GENETIKA FROM FUNDAMENTAL RESEARCH TO UNDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY Р.А. Хамитов ГНЦ РФ ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВА БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СУБСТАНЦИЙ ВИП: Важнейший инновационный проект 2007 – 2010 Тема: «Производство рекомбинантных белков для медицинского применения на основе культур клеток животных и микроорганизмов с использованием высокоэффективных технологических платформ». Цель: ликвидация технологического отставания отечественной фарминдустрии и снижение зависимости от импорта лекарственных субстанций за счет реализации цикла работ по созданию производства рекомбинантных белков для медицинского применения на базе высокоэффективных технологических платформ на основе культур клеток животных и микроорганизмов, включая работы от создания перспективного инновационного продукта, имеющего значительный потенциал для коммерциализации, до освоения на его основе промышленного производства новой и усовершенствованной высокотехнологичной продукции и ее успешной реализации на рынке, обеспечивающей в течение выполнения проекта 5-кратное превышение объемов продаж созданной продукции относительно затраченных по проекту бюджетных средств. Инновационный внедренческий центр на базе ГосНИИгенетики В центре имеются следующие технологические участки: • блок для проведения генно-инженерных работ и конструирования продуцентов; • лаборатория культивирования микроорганизмов; • лаборатория культивирования эукариотов; • участок биохимии для проведения очистки белковых препаратов, полученных микробиологическим способом; • участок биохимии для проведения очистки белковых препаратов, полученных с помощью эукариотов; • лаборатория переноса технологии; • помещение карантинного хранения; • испытательная аналитическая лаборатория; • собственная система водоподготовки • собственная замкнутая система вентиляции и кондиционирования воздуха. • специальные помещения для подготовки посуды и приготовления растворов, питательных сред и т.д. (отдельно для микробиологического производства и для производства с использование клеток млекопитающих); Лаборатория культивирования микроорганизмов Лаборатория культивирования эукариотов Лаборатория переноса технологии Испытательная аналитическая лаборатория Центр прошел лицензирование и аккредитацию в системе качества. Получена лицензия на осуществление деятельности, связанной с использованием возбудителей инфекционных заболеваний. Основные биофармацевтические продукты, закупаемые по импорту, и потери бюджета от отсутствия отечественных аналогов ПРОДУКТЫ и НОЗООЛОГИИ (ОСНОВНЫЕ) ДОЛЯ ИМПОРТА ПОТЕРИ ОТ ОТСУТСТВИЯ ОТЕЧЕСТВ. СРЕДСТВ Эритропоэтин, ЭПО (анемия) >95% 1.0 МЛРД.РУБ / ГОД Интерферон-альфа, ИНФальфа (гепатиты В и С, онкология) 80 1.0 МЛРД.РУБ / ГОД Стоимость годового курса ЭПО при лечении почечной недостаточности составляет более 150 тыс рублей на одного пациента Стоимость курса интерферона альфа при лечении вирусных гепатитов – более 250 тыс рублей на пациента, а при лечении онкологических заболеваний может достигать 2 млн. руб. Этапы создания лекарственных средств на основе рекомбинантных белков генно-инженерные работы создания генетических конструкций; получение клеток-продуцентов; оптимизация условий культивирования, способствующих максимальному выходу продукта без потери его качественных характеристик; подбор условий выделения и очистки целевого белка и их оптимизация для снижения себестоимости продукта; разработка методов контроля качества; разработка и испытание готовой лекарственной формы; . масштабирование производства. Производство рекомбинантного эритропоэтина человека Эритропоэтин (ЭПО) – основной регулятор эритропоэза. Первичная структура зрелого эритропоэтина человека, имеющего три N-связанных углеводных остатка (аминокислоты Asn-24, Asn-38 и Asn-83) и одну О-связанную углеводную цепь (Ser-126). Эпоэтин-бета отличается от эпоэтина-альфа: 1) более широким спектром и большей пропорцией менее кислых изоформ; 2) большей пропорцией связывания с лектинами Erythrina cristagalli, Lycopersicon esculentum, Phaseolis vulgaris и Agaricus bisporus; 3) большим содержанием изоформ с высоким соотношением биоактивностей in vivo/in vitro. Схемы производства эритропоэтина Адгезионная культура клеток СНО Приготовление банков клеток Культивирование на флаконах Роллерное культивирование Выделение и очистка Стерилизующая фильтрация И фасовка Суспензионная и псевдосуспензионная культура клеток СНО Приготовление банков клеток Культивирование в колбах Реакторное культивирование Выделение и очистка Стерилизующая фильтрация И фасовка МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО ЭРИТРОПОЭТИНА Адгезионная (прикрепленная) культура клеток СНО Клетки прикрепляются к поверхности сосуда. Культивируются в роллерных установках с вращающимися бутылями. P ~ Vbio ~ S ~ L2, Vmed ~ Vfl ~ L3 р = P/V ~ Vmed-1/3 P – продуктивность клеток р – удельная продуктивность на единицу объема Vfl – объем сосуда Vbio - объем биомассы Vmed - объем среды S – площадь поверхности сосуда L- линейные размеры сосуда Увеличение объема сосуда приводит к уменьшению удельной продуктивности на единицу Возможности масштабирования адгезионной культуры клеток CHO 1. Увеличение числа роллерных бутылей Преимущества: - низкая стоимость материалов - неизменность производственного регламента Недостатки: - высокая трудоемкость - необходимость увеличения производственной базы 2. Использование сосудов с увеличенной площадью поверхности Роллерные