infection and Immunity. – 1990. – № 58. – P. 2452–2458. 19. Heinze, T. Chemical characteristics of cellulose acetate / T. Heinze, T. Liebert // Macromolecular Symposia. – 2004. – Vol. 208. – P. 167–238. 20. Quality assurance in clinical dextran manufacture by molecular weight characterization / R.M. Alsop, G.A. Byrne, J.N. Done [at al] // Process Biochemistry. – 1977. – № 12. – P. 15–35. 114 21. Ioan, C. E. Structure Properties of dextran 2. Dilute solution / C.E. Ioan, T. Aberle, W. Burchard // Macromolecules. – 2000. – № 15. – P. 5730–5739. 22. Gekko, K. Physicochemical studies of oligodextran II. Intrinsic viscosity– molecular weight relationship / K. Gekko // Die Makromolekulare Chemie. – 1971. – № 148. – P. 229–238. 23. Small–angle X–ray scattering studies of moderately concentrated dextran solution / Y. Hirata, Y. Sano, M. Aoki [at al] // Carbohydrate Polymers. – 2003. – № 53. – P. 331–335. 24. Structural changes in dextran: mechanism of insolubilization by absorption on the air–liquid interface / Y. Hirata, Y. Sano, M. Aoki [at al] // Journal of Colloid and Interface Science. – 1999. – Vol. 212. – P. 530–534. 25. Properties of dextran as a cryo–protectant in ice cream / R.D. McCurdy, H.D. Goff, D.W. Stanley, A.P. Stone // Food Hydrocolloids. – 1994. – № 8. – P. 625–633. 26. Ioan, C.E. Light scattering and viscosity behavior of dextran in semidilute solution / C.E. Ioan, T. Aberle, W. Burchard // Macromolecules. – 2001. – № 34. – P. 326–5739. 27. DeBelder, A.N. Dextran / A.N. DeBelder // Amersham Biosciense. – 2003. – № 18–1166–12. – P. 1–57. 28. Chanzy, H. Single crystals of dextran: High temperature polymorph / H. Chanzy, G. Excoffier, C. Guizard // Carbohydrate Polymers. – 1981. – № 1. – P. 67–77. 29. Guizard, C. Molecular and crystal structure dextrans: a combined electron and X–ray diffraction study. 1. The anhydrous high–temperature polymorph / C. Guizard, H. Chanzy, A. Sarko // Macromolecules. – 1984. – № 17. – P. 100–107. 30. Shingel, K.I. Determination of structural peculiarities of dextran, pullulan and C–irradiated pullulan by Fourier–transform IR spectroscopy / K.I. Shingel // Carbohydrate Research. – 2002. – № 337. – P. 1445–1451. 31. Insolubilization of water–soluble dextran / Y. Hirata, M Aoki, H. Kobatake, H. Yamamoto // Biomaterials. – 1999. – № 20. – P. 303–307. 115 32. Stenekes, R.J.H. Formation of dextran hydrogels by crystallization / R.J.H. Stenekes, H. Talsma, W.E. Hennink // Biomaterials. – 2001. – № 22. – P. 1891–1898. 33. A generalized correlation for the viscosity of dextrans in aqueous solution as a function of temperature, concentration, and molecular weight at low shear rates / F. Carrasco, E. Chornet, R.P. Overend, J. Costa // Journal of Applied Polymer Science. – 1989. – № 37. – P. 2087–2098. 34. Larm, O. Studies on the length of the side chains of dextran elaborated by Leuconostoc mesenteroids NRRL B–512 / O. Larm, B. Lindberg, S. Svensson // Carbohydrate Research. – 1971. – № 20. – P. 39–48. 35. Norrman, B Partial methylation of dextran / B. Norrman // Acta Chemica Scandinavica. – 1968. – № 22. – P. 1381–1385. 36. Garreg, P.J. Partial methylation of benzyl 4–O–methyl–β–D–xylopyranoside / P.J. Garreg // Acta Chemica Scandinavica. – 1963. – № 17. – P. 1343–1347. 37. DeBelder, A.N. Partial methylation studies on methyl β–D–glycopyranoside and some derivatives / A.N. DeBelder, B. Lindberg, O. Theander // Acta Chemica Scandinavica. – 1962. – № 16. – P. 2005–2009. 38. Ceska, M. Enzymatic reactions in the presence of non ionic polymer / M. Ceska // Experientia. – 1971. – № 27. – P. 767–768. 