Специальность 06.01.05. - Кубанский государственный аграрный
реклама
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение СЕВЕРО-КАВКАЗСКИЙ ЗОНАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ САДОВОДСТВА И ВИНОГРАДАРСТВА (ФГБНУ СКЗНИИСиВ) На правах рукописи УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ Специальность 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник И.И. Супрун Краснодар – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 4 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................... 10 1.1 Значение яблони как плодовой культуры, основные задачи и направления в современной селекции яблони ........................................................................... 10 1.2. Парша яблони .................................................................................................. 11 1.3 Понятие молекулярного маркера и основные типы маркерных систем .... 17 1.4 Молекулярно-генетические методы в изучении устойчивости яблони к парше ....................................................................................................................... 23 1.5 Изучение генетического разнообразия яблони ............................................. 30 1.6 Молекулярно-генетический полиморфизм гена самонесовместимости в пределах вида Malus domestica ............................................................................. 35 2 УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ .................................................................................................... 41 2.1 Условия проведения и материал исследований ............................................ 41 2.2 Молекулярные маркеры, использованные в работе ..................................... 42 2.3 Методы исследований...................................................................................... 44 2.4 Статистическая обработка данных ................................................................. 48 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ...................................................................... 49 3. 1 Апробация методов экстракции ДНК ........................................................... 49 3.2 Идентификация генов Vf и Vm у отечественных сортов и селекционных форм яблони ............................................................................................................ 52 3.3 Совершенствование ДНК-маркерной идентификации гена Vf иммунитета яблони к парше ....................................................................................................... 59 3.4 Молекулярно-генетическая идентификация аллелей гена самонесовместимости в сортах яблони ................................................................ 63 3.5 Исследование полиморфизма микросателлитных локусов сортов яблони отечественной селекции ........................................................................................ 82 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ....................................................................................................... 106 2 РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ ............................... 107 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ............................................... 108 ПРИЛОЖЕНИЯ ....................................................................................................... 132 3 ВВЕДЕНИЕ Применение ДНК-технологий в селекции и генетике сельскохозяйственных культур позволяет значительно расширить область научных исследований: от изучения генетического разнообразия и вопросов паспортизации сортов до защиты авторских прав селекционеров и продукции растениеводства от фальсификации, а также определение её качества и генетической чистоты. Возможности ДНК-маркеров превосходят потенциал изоферментов и запасных белков. В связи с тем, что применение молекулярных маркеров не зависит от фенотипа растения, этапа вегетационного периода и их использование позволяет напрямую характеризовать генотип, они приобретают все большую ценность при оценке степени генетического разнообразия, а также в исследованиях, направленных на идентификацию генов, участвующих в детерминации хозяйственно-ценных признаков [Хавкин Э.Е., 1997]. Особенно актуально использование ДНК-маркеров при идентификации генов устойчивости к заболеваниям, т. к. это отменяет необходимость проведения фитопатологической оценки образцов. Ввиду высокой вредоносности парши яблони, вызываемой грибным патогеном Venturia inaequalis (Cooke)G. Winter, актуально ускоренное создание сортов, иммунных к данному заболеванию. Решение этой задачи невозможно без глубоких знаний генетических основ устойчивости к парше. Особое значение здесь приобретает технология ДНК-маркирования, позволяющая проводить скрининг генетической плазмы яблони на наличие генов устойчивости на любом этапе селекционного процесса вне зависимости от фазы онтогенеза растений. ДНК-маркеры могут быть использованы как для идентификации целевых генов, так и при изучении генетического разнообразия культурных растений. В этих целях могут быть эффективно использованы микросателлитные маркеры, 4 что обусловлено их локусспецифичностью и значительной аллельной изменчивости [Хавкин Э.Е., 1997]. Чаще всего микросателлитные маркеры используют для дифференцировки растений внутри вида, идентификации сортов, составлении генетических карт и в маркерной селекции, а также в работах по изучению генетического разнообразия и паспортизации сортов культурных растений [Гостимский С.А., 1999]. Молекулярные ДНК-маркеры открывают большие перспективы для генетической паспортизации сортов яблони, детального картирования хромосом, изучения генетического разнообразия, определения родства на внутри- и межвидовом уровне и идентификации генов хозяйственно-ценных признаков в селекционном материале. Степень разработанности темы Вопросы по изучению эффективности селекционных программ создания устойчивых к парше сортов яблони, оценке уровня генетического полиморфизма генофонда яблони, а также определению S-генотипов различных сортов яблони с применением молекулярно-генетических методов ДНКмаркирования нашли свое отражение в трудах VinatzerB.A., HemmatM., PatocchiA., BroothaertsW., AfunianM.R., LiebhardR., HegedûsA., Седова Е.Н., Супруна И.И., Ульяновской Е.А., Г.А. Седышевой, З.М. Серова, ТокмаковаС.В., Шамшин, И.Н., Савельева Н.