На правах рукописи ШИБИНА ЛАРИСА ВИКТОРОВНА

На правах рукописи
ШИБИНА ЛАРИСА ВИКТОРОВНА
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ДИАГНОСТИКИ И
ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКИХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНОВ МАЛОГО ТАЗА У ЖЕНЩИН
РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА
14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении
«Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор
Краснопрошина Людмила Ивановна
доктор медицинских наук, профессор
Ордиянц Ирина Михайловна
Официальные оппоненты:
Ахматова Нэлли Кимовна, доктор медицинских наук, заведующий
лабораторией механизмов регуляции иммунитета ФГБУ «НИИВС им. И.И.
Мечникова» РАМН;
Пинегин Борис Владимирович, доктор медицинских наук, профессор,
заведующий отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции ФГБУ «ГНЦ
Институт иммунологии» ФМБА России.
Ведущая организация:
Роспотребнадзора
ФБУН
«МНИИЭМ
им.
Г.Н.
Габричевского»
Защита состоится «21» ноября 2013г. в 14 часов на заседании диссертационного
совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. И.И.Мечникова» РАМН по адресу:
105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИВС им.
И.И.Мечникова» РАМН, (Москва, Малый Казенный пер., д. 5а).
Автореферат разослан «___» октября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук
Ирина Владимировна Яковлева
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ) у женщин, к
которым относят весь спектр воспалительных процессов репродуктивного тракта,
занимают ведущее место в структуре гинекологических заболеваний, составляя
60-65% от всей гинекологической патологии [Кулаков В.И., 2004; Курбанова
Д.Ф., 2007] и оказывают существенное влияние на здоровье женщин
репродуктивного возраста [Серов В.Н. и соавт., 2004; Unemo М., Shafer W., 2011].
Ежегодно ВЗОМТ страдают около 1 млн. женщин, 30% из них нуждаются
в стационарном лечении [Савельева Г.М. и соавт. 1997; Zhang J. et al., 2012]. У
200 тыс. женщин возникают гнойно-септические осложнения, требующие
оперативного вмешательства [Краснопольский В.И. и соавт., 1999; Рахматулина
М.Р., 2011], среди них лица моложе 25 лет составляют 70% [Максименко Т.А. и
соавт., 1996]. ВЗОМТ могут приводить к нарушению овариально-менструального
цикла, бесплодию (40%), повышению частоты невынашивания (45%) и
эктопической беременности (3%) [Кулаков В.И. и соавт., 2006] и являются
этиологическим фактором анте- и интранатального инфицирования плода
[Никонов А.П. и соавт., 1993; Yao X., Rosenthal K., 2011].
Вопрос об этиологической роли инфекции широко дискутируется в
литературе [Демидова Е.М., 1993]. Причиной ВЗОМТ в большинстве случаев
являются возбудители инфекций, передаваемых половым путем (ИППП) (ВОЗ,
2000г). В 60-70% случаев ВЗОМТ вызывают хламидии (Сhlamidia trachomatis30%) и гонококки (Neisseria gonorrhea 40-50%) (ВОЗ, 2000). Не исключена роль и
других инфекционных агентов [Савельева Г.М., 2006].
На сегодняшний день известно, что одним из основных факторов защиты
слизистых оболочек от поражения инфекционными агентами являются секреторные
IgA-антитела
(sIgA),
осуществляющие
функцию
иммунного
исключения
(обволакивая бактерии и вирусы sIgA препятствуют адгезии патогенов на
эпителиоцитах и генерализации инфекции в пределах слизистых). Значительную
3
роль в осуществлении механизмов защиты при нормальном циклическом
функционировании женской репродуктивной системы, как полагают, играют TOLLподобные рецепторы (TLRs) [Wira C., Fahey J., 2004; Abrahams V. et al., 2005]. В
последние годы доказана экспрессия TLR2 и TLR4 в эпителии эндометрия и
эпителиальных клетках нижних половых путей [Shcaefer T. et al., 2004; Dwyer P.,
2011]. Однако большинство исследований посвящено изучению иммунитета
слизистых кишечника, а данные, характеризующие участие иммунной системы в
защите слизистых женской половой системы, носят фрагментарный характер.
Одним из наиболее сложных на сегодняшний день остается вопрос
эффективности
терапии
урогенитальных
инфекций.
Очевидно,
что
раннее
адекватное лечение воспалительных заболеваний способно предотвратить многие
тяжелые последствия для организма, особенно для репродуктивной функции
[Тихомиров
А.Л.,
2003].
На
основании
характера
и
типа
выявленных
иммунологических нарушений в комплексную противовоспалительную терапию
целесообразно включать иммунотропные препараты, способствующие стимуляции
факторов неспецифической резистентности и наделенные иммунокорригирующими
свойствами [Хаитов Р.М., 2001]. Одним из обязательных условий применения
иммуномодуляторов является определение механизма действия препарата, его
«точки приложения» в системе иммунитета [Нестеров И.М., Тотолян А.А., 2007].
На сегодняшний день остаются мало изученными изменения иммунного
статуса, возникающие у женщин репродуктивного возраста и, как следствие, не
разработаны четкие критерии их иммунотерапии. Для повышения эффективности
лечения женщин с ВЗОМТ актуальна разработка дополнительных диагностических
критериев течения данной патологии и методов комплексной терапии, позволяющих
регулировать иммунный ответ, а также снизить частоту рецидивирования.
Цель. Выявление иммунологических критериев наличия и степени
выраженности воспалительных заболеваний органов малого таза у женщин
репродуктивного возраста для разработки оптимальной тактики лечения.