39. Ceska, M. Enhancement of enzymatic catalysis of cross–linked dextran in the presence of non ionic polymer / M. Ceska // Experientia. – 1972. – № 28. – P. 146–147. 40. Yuan, G.I. Chemical synthesis of optically active polyaniline in the presence of dextran sulfate as molecular template / G.I. Yuan, N. Kuramoto // Chemestry Letters. – 2002. – № 5. – P. 544–545. 41. Zhang, J Aqueous biphase formation by mixtures of dextran and hydrophobically modified dextran / J. Zhang, R. Pelton, L. Wagberg // Colloid Polymer Science. – 1998. – № 276. – P. 476–481. 42. Arranz, F. Functionalization of dextran: incorporation of carboxy groups by O–succinoylation / F. Arranz, M. Sanchez–Chaves, J.C. Ramirez // Die Angewandte Makromolekulare Chemie. – 1992. – Vol. 194. – P. 79–89. 116 43. Arranz, F. Adducts of succinylated dextran–benzocaine. Synthesis and controlled release behavior / F. Arranz, M. Sanchez–Chaves, J.C. Ramirez // Die Makromolekulare Chemie, Rapid Communications. – 1992. – Vol. 13. – P. 403–407. 44. Усманов, Т.И. Исследование распределения карбоксиметиловых эфирах полисахаридов методом ЯМР заместителей в 13 С /Т.И. Усманов, У.Г. Каримова, А. Сарымсаков // Высокомолекулярные соединения. 1990. – Т. 32А. –№6. – С. 1176–1183. 45. Mauzac, M. Anticoagulant activity of dextran derivatives. Part I. Synthesis and characterization / M. Mauzac, J. Jozefonvicz // Biomaterials. – 1984. – № 5. – P. 301–304. 46. Synthesis and structure – anticoagulant property relationship of functionalized dextrans: CMDBS / F. Chaubet, J. Champion, O. Maiga [at al] // Carbohydrate Polymers. – 1995. – № 28. – P. 145–152. 47. Non degradative sulfation of polysaccharides. Synthesis and structure characterization of biologically active heparan sulfate mimetic / D. Papy–Garcia, V. Barbier–Chassefiere, V. Rouet [at al] // Macromolecules. – 2005. – № 38. – P. 4647–4654. 48. Owen, Wm. L. Development of microorganisms during sugar manufacture / Wm. L. Owen // Industrial and Engineering Chemistry. – 1951. – № 3. – P. 606–609. 49. Horne, W.D. Sugar chemistry / W.D. Horne, S.M. Cantor, R.W. Liggett // Industrial and Engineering Chemistry. – 1951. – № 4. – P. 804–808. 50. Sylvan, B.L. Fermentation / B.L. Sylvan // Industrial and Engineering Chemistry. – 1951. – № 9. – P. 1948–1969. 51. Barker, P.E. A new process for the continuous fraction of dextran / P.E. Barker, F.J. Ellison, B.W. Hatt // Industrial & Engineering Chemistry Process Design and Development. – 1978. – № 3. – P. 302–309. 52. Tsuchiya, H.M. An unusual streptococcus that yields low molecular weight (clinical type) dextran directly [abstract A22] / H.M. Tsuchiya, D.M. Hamilton, A.S. Carlson // Bacterial Processes. – № 23. – P. 1–84. 117 53. Lawford, G.R. Dextran biosynthesis and dextransucrose production by continuos culture of Leuconostoc mesenteroids / G.R. Lawford, A. Klingerman, T. Williams // Biotechnology and Bioengineering. – 1979. – № 21. – P. 1121–1127. 54. Neely, W.B. Dextransucrase, an induced enzyme from Leuconostoc mesenteroids / W.B. Neely, J. Nott // Biochemistry. – 1962. – № 1. – P. 1136–1140. 55. Михалев, М.Ф. Расчет и конструирование машин и аппаратов химических производств: Примеры и задачи для вузов / М.Ф. Михалев, Н.П. Третьяков, А.И. Мильченко, В.В. Зобнин: под ред. М.Ф. Михалева. –Л.: Машиностроение, 1984. – 301 с. 56. Lopez, A. Dextran synthesis by immobilized dextran sucrase / A. Lopez, P. Monsan // Biochemie. – 1980. – № 62. – P. 323–329. 57. Biomimetic surfaces via dextran immobilization: grafting density and surface properties / D. Miksa, E.R. Irish, D. Chen [at al] / Material Research Society Symposium Proceeding. – 2004. – № 826E. – P. 2.2.1–2.2.7. 