И. и других. В данных работах показано, что применение в генетических исследованиях методов, основанных на ДНК-маркировании, значительно повышает эффективность оценки растительного материала по многим интересующим хозяйственно-ценным признакам. Тем не менее, в данных работах не проводилась оценка генетического родства сортов яблони отечественной селекции из коллекции генетических ресурсов микросателлитных СКЗНИИСиВ маркеров с наряду использованием с полиморфизма молекулярно-генетической идентификацией аллелей S2, S3, S7, S10 гена самонесовместимости в отечественных районированных и перспективных сортах яблони. 5 Цель и задачи исследования Цель исследований: методологических подходов разработка использования и совершенствованием молекулярно-генетических методов оценки и отбора исходного материала яблони в селекционном процессе и генетических комплексное ресурсов изучение генофонда ФГБНУ СКЗНИИСиВ с яблони коллекции применением ДНК- маркерного анализа. Для выполнения этой цели решаются следующие задачи: - изучить генетическое разнообразие сортов яблони коллекции генетических ресурсов ФГБНУ СКЗНИИСиВ с использованием полиморфизма микросателлитных локусов ДНК в качестве маркерной системы; -на основании данных анализа микросателлитных локусов ДНК составить молекулярно-генетические паспорта сортов яблони отечественной селекции с оценкой уровня общего генетического полиморфизма и степени их генетического родства; - провести скрининг селекционного материала яблони, предоставляемого центром селекции ФГБНУ СКЗНИИСиВ с использованием ДНК-маркерного анализа для выявления образцов, несущих гены устойчивости к парше Vf и Vm; - разработать ДНК-маркер для гена устойчивости яблони к парше Vf для получения ПЦР-продукта, специфичного для его доминантного аллеля, размером 100-150 пар нуклеотидов (п. н.); - выполнить молекулярно-генетическую идентификацию аллелей S2, S3, S7, S10 гена самонесовместимости у отечественных сортов яблони с применением ДНК-маркерного анализа. Научная новизна В настоящей работе впервые выполнена оценка генетического родства сортов яблони отечественной селекции с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров. На основании 6 данных, полученных по результатам анализа полиморфизма микросателлитных локусов, составлены ДНК-паспорта изученных сортов яблони. Идентифицированы гены устойчивости к парше Vf и Vm с применением ДНК-маркерных технологий в сортах и селекционных формах яблони ФГБНУ СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК. Разработан молекулярный маркер к гену Vf на основании данных о его нуклеотидной последовательности с целью повышения перспективности и эффективности возможного применения мультиплексной ПЦР для одновременной идентификации гена Vf с генами устойчивости яблони к мучнистой росе. Впервые проведена молекулярно-генетическая идентификация аллелей S2, S3, S7, S10 гена самонесовместимости в отечественных районированных и перспективных сортах яблони. На основании данных об аллельных комбинациях гена самонесовместимости определены группы совместимых и не совместимых при опылении сортов. Практическая значимость исследования Полученные с применением микросателлитного анализа данные о степени генетического родства сортов яблони отечественной селекции востребованы в селекционном процессе и предназначены для улучшения качества гибридизации с целью получения максимального спектра изменчивости в гибридном потомстве. Показана перспективность использования ДНК-маркирования для идентификации генов устойчивости к парше Vf и Vm, а также аллелей гена самонесовместимости у сортов и форм яблони отечественной и мировой селекции. Идентифицированы доминантные аллели генов устойчивости яблони к парше Vf и Vm у сортов и элитных форм яблони селекции ФГБНУ СКЗНИИСиВ совместно с ВНИИСПК. Усовершенствованный ДНК-маркер гена Vf позволяет расширить возможность применения мультиплексной ПЦР при идентификации 7 данного гена устойчивости к парше в сочетании с другими генами хозяйственноценных признаков. Информация об аллельном составе гена самонесовместимости позволит прогнозировать совместимость сортов при опылении, что даст возможность более эффективно формировать сортовые схемы садовых насаждений. Методология и методы исследований При планировании и проведении исследований в виде источников информации использовались научные статьи, доклады, книги производственной тематики, электронные ресурсы и другие материалы. При проведении исследований применялся системный подход. Теоретико-методологическую основу исследований составили методы планирования и проведения опытов, лабораторные исследования с применением системного подхода. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Обоснование актуальности формирования ДНК-паспортов сортов яблони отечественной селекции с применением микросателлитного анализа. 2. Новые данные о степени генетического родства изученных сортов яблони. 3. Методические аспекты идентификации генов устойчивости к парше Vf и Vm. Выявление образцов, несущие доминантные аллели генов устойчивости к парше Vf и Vm, 4. Обоснование данных об аллельных комбинациях гена самонесовместимости у изученных сортов яблони отечественной селекции и установление степени совместимости сортов согласно выявленному аллельному составу S-гена 5. Усовершенствование ДНК-маркера гена Vf устойчивости к парше, дополняющего методическую базу и позволяющего расширить область применения мультиплексной ПЦР в идентификации генов хозяйственно ценных признаков яблони. Степень достоверности и апробация результатов исследований подтверждается значительным объёмом полученных экспериментальных данных, 8 выполненных с применением с применением современных методов молекулярной генетики, стандартных методов математического анализа и положительными результатами апробации, проведённой в лабораторных условиях. Результаты исследований доложены на ежегодных заседаниях Ученого совета ГНУ СКЗНИИСиВ Россельхозакадемии в 2009-2011 гг., III и IV Всероссийских научно-практических конференциях молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2009-2010 гг.), Расширенном заседании Учёного совета по проблемам интенсивного садоводства посвященного 100-летию со дня рождения Гавриила Владимировича Трусевича (Краснодар, 2010 г.). Публикации По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 8 из них в изданиях из Перечня, рекомендованного ВАК Российской Федерации. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 странице машинописного текста, включающих 12 таблиц и 26 рисунков. Состоит из введения, трех глав, выводов, рекомендаций для практической селекции и двух приложений. Список использованной литературы включает 202 источника, в том числе 127 – зарубежных авторов. Благодарности. Автор выражает большую благодарность кандидату биологических наук Супруну Ивану Ивановичу за научное и методическое руководство, просмотр и редакцию рукописи, ценные замечания и предложения. Автор благодарит Седова Е.Н. (доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РАН), Ульяновскую Е.В. (доктор биологических наук), Артюх С.Н. (кандидат сельскохозяйственных наук), Ефимову И.Л. (научный сотрудник лаборатории питомниководства) за предоставление селекционного растительного материала для проведения исследований и неоценимую помощь в обсуждении их результатов, а также Токмакова С.В. (кандидат биологических наук), Сундыреву М.А. (кандидат сельскохозяйственных наук) и Якубу Ю.Ф. (кандидат технических наук) за просмотр и обсуждение рукописи. 9 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Значение яблони как плодовой культуры, основные задачи и направления в современной селекции яблони Одно из ведущих мест среди плодовых культур в России, благодаря биологическим и хозяйственным качествам, принадлежит яблоне, занимающей более 60% всей площади садов. Центром происхождения яблони считается Восточная Азия. Дикорастущий предок окультуренных сортов яблони – это яблоня Сиверса (Malus sieversii), произрастающая в Средней Азии [Christopher M.R. et al., 2009]. Широкое распространение культуры яблони обусловлено большим потребительским спросом на ее диетические плоды, богатые витаминами, легко усвояемыми аминокислотами, сахарами, азотистыми и другими биологически активными веществами. Кроме того, плоды яблони ценятся за их профилактические и лечебные свойства, а также возможность использования их как в свежем, так и в переработанном виде круглый год [Куликов И.М. и др., 2006]. По Северо-Кавказскому региону в Госреестр РФ селекционных достижений, допущенных к использованию, на 2013 год включено 64 сорта яблони различных сроков созревания, из которых 67 % – сорта местной селекции, полученные в СКЗНИИСиВ (24 сорта), Крымской ОСС (6 сортов), Дагестанской СОС (7 сортов), Россошанской ЗОСС (4 сорта), ВНИИЦиСК (1 сорт), КубГАУ (1 сорт). В целом в настоящее время сортимент яблони расширен на 36 %, ввиду увеличения числа допущенных сортов с 47 до 64. В больше й степени расширен летний сортимент (на 80 %), в меньшей степени – осенний и зимний (на 14 и 30 % соответственно) [Артюх С.Н. и др., 2001; Егоров Е.А., 2013]. Анализ сложившегося сортимента яблони показывает, что несмотря на существенное обновление достаточно обширный сортовой состав яблони не отвечает полностью требованиям современного промышленного интенсивного 10 садоводства, не обладает в полной мере необходимым сочетанием высокой адаптивности к абио- и биотическим стрессорам среды с показателями на максимально возможном уровне продуктивности и качества плодов [Артюх С.Н. и др., 1999]. С целью дальнейшего совершенствования сортимента яблони современные программы селекционных исследований включают такие задачи как разработка системы производства, переработки и хранения получаемой продукции с использованием высокопродуктивных сортов, оздоровленного посадочного материала и новой техники [Ульяновская Е.В. и др., 2013]. В связи с этим возникает необходимость точного и быстрого выявления закономерностей наследования важнейших хозяйственно-ценных признаков яблони: устойчивости к неблагоприятным абиотическим и биотическим факторам, особенностей роста, структурных признаков урожайности, товарных и потребительских качеств плодов, а также экспрессивности идентифицированных генов и характера их взаимодействия [Ульяновская Е.В. и др., 2011]. Особую ценность приобретают исследования, направленные на оценку генетического разнообразия, паспортизацию и классификацию сортов, картирование и определение физической природы генов и генетического мониторинга в селекции и генетике яблони [Shulaev V. et al., 2008 ]. Вовлечение генетических в методов селекционный процесс ДНК-маркирования современных необходимо для молекулярноэффективной модернизации селекционного процесса и, соответственно, совершенствования отечественного сортимента яблони [Ульяновская Е.В. и др., 2011]. 1.2. Парша яблони Одной из главных проблем современной селекции яблони считается создание сортов, обладающих наряду с комплексом ценных хозяйственнобиологических признаков устойчивостью к патогенам. Самым распространенным на юге России и вредоносным заболеванием яблони 11 является парша [Ефимова И.Л. и др., 2010]. Снижение урожая яблок в нашей стране от поражения паршой составляет не менее 40 %, а в годы массового распространения теряется почти весь урожай [Седов Е.Н. и др., 1983]. Применение химических методов защиты в садах против этой болезни способствует постепенному возникновению резистентности патогенов к используемым препаратам. Возникает необходимость использования новых фунгицидов широкого спектра действия, что приводит не только к загрязнению окружающей среды, уничтожению полезной энтомофауны, но и возникновению угрозы здоровью людей [Смольякова В.М. и др., 2005]. Возделывание устойчивых к парше сортов яблони в комплексе с интегрированной защитой против других вредителей и болезней позволяет снизить затраты на фунгициды почти на 70 % и получать относительно чистую и безопасную для здоровья человека продукцию [Седов Е.Н., 1992]. Одним из первых селекцию иммунных к парше сортов яблони начал американский ученый L.F. Hough в сороковых годах двадцатого века. В штате Иллинойс была скрещена форма яблони M. Floribunda 821 (с геном Vf иммунитета к парше) с сортом Ром Бьюти. Среди полученных сеянцев было равное количество иммунных и восприимчивых к парше. Среди иммунных сеянцев было отобрано два, ставших исходным материалом для широкомасштабной селекционной программы (PRI), развернутой в США, Канаде, Франции и Великобритании [Седов Е.Н., 2007]. В настоящее время в мире создано более 155 сортов с моногенной устойчивостью к парше, которые почти не требуют применения фунгицидов [Савельев Н.И., 2008; Савельева Н.Н. и др., 2008]. В России селекция на олигогенную устойчивость к парше начата в начале 70-х годов на основе использования главных генов устойчивости Vf, Vm и Vr [Ищенко Л.