бутыли с гофрированной поверхностью (в 2 раза) Многоэтажные флаконы (до 50 “этажей”) Преимущества: - меньшие затраты на оборудование Недостатки: - необходимость изменения производственного регламента Замечание: - высокая стоимость материалов, которая часто окупается за счет большей продуктивности Перевод клеток в суспензионную форму позволяет культивировать клетки не на поверхности, а в объеме среды 1. “Псевдосуспензия” с использованием микроносителей (клетки растут на поверхности или в порах микрочастиц) Преимущества: - использование обычных адгезионных клеточных линий Недостатки: - сравнительно низкая плотность - высокая себестоимость частиц 2. “Истинная” суспензионная культура Преимущества: - сверхвысокая клеточная плотность (более 107 клеток/мл) - использование бессывороточных сред Недостатки: - необходимость создания и характеризации специальных клеточных линий Культивирование суспензионных клеток СНО Многоразовые биореакторы Одноразовые системы культивирования К преимуществам одноразовых ферментеров относятся: сокращение времени подготовку ферментера к работе за счет исключения процессов мойки и стерилизации и связанным с ними контрольных операций; технологичность процессов масштабирования и переноса технологий; упрощение процессов ферментации и снижение практически до нуля рисков контаминации; удешевление процессов внедрения технологий; повышение коэффициента загрузки оборудования за счет сокращения времени на его подготовку; упрощение системы валидации оборудования и технологии; снижение требований к квалификации персонала. ПРОДУКЦИЯ КЛЕТКАМИ ЭПО ПРИ РАЗНЫХ УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Клетки СНО, продуцирующие эритропоэтин, культивировали в следующих условиях: 1 роллерные бутыли, адгезионная культура 2 суспензионная культура, сывороточная среда 3 суспензионная культура, бессывороточная среда 4 После чего собирали культуральную жидкость (КЖ) с помощью центрифугирования и/или фильтрации. Изоэлектрическое фокусирование образцов КЖ В качестве образца сравнения использовали: 4 стандарт BRP Европейской фармакопеи Концентрация ЭПО в образцах КЖ по данным ИФА Вестерн-блот образцов КЖ Образцы 3 2 1 4 Концентрация ЭПО, мг/л 1 13-27 2 35-46 3 22-34 Исх. линия 10-15 1 2 3 4 Производство рекомбинантного безметионинового интерферона альфа – 2b человека Интерферон альфа-2b - рекомбинантный белок с молекулярной массой 19 300 дальтон. Получен из клона E.coli путем гибридизации плазмиды бактерий с геном человеческих лейкоцитов, кодирующим синтез интерферона. В отличие от интерферона альфа-2a имеет аргинин в положении 23. Схема производства Приготовление банков клеток Культивирование в колбах Культивирование в биореакторе дезинтеграция и Первичная очистка Выделение и очистка Стерилизующая фильтрация И фасовка Разработка продуцента безметионинового интерферона альфа-2b Система SUMO (Small Ubiquitin-related protein Modifier) состоит из гибридного белка, включающего в свой состав одноименный белок-помощник, а также SUMO-специфичной протеиназы Ulp1, используемой для процессинга гибридного белка и выщепления из его состава целевой части. Достоинства: 1) Ulp1 способна эффективно гидролизовать пептидную связь, соединяющую консервативный С-концевой дипептид ГлиГли зрелого SUMO с любым последующим аминокислотным остатком (кроме пролина); 2) способна эффективно гидролизовать изопептидную связь соединяющую консервативный С-концевой дипептид ГлиГли зрелого SUMO с -аминогруппой остатка лизина в целевом белке; 3) Ulp1 является одной из самых «технологичных» протеиназ. Стадии дезинтеграции и первичной очистки Дезинтеграцию проводят в проточном дезинтеграторе при высоком давлении. Удаление растворимых клеточных компонентов производят промыванием нерастворимой формы интерферона буферными растворами, содержащими денатурирующие агенты и детергенты (Тритон Х100, мочевина и т.д.). Полученный осадок, содержащий интерферон, растворяют в буферном растворе, гидрохлорид. содержащим 6 М гуанидин Схема процесса 4-х стадийной хроматографической очистки Обращеннофазная хроматография (RPC) Катионообменная хроматография (КМ1) Катионообменная хроматография (КМ2) Гель-фильтрация (SE) KM1 RPC KM2 SE Цель Захват белка, концентрирование Основная очистка Концентрирование Очистка от димеров ИФН, перевод в буфер ГЛФ Оборудование Радиальные колонки Proxys с сорбентом CM-Sepharose FF Аксиальные колонки высокого давления Vydac C18 Радиальные колонки Proxys с сорбентом CM-Sepharose FF Аксиальные колонки с сорбентом Superdex 75 Масштабирование стадии хроматографической очистки Рисунок 2. Слева - схема потока и эффект концентрирования в радиальной хроматографии; Справа - пристеночные эффекты и схема потока в аксиальной хроматографии. Преимущества: Рисунок 1. Схема радиальной колонки. А - упаковочные входы. воспроизводимость; экономичность; высокая производительность; дополнительное концентрирование элюата; высокая масштабируемость Характеристики этапов очистки безметионинового интерферона альфа-2b Стадии Выход со стадии Чистота интерферона Подготовительные этапы Отмывка 1 20±2% Отмывка 2 90±2% Отмывка 3 85±5% Растворение 98±1% Ренатурация и ферментолиз 6,5±0,5% 50±5% Очистка Ионообменная хроматография КМ1 85±5% > 70% Обращенно-фазная хроматография 75±5% > 95% Ионообменная хроматография КМ2 Гель-фильтрация 97±2% > 95% 97±2% > 95% ВЫВОДЫ: 1. Производство субстанции эритропоэтина было увеличено в 5 раз; 2. Производство субстанции интерферона альфа-2b было увеличено в 2,5 раза. Меняйте мир вместе с нами www.genetika.ru