58. Zhao, H. Determination of degree of substitution of formyl groups in polyaldehyde dextran by the hydroxylamine hydrochloride method / H. Zhao, N.D. Heindel // Pharmaceutical Research. – 1991. – № 3. – P. 400–402. 59. Mazurkirwicz, J. Viscosity of solutions of dextrans with selected sweeteners / J. Mazurkiewicz, K. Rebilas, P. Tomasik // European Food Research Technology. – 2001. – № 213. – P. 470–473. 60. Robyt, J.F. Production, purification and properties of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroids NRRL B–512F / J.F. Robyt, T.F. Walseth // Carbohydrate Research. – 1979. – № 68. – P. 95–111. 61. Nilsson, G. Molecular–weight distribution determination of clinical dextran by gel permeation chromatography / G. Nilsson, K. Nilsson // Journal of Chromatography. – 1974. – № 101. – P. 137–153. 62. Alsop, R.M. Industrial production of dextrans. In: BUSHELL / R.M. Alsop // Microbial Polysaccharides. – 1983. – № 1. – P. 1–44. 118 63. Fukui, K. Purification and properties of dextransucrase and invertase from Streptococcus mutans / K. Fukui, Y. Fukui, T. Moriyama // Journal of Bacteriology. – 1974. – № 118. – P. 796–804. 64. Kim, M. Optimization of oligosaccharide synthesis from cellobiose by dextransucrase / M. Kim, D.F. Day // Application Biochemistry and Biotechnology. – 2008. – № 148. – P. 189–198. 65. Effect of pH and aeration on dextran production by Leuconostoc mesenteroids / M.L. Lazic, V.B. Veljkovic, J.I. Vucetic, M.M. Vrvic // Enzyme Microbiology Technology. – 1993. – № 15. – P. 334–338. 66. Dextransucrase production from Leuconostoc mesenteroids NRRL B–640 in batch fermentation / R.K. Purama, G. Singh, A. Majumder [at al] // Internet Journal of Chemistry Science. – 2007. – № 5. – P. 1497–1504. 67. Shamala, T.R. Preliminary studies on the production of high and low viscosity dextran by Leuconostoc spp. / T.R. Shamala, M.S. Prasad // Process Biochemestry. – 1995. – № 30. – P. 237–241. 68. Павлов, К.Ф. Примеры и задачи по курсу процессов и аппаратов химической технологии: учеб. пособие для вузов / К.Ф. Павлов, П.Г. Романков, А.А. Носков. – 11–е изд. – М.: ООО «РусМедиаКонсалт», 2004. – 576 с. 69. Willemot, R.M. Effects of dextran on the activity of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroids / R.M. Willemot, P. Monsan, G. Durang // Annals of the New York Academy of Science. – 1988. – № 542. – P. 169–172. 70. Дытнерский, Ю.И. Основные процессы и аппараты химической технологии: Пособие по проектированию / Ю.И. Дытнерский. – М.: Химия, 1983. – 272 с. 71. Santos, M. Production of dextransucrase, dextran and frutose from sucrose using Leuconostoc mesenteroids NRRL B–5125(F) / M. Santos, J. Teixeira, A. Rodrigues // Biochemical Engeneering. – 2000. – № 4. – P. 177–188. 72. Girard, E. Activity and stability of dextrans from Leuconostoc mesenteroids NRRL R–512(F) in the presence of organic solvent / E. Girard, M.D. Legoy // Enzyme and Microbial Technology. – 1999. – № 24. – P. 425–432. 119 73. Higher antitumor efficacy of daunomycin when linked to dextran / A. Bernstein, E. Hurwitz, R. Maron [at al] // Journal of the National Cancer Institute. – 1978. – № 112. – P. 285–298. 74. Курсовое проектирование по предмету «Процессы и аппараты химической промышленности»: учеб.пособие для техникумов / М.Н. Кувшинский, А.П. Соболева. – 2–е изд. – М.: Высш. школа, 1980.–223 с. 75. Directed covalent immobilization of aminated DNA probes on aminated plates / M. Fuentes, C. Mateo, L. Garcia [at al] // Biomacromolecules. – 2004. – № 5. – P. 883–888. 76. С.Н. Дробченко, С. Н. Таутомерные структуры диальдегидцекстранов / Дробченко, Л.C. Исаева–Иванова, С.А. Грачев, Г.Н. Бондарев // Высокомолекулярные соединения. – 1990. – Т. 32. – № 4. – С. 254–258. 