А., 1987]. С 1975 г. во ВНИИСПК под руководством академика Е.Н. Седова проводится работа по селекции сортов яблони, обладающих иммунитетом к парше, с использованием как метода раннего отбора на искусственных инфекционных фонах и приемов ускорения плодоношения 12 гибридных сеянцев, так и новых методик селекции [Ульяновская Е.В. и др., 2013]. Особый интерес представляет совмещение олигогенной и полигенной устойчивости к парше, а также двух и более главных генов устойчивости в одном генотипе яблони [Седов Е.Н. и др., 1987]. В настоящее время во ВНИИСПК и ФГБНУ СКЗНИИСиВ ведется совместная селекционная программа по созданию сортов яблони с более стабильной, долговременной устойчивостью яблони к парше с применением молекулярно-генетических методов ДНК-маркирования, позволяющих проводить исследования на высоком научно-методическом уровне [Супрун И.И. и др., 2009, 2011; Ульяновская Е.В. и др., 2011, 2012]. Постоянное наблюдение за многообразием форм и непрерывной изменчивостью возбудителя парши яблони является необходимым условием для продуктивной селекции устойчивых к данному заболеванию сортов яблони [Ефимова И.Л. и др., 2012]. Возбудитель парши яблони Venturia inaequalis (Cooke) G. Winter относится к классу Сумчатые грибы (Ascomycetes), подклассу Локулоаскомицеты (Loculoascomycetidae), порядку Дотидеальные (Dothideales), семейству Вентуриевые (Venturiaceae), роду Venturia [Барсукова О.Н., 1985]. С помощью стандартных сортов-дифференциаторов яблони выявлено 19 генных пар (локусов), контролирующих патогенность клонов гриба [Williams E.B. et al., 1969]. Каждая пара состоит из аллели вирулентности Р+ (Р1+ , Р2+ и т. д.), вызывающий на том или ином сорте (или группе сортов) обильное спороношение гриба (реакция «поражение») и аллели авирулентности Р (Р1, Р2 и т. д.), вызывающей на том же сорте (сортах) хлоротические и некротические пятна без спороношения или с очень слабым спороношением патогенна (реакция «пятно»). Каждый клон (физиологическая раса, биотип) гриба отличается своим, только ему присущим набором аллелей вирулентности и авирулентности [Бондарь Л.В., 1981]. Частота встречаемости тех или иных генов вирулентности и определяет различия по вирулентности популяций и биотипов гриба [Седов Е.Н. и др., 1983]. 13 В настоящее время известны восемь рас Venturia inaequalis, наиболее изучены первые пять. Самой распространенной расой, поражающей даже Malus silvestris и Malus floribunda, является раса 1. Устойчивостью к ней обладают некоторые мелкоплодные виды и сорта Сибири, Японии и Северо-Восточного Китая. Согласно исследованиям американских ученых [Barnes E.H. et al., 1961; Kuc J. et al., 1959; MacLennan D.H. et al., 1963] расы 2-4, кроме специфичных для них генов вирулентности, обладают также генами вирулентности расы 1 по отношению к промышленным сортам яблони. Отличаются между собой популяции возбудителя парши в европейской и азиатской частях России по своей специализации и вирулентности [Гешеле Э.Э., 1958; Казенас Л.Д., 1953; Матвеева В.К. и др., 1965; Сахарова Л.П., 1968; Хохрякова Т.М., 1978]. В начале 1990-х годов в Германии и Франции идентифицирована шестая раса парши, которая способна преодолевать устойчивость у сортов и форм яблони с геном Vf [Durel C.E. et al., 2003; Lespinasse V., 1994]. Выявление седьмой расы парши позволило идентифицировать ген Vg, контролирующий устойчивость к ней у сорта яблони Голден Делишес [Benaouf G. et al., 2000]. Восьмая раса парши была описана в 2005 г. V.G.M. Bus с соавторами [Bus V.G.M. et al., 2005]. Различают полигенную (относительную, частичную) устойчивость яблони к парше, степень которой может изменяться под влиянием условий внешней среды, и олигогенную или невосприимчивость (иммунитет). Иммунитет определяется одним или несколькими главными генами и присущ некоторым мелкоплодным клонам диких видов, а также созданным на их основе полукультурным и культурным сортам [Ульяновская Е.В. и др., 2013]. При скрещивании двух форм, одна из которых имеет данный ген в отличие от другой, расщепление идет по типу анализирующего скрещивания, и отношение устойчивых сеянцев к восприимчивым составляет 1:1, следовательно, около 50 % полученного потомства является устойчивым [Седов Е.Н., 1992; Durel C.E. et al., 2004]. 14 Выявление источников устойчивости обычно предшествует селекционной работе на улучшение этого признака. На начальном этапе изучения признака устойчивости к парше было идентифицировано шесть основных генов, обуславливающих ммунитет яблони к парше: Vf, Vm, Vb, Vbj, Vr, Va [Козловская З.А. и др., 2005]. В дальнейшем, с применением методов молекулярного ДНК- маркирования, идентифицировали еще ряд генов, кроме указанных: Vd (источник гена – сорт Durello di Forli); Vh2, Vh4 – источник гена образец R-12740-7A, относящийся к виду Malus pimula; Vh8 – источник гена образец W193B, относящийся к виду M. silvestris [Lespinasse V., 1994]. Сорта с геном Vf иммунитета к парше имеют сложное генетическое происхождение. Большинство сортов с геном Vf было получено на основе двух потомков F2 от M. floribunda 821: 26829-2-2 и 26830-2. В свою очередь, эти сеянцы выделены в потомстве от скрещивания двух сибсов: 9433-2-2 (Ром Бьюти × M. floribunda 821) × 9433-2-8 (Ром Бьюти × M. floribunda 821) [Ульяновская Е.В. и др., 2013]. К настоящему времени от клона M. floribunda 821 отечественными и зарубежными селекционерами получено более 155 сортов яблони с олигогенной устойчивостью к парше, причем доля тех, у которых устойчивость контролируется геном Vf, превышает 85 % [Савельев Н.И., 1998]. Согласно недавним исследованиям у клона M. floribunda 821, кроме гена Vf, имеется второй независимый доминантный ген Vfh, который индуцирует гиперчувствительную реакцию [Benaouf G. et al., 2000]. Это согласуется с данными, которые свидетельствуют, что устойчивость к парше у M. floribunda 821определяется не одним геном Vf, как считалось ранее, а имеет более сложную природу. Следовательно, представление, что устойчивость, контролируемая геном Vf, будет стабильной, нуждается в переоценке [Жданов В.В. и др., 1995]. В зарубежных селекционных программах для гибридизации широко использовались сорта, несушие ген Vf, это: Прима, Присцилла, Флорина, Фридом, в несколько меньшей степени – Редфри, CO-OP 17, Либерти, Голдраш, 15 Интерпрайс, BM 41497 [Laurens F., 1999]. Сорта Муррей и Раувилл получены на основе доноров с геном Vm, Нова Эсигро, Новамак, Новаспай несут ген Vr [Ульяновская Е.