4
Задачи исследования:
1. Изучить особенности микробиоценоза урогенитального тракта у женщин
репродуктивного возраста с воспалительными заболеваниями органов малого
таза до и после иммунотерапии.
2.
Выявить
воспалительного
взаимосвязь
процесса
и
между
клиническими
показателями
врожденного
проявлениями
и
адаптивного
иммунитета у женщин с хроническими воспалительными заболеваниями органов
малого таза.
3. Определить диагностические критерии наличия и степени выраженности
воспалительного процесса для уточнения механизма развития воспалительного
процесса, выбора тактики лечения и оценки клинического эффекта.
4. Оценить клинико-иммунологический эффект иммуномодулирующей
терапии в зависимости от динамики показателей иммунного статуса пациентов.
5.
Разработать алгоритм лечения женщин репродуктивного возраста с
воспалительными заболеваниями органов малого.
Научная новизна
Впервые установлена взаимосвязь показателей врожденного и адаптивного
иммунного ответа с наличием и степенью выраженности воспалительных
заболеваний органов малого таза у женщин репродуктивного возраста и
разработана оптимальная
тактика терапии
этой
категории
пациентов с
включением иммуномодулирующих препаратов различного механизма действия.
Показано, что у пациентов с воспалительными заболеваниями органов
малого таза микробиоценоз урогенитального тракта представлен патогенной и
условно патогенной микрофлорой в количестве (более 104), на фоне снижения
лакто- и бифидобактерий (менее 104).
Впервые выявлено диагностическое значение повышения экспрессии генов
TLR2 и TLR9 в эпителиальных клетках цервикального канала у женщин с
воспалительными заболеваниями органов малого таза, а также увеличение
концентрации IgA, sIgA и IgG в вагинальном секрете, что позволяет выявить
начало перехода заболевания в хроническую форму.
5
Впервые показано, что интенсивность гуморального иммунного ответа в
различных отделах мукозассоциированной лимфоидной ткани неодинакова и
наличие воспалительного процесса в органах малого таза у женщин не приводит к
изменению секреции иммуноглобулинов в слизистой полости рта.
Впервые показано, что фагоцитарная активность лейкоцитов и уровень
субпопуляций лимфоцитов крови (CD3+, СD4+, СD8+ и CD72+) не могут служить
диагностическим критерием наличия и степени выраженности воспалительного
процесса, однако наличие отдельных нарушений в системном иммунитете имеет
значение при выборе иммуномодулятора для повышения клинического эффекта
терапии.
Впервые показан клинический эффект комплексной противовоспалительной
терапии с применением иммуномодуляторов различного механизма действия
(Иммуновак-ВП-4,
Т-активин,
Дифференцированный
подход
Ликопид,
к
Полиоксидоний,
Суперлимф).
выбору иммуномодулятора
способствовал
снижению экспрессии генов TLR2 и TLR9 в эпителиальных клетках цервикального
канала, коррекции содержания иммуноглобулинов в вагинальном секрете,
приводил к нормализации бактериальной микрофлоры с преобладанием лакто- и
бифидобактерий,
а
также
обеспечивал
высокий
клинический
эффект,
характеризующийся отсутствием рецидивов на протяжении всего времени
наблюдения по сравнению с классическими схемами терапии, исключающими
проведение иммунокоррекции.
Впервые уточнен иммунопатогенез хронических воспалительных заболеваний
органов малого таза у женщин репродуктивного возраста и обоснован подход к
оптимизации иммунокорригирующей терапии.
Практическая значимость
Изучение параметров системного и местного иммунитета у женщин
репродуктивного периода с воспалительными заболеваниями органов малого таза
рекомендуется
для
выявления
индивидуальных
отклонений,
требующих
назначения препаратов системного или местного (вагинальные и/или ректальные
свечи) действия для повышения клинического эффекта терапии.
6
Разработан метод забора вагинального секрета для оценки мукозального
иммунитета по определению концентраций IgG, IgA, sIgA. Данный метод может
быть
использован
врачами
акушерами-гинекологами
для
проведения
дополнительных диагностических мероприятий.
Рекомендуется использовать методы определения концентрации IgG, IgA,
sIgA в вагинальном секрете и уровней экспрессии TLR2 и TLR9 в эпителии
цервикального канала у женщин с воспалительными заболеваниями органов
малого таза как дополнительные диагностические критерии наличия и степени
выраженности заболевания и оценки эффективности проводимой терапии.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Повышение экспрессии генов TLR2 и TLR9 в эпителии цервикального канала
и увеличение концентрации IgG, IgA, sIgA в вагинальном секрете являются
дополнительными иммунологическими критериями наличия и степени
выраженности воспалительных заболеваний органов малого таза.
2. Определение показателей местного и системного иммунитета пациентов
репродуктивного возраста с воспалительными заболеваниями органов малого таза
позволяют
применить
дифференцированный
подход
к
проведению
иммунокоригирующей терапии для повышения клинического эффекта лечения.
Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на
конференциях молодых ученых ФГБУ НИИВС им. Мечникова РАМН 2010, 2011,
2012 гг; на XIV Всероссийском научном Форуме с международным участием
имени академика В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт Петербурге, 23-26 мая
2011 г.; на XII Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии,
аллергологии и иммунофармакологии», 11-13 марта 2013 г., Москва.
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 5 статей в
журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 125 страницах, иллюстрирована 9 таблицами, 12
рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов
исследования, трех глав результатов собственных исследований и их обсуждения,
7
выводов и списка литературы, содержащего 150 источников (50 отечественных и
100 зарубежных).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Характеристика
клинических
групп.