77. Foster, R.L. Preparation and properties of a soluble trypsin–dextran conjugate/ R.L. Foster // Experentia. – 1975. – № 31. – P. 772–773. 78. Effects of molecular weight of dextran and NAD+ density on coenzyme activity of high molecular weight NAD+ derivative covalently bound to dextran / S. Adachi, M. Ogata, H. Tobita, K. Hashimoto // Enzyme and Microbial Technology. – 1984. – № 6. – P. 259–262. 79. Huiru, Z. Determination of degree of substitution of formyl groups in polyaldehyde dextran by the hydroxylamine hydrochloride method / Z. Huiru, N.D. Heindel // Pharmaceutical Research. – 1991. – № 8. – P. 400–402. 80. Polysaccharide–oligoamine based conjugates for gene delivery / T. Azzam, H. Eliyahu, L. Shapira [at al] // Journal of Medical Chemistry. – 2002. – № 45. – P. 1817–1824. 81. Sokolsky–Papkov, M Impact of aldehyde content on amphotericin B – dextran imine conjugate toxicity / M. Sokolsky–Papkov, A.J. Domb, J. Golenser // Biomacromolecules. – 2006. – № 7. – P. 1529–1535. 82. Hydrazide pharmaceuticals as conjugates to polyaldehyde dextran: synthesys, characterization, and stability / N.D. Heindel, H. Zhao, J. Leiby [at al] // Bioconjugate Chemistry. – 1990. – № 1. – P. 77–82. 120 83. Cationic polysaccharides as antiprion agent / I. Yudovin–Farber, T. Azzam, E. Metzer [at al] // Journal of Medical Chemistry. – 2005. – Vol. 48. – P. 1414–1420. 84. Usov, D. Dextran coating for aggregation control of layer–by–layer assembled polyelectrolyte microcapsules / D. Usov, G.B. Sukhorukov // Langmuir. – 2010. – Vol. 26. – P. 12575–12584. 85. Mann, J.S. Molecular amplifiers: synthesis and functionalization of a poly(aminopropyl)dextran bearing a uniquely reactive terminus for univalent attachment to biomolecules / J.S. Mann, J.C. Huang, J.F.W. Keana // Bioconjugate Chemistry. – 1992. – № 3. – P. 154–159. 86. Fluorescent neoglycoproteins: antibody–aminodextran–phycobiliprotein conjugates / O. Siimar, J. Wilkinson, A. Burshteyn [at al] // Bioconjugate Chemistry. – 1999. – № 10. – P. 1090–1106. 87. Semisynthetic hydrophilic polyals / M.I. Papisov, A. Hiller, A. Yurkovetskiy // Biomacromolecules. – 2005. – № 6. – P. 2659–2670. 88. Pietersz, G.A. The linkage of cytotoxic drugs to monoclonal antibodies for the treatment of cancer / G.A. Pietersz // Bioconjugate Chemistry. – 1990. – № 1. – P. 89–95. 89. Protein conjugates of defined structure: synthesis and use of a new carrier molecule / L.A. Vilaseca, K. Rose, R. Werlen [at al] // Bioconjugate Chemistry. – 1990. – № 1. – P. 89–95. 90. A study of aluminum–substituted iron dextran complexes by Mossbauer spectroscopy and X–ray diffraction / T. Cheng, R. Bereman, E.D. Grave, L.H. Bowen // Chemistry of Materials. – 2001. – № 13. – P. 136–140. 91. Dextran functionalized surfaces via reductive amination: morphology, wetting, and adhesion / D. Miksa, E.R. Irish, D. Chen [at al] / Biomacromolecules. – 2006. – № 7. – P. 557–564. 92. Devakumar, J. A novel affinity–based controlled release system involving derivatives with enhanced osmotic activity / J. Devakumar, V. Mookambeswaran // Bioconjugate Chemestry. – 2007. – № 2. – P. 477–483. 121 93. Launer, H.F. Alkali sensitivity of polysaccharides: periodate starches, periodate dextran and a polygalacturonide / H.F. Launer, Y. Tomimatsu // Journal of Organic Chemistry. – 1961. – № 26. – P. 541–545. 94. Thomas, J.J. Unraveling the intracellular efficacy of dextran–histidine polycation as an efficient nonviral gene delivery system / J.J. Thomas, M.R. Rekha, C.P. Sharma // Molecular Pharmaceutics. – 2012. – № 1. – P. 121–134. 95. Иозеп, А.А. Ацилирование аминов азидами карбоксиметилпроиз-водных полисахаридов / А.