В. и др., 2013]. В качестве донора гена Va часто используют формы сорта Антоновка и производные от них сеянцы, в потомстве которых выход высокоустойчивых к парше сеянцев составляет около 11 % [Браун А.Д., 1981; Williams E.B. et al., 1969]. Из восприимчивых родителей привлекают для скрещиваний сорта с высоким качеством плодов и другими хозяйственно-ценными признаками. В Институте садоводства и селекции в городе Дрезден-Пильнице (Германия) от скрещивания сортов Jongrimes и Антоновка выведен сорт Reglindis с генетической устойчивостью к парше. В потомствах от гибридизации сортов яблони домашней и доноров с геном Vr (производные M. pumila) получены сорта Realka, Releta, Remura и Reka [Fischer C., 2000]. Большой проблемой в селекции яблони на устойчивость к парше является стабильность и долговременность этого признака [Браун А.Д., 1981; Седов Е.Н. и др., 1985; Daeton D. et al., 1983; Williams E.B. et al., 1969]. От степени устойчивости родителей зависит поражаемость потомства. Хотя подбор родителей по фенотипу устойчивости и имеет значение, большое влияние на разнообразие потомства оказывают условия внешней среды, поэтому подбор родителей по фенотипу должен быть дополнен оценкой родителей по потомству [Жданов В.В. и др., 1991]. Сорта яблони могут терять устойчивость к парше, в результате чего учащаются случаи массового заболевания паршой. Причины потери устойчивости сортов могут быть различны, но первостепенное значение имеет изменчивость патогена и условий внешней среды, а также самого хозяина [Gessler C. et al., 2006]. Многие относительно устойчивые культурные сорта яблони становятся восприимчивыми при интродукции их в другую зону, где имеются вирулентные для них клоны гриба. Чаще поражаются паршой сорта с ослабленными под влиянием стрессовых факторов внешней среды защитными реакциями [Седов Е.Н. и др., 1982]. Редко встречающиеся или новые расы 16 патогена обычно не приносят большого ущерба до тех пор, пока сорт не занимает больших ареалов. Но по мере роста площадей под сортом происходит постепенное их накопление и широкое распространение [Савельев Н.И., 2002]. Рекомендуется два основных пути создания сортов с более стабильным долговременным иммунитетом: 1) совмещение олигогенной (вертикальной) и полигенной (горизонтальной) устойчивости; 2) комбинирование главных генов устойчивости. Закладка садов сортами с различными типами устойчивости также будет способствовать снижению риска поражения паршой (на 60-80%) [Браун А.Д., 1981; Жданов В.В. и др., 1991; Daeton D. et al., 1983]. На современном этапе развития селекционных технологий, благодаря успехам молекулярной биологии, развитию методов молекулярного ДНКмаркирования и накоплению молекулярно-генетических экспериментальных исследований, данных появилась в области технология так называемой маркерной селекции (marker assisted selection – MAS). Данная технология позволяет проводить идентификацию и отбор генотипов, несущих целевые гены, минуя фенотипическую оценку, основываясь лишь на данных ДНК-анализа [Ульяновская Е.В. и др., 2012]. Таким образом, наиболее перспективным и экономически оправданным подходом в селекционной работе по созданию устойчивых к парше сортов яблони является сочетание как оригинальных и усовершенствованных традиционных методов оценки селекционного материала, так и современных молекулярно-генетических методов [Ульяновская Е.В. и др., 2011]. 1.3 Понятие молекулярного маркера и основные типы маркерных систем Развитие методов ДНК-маркирования привело к появлению технологии маркерной селекции, позволяющей проводить идентификацию и отбор генотипов, минуя фенотипическую оценку, основываясь лишь на данных ДНК- 17 анализа, в отличие от классических селекционных экспериментов, работающих в основном с морфологическими проявлениями генов [Конарев В.Г., 1983]. Молекулярной маркер – это ген известной локализации, с помощью которого можно идентифицировать другие искомые гены [Конарев В.Г., 1983]. Перед тем, как маркер может быть использован для решения каких-либо конкретных задач, корректность его применения должна быть аргументирована с генетической и биохимической позиции [Созинов А.А., 1985]. Маркеры генетических систем разного уровня должны обладать определенными свойствами и отвечать следующим требованиям: высокий уровень полиморфизма, кодоминантный характер наследования, оптимальный уровень частоты встречаемости в геноме для решения конкретных задач, равномерное распределение в геноме по хромосомам, селективно нейтральное поведение; легкая оценка параметров маркера, возможность автоматизации оценки параметров маркера, высокая воспроизводимость оценки параметров маркера; возможность легкого обмена данными между лабораториями [Льюин Б., 1987]. За последние 30 лет были созданы и использовались несколько поколений молекулярных совершенствованием маркеров. Изначально, электрофоретических методов, с развитием основанных и на фракционировании макромолекул, различающихся по таким параметрам как размеры (или молекулярная масса), вторичная структура и электрический заряд, широко использовались белковые маркеры – запасные белки семян и изоферменты, отражающие полиморфизм соответствующих структурных генов [Bolar J.P. et al., 2000; Schulman A.H., 2007]. С применением белковых маркеров можно исследовать полиморфизм только белок-кодирующих последовательностей и только у экспрессирующихся генов, причем их уровень полиморфизма слишком низкий в популяциях большинства культурных растений, домашних животных, птиц [McCouch S.R. et al., 1997]. Такие маркеры могут изменяться под воздействием окружающей среды, а в случае с изоферментными маркерами обладать 18 тканевой или органной специфичностью, что существенно снижает их ценность для генетики и селекции [Mohan M. et al., 1997]. В дальнейшем, прогресс молекулярной генетики способствовал возникновению маркеров, принадлежащих к наиболее эффективной сегодняшний день ДНК-маркерной системе, основанной на на анализе полиморфизма нуклеотидной последовательности ДНК и позволяющих тестировать генетический полиморфизм непосредственно на уровне генома [Остерман Л.А., 1981]. С помощью ДНК-маркеров можно исследовать практически любые участки геномов и генов, а также использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма, что значительно повышает эффективность селекционного процесса [Гостимский С.