Работа
проведена
при
сотрудничестве с кафедрой акушерства и гинекологии ФГБОУ ВПО РУДН,
Москва (зав. кафедрой д.м.н., проф. В.Е. Радзинский, д.м.н., проф. И.М. Ордиянц).
Обследовано 105 женщин в возрасте от 19 до 45 лет, из которых 78 пациентов с
воспалительными заболеваниями органов малого таза (ВЗОМТ) и 27 –
практически здоровых женщин (контрольная группа). Критериями отбора в
контрольную группу служили следующие показатели: отсутствие воспалительных
и инфекционных (RW, ВИЧ Hbs, HCV) заболеваний, аутоиммунной и
эндокринной патологии. Всем пациентам проводили общеклиническое, клинико лабораторное, гинекологическое исследования, УЗИ органов малого таза, ПЦР на
наличие хламидий, ВПЧ 16, 18, ВПГ I, II, бактериологические посевы из
цервикального канала с определением чувствительности микроорганизмов к
антибиотикам (исследование проведено в женской консультации ГП №157, г.
Москвы). Посевы из цервикального канала проводили в КВД №3, г. Москва. На
каждого
пациента
анамнестические
и
заводили
индивидуальную
общесоматические
данные,
карту,
включающую
результаты
проводимых
гинекологических и иммунологических исследований до лечения, через 2 недели
и 3 месяца после проведенной терапии.
Материалы и методы исследования.
Клинический материал. В работе использовали: слюну пациентов (n=19) и
здоровых женщин (n=9 человек); вагинальный секрет пациентов (n=78 человек) и
здоровых женщин (n=27): клетки слизистой цервикального канала пациентов
(n=15) и здоровых женщин (n=9); сыворотку крови пациентов (n=26) и здоровых
женщин (n=15); кровь пациентов (n=26) и здоровых женщин (n=15).
Микроскопическое исследование. Мазок вагинального секрета переносили на
стекло, высушивали на воздухе, фиксировали с помощью щадящей химической
8
фиксации и после этого окрашивали (ацетон, смесь Никифорова, жидкость
Карнуа) [Савичева А.М. и др., 2007]
Бактериологическое исследование. Взятие отделяемого цервикального канала
проводили с помощью ложечки Фолькмана, затем материал погружали в 1 мл
жидкой транспортной среды, далее готовили серийные разведения из расчета 10:1
(объем/вес) и затем по 0,1 мл высевали на различные селективные питательные
среды. Степень роста определяли в пересчете на 1 мл вагинального отделяемого
(КОЕ/мл). [Сасова В.А. и др. 2007]
Оценку иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови проводили с
помощью
моноклональных
антител
(Caltag
Laboratories,
США)
против
соответствующих антигенов. Результаты учитывали на проточном цитометре
«CYTOMICS FC-500, Beckman Coulter США).
Фагоцитарную активность лейкоцитов крови оценивали в НСТ-тесте по восстановлению в
цитоплазме нейтрофилов нитросинего тетразолия до диформазана под влиянием
супероксидного аниона [Hed J., et al. 1987].
Определение коцентрации IgG, IgA, IgM классов в сыворотке крови проводили методом
радиальной иммунодиффузии (РИД) по Манчини [Manchini et al. 1970].
Определение концентрации IgА, sIgA, IgG классов в слюне. Использовали
общую смешанную, не стимулированную слюну [Цвелев Ю.В. и др. 1995; Хаитов
Р.М. и др. 1995]. Стимулированную слюну использовали только в группе
здоровых доноров. Определение концентрации IgА, sIgA, IgG проводили с
использованием коммерческого набора (НПЦ «Медицинская иммунология») в
соответствии с инструкцией производителя.
Определение концентрации IgА, sIgA, IgG, в вагинальном секрете. У
пациента производили забор только вагинального секрета, находящегося в заднем
своде влагалища ватным тампоном, который помещали в пробирку - эппендорф.
Образцы хранили не более 48 часов. Определение иммуноглобулинов классов G,
A и секреторного А в вагинальном секрете проводили с помощью коммерческого
набора (НПЦ «Медицинская иммунология»). Тест-система содержит три типа
моноспецифических сывороток против: 1) IgG человека, 2) -цепи IgA молекулы
9
(для оценки уровня общего IgA) и 3) секреторного компонента (для оценки
суммарного содержания sIgA). По разности значений общего IgA и суммарного
sIgA оценивали содержание свободного секреторного компонента в образце
вагинального секрета.
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. Уровень
экспрессии генов TLR2 и TLR9 в эпителиальных клетках цервикального канала
оценивали с помощью метода полимеразной цепной реакции в режиме реального
времени (ПЦР-РВ). Последовательность праймеров и зондов TLR2 и TLR9 для
реакции подбирали с помощью программы Vector NTI 8.0, анализируя
последовательность мРНК, полученную из электронной базы данных GenBank.
Реакцию ПЦР-РВ проводили в амплификаторе ДТ-96 (ДНК-технология, РФ). Все
действия по постановке реакции проводились согласно рекомендациям фирмыпроизводителя.
Статистическую обработку данных проводили в рамках непараметрической
базовой статистики с использованием критерия Манна-Уитни для сравнения двух
выборок. Данные представлены в виде «среднее значение ± стандартное
отклонение от среднего». Различия в группах рассматривались как значимые при
р < 0,05. Наличие статистических достоверной корреляции между уровнями
экспрессии исследуемых генов оценивали по коэффициенту ранговой корреляции
Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
При проведении микробиологического обследования у 70% пациентов с
воспалительными заболеваниями органов малого таза выявлена персистирующая
инфекция бактериальной природы (30% - Ureaplasma urealyticum/parvum; 20% Mycoplasma hominis; 20% - Candida albicans, Escherichia coli, представители родов
Proteus, Streptococcus, Staphylococcus). У остальных 25% пациентов – микст
инфекция (один или нескольких бактериальных возбудителей в ассоциации с
одним
или
несколькими
агентами
вирусной
природы);
в
5%
случаев
10
инфекционные агенты вирусной этиологии (цитомегаловирус, вирус простого
герпеса
1
и
2
типов,
вирус
папилломы
человека)
(рис.