А. Иозеп, М.Н. Пономаренко, Б.В. Пассет // Журнал прикладной химии. 1998. – Т.71. – Вып. 1. – С. 140–145. 96. Шарпатый, В.А. Проблемы радиационной химии полисахаридов / В.А. Шарпатый // Радиационная биология. Радиоэкология. – 1999. – №1. – P. 156–161. 97. Ahmed, N.U. Radiation chemistry of carbohydrates. XVIII. The extreme and variable susepectibility of crystalline lactose to ionizing radiations / N.U. Ahmed, G.O. Philips, P. Baugh // Journal of Chemical Society Perkin Transaction. . – 1972. – № 10. – P. 1305–1309. 98. Lofroth, G.O. Yilds in the radiation degradation of solid carbohydrates / G.O. Lofroth // Acta Chemica Scandinavica. – 1967. – № 21. – P. 1997–2001. 99. Von Sonntag, C. Chain Reaction of radicals in crystalline lactose monohydrate / C. Von Sonntag, M. Disdaroglu // Z. Natureforsh. – 1973. – № 28. – P. 367–378. 100. Суппе, А.А. Оптическое поглощение облучённых углеводов / А.А. Суппе, Ю.Е. Тиликс // Химия высоких энергий. – 1994 – № 3. – С. 224–228. 101. Singn, A. Introduction: intel–conversion of singlet oxygen arid related R–pecies / A. Singn // Photochemistry and Photobiology. – 1978 – Vol. 28. – P. 429–430. 102. Пострадиационные и лиохимические реакции радикалов пентаэритрита / М.Ю. Суслов, И.В. Юдин, С.Л. Панасюк, Е.А. Малинина // Химия высоких энергий. – 1988 – № 5. – с. 413–417. 103. Матюшков, В.В. Исследование механизма хемилюминесценции при растворении облученных углеводов / В.В. Матюшков, И.В. Юдин, С.Л. Панасюк // Химия высоких энергий. – 1982 – № 2. – P. 135–138. 122 104. Bothe, E. Radiation chemistry of carbohydrate. Kinetics of HO 2. Elimination from peroryl radicals derived from glucose and polyhydric alcohol / E. Bothe, D. Schulte–Prohlinde, C. Von Sonntag // Journal of Chemical Society Perkin Transaction. . – 1979. – № 5. – P. 416–420. 105. Schuchmann, M.N. Radiation chemistry of carbohydrates. Part 14. Hydroxyl radical induced oxidation of D–glucose in oxygenated aqueous solution / M.N. Schuchmann, C. Von Sonntag // Journal of Chemical Society Perkin Translation. – 1977. – № 2. – P. 1958–1963. 106. Mechanisms of oxidative degradation of carbohydrates during oxygen delignification. 2. Reaction of photochemically generated hydroxyl radicals with methyl β–callobioside / D.F. Guay, B.J.W. Cole, R.C. Fort [at al] // Journal of Wood Chemistry and Technology. – 2001. – № 1. – P. 67–69. 107. Gilbert, B.C. Radical reaction of carbohydrates. Part 4. Electron spin resonance studies of radical–induced oxidation of some aldopentoses, sucrose, and compounds containing furanose ring / B.C. Gilbert, D.M. King, T.C. Barry // Journal of Chemical Society Perkin Transaction. – 1983. – № 2. – P. 675–683. 108. Reactivity of carbohydrate radicals derived from iodo sugars and dibenzoyl peroxide. Homolytic heteroaromatic and aromatic substitution, reduction, and oxidation / E. Vismara, A. Donna, F. Minisci // Journal of Organic Chemistry. – 1993. – № 4. – P. 959–963. 109. Дытнерский, Ю.И. Процессы и аппараты химической технологии: учебник для вузов в 2 ч. Часть 2. Массообменные процессы и аппараты / Ю.И. Дытнерский. – изд. 3–е. – М.: Химия, 2002. – 368 с. 110. Identification of a novel structure in heparin generated by potassium permanganate oxidation / D. Beccati, S. Roy, F. Yu // Carbohydrate Polymers. – 2010. – № 82. – P. 699–705. 111. Odebunmi, E.O. Kinetics of oxidation of fructose, sucrose and maltose by potassium permanganate in NaHCO3/NaOH buffer and iridium(IV) complex in sodium acetate/acetic acid buffer / E.O. Odebunmi, S.A. Iwarere, S.O. Owalude // International Journal of Chemistry. – 2006. – № 3. – P. 167–176. 123 112. Шкурупий В.