А. и др., 1999]. Появление молекулярных ДНК-маркеров открывало большие перспективы для детального картирования хромосом, идентификации и клонирования генов, а также изучения генетического разнообразия, определения родства на внутри- и межвидовом уровне [Avise J.C., 1994]. ДНК-маркерные технологии условно можно разделить на две основные группы: с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и без нее. Открытие и синтез специфичных бактериальных ферментов – рестрицирующих эндонуклеаз (рестриктаз), расщепляющих ДНК только в участках со строго определенной последовательностью, позволило разработать маркеры на основе анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (англ. RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism). Продукты рестрикции разделяют электрофорезом в агарозном геле, длина и концентрация геля зависит от диапазона длин распределяемых фрагментов [Льюин Б., 1987]. Впервые полиморфизм длин рестрикционных фрагментов был использован в 1974 г. при идентификации термочувствительной мутации в геноме аденовируса [Grodzicker T. et al., 1974]. Однако широкое применение RFLPмаркеров началось с 1980 г. после выхода основополагающей работы D.С. Вotstein с соавторами [Вotstein D. et al., 1980]. В основном такие маркеры используют для анализа полиморфизма конкретных локусов (генов). После 19 электрофоретического разделения продуктов рестрикции их «проявляют» путем гибридизации со специфическими радиоактивными зондами- фрагментами ДНК и анализируют по положению на радиоавтографах с определением длин рестрикционных фрагментов [Чан В-Т. В., 1999]. В качестве зондов могут служить случайные продукты рестрикции геномной ДНК, однако чаще всего используют специально отобранные клоны уникальных и редко повторяющихся последовательностей ДНК, применяемых для составления молекулярных карт геномов и физического картирования генов [Kurata N. et al., 1997; Saji S. et al., 2001]. С использованием RFLP-маркеров были получены первые успешные результаты по построению молекулярно-генетических карт многих видов растений и животных, накоплены обширные сведения о генетическом полиморфизме различных организмов, выявлены ассоциации с хозяйственнополезными признаками [Tanksley S.D. et al., 1996]. Высокий консерватизм RFLP-маркеров позволяет использовать их при сравнительном картировании родственных видов [Avise J.C., 1994]. После открытия в 1983 г. метода ПЦР, позволяющего быстро получить более 10 миллионов копий целевой последовательности ДНК в ходе проведения реакции, появился новый тип молекулярных маркеров [Шибата Д.К., 1999]. В сравнении с RFLP-анализом, методы, основанные на ПЦР-технологии, требует выделения значительно меньшего количества ДНК из растительной ткани, однако ДНК должна быть чистой от ДНК грибов и бактерий. При ПЦРанализе отпадает нужда в поддержании библиотеки клонов для гибридизационных зондов и работа с радиоактивными изотопами [Хавкин Э.Е., 1997]. Для того чтобы осуществить этот процесс in vitro, используют две генетические пробы, называемые праймерами, которые присоединяются к комплементарному им фрагменту ДНК, образуя таким образом двунитиевый стартовый участок, и служат в качестве затравки для синтеза выбранного маркерного участка ДНК. Помимо праймеров основными компонентами ПЦР 20 являются: фермент Taq-ДНК-полимераза, осуществляющая воспроизведение специфического участка, расположенного между 5` концами праймеров; 4 типа дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ); копируемая ДНК; ионы Mg2+ [Янковский Н.К., 1996]. В зависимости от природы праймеров и способа идентификации продуктов амплификации различают несколько методов ДНК-маркерного анализа и соответствующих типов ДНК-маркеров. Первым появился метод случайно выбранных последовательностей ДНК (randomly amplified polymorphic DNA-RAPD), в котором используют стандартные наборы праймеров, как правило, длиной 10-14 нуклеотидов и который основан на анализе случайно амплифицированной полиморфной ДНК. При выполнении данного вида анализа полиморфизм определяется как присутствие – отсутствие в электрофоретических спектрах специфических фрагментов ДНК и обусловлен различиями последовательностей ДНК в местах посадки праймеров [Гучетль С.З. и др., 2008; Сиволап Ю.М. и др., 1997; Суворова Г.Н. и др., 1999]. Главным ограничением в применении RAPD-маркеров является их доминантность, из-за которой невозможно отличить гетерозиготное состояние от гомозиготного, что приводит к утрате информации, необходимой, например, в популяционной генетике для оценки частот аллелей, а также низкая воспроизводимость результатов, обусловленная повышенной чувствительностью к условиям реакции [Гостимский С.А. и др., 1999]. Для того чтобы исключить перечисленные недостатки RAPD-маркеров был предложен метод, занимающий промежуточное положение между RFLP- и ПЦР-анализом – AFLP-технология (amplified fragment length polymorphism), не требующая ни предварительного клонирования, ни секвенирования ДНК [Гучетль С.З. и др., 2008; Хавкин Э.Е., 1997]. AFLP-маркерная система требует большего количества ДНК (1 мкг на реакцию), однако определение последовательности выделенных таким образом фрагментов дает много новой информации о природе генов и организации их непосредственного окружения 21 [Castiglioni P. et al., 1998; Dudley J.W., 1993; Vos P. et al., 1995]. Главным недостатком AFLP-маркеров является их доминантность [Jansen R.C. et al., 2001]. Метод SSAP – (англ. Sequence Specific Amplification Polymorphism) явился модификацией метода AFLP, для выявления полиморфизма как по сайту рестрикции, так и по вставке в геномную ДНК транспозона или ретротранспозона. Данный метод нашел широкое применение в исследованиях генетического разнообразия культурных растений [Waugh R. et al., 1997]. C открытием микросателлитных последовательностей (SSR – simple sequence repeat), распространенных повсеместно в ДНК высших растений, были созданы более универсальные типы молекулярных маркеров. Среди микросателлитных последовательностей в геноме ядра многих растений преобладают ди-, три- и тетрануклеотидные повторы [Diwan N. et al, 1997; Diwan N. et al., 1994]. Источник полиморфизма этих последовательностей – в сайт-специфическом варьировании длины повтора, что в свою очередь обусловлено различием в числе единиц повтора [Schlotterer C. et al., 1997]. Одними из первых маркеров, для создания которых использовали праймеры, комплементарные микросателлитным повторам (4-12 единицам повтора) и несущие на одном из концов