1).
Рис. 1 Микробиологический состав отделяемого цервикального канала
женщин с воспалительными заболеваниями органов малого таза до лечения.
Учитывая возможность нарушения иммунного статуса организма, в том
числе механизмов врожденного иммунитета при воспалительном процессе,
вызванном персистирующей инфекцией, у пациентов исследовали комплекс
иммунологических показателей
при хроническом течении и
обострении
заболевания в сыворотке крови и в секретах в сравнении с группой контроля.
Исследования
фагоцитарной
активности
лейкоцитов
в
НСТ-тесте
показали, что у всех пациентов обследуемых групп поглотительная способность
клеток была в пределах нормы (табл. 1), что свидетельствует о сохранении их
функциональной активности у больных при воспалительных заболеваниях
органов малого таза.
11
Таблица 1. Показатели фагоцитарной активности лейкоцитов крови женщин с
воспалительными заболеваниями органов малого таза в сравнении с контрольной
группой
Женщины с воспалительными
заболеваниями органов малого таза
Показатели
Норма
Группа
контроля
(n=27)
хроническое воспаление
(n=22)
острое
воспаление
(n=56)
Фагоцитарный индекс гранулоцитов
95
99
%
96,4±1,5
92±3,5
88±6,7
Фагоцитарный индекс моноцитов
65
95
%
83,5±9,5
83,5±5,7
82,25±9,6
12
Фагоцитарный
ин 40
де кс 80
%
61±17,1
66,3±19,1
79,4±16,7
Цитологический показатель
0,1
,32
у.е
0,26±0,12
0,29±0,1
0,28±0,13
Содержание
фо 5рм 23
аза %
нпо
зи
ти
вн
ых
не
йт
ро
фи
ло
в
16,07±5,44
25±9,6
13
24,6±12,1
Индекс активации латексом
≥3
1,64±0,73
1,73±0,6
1,66±0,5
Примечание. Различия средних значений между группами больных и
контрольной группой статистически незначимы.
Исследованные
уровни
субпопуляций
лимфоцитов
у
женщин
с
воспалительными заболеваниями органов малого таза и у здоровых доноров
статистически
не
отличались,
то
есть
у
женщин
с
воспалительными
заболеваниями органов малого таза отсутствовали выраженные нарушения в
клеточном звене системного иммунитета (табл. 2).
Таблица 2. Субпопуляционная структура лимфоцитов крови женщин с
воспалительными заболеваниями органов малого таза в сравнении с контрольной
группой
Показатель
14
Единицы
измерения
Группа
контроля
(n=27)
Женщины с воспалительными
заболеваниями органов малого таза
Хроническое воспаление
Лейкоциты
(тыс/мкл)
(n=22)
6,2±1,4
7,2±1,6
Обострени
е
хроническ
ого
воспалени
я (n=56)
6,1±1,3
Лимфоциты
%
28,0±7,1
36,0±10,0
37,0±12,0
абс.
1,9±0,4
2,3±1,0
2,4±0,7
CD3
%
67,9±5,9
61,0±7,8
71,3±7,3
абс.
1434,0±231,0
15
1811,0±769,2
1642,0±501,0
CD4
%
42,0±3,1
43,4±10,0
43,0±6,3
абс.
898,0±138,0
1073,0 ±556,3
1001,0 ±422,0
CD8
%
35,6± 3,6
26,6±9,7
29,5±6,2
абс.
734,0±183,0
688,7±358,5
694,0±293,0
ИРИ
1,5±0,3
2,02±1,3
16
1,7±0,5
CD16
%
15,3±3,05
14,65±8,2
15,7±8,6
абс.
293,0±70,0
351,3±191,4
374,0±280,0
CD 72
%
13,3±1,7
10,7±3,6
10,6±3,0
абс.
295,0±71,0
244,0±76,3
241,0±75,2
Примечание.
Различия
средних
значений
группами больных и контрольной группой статистически незначимы.
между
Анализ уровней иммуноглобулинов сыворотке пациентов также не выявил
значимых различий с группой контроля (табл. 3).
17
Таблица 3. Уровни IgG, IgA, IgМ в сыворотке крови у пациентов с
воспалительными заболеваниями органов малого таза и в группе контроля
Женщины с воспалительными
заболеваниями органов малого таза
Группа контроля
Показатель
(n=27)
Хроническое
Острое воспаление
воспаление (n=22)
(n=56)
IgG, мг/мл
12,8±3,5
12,3±2,8
10,76±3,3
IgA, мг/мл
3,4±1,3
2,63±1,0
1,8±0,4
IgM, мг/мл
2,04±0,44
2,17±1,0
2,26±0,6
Примечание. Различия средних значений между группами больных и
контрольной группой статистически незначимы.
Особый интерес в данном исследовании представляла сравнительная
оценка показателей гуморального иммунитета слизистых оболочек. Для этого
определяли концентрацию IgG, IgA, sIgA в слюне и вагинальном секрете женщин
с воспалительными заболеваниями органов малого таза (табл. 4 и 5).