А. Фагоцитоз макрофагами молекулярно–наносомальных гибридных композиций с окисленными декстранами, конъюгированными с гидразидом изоникотиновой кислоты / В.А. Шкурупий, С.А. Архипов, А.В. Троицкий и др // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Т. 148. – № 12. – С. 633 – 635. 113. Шкурупий В.А. Эффекты молекулярно–наносомальных гибридных композиций с окисленными декстранами, конъюгированными с гидразидом изоникотиновой кислоты, на перитонеальные макрофаги in vitro / В.А. Шкурупий, С.А. Архипов, В.О. Ткачев и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Т. 146. – № 11. – С. 563 – 566. 114. Kinetics and mechanism of permanganate oxidation of iota– and lambda– carrageenan polysaccharides as sulfated carbohydrates in acid perchlorate solution / R.M. Hassan, A. Fawzy, G.A. Ahmed // Carbohydrate Research. – 2011. – № 14. – P. 2260–2267. 115. Raheela, N Kinetics of oxidation of some reducing sugars by potassium permanganate in acidic medium by visible spectrophotometry a thesis submitted for the degree of doctor of philosophy: Raheela Naz. – Karachi, 2008. – 226 p. 116. Tetianec, L. An unexpectedly high reactivity of carbohydrate oxidase to permanganate / L. Tetianic, J. Kulys // Biologija. – 2004. – № 2. – P. 22–25. 117. Structure of periodate oxidation product with characteristic partial structures of zooxanthellatoxin–A, a potent vasoconstructive polyol from a symbiotic dinoflagellate / H. Nakamura, T. Asari, A. Murai [at al] // Journal of Organic Chemistry. – 1993. – № 2. – P. 313–314. 118. Synthesis of ultrasmall superparamagnetic iron oxides using reduced polysaccharides / G.P. Kenneth, T.B. Frigo, J.Y. Groman, E.V. Groman // Bioconjugate Chemistry. – 2004. – № 2. – P. 394–401. 119. Barbour, R.F. The determination of glycerol by the I.U.P.A.C. form of the Malaprade method / R.F. Barbour, J. Devine // Analyst. – 1971. – № 96. – P. 288–195. 124 120. Stereochemical studies of polyols from the polyene macrolide lienomycin / J. Pawlak, K. Nakanishi, T. Iwashita, E. Borowski // Journal of Organic Chemistry. – 1987. – № 13. – P. 2896–2901. 121. Tipper, D.J. Structures of the cell wall peptidoglycans of Staphylococcus epidermidis texas 26 and Staphylococcus aureus copenhagen. I. Chain length and average sequence of cross–bridge peptides / D.J. Tipper, M.F. Berman // Biochemistry. – 1969. – № 5. – P. 2183–2192. 122. Валян, В.А. Баромембранные технологии и оборудование/ В.А. Валян // Молочная промышленность. – 2007. – №7. – С.13 – 18. 123. Горшков, А.А. Автоматические установки для финишной фильтрации вина и ликероводочной продукции / А.А. Горшков // Ликероводочное производство и виноделие. – 2006. – №8. – С. 23 – 27. 124. Смирнов, В.Б. Ультрафильтрация – технологически обоснованный метод подготовки воды / В.Б. Смирнов, А.Р. Сидоров // Ликероводочное производство и виноделие. – 2007. – №11. – С. 32 – 37. 125. Tarentino, A.L. The isolation and structure of the core oligosaccharide sequences of IgM / A.L. Tarentino, T.H. Plummer, F. Maley // Biochemistry. – 1975. – № 25. – P. 5516–5523. 126. Baddiley, J. Structure, biosynthesis, and function of teichoic acid / J. Baddiley // Accounts of Chemical Research. – 1970. – № 3. – P. 98–105. 127. Injectable in situ cross–linking hydrogels for local antifungal therapy / S.P. Hudson, R. Langer, G.R. Fink, D.S. Kohane // Biomaterials. – 2010. – № 6. – P. 1444–1452. 128. Ocular injectable formulation assessment for oxidezed dextran–base hydrogels / J. Maia, M.P. Ribeiro, C. Ventura // Acta Biomaterialia. – 2009. – № 6. – P. 1948–1955. 129. Synthesis and characterization of new injectable and degradable dextran–based hydrogels / J. Maia, L. Ferreira, R. Carvalho // Polymer. – 2005. – № 46. – P. 9604–9614. 