Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014 УДК 66.011 Доцент Д.С. Дворецкий, доцент Е.В. Пешкова, аспирант М.С. Темнов (Тамбовский гос. техн. ун-т) кафедра технологии и оборудования пищевых и химических производств, тел. (4752) 63-94-42 Экспериментальное определение технологических режимов роста биомассы микроводоросли хлорелла с повышенным содержанием липидов Обосновано применение микроводоросли Chlorella vulgaris штамм ИФР № С-111 в качестве источника сырьевых компонентов для произ­ водства биодизельного топлива третьего поколения. Проведены экспе­ риментальные исследования, на основании которых разработаны тех­ нологические основы и модифицированные питательные среды для культивирования биомассы Chlorella vulgaris ИФР № С-111 с повышен­ ным содержанием липидов. The implementation of Chrorella vulgaris microalgae (strain IFR No. C- 111) as a source of raw materials for third-generation biodiesel fuel production is justified. Experimental research has been conducted which allowed to develop techniques and modified broth for the cultivation of Chrorella vulgaris (strain IFR No. C- 111) biomass rich in lipids. Ключевые слова: микроводоросль Chlorella vulgaris, штамм ИФР № С-111, липиды, компоненты смесевого биодизельного топлива, техно­ логические режимы культивирования, модифицированная питательная среда Тамийя, источники азотного питания. В настоящее время перспективным является применение биомассы в производстве энергоносителей. Основным сырьем для получения биодизельного топлива являются растительные технические липиды, которые извлекают из возоб­ новляемой биомассы (рапса, сои, рыжика, кукурузы) [1]. Использование биомассы микроводорослей в качестве источника сырья представляется наиболее оправдан­ ным в производстве биотоплива третьего поколения [1]. Для производства биотоп­ лива используются нейтральные липиды триацилглицериды. Синтез и накопление большого количества триацилглицеридов в биомассе микроводорос­ лей происходит в условиях стрессового культивирования, осуществляемого подбо­ ром специальной питательной среды, температуры, освещения [4]. В исследовании Н.И. Черновой и др. [2] проведен сравнительный анализ ур о­ жайности масличных растений и микроводорослей при промышленном производ­ стве технических липидов и показано, что из-за высокой продуктивности микрово­ дорослей замена масличных культур на микроводорослевые позволит сократить площади выращивания в 5СН100 раз, используя земли, не пригодные для растениеводства. В исследовании Б.К. Заядана и др. [3] выделены альгологически чистые куль­ туры микроводорослей из различных водных экосистем, проведен скрининг по продуктивности выделенных культур и коллекционных штаммов микроводорослей. СДворецкий Д.С., Пешкова Е.В., Темнов М.С., 2014 32 Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014 Методом индуцированного мутагенеза (УФ-облучение, 254 нм, 40 эрг/мм2) и селекции получен мутантный штамм Chlorella pyrenoidosa C-2m2, характеризую­ щийся высокой активностью биосинтеза и накопления липидов, и проведена опти­ мизация условий его культивирования. Установлено, что оптимальными условиями для интенсивного накопления липидов клетками Chlorella pyrenoidosa C-2m2 явля­ ется уменьшение концентрации азота в питательной среде в 10 раз (до 0,004 г/л) и освещенность на уровне 4 кАк. Paul Held [4] изучал штаммы Chlorella vulgaris (2714) и два различных выде­ ленных штамма Microcystis aeruginosa (LB 2238 и LB 2061). Клетки штаммов выра­ щивались на средах BG11, ТАР и ТР. В результате было определено, что при вы ра­ щивании штаммов на среде BG11 наибольшую продуктивность имеет Chlorella vulgaris 2714 - на 15-й день культивирования 38 миллионов клеток в 1 мл суспен­ зии, Microcystis aeruginosa LB2238 и LB2061 - 8 миллионов клеток в 1 мл суспензии и 30 миллионов клеток в 1 мл суспензии. При выращивании штамма Chlorella vulgaris (2714) на средах