Таблица 4. Уровни IgG, IgA, sIgA в слюне пациентов с воспалительными
заболеваниями органов малого таза и у здоровых женщин
Группа
Женщины с воспалительными
Показатели
контроля
заболеваниями органов малого таза
(n=9)
Хроническое воспаление (n=8)
Острое
воспаление
(n=11)
IgG, мкг/мл
IgA, мкг/мл
sIgA, мкг/мл
28±12,0
82±41,1
146±48,1
35,4±17,0
69,8±30,9
163,6±72,8
35,2±14,4
56,6±22,6
156,1±44,0
18
Примечание. Различия средних значений между группами больных и
контрольной группой статистически незначимы.
Установлено, что уровень иммуноглобулинов в слюне больных и здоровых
женщин не имел существенных различий.
Полученные данные позволяют сделать важный вывод о том, что
несмотря на существование общей системы слизистых оболочек, интенсивность
гуморального иммунного ответа в различных ее отделах неодинакова и
воспалительные заболевания органов малого таза не приводят к изменению
секреции иммуноглобулинов в слизистой полости рта.
Следовательно, фагоцитарная активность лейкоцитов, субпопуляционный
состав лимфоцитов, уровень иммуноглобулинов сыворотки крови и в слюне
пациентов c воспалительными заболеваниями органов малого таза не могут
служить диагностическими критериями характера воспаления и степени его
выраженности.
Диагностически значимым оказалось исследование уровня IgG, IgA, sIgA в
вагинальном секрете у пациентов с воспалительными заболеваниями органов
малого таза. Эти показатели значительно повышались в вагинальном секрете
при хроническом течении воспалительного процесса и имели наиболее высокие
значения в стадии обострения. Исследование концентрации IgG, IgA, sIgA в
вагинальном секрете при хроническом течении заболевания показало повышение
показателей по сравнению с контрольной группой: (504,1±3,3) против (87,2±2,6)
мкг/мл; (152,7±2,0) против (34,9±1,7) мкг/мл и (452,3±23,6) против (142,1±2,8)
мкг/мл соответственно. Еще более выраженное увеличение выявлено при остром
течении заболевания: IgG (1335,2±89,3) мкг/мл, IgA (582,3±16,1) мкг/мл и sIgA
(2038,2±75,1) мкг/мл, что значимо отличалось от показателей в группе с
хроническим течением заболевания (табл. 5).
Таблица 5. Уровни IgG, IgA, sIgA в вагинальном
воспалительными заболеваниями органов малого таза
секрете пациентов с
19
Группа
контроля
(n=27)
Показатели
Женщины с воспалительными
заболеваниями органов малого таза
Хроническое воспаление (n=22)
Острое
воспаление
(n=56)
IgG mkg/ml
87,2±2,6
504,1±3,3*
1335,2±89,3*
IgA mkg/ml
34,9±1,7
152,7±2,0*
582,3±16,1*
sIgA mkg/ml
142,1±2,8
452,3±23,6*
2038,2±75,1*
Примечание. * - достоверность различий по отношению к
группе контроля p≤0,05.
Можно предположить, что инфекционные агенты способны активировать
местный иммунный ответ в конкретном отделе слизистой оболочки, что приводит
к повышению их уровня в вагинальном секрете. При этом, чем выше степень
выраженности воспалительного процесса, тем больше выражена местная
иммунологическая реакция.
Следующим
этапом
исследований
иммунологических
показателей
слизистых оболочек явилось изучение экспрессии генов TLRs в эпителиальных
20
клетках цервикального канала у женщин с воспалительными заболеваниями
органов малого таза. В группе с хроническим течением заболевания выявлено
повышение уровня экспрессии генов TLR2 и TLR9, до 47,86±25,7 и 0,40±0,08
(*105 количества копий к ДНК TLR2 и TLR9) относительно 106 копий гена βактина соответственно по сравнению с показателями женщин, входящих в группу
контроля (TLR2 - 19,95±11,80 и TLR9 - 0,06±0,03). В группе с обострением
воспалительного заболевания отмечено более выраженное повышение экспрессии
генов TLR2 и TLR9 до 52,48±16,67 и 1,35±0,43 (*105 количества копий к ДНК
TLR2 и TLR9) относительно 106 копий гена β-актина соответственно по
сравнению с уровнем экспрессии TLR2 и TLR9 женщин, входящих в группу
контроля (TLR2 - 19,95±11,80 и TLR9 - 0,06±0,03) (табл. 6).
Таблица 6. Уровни экспрессии генов TLR2 и TLR9 в эпителиальных клетках
слизистой оболочки цервикального канала женщин с воспалительными
заболеваниями органов малого таза
Показатели
Группа контроля
(n=27)
TLR2**
TLR9**
19,95±11,80
0,06±0,03
Женщины с воспалительными
заболеваниями органов малого таза
Хроническое
Обострение
воспаление (n=21)
воспаление
(n=33)
47,86±25,7*
52,48±16,67*
0,40±0,08*
1,35±0,43*
Примечание. * – достоверность различий по отношению к группе контроля
p≤0,05; ** – показатели TLRs представлены в количествах копий исследуемого
гена относительно 106 копий гена β-актина.
Полученные результаты свидетельствуют о более высоком количестве TLR2
(50,12±22,30) (*105 количества копий к ДНК TLR2) относительно 106 копий гена
β-актина по сравнению с TLR9 (0,87±0,32) (*105 количества копий к ДНК TLR9)
относительно 106 копий гена β-актина в эпителиальных клетках слизистой
оболочки цервикального канала у пациентов с воспалительными заболеваниями
органов малого таза.
Всем пациентам с воспалительными заболеваниями органов малого таза
назначали комплексное противовоспалительное и иммуномодулирующее лечение.