130. Guthrie, R.D. The “dialdehydes” from the periodate oxidation of carbohydrates / R.D. Gothrie // Advaced Carbohydrate Chemistry. – 1961. – № 16. – P. 105–158. 125 131. Ishak, M.F. Kinetic evidence for hemiacetal formation during the oxidation of dextran in aqueous periodate / M.F. Ishak, T.J. Painter // Carbohydrate Research. – 1978. – № 64. – P. 189–197. 132. Bouhadir, K.H. Synthesis of cross–linked polyaldehyde guluronate hydrogels // Polymer. – 1999. – № 40. – P. 3575–3584. 133. Иозеп, А.А. Синтез замещенных амидов карбоксиметилдекстрана / А.А. Иозеп, Т.Ю. Ильина, Б.В. Пассет // Журнал прикладной химии. 1994. – Т. 67. – Вып. 1. – С. 470–474. 134. Иозеп, А.А. Синтез и анализ гидразидов карбоксиметилпроизводных некоторых микробных полисахаридов / А.А. Иозеп, Л.Н. Куприянова, М.Н. Пономаренко, Б.А. Ивин, Б.В. Пассет // Журнал прикладной химии. 1996. – Т. 69. – № 9. – С. 1537 – 1542. 135. Иозеп, A.A. Спектрометрические методы анализа водорастворимых полисахаридальдегидов / A.A. Иозеп, О.Б. Суворова, Л.И. Иозеп, Б.В. Пассет // Журнал прикладной химии. 1998. – Т. 71. – № 7. – С. 1202 – 1205. 136. Тищенко, Е.В. Реакции декстранполиальдегида с аминогидрокси– пиримидинами / Е.В. Тищенко, A.A. Иозеп, Б.А. Ивин // Журнал прикладной химии. – 2002. – Т. 75. № 4. – С. 694 – 696. 137. A new procedure for the determination of the fine structure of polysaccharides / M. Abdel–Akher, J.K. Hamilton, R. Montgomery, F. Smith // Journal of American Chemical Society. – 1952. – № 74. – P. 4970–4971. 138. Hamilton, J.K. Reduction of the products of periodate oxidation of carbohydrates. II. A new method for the end–group assay of amylopectin / J.K. Hamilton, F. Smith // Journal of American Chemical Society. – 1956. – № 78. – P. 5907–5909. 139. Reduction of the products of periodate oxidation of carbohydrates. V. The constitution of cellulose / I.J. Goldstein, J.K. Hamilton, R. Montgomery, F. Smith // Journal of American Chemical Society. – 1957. – № 79. – P. 6469–6473. 140. Abdel–Akher, M. Reduction of the products of periodate oxidation of carbohydrates. VII. The constitution of glycogen / M. Abdel–Akher, F. Smith // Archives of Biochemistry and Biophysics. – 1958. – № 78. – P. 451–459. 126 141. Controlled degradation of polysaccharides by periodate oxidation, reduction, and hydrolysis / I.J. Goldstein, G.W. Hay, B.A. Lewis, F. Smith // Methods in Carbohydrate Chemistry. – 1965. – № 5. – P. 361–370. 142. Ederer, H.J. Modeling of polymer degradation reaction / H.J. Ederer, A.M. Basedow, K.H. Ebert // Modelling of Chemical Reaction System. Springer Series in Chemical Physics. – 1981. – Vol. 18. – P. 189–215. 143. Mahvar, R. Dextrans for targeted and sustained delivery of therapeutic and imaging agents / R. Mehvar // Journal of Controlled Release. – 2000. – № 69. – P. 1–25. 144. Xu, X. Hydrodynamic properties of aqueous dextran solution / X. Xu, L.H. Zhang, X. Qi // Journal of Applied Polymer Science. – 2009. – № 111. – P. 1523–1529. 145. Fritz, S.S. Determination of carbonyl compound / J.S. Fritz, S.S. Yamamura, E.C. Bradford // Analytical Chemistry. – 1959. – № 31. – P. 260–264. 146. Molteni, L. Dextran and inulin conjugates as drug carriers / L. Molteni // Methods in Enzymology. – 1985. – № 112. – P. 285–298. 147. Robyt, J.F. Reducing value methods for maltodextrains / J.F. Robyt, W.J. Whelan // Analytical Biochemistry. – 1972. – № 45. – P. 510–516. 148. Polymeric prodrug. Dextran–bound antirheumatic agent Naproxen / M. Azori, J. Pato, E. Csakvari, F. Tudos // Makromolecular Chemistry. – 1986. – № 187. – P. 2073–2080. 