BG11, ТАР и ТР наибольший прирост биомассы составил на среде ТАР. В исследовании Eline Ryckebosch и др. [6] использовались штамм Phaeodactylumtri cornutum P tl 8.6, который выращивали на питательной среде WC с добавлением 30 г/л искусственной морской соли. Также изучались штамы Nannochloropsis salina SAG 40.85, Chlorella vulgaris SAG 2 1 1 - llb и Arthrospira platensis SAG 85.79. Nannochloropsis salina и Chlorella vulgaris культивировали при температуре 21,9 ± 0,5 °C и при использовании среды WC. Для морской микроводо­ росли Nannochloropsis salina добавлялось 30 г/л искусственной морской соли. A r­ throspira platensis культивировали при температуре 21,9 ± 0,5 °С, для культивиро­ вания использовалась среда Spirulina (SAG, Германия). Клеточные стенки всех штаммов подвергались разрушению (обработкой в шариковой мельнице или уль­ тразвуком), при этом максимальное количество липидов было экстрагировано из биомассы Nannochloropsis salina (35,1 ± 0,8 %), далее шли остальные штаммы: Phaeodactylumtri cornutum (28,7 ± 0,4), Chlorella vulgaris (21,7 ± 2,0), Arthrospira platensis (11,6 ± 0,8). В исследовании Pandian Prabakaran et al. [7], были выбраны микроводоросли Chorella sp., Scenedesmus sp. и Neochloris sp. Микроводоросли инкубировали, и с­ пользуя среду BG11 [7] при воздухообмене 0,3 об/м3 и освещенности на уровне 2.5 кАк. Сухой вес биомассы всех трех штаммов составил 0,5 г/л, наибольшая про­ дуктивность была у штамма Chorella sp. и составила 52,7 мг/л-сут. Максимальная производительность липидов была у штамма Scenedesmus sp. и составила 9,5 мг/(л-сут). По результатам данного исследования, учитывая величины производи­ тельности биомассы и липидов, можно рекомендовать использовать штаммы Chorella sp. и Scenedesmus sp. В исследовании Jae-Yon Lee et al. [8] были использованы микроводоросли Botryococcus sp., Chlorella vulgaris и Scenedesmus sp. на среде B G 11 при воздухообмене 0,3 об/м3. Дни инкубации штаммов Chlorella vulgaris, Scenedesmus sp. составили 7 дней, для штамма Botryococcus sp. в два раза больше - 14. Сухой вес биомассы всех трех штаммов составил 0,5 г/л, наибольшая продуктивность была у штамма Chorella vulgaris и составила 74,2 мг/л-сут. Максимальная производительность ли ­ пидов была у штамма Botryococcus sp. и составила 11.5 мг/(л-сут), а у Chlorella vulgaris - 11,1 мг/(л-сут). Однако, учитывая тот факт, что дни инкубации штамма Chlorella vulgaris по сравнению со штаммом Botryococ­ cus sp. в два раза меньше, а содержание липидов в них практически одинаковое, микроводоросли Chlorella vulgaris можно рекомендовать использовать в качестве сырья для производства биотоплива. Таким образом, для производства биомассы в промышленном масштабе из всего многообразия микроводорослей пригодны штаммы рода Chlorella, 33 Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014 что обусловлено высокой скоростью роста, высоким содержанием триацилглицеридов по отношению к сухой массе и устойчивостью к чужеродным биологическим агентам (грибы, бактерии, другие виды микроводорослей). В качестве объекта исследования в данной работе использовался штамм мик­ роводоросли Chlorella vulgaris ИФР № С -111 как наиболее приспособленный для культивирования в условиях средней полосы России [9]. Экспериментальная установка (рис. 1) представляет собой реактор цилиндри­ ческой формы объемом 0,002 м3 из прозрачного материала, снабжённый барботером, с помощью которого осуществлялось обогащение суспензии газо-воздушной смесью. Освещенность реактора была на уровне 10,6 кАк, что соответствует преде­ лу насыщения по Винбергу. Рис. 1. Лабораторный фотобиореактор для культивирования фотоавт отроф ных м икроор­ ганизмов: 1 - реакт ор в форме цилиндра (h=400 мм, D=8 мм); 2 - барбот ажное устройство; 3 - панель с энергосберегающими лампами (освещенность слоя суспензии порядка 10 клк); 4 - компрессор; 5 - емкость для подачи питательной среды Цель