21
Терапию проводили 22 женщинам с воспалительными заболеваниями
органов малого таза в стадии хронического течения заболевания и 56 женщинам в
стадии обострения. Для лечения применяли как системные препараты, так и
местные
в
виде
свечей
(интравагинально
и/или
ректально).
Оценку
иммунологических показателей проводили через 2 недели и через 3 месяца после
терапии.
Лечение состояло из 2-х этапов. На первом этапе проводили системную
антибактериальную (препараты выбирали по чувствительности микроорганизмов
к антибиотикам, назначаемым в возрастных дозировках в течение 10-14 дней)
и/или противовирусную терапию (Валтрекс, 500 мг х 2 раза в день в течение 5
дней, далее по 500 мг в день в течение полугода). Дополнительно назначали
местную терапию комплексными препаратами (Тержинан 1 таблетка в день – 10
дней, Полижинакс 1 капсула в день – 6 дней, Макмирор-комплекс 1 свеча перед
сном – 8 дней).
На
втором
этапе
осуществляли
иммунокорригирующую
терапию.
Иммуномодуляторы назначали в соответствии с инструкцией по их применению.
При
этом
использовали
дифференцированный
подход
к
выбору
иммуномодулирующего препарата, основанный на значениях иммунологических
показателей.
Хотя у большинства обследованных женщин
с
воспалительными
заболеваниями органов малого таза выявлены нормальные уровни показателей
субпопуляции лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD72+), в ряде случаев
отмечали отклонения от нормы. Это являлось основанием для проведения
иммунотропного лечения.
При отклонении от нормы уровней CD3+, CD4+, CD72+ клеток назначали
бактериальный
иммуномодулятор
Иммуновак-ВП-4.
При
отклонении
от
нормальных показателей CD8+ - лимфоцитов применяли Тактивин. При менее
выраженных
отклонениях
показателей
CD16+
-
лимфоцитов
применяли
синтетический иммуномодулятор Ликопид, при более выраженных, основываясь
на
практическом
опыте,
назначали
Полиоксидоний.
Для
проведения
22
иммунокорригирующего лечения препаратом Суперлимф в свечах сформировали
группу женщин с воспалительными заболеваниями органов малого таза, с
этиологическим
фактором
urealyticum/parvum;
Mycoplasma
бактериальной
hominis;
природы
Candida
(Ureaplasma
albicans,
Streptococcus,
Staphylococcus) у которых отсутствовали нарушения в системном иммунитете.
Все препараты назначали в соответствии с инструкцией по применению, с учетом
возрастных дозировок и механизма их действия на иммунную систему. Оценку
терапевтического эффекта проводили в целом по группе пациентов с
воспалительными заболеваниями органов малого таза.
После иммунотерапии, проведенной на фоне базисного лечения, ведущее
место
в
вагинальном
микроценозе
принадлежало
микроаэрофильным
лактобактериям в количестве 109 КОЕ/мл (рис. 2).
Рис. 2. Микробиоценоз отделяемого цервикального канала после комплексной
противовоспалительной с использованием иммуномодуляторов.
В 60% случаев определялись Lactobacillus spp.: из них в 15%
Bifidobacterium
spp.
в
концентрациях
103-107
КОЕ/мл;
25%
составили
Peptostreptococcus spp. в титре 102-103 КОЕ/мл.: Staphylococcus spp. 102-103;
23
Streptococcus spp. 102-103 КОЕ/мл.; M.hominis 103 КОЕ/мл.;
U.urealyticum 103
КОЕ/мл.; дрожжевые грибы рода Candida до 103 КОЕ/мл.
После терапии с использованием иммуномодулирующих препаратов
наблюдали положительную динамику, заключающуюся в снижении уровня
экспрессии
генов
TLR2
и
TLR9
в
эпителиальных
клетках
слизистой
цервикального канала у женщин с воспалительными заболеваниями органов
малого таза (табл. 7), а также нормализацию концентрации IgG, IgA, sIgA в
вагинальном секрете (табл. 8).
Таблица 7. Уровень экспрессии генов TLR2 и TLR9 в эпителиальных клетках
слизистой цервикального канала женщин после иммунокорригирующей терапии
Показатель
До лечения
Стадия заболевания
TLR2
TLR9
Обострение (n=33)
52,48±16,67*
1,35±0,43*
Хроническое течение (n=21)
47,86±25,7*
0,40±0,08*
Через 2 недели
Обострение (n=33)
16,60±13,8**
0,16±0,07**
после лечения Хроническое течение (n=21) 17,78±12,5**
0,14±0,09**
Группа контроля (n=27)
19,95±11,8
0,06±0,03
Примечание. * - различия средних значений между группами женщин с
воспалительными заболеваниями органов малого таза и контрольной группой
p≤0,05; ** - различия средних показателей до и после лечения у пациентов с
воспалительными заболеваниями органов малого таза p≤0,05.
В группе женщин с воспалительными заболеваниями органов малого таза
через 2 недели исходно высокий уровень экспрессии TLR2 снизился в стадии
обострения в 3,1 раза с (52,48±16,67) (*105 количества копий к ДНК TLR2)
относительно 106 копий гена β-актина до (16,60±13,8) и в группе женщин с
хроническим течением воспалительных заболеваний в 2,9 раза с (47,86±25,7)
(*105 количества копий к ДНК TLR2) относительно 106 копий гена β-актина до
(17,78±12,5) (*105 количества копий к ДНК TLR2) относительно 106 копий гена βактина.