149. Dextran–spermine conjugate: an efficient vector for gene delivery / T. Azzam, H. Eliyahu, A. Makovitzki, A.J. Domb // Macromolecular Symposia. – 2003. – № 195. – P. 247–261. 150. Robyt, J.F. Reducing value method for maltodextrins / J.F. Robyt, R.J. Ackerman, J.G. Keng // Analytical Biochemistry. – 1972. – № 45. – P. 517–524. 151. Reiner, R.H. Periodic acid–oxidized soluble polysaccharides as polyfunctional links for covalent binding of enzymes / R.H. Reiner, H.G. Batz // Makromolecular Chemistry. – 1981. – № 182. – P. 1641–1648. 127 152. Superiority of an immunoconjugate compared acid–labile to daunorubicin–monoclonal free drug / antibody R.O. Dillman, D.E. Johnson, D.L. Shawler, J.A. Koziol // Cancer Research. – 1988. – № 48. – P. 6097–6102. 153. Diaz, J.V. Nonenzymatic degradation of citrus pectin and during prolonger heating: effects of pH, temperature, and degree of methyl esterification / J.V. Diaz, G.E. Anthon, D.M. Barrett // Journal of Agricultural and Food Chemistry. – 2007. – № 55. – P. 5131–5136. 154. Жужиков, В.А. Фильтрование: Теория и практика разделения суспензий / В.А. Жужиков. – 4–е изд., перераб. и доп. – М.: Химия, 1980. – 400 с. 155. Дытнерский, Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей / Ю.И. Дытнерский. – М.: Химия, 1975. – 232 с. 156. Хванг, С.–Т. Мембранные процессы разделения / С.–Т. Хванг, К. Каммермейер; под ред. Ю.И. Дытнерского. – М.: Химия, 1981. – 464 с. 157. Хадаханэ, Н.Э. Фильтрация воды через тонкопористые стеклянные мембраны / Н.Э. Хадаханэ, В.Д. Соболев, Н.В. Чураев // Коллоидный журнал. – 1980. – № 5. – С.911 – 915. 158. Мачигин, В.С. физикохимическим Ультрафильтрация методам очистки – альтернатива жирсодержащих реагентным сточных вод / В.С. Мачигин // Масложировая промышленность. – 2007. – №4. – С. 25 – 31. 159. Дытнерский, Ю.И. Обратный осмос и ультрафильтрация / Ю.И. Дытнерский. – М.: Химия, 1978. – 293 с. 160. Медведев, В.С. Определение оптимального режима технологического процесса окисления декстрана / В.С. Медведев, В.Н. Беляев, Д.Ю. Глазев // Управление качеством образования, продукции и окружающей среды: Материалы 7–й Всероссийской научно–практической конференции – Бийск, 2013. – С. 140–142. 161. Медведев, В.С. Получение меченного флуоресцеином окисленного декстрана и определение эффективности его захвата клетками–мишенями / В.С. Медведев, Н.С. Зайцева // Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы: 128 Материалы ежегодной 8–й Всероссийской школы–семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых – Белгород, 2010. – С. 89–92. 162. Патент 2426554 РФ, МПК A61K 31/721, C08L 5/02, C07C 245/12, A61J 3/00 Способ получения флуоресцентных производных декстранов / Шкурупий В.А., Лузгина Н.Г, Троицкий А.В., Гуляева Е.П., Быстрова Т.Н., Медведев В.С.; заявитель и патентообладатель НЦКЭМ СО РАМН. – заявл. 26.04.10, опубл. 20.08.11 – бюл. № 23. – 5 с. 163. Медведев, В.С. Методы определения количества альдегидных групп в полиальдегиддекстране с применением 2,4–динитрофенилгидразина / В.С. Медведев, А.В. Троицкий, Т.В. Быстрова, В.А. Шкурупий // Химико– фармацевтический журнал – Москва: Изд–во ООО «Фолиум» – 2012. – №8. – С. 78–82. 164. Медведев, В.С. Метод получения меченных флуоресцеином декстранов и полиальдегиддекстранов / В.С. Медведев, А.В. Троицкий, Е.П. Гуляева, Н.С. Зайцева, В.А. Шкурупий, В.Н. Беляев // Вестник новых медицинских технологий – Тула: Изд–во ФГБОУ ВПО ТулГУ – 2012. – № 4. – с. 104–106. 165. Медведев, В.С. Совершенствование технологии окисления декстранов / В.С. Медведев, А.С. Жарков, Б.В. Певченко, Д.Ю. Глазев, Е.В. Копылов // Ползуновский вестник – Бийск: Изд–во ГОУ ВПО АлтГТУ им. И.И. Ползунова – 2013. – № 3. – С. 143–148. 129