исследования - определение технологических режимов роста биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris штамма ИФР № С -111, обеспечивающих накопле­ ние нейтральных липидов для последующего их использования в качестве сырья для смесевого биодизельного топлива, а именно: выбор питательной среды, обеспе­ чивающей наибольшую продуктивность микроводоросли, подбор компонентов п и ­ тательной среды - источников азотсодержащих соединений и интервала оптималь­ ных температур для роста биомассы микроводорослей хлорелла, а также условий стресса, стимулирующих накопление липидов в клетках рассматриваемого штамма. Для проведения первого эксперимента штамм Chlorella vulgaris ИФР № С -111 культивировался на питательных средах Тамийя [1] и ТАР [2] при температуре 29 °С, уровне pH 6,2-8,0, при круглосуточном освещении энергосберегающими лам ­ пами с освещенностью на уровне 10,6 кАк, аэрация осуществлялась воздушной смесью с содержанием углекислого газа 0,04 %. Посевной материал составлял 20 % от общего объема суспензии (с концентрацией: 1■10б кл/мл). Динамика прироста 34 Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014 Ж* штамма Chlorella vulgaris ИФР № С-111 на средах Тамийя и ТАР представлена на рис. 2. •—среда Тамийя ►*- среда ТАР t, сутки t, с у т Рис. 3. Динам ика прироста биомассы на модернизированных средах Тамийя с разным и источниками азота Рис. 2. Н акопление биомассы штамма Chlorella vulgaris И Ф Р NqC -111 на средах Тамийя и ТАР Экспоненциальная фаза роста составила 8 сут и максимальный прирост био­ массы - 55-106 кл/мл для среды Тамийя (8-е сут), максимальный прирост биомассы на среде ТАР был 15-106 кл/мл. Согласно литературе различные соединения - источники азота обладают разной доступностью для клеток микроводоросли хлорелла, поэтому во втором эксперименте производилась оптимизация питательной среды по применению азотсодержащих соединений. Для этого применялись модифицированные питательные среды Тамийя, в которых в качестве источника азота использовались: нитрат калия в первом эксперименте, хлорид аммония - во втором и мочевина в третьем (рис. 3). Условия культивирования: температура 29 °С, круглосуточная освещённость лампами на уровне 10,6 кАк, концентрация посевного материала 2-106 кл/мл. Результаты эксперимента показывают, что в качестве источника азотсодер­ жащих соединений для накопления биомассы штамма Chlorella vulgaris ИФР № С-111 оптимально подходит нитрат калия, обеспечивающий двукратный прирост биомассы на 7-й день культивирования по сравнению со средой с мочеви­ ной и более чем пятидесятикратный - при использовании питательной среды с хло­ ридом аммония. Объяснить низкий прирост на среде с источником азота - хлорид аммония можно тем, что хлорид аммония N H 4 CI - соль слабого основания гидрата аммиака NH./HvO и сильной соляной кислоты НС1, в воде гидролизуется и дает кис­ лую реакцию: N H 4 CI + НОН <-► N H 4 OH + НС1 NH4+ + НОН <-►n h 4o h + Н+, поэтому уровень pH в процессе культивирования на этой среде падал с 7,05 до 3,5. Замедление прироста биомассы на среде с использованием мочевины можно объяснить тем, что Chlorella vulgaris содержит мочевинную амидазу, которая ката­ лизирует расщепление мочевины [2]: С ( Ш 2 )2+АТФ+Н 2 0=С02+2КНз+АДФ+Р1. Установлено, что при культивировании штамма и использовании в качестве источника азота - мочевины, на 4-5-й день культивирования аммонийная форма азота может достигать в среде 40-60 % от общего содержания азота, что подкисляет среду и вызывает угнетение роста клеток. 