последовательность из двух-четырех произвольных нуклеотидов были ISSR-маркеры [Morgante M. et al., 1993]. На основе применения ISSR праймера и праймера, комплементарного фрагменту LTR ретротранспозона, построен принцип работы REMAP (Retrotransposone Microsatellite Amplified Polymorphism) ДНК-маркеров – мультилокусной ДНКмаркерной системы, эффективно используемой в филогенетических исследованиях и изучении генетического разнообразия культурных растений [Kalendar R. et al., 1999, 2006]. Наиболее информативные системы молекулярного ДНК-маркирования сельскохозяйственных культур – это микросателлитные последовательности ДНК, которые могут состоять из 4, 3, 2 и даже одного нуклеотида (SSR). Они также относятся к диспергированным 22 тандемно повторяющимся последовательностям, но единицы повторов (ди-, три- и тетрануклеотиды) и общий размер повторяющейся области существенно короче (как правило, не более 100 п. н.) [Litt M. et al., 1989]. Для создания SSR подбираются праймеры к уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим микросателлитный повтор, что требует предварительного знания их нуклеотидной последовательности. SSRмаркеры стабильны в соматических клетках, их наследование носит кодоминантный характер [Weber J.L., 1990], распределение по всему геному облегчает использование этих маркеров для молекулярного картирования генома, идентификации генотипа и паспортизации сортов, скрининга крупных инсерционных библиотек, делая SSR в настоящее время одной из самых востребованных маркерных систем для осуществлении маркерной селекции у яблони [Thomas M.R. et al., 1993]. В последнее время широкое распространение в исследованиях, направленных на идентификацию генов, детерминирующих хозяйственноценные признаки, а также в изучении геномного полиморфизма, выяснения филогенетических аспектов культурных растений, в том числе яблони, получил тип ДНК-маркеров, основанных на единичных нуклеотидных заменах – SNP (single nucleotide polymorphism). Во многом это обусловлено значительно высокой частотой встречаемости SNP-сайтов в геноме. Этот метод получил более широкое распространение с развитием методов секвенирования геномов, и появлением технологии полногеномного секвенирования (Next Generation Sequences – NGS) [Ignazio V. et al., 2012; Laima A. et al., 2012; Satish K. et al., 2013; Velasco R. et al., 2010]. 1.4 Молекулярно-генетические методы в изучении устойчивости яблони к парше Маркер-вспомогательная селекция, предполагающая использование ДНКмаркеров для идентификации целевых генов, является в настоящее время одной 23 из наиболее востребованных технологий при работе с генами тех признаков, фенотипическая оценка которых затруднительна. В эту категорию можно отнести устойчивость к биотическим стрессовым факторам, из которых для яблони особенно вредоносным является грибной патоген Venturia inaequalis – возбудитель заболевания парша [Седов Е.Н., 1992]. Важнейшее преимущество маркерной селекции – это возможность упразднения сложного и трудоемкого этапа фитопатологического тестирования, которое особенно усложняется при необходимости контроля наличия в селекционном материале более чем одного гена устойчивости [Супрун И.И. и др., 2012]. Наличие искомого гена определяется напрямую в генетическом материале по результатам ПЦР, причем проводить оценку можно практически на всех этапах вегетационного развития растения [Tanksley S.D., 1983]. Для успешного выполнения подобных исследований необходимо наличие ДНК-маркеров к искомым генам. С использованием ДНК-маркеров на генетической карте яблони картировано большинство известных генов устойчивости [Baldi P. et al., 2004]. Главными генами устойчивости яблони к парше считаются гены Vf, Vr, Vb, Va, Vm, Vbj, для подавляющего большинства опубликованы ДНК-маркеры: Vf [Vinatzer B.A. et al., 2004]; Vr [Hemmat M. et al., 2002]; Vb и Va [Hemmat M. et al., 2003], Vm [Cheng F.S. et al., 1998]. Два других гена устойчивости: Vx и Vr2 и молекулярные маркеры к ним были открыты сравнительно недавно [Hemmat M. et al., 2002; Patocchi A. et al., 2004]. Для большинства генов устойчивости идентифицированы сонаследуемые ДНК-маркеры. С точки зрения молекулярной генетики ген Vf является наиболее изученным на сегодняшний день [Afunian M.R. et al., 2004; Patocchi A. et al., 2004; Suprun I. et al., 2012]. Ген Vf выделен из M. floribunda 821, Vm из Malus micromalus 245–38 или Malus atrosanguinea 804, Vr, Vh2 и Vh4 (также называемый Vx или Vr1) из M. pumila R12740-7A; Vbj из Malus baccata jackii; Vb из Hansen’s baccata №2; Va из PI172623; Vg из Голден Делишес; Vr2 из GMAL 2473 и Vd из Durello di Forli [Boudichevskaia A. et al., 2004; Bus V.G.M et al., 2005; Hemmat M. et al., 2002; 24 Patocchi A. et al., 2004; Tartarini S. et al., 2004; Williams E.B. et al., 1969]. Все эти гены функционально различны. Наиболее широко в селекционных программах США, Канады, Западной и Восточной Европы используется ген Vf, расположенный на первой хромосоме и обладающий наиболее широким спектром устойчивости к патогену V. inaequalis. Для данного гена установлена нуклеотидная последовательность, и идентифицирован сонаследуемый SCAR ДНК-маркер [Afunian M.R. et al., 2004; Patocchi A. et al., 2004]. Многие гены устойчивости представляют собой кластеры из нескольких генов в пределах определенного участка хромосомы – консервативные функциональные домены. Информация, полученная в ходе изучения Vf-гена при помощи различных ДНК-маркеров, позволила в дальнейшем выполнить тонкое картирование области локализации данного гена и идентифицировать кластер из четырех элементов в Vf-локусе: Vfa1, Vfa2, Vfa3, Vfa4. Нуклеотидная последовательность была расшифрована для каждого элемента кластера. В дальнейшем было выявлено, что устойчивость к патогену V. обуславливает Vfa4, имеющий inaequalis наибольшее количество гипервариабельных участков [MacHardy W.E., 1996]. Различия в экспрессии этих четырех генов наблюдаются в процессе развития листа. Vf1, Vf2 и Vf3 были активны в молодых листьях и незначительно экспрессировались в зрелых листьях, в то время как Vf4 был активен в молодых и хорошо экспрессировался в зрелых листьях [Xu M. et al., 2006]. В Vf-локусе, помимо генов резистентности, идентифицирован также ряд экспрессирующихся последовательностей (EST), роль которых в обеспечении иммунитета к парше еще не изучена, но есть предположение, что они могут влиять на транскрипцию и трансляцию Vf-генов, а также на