Уровень экспрессии генов TLR9 через 2 недели после лечения снизился в
группе женщин с обострением воспалительных заболеваний в 22,5 раза
(1,35±0,43) (*105 количества копий к ДНК TLR9) относительно 106 копий гена β24
актина до (0,16±0,07) (*105 количества копий к ДНК TLR9) относительно 106
копий гена β-актина и в группе женщин с хроническим течением воспалительных
заболеваний в 6,7 раза с (0,40±0,08) (*105 количества копий к ДНК и TLR9)
относительно 106 копий гена β-актина до (0,14±0,09) (*105 количества копий к
ДНК TLR9) относительно 106 копий гена β-актина.
После терапии с использованием иммуномодулирующих препаратов
наблюдали существенное снижение исходно высоких концентраций IgG, IgA,
sIgA в вагинальном секрете (табл. 8).
Таблица 8. Концентрации IgG, IgA, sIgA в вагинальном секрете женщин после
иммуномодулирующей терапии
Показатели
IgA (мкг/мл)
sIgA (мкг/мл) IgG (мкг/мл)
Группа контроля (n=27)
34,9±1,7
142,1±2,8
87,2±2,6
до лечения
152,7±2,0*
452,3±23,6*
504,1±3,3*
Хроническое
через 2 нед.
64,9±3,4**
223,3±9,0**
137,2±6,9**
воспаление
после лечения
(n=22)
через 3 мес.
47,8±3,9**
148,8±2,1**
97,6±5,4**
после лечения
до лечения
582,3±16,1*
2038,2±75,1*
1335,2±89,3*
Острое
через 2 нед.
воспаление
81,7±4,5**
249,8±4,3**
152,0±3,7**
после лечения
(n=56)
через 3 мес.
54,7±4,3**
150,4±5,7**
107,5±3,6**
после лечения
Примечание. * – различия средних значений между группами женщин с
воспалительными заболеваниями органов малого таза и контрольной группой
p≤0,05; ** – различия средних показателей до и после лечения у пациентов с
воспалительными заболеваниями органов малого таза p≤0,05.
.На основании полученных результатов можно предположить, что чем выше
степень выраженности воспалительного процесса, тем больше выражена местная
иммунологическая реакция, связанная
слизистых
организма.
Нормализация
с
активацией защитных
показателей
местного
механизмов
иммунитета
соответствовала восстановлению микробиоценоза цервикального канала. Через 2
недели
после
проведения
лечения
повышалось
содержание
лакто-
и
бифидобактерий.
Следует отметить, что нормализации показателей местного иммунитета
соответствовала положительная динамика в клинической картине заболевания,
25
оценку которой проводили в целом по группе больных с воспалительными
заболеваниями органов малого таза (табл. 9).
Таблица 9. Динамика клинических симптомов воспалительных заболеваний на
фоне проводимой терапии
Жалобы
Слизисто-гнойные выделения
Зуд, жжение в области вульвы
Дизурические расстройства
Диспареуния
Положительная динамика
психо-эмоционального состояния
Кольпоскопическая картина: эндоэкзоцервицит
Количество женщин, предъявляющих
жалобы
До лечения Через 2 нед. Через 3 мес.
после
после
лечения
лечения
64
0
0
58
0
0
27
2
1
32
2
0
34
1
1
55*
1
0
В 90% случаев через 2 недели после лечения и в течение 3 месяцев
наблюдений
женщины
не
предъявляли
жалоб,
отмеченных
до
лечения.
Улучшилось общее состояние здоровья.
Полученные
данные
свидетельствуют
о
том,
что
у
женщин
с
воспалительными заболеваниями органов малого таза проявляются нарушения в
системе местного и системного иммунитета. Включение иммунокорригирующих
препаратов в комплексную противовоспалительную терапию в зависимости от
характера иммунологических нарушений приводит к улучшению клинического
течения заболевания и нормализации иммунологических показателей.
Выводы:
1. Показано, что у 70% пациентов в секрете из цервикального канала
персистировали бактерии Ureaplasma urealyticum/parvum, Mycoplasma hominis,
26
Candida albicans, Escherichia coli, а также представители родов Proteus,
Streptococcus, Staphylococcus); у 5% - вирусы (цитомегаловирус, вирус простого
герпеса 1 и 2 типов, вирус папилломы человека); у 25% пациентов –
бактериально-вирусная инфекция.
2. Установлено, что фагоцитарная активность лейкоцитов, субпопуляционная
структура лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD72+), уровень общих
иммуноглобулинов A, G, M классов в сыворотке крови и слюне пациентов c
воспалительными заболеваниями органов малого таза не могут служить
иммунологическими
критериями
наличия
воспаления
и
степени
его
выраженности.
3. Показано, что у пациентов с воспалительными заболеваниями органов малого
таза повышена экспрессия генов TLR2 и TLR9 в эпителиальных клетках
цервикального канала, что может служить критерием диагностики наличия и
степени выраженности воспалительного процесса.
4. У пациентов с воспалительными заболеваниями органов малого таза выявлено
повышенное содержание IgG, slgA, IgА в вагинальном секрете: более выраженное
при обострении, чем при хроническом течении заболевания.
5. Установлено, что интенсивность гуморального иммунного ответа в различных
отделах
мукозоассоциированной
лимфоидной
ткани
неодинакова
и
воспалительные заболевания органов малого таза не приводят к изменению
секреции иммуноглобулинов в слизистой полости рта.
7. Снижение экспрессии генов TLR2 и TLR9, а также продукции IgG, slgA, IgА
влагалищного секрета после иммунокорригирующей терапии свидетельствует о
положительной динамике течения заболевания и эффективности проводимой
терапии.