35 Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014 Для определения интервала температуры культивирования, обеспечивающего высокую продуктивность по биомассе, штамм Chlorella vulgaris ИФР № С-111 куль­ тивировался на среде Тамийя, уровне pH 6,2-8,0, при круглосуточном освещении энергосберегающими лампами с освещенностью на уровне 10,6 кАк, аэрация осу­ ществлялась воздушной смесью с содержанием углекислого газа 0,04 %, при тем пе­ ратурах культивированиях 27,5, 29,5 и 35 °С. Посевной материал составлял 20 % от общего объема суспензии (с концентрацией 2-106 кл/мл). Динамика прироста био­ массы клеток микроводорослей представлена на рис. 4. -1РСДЛ Тамий? &-J9.ST *-J5T -обеднение* среда а зо то м Там ий* Рис. 5. Накопление биожассы штамма Chlorella vulgaris ИФР Nq С-111 на стандартной и обедненной азотож средах Тажийя Рис. 4. Динам ика прироста биожассы штажма Chlorella vulgaris ИФР Nq С -1 11 в зависимости от температуры Анализ графиков показывает, что максимальный прирост биомассы штамма был при температуре суспензии 29,5 °С, и составил 53-10б кл/мл на 8-й день культивирования. Повышение температуры приводит к значительному снижению роста клеток. Такое поведение объясняется повышением растворимости и концентрации углекислого газа в культуральной жидкости, приводящим к ингибированию роста клеток микроводоросли. Деф ицит доступных азотсодержащих соединений в питательной среде созда­ ет стресс для клеток микроводорослей, которые стимулируют накопление липидов в клетках биомассы. При этом наблюдается снижение интенсивности биосинтеза белка, образование клеток, которые теряют способность к делению, но увеличива­ ются в диаметре и образуют глобулы, содержащие нейтральные липиды. Данные изменения в клетках наблюдаются при концентрации азота в питательной среде менее 80 мг/л. В зависимости от физиологических свойств штамма при азотном голодании накапливается до 50-80 % липидов от сухой массы клетки. Для определения режимов, соответствующих стрессовым условиям, обеспе­ чивающим максимальное накопление липидов внутри клетки, штамм Chlorella vul­ garis ИФР № С-111 выращивался на стандартной и обедненной азотом средах Т а ­ мийя. Содержание азота в стандартной среде Тамийя было 231 мг/л, а на обеднен­ ной азотом среде Тамийя содержание азота было 50 мг/л. Посевной материал со­ ставлял 20 % от общего объема суспензии с концентрацией 1•10б кл/мл; температура культивирования - 29 °С, при круглосуточном освещении энергосберегающими лампами с освещенностью на уровне 10,6 кАк, аэрация осу­ ществлялась воздушной смесью с содержанием углекислого газа 0,04 %. Динамика прироста биомассы штамма Chlorella vulgaris ИФР № С -111 на стандартной и обедненной азотом среде Тамийя представлена на рис. 5. 36 Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014 Снижение роста клеток почти в 5,5 раз на среде, обедненной азотом, объясня­ ется тем, что клетки Chlorella vulgaris не способны полностью поглощать азот из пи­ тательной среды. Таким образом, азот становится практически не доступен для клеток при остаточной концентрации 10 мг/л. Данный эксперимент позволил вы ­ явить нецелесообразность накопления биомассы Chlorella vulgaris ИФР № С -111 с применением среды с пониженным содержанием азота, поскольку такой режим способствует раннему наступлению стационарной фазы при концентрации клеток 9-10б кл./мл, однако такой режим можно рекомендовать на второй стадии культи­ вирования для накопления липидов. По результатам работы можно сделать следующие выводы: - микроводоросль хлорелла является перспективным продуцентом при производ­ стве компонентов смесевого биодизельного топлива - нейтральных липидов. На ос­ новании обзора информационных источников был обоснован выбор штамма мик­ роводоросли Chlorella vulgaris ИФР № С -111; - экспериментальные исследования позволили установить, что для накопительно­ го культивирования биомассы Chlorella vulgaris ИФР № С-111 с повышенным со­ держанием липидов наилучшая продуктивность микроводоросли хлорелла достига­ ется при использовании модифицированной среды Тамийя, содержащей в своем составе нитрат калия в качестве источников азота; - наилучшая скорость роста биомассы наблюдается при температуре 29,5 °С; - по достижении биомассой микроводоросли хлорелла стационарной стадии ро­ ста, следует создавать клеткам стрессовые условия путём снижения содержания доступных азотсодержащих соединений в питательной среде для стимулирования накопления внутриклеточных липидов. Установление оптимальных режимов накоп­ ления внутриклеточных липидов и режимов их выделения является предметом дальнейшего исследования. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в базовой части задания. ЛИТЕРАТУРА 1. Дворецкий, Д.С. Технология получения биодизельного топлива с использо­ ванием гетерофазных катализаторов и СВЧ-нагрева [Текст] / Д.С. Дворецкий, С.А. Нагорнов, А.А. Ермаков, С.В. Неизвестная // Вопросы современной науки и прак­ тики. Университет имени В.И. Вернадского. - 2012. - Специальный выпуск (39). С. 136-143. 2. Чернова, Н.И. Микроводоросли в качестве сырья для получения биотоплива [Текст] / Н.И. Чернова, С.В. Киселева, Т.П. Коробкова, С.И.Зайцев / / Альтернатив­ ная энергетика и экология. - 2008. - № 9. - С. 68-74. 3. Заядан, Б.К. Выделение, мутагенез и оптимизация условий культивирова­ ния штамовмикроводорослей для производства биодизеля [Текст] / Б.К. Заядан, С. Пуртон, А.К. Садвакасова, А.А. Усербаева, К. Болатхан // Физио­ логия растений. - 2014. - № 1. - С. 135. 4. Held, Paul. Determination o f Algal Cell Lipids Using Nile Red - Using Microplates to Monitor Neutral Lipids in Chlorella Vulgaris / Paul Held, Keri Raymond. (http: / /www.biotek.com/resources/articles/nile-red-dve-algal.html). 5. Gouveia, Luisa / Microalgae as a Feedstock for Biofuels. Book / Luisa Gouveia. - Springer, 2011. 37 Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности А П К - продукты здорового питания, № 2, 2014 6. Ryckebosch, Е. Optimization o f an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae / / Journal o f the American Oil Chemists' Society. 2012. vol 89. P. 189­ 198. 7. Pandian, P. A study on effective lipid extraction methods from certain fresh w a ­ ter microalgae // Elixir Bio Technology. 2011. vol 39. P. 4589-4591. 8. Jae-Yon Lee Comparison o f several methods for effective lipid extraction from microalgae // Bioresource Technology. 2010. Vol 101. P. 575-577. 9. Богданов, Н.И. Суспензия хлореллы в рационе сельскохозяйственных ж и­ вотных [Текст] / Н.И. Богданов. - Волгоград : «Здоровье и экология», 2007. - 48 с. R E FE R E N C E 1. Dvoretsky, D.S. Technology o f Producing Biodiesel Using Heterophase Catalysts and Microwave Heating[Text]/ D.S. Dvoretsky, S.A. Nagornov, A.A. Ermakov, S.V. Neisvestnaya // Questions o f modern science and practice. Vernadsky University 2012. vol 39. - P. 136-143. 2. Chernova, N.I. Microalgae as Source for Biofuels [Text] / N.I Chernova, S.V. Kiseleva, T.P. Korobkova, S.I. Zaitsev // Alternative Energy and Economy. 2008. vol 9. P. 68-74. 3. Zayadan, B.K. Isolation, mutagenesis and optimization o f strain cultivation o f microalgae for biodiesel production [Text] / / Vegetable physiology. 2014. vol 1. P. 135. 4. Held, Paul. Determination o f Algal Cell Lipids Using Nile Red - Using M icro­ plates to Monitor Neutral Lipids in Chlorella Vulgaris/ Paul Held, Keri Raymond. (http: / /www.biotek.com/resources/articles/nile-red-dye-algal.html). 5. Gouveia, Luisa/ Microalgae as a Feedstock for Biofuels. Book / Luisa Gouveia. Springer, 2011. 6. Ryckebosch, E. Optimization o f an Analytical Procedure for Extraction o f Lipids from Microalgae // Journal o f the American Oil Chemists' Society. 2012. vol 89. P. 189-198. 7. Pandian, P.A. study on effective lipid extraction methods from certain fresh w a ­ ter microalgae // Elixir Bio Technology. 2011. vol 39. P. 4589-4591. 8. Lee, Jae-Yon et al. Comparison o f several methods for effective lipid extraction from microalgae // Bioresource Technology. 2010. Vol 101. P. 575-577. 9. Bogdanov, N.I. Suspension of Chlorella in the diet o f farm animals [Text] / N.I.Bogdanov. - Volgograd: « Health and ecology», 2007. - P.48. 38