8. После проведения иммунокорригирующей терапии на фоне комплексного
лечения пациентов с воспалительными заболеваниями органов малого таза через
2 недели после окончания курса лечения и в течение 3-х месяцев наблюдения
происходит
нормализация
клинико-лабораторных,
микробиологических,
27
иммунологических показателей и положительная динамика клинического течения
заболевания.
Практические рекомендации
к проведению иммунокорригирующей терапии в составе комплесного лечения
воспалительных заболеваний органов малого таза (ВЗОМТ).
1. До начала лечения, при предъявлении женщиной жалоб, характерных для
ВЗОМТ всем женщинам следует проводить комплексное общеклиническое,
клинико – лабораторное, гинекологическое исследования, УЗИ органов малого
таза, ПЦР-диагностика на наличие хламидий, ВПЧ 16, 18, ВПГ I, II,
бактериологические посевы из цервикального канала, с целью определения роста
патогенной
и
условно
патогенной
микрофлоры,
чувствительности
микроорганизмов к антибиотикам, а также для определения количества
нормальной микрофлоры. Лечение ВЗОМТ целесообразно проводить в 2 этапа.
На первом этапе проводить мероприятия, способствующие элиминации
инфекционного агента. На втором - иммунокорригирующую терапию.
2.
Для
элиминации
инфекционного
агента
бактериальной
природы
рекомендуется проводить антибактериальную терапию (препараты следует
выбирать
по
чувствительности
микроорганизмов
к
антибиотикам).
Для
подавления вирусной активности - применять противовирусную терапию
(Валтрекс 500 мг х 2 раза в день в течение 5 дней, далее по 500 мг в день в
течение полугода). В качестве местной терапии пользоваться комплексными
препаратами (Тержинан 1 таблетка в день – 10 дней, Полижинакс 1 капсула в
день – 6 дней, Макмирор-комплекс 1 свеча перед сном – 8 дней).
3. Перед назначением иммунотерапии целесообразно проводить оценку
иммунного статуса.
Выбор
иммуномодулирующего
препарата
должен
быть
обоснован
изменениями в субпопуляционной структуре лимфоцитов:
- при отклонении от нормы содержания CD3+, CD4+, CD72+ клеток
рекомендуется
выбирать
бактериальные
иммуномодуляторы
(например,
Иммуновак-ВП-4).
28
-
При
выявленном
рекомендуется
дефиците
применять
CD8+
препарат
цитотоксических
полипептидной
Т-лимфоцитов
природы
(например,
Тактивин).
- При снижении численности CD16+ клеток целесообразно применять
синтетические иммуномодуляторы, например, Полиоксидоний - при более
выраженных отклонениях показателя, Ликопид - при менее выраженных.
-
При
отсутствии
нарушений
в
показателях
системного
иммунитета
рекомендуется применять препараты местного действия обладающие местным
иммуномодулирующим и противомикробным действием, например Суперлимф.
- Определение показателей местного иммунитета может служить в качестве
дополнительного диагностического критерия эффективности проводимой
терапии.
- Иммунотерапию рекомендуется применять в комплексе с другими
препаратами, используемыми для лечения воспалительных заболеваний
органов малого таза у женщин независимо от клинической степени
выраженности течения заболевания.
Включение иммунокорригирующей терапии в состав комплексного лечения
ВЗОМТ по ближайшим и отдаленным результатам лечения позволяет достичь
положительной динамики в клинической картине и хорошо переносится больными.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Шибина Л.В., Краснопрошина Л.И., Ордиянц И.М. Эпидемиологические
аспекты хронического эндометрита в рамках воспалительных заболеваний
органов малого таза у женщин репродуктивного возраста // Актуальные вопросы
эпидемиологии инфекционных болезней. - 2011. - № 10. - С. 534-538.
2. Шибина Л.В., Краснопрошина Л.И., Ордиянц И.М. Иммунологические
методы диагностики хронических воспалительных заболеваний органов малого
таза у женщин репродуктивного периода // Медицинская иммунология. - 2011. –
Т. 13. - №4-5. - С. 445.
3. Краснопрошина Л.И., Шибина Л.В., Свитич О. А., Ордиянц И. М.,
Сходова С.А.Уровень экспрессии TLR 2, TLR 9 эпителиальными клетками
слизистой цервикального канала как дополнительный диагностический критерий
хронических воспалительных заболеваний органов малого таза у женщин
репродуктивного периода // Российский аллергологический журнал. – 2013. №2. Ч.2. - С. 157-158.
29
4. Шибина Л.В., Краснопрошина Л.И., Свитич О.А. и др. Продукция IgG,
IgA, sIgA в вагинальном секрете, экспрессия TLR2, TLR9 эпителиальными
клетками слизистой цервикального канала до и после комплексного
иммунокорригирующего лечения воспалительных заболеваний органов малого
таза у женщин репродуктивного возраста // Российский иммунологический
журнал. – 2013. Т. 7(16). - № 1. - С. 77-82.
5. Шибина Л.В., Свитич О.А., Краснопрошина Л.И., Сходова С.А.,
Ордиянц И.М.,Бишева И.В. Экспрссия генов TLR2 и TLR9 эпителиальными
клетками слизистой оболочки цервикального канала у женщин с
воспалительными заболеваниями органов малого таза // Журнал микробиологии,
эпидемиологии и иммунобиоллогии. - 2013. - № 3. – С. 68-72.
6. Шибина Л.В., Краснопошина Л.И., Ордиянц И.М., Слатинова О.В.,
Сходова С.А. Уровень sIgA, IgG, IgA в вагинальном секрете женщин с
хроническими заболеваниями органов малого таза // Журнал микробиологии,
эпидемиологии и иммунобиоллогии. - 2013. - № 4. – С. 55 - 59.
30