их активность в процессе развития листа [Gianfranceschi L. et al., 1996; Vinatzer B.A. et al., 2001]. Ген устойчивости яблони к парше Vm, интрогрессирован из форм яблони, принадлежащих к видам Malus atrosanguinea 804 (гены Vm и Vf) и M. micromalus (ген Vm). Наиболее известная работа по молекулярно25 генетическому картированию гена Vm была выполнена A. Patocchi с соавторами (2005 г.). В результате выполненных исследований была окончательно определена позиция этого гена на хромосоме 17 и идентифицирован ДНКмаркер, сонаследуемый с геном, а также определен ряд SSR-локусов, тесно сцепленных с ним [Patocchi A. et al., 2005]. Ген устойчивости к парше Vb редко используется в селекционных программах, он был идентифицирован и впервые картирован G. Bеnaouf с соавторами в1997-2000 гг. [Benaouf G. et al., 2000]. В 1976 году H.S. Aldwinckle с соавторами связали название «Vr» с геном устойчивости к парше, обусловливающим специфические расходящиеся лучами в виде звезды некротические реакции на патоген, обозначив его Vr-A, чтобы отличить от Vr-DW [Aldwinckle H.S. et al., 1976]. А. Boudichevskaia с соавторами, установила, что Vh2 идентичен Vr, а Vh4 идентичен Vx и Vr1 и расположены на противоположных участках второй группы сцепления на генетической карте яблони [Boudichevskaia A. et al., 2006]. Идентифицирован расоспецифичекий ген Vh8, источником которого является M. sieversii. Данный ген обуславливает устойчивость к восьмой расе парши. Vh8, как Vh2-ген, относится ко второй группе сцепления, причем расположены эти гены рядом и, возможно, являются разными локусами одного гена устойчивости [Bus V.G.M. et al., 2005; Hemmat M. et al., 2002]. Для исследования генплазмы яблони можно применять как SCARмаркеры, так микросателлитные ДНК-маркеры. Так, при изучении сеянцев R12740-7A яблони российской селекции A. Boudichevskaia с соавторами обнаружили ген устойчивости, названный Vr1 [Boudichevskaia A. et al., 2004]. В 2009 г. J.M. Soriano с соавторами описали ген устойчивости Vd3 к высоковирулентной седьмой расе парши, донором которого является нидерландская селекционная форма яблони “1980-015-25”, также несущая ген Vf [Soriano J.M. et al., 2009]. Взаимодействие между генами устойчивости яблони к парше и антигеном возбудителя V. Inaequalis для удобства рассматривают как модель «рецептор26 лиганд» [Bus V.G.M. et al., 2005]. Согласно такой модели реакция гиперчувствительности является результатом взаимодействия антигена V. Inaequalis с сигнальными рецепторами яблони и как следствие вызывает локальную гибель пораженных клеток эпидермиса листьев [Goodman R.N. et al., 1994]. Согласно современной номенклатуре, предложенной V.G.M. Bus с соавторами, гены устойчивости яблони к парше называют Rvik (буква R означает резистентность, vi - V. Inaequalis, k – относится к источнику данного гена) [Gopaljee J. et al., 2009]. В таблице 1 указаны изученные на сегодняшний день гены устойчивости яблони к парше [Gopaljee J. et al., 2009; Gygax M. et al., 2004; Hemmat M. et al., 2003; Matsumoto S. et al., 2000; Patocchi A. et al., 2004; Patocchi A. et al., 2005; Tartarini S. et al., 2004]. К этим генам существуют различные ДНК-маркеры [Bus V.G.M. et al., 2005; Cheng F.S. et al., 1998; Gygax M. et al., 2004; Hemmat M. et al., 2002; Matsumoto S. et al., 2000; Patocchi A. et al., 2004; Vinatzer B.A. et al., 2004]. Таблица 1 цитируется по источнику [Gopaljee J. et al., 2009]. Таблица 1 – Гены устойчивости яблони к парше Ген устойчивости к Источник Группа Иммунный ответ Сцепленный парше сцепления ДНК-маркер (дистанция от Старое Новое гена в сМ) назв. назв. 1 2 3 4 5 6 Va Rvi10 Антоновка 1 Реакция B398480 PI 172623 гиперчувствительности (16) Vb Rvi12 Hansen’s 12 Хлоротические или Hi02d05 baccata № 2 некротические поражения, (7.8) иногда спороношение Hi07f01 (13.7) Vbj Rvi11 Malus 2 От бессимптомного течения CH05e03 baccata до хлоротических и (0.6) jackii некротических поражений со T6 спороношением (3.9) Vd Rvi13 Durello Forli di Незначительные OPAF07-880 хлоротические повреждения (2.0) без спороношения CH2b07 (9.0) 10 27 Окончание таблицы 1 1 2 – Vd3 3 1980-015025 D¨ulmener Rosenapfel 4 1 – Rvi14 Vf Rvi6 Priscilla 1 Vfh Rvi7 8 Vg Rvi1 Malus floribunda 821 Golden Delicious Vh2 Rvi2 Vh4/Vr1 Rvi4 Vh8 Rvi8 Vm Rvi5 Vr2 Rvi15 Malus pumila R12740-7A (TSR34T15) Malus pumila R12740-7A (TSR33T23 9) Malus sieversii W193B Malus atrosanguine a 840 GMAL 2473 5 – 6 CH-Vf1 (1) 67005F17 (7) Незначительные HB09TC хлоротические повреждения (5) без спороношения От бессимптомного течения M18 до хлоротических и (0.2) некротических поражений со CH-Vf1 спороношением (0.0) AL07 (0.9) Реакция – гиперчувствительности 6 Незначительные MC105 хлоротические повреждения (3.0) без спороношения CH01D03 (0.5) Незначительные OPL19 433 хлоротические повреждения (1) без спороношения Ch02b10 (8) Реакция S22 гиперчувствительности (4) CH02c02 (5) 12 2 2 Незначительные OPL19 хлоротические повреждения (1.3) без спороношения Реакция Hi07h02 гиперчувствительности (6) 2 17 От отсутствия симптомов до CH02c02a незначительные (0.0) хлоротические повреждения без спороношения 2 Определение позиций генов устойчивости к парше на генетической карте яблони и идентификация ДНК-маркеров данных генов необходимо для выполнения программ по маркер-вспомогательной селекции, в том числе пирамидирования, т.е. объединение двух и более генов устойчивости в одном сорте [MacHardy W.E. et al., 2001]. Для этого необходимо иметь в распоряжении соответствующие ДНК-маркеры искомых генов [Suprun I. et al., 28 2012]. Большинство генов устойчивости представляет собой комплексные генетические семейства, сгруппированные внутри отдельных хромосомных областей [MacHardy W.E. et al., 2001]. Идентифицированы гены, отвечающие за непрямой (опосредованный) ответ на инфекцию V. Inaequalis у яблони. Они участвуют в клеточной детоксикации молодых листьев. Изучение экспрессии данных генов необходимо для понимания иммунного ответа яблони [Cao H. et al., 1997; Gau A.E. et al., 2004]. Наряду с изучением генетических основ и идентификацией генов устойчивости в геноме вида Malus domestica, в последнее время активно используют технологию генетической трансформации для получения устойчивых к данному заболеванию форм [Bolar J.P. et al., 2000, 2001]. Пуроиндолин Б (PinB), богатый цистеином противогрибковый протеин пшеницы, может подавлять рост V. Inaequalis. Сочетание генов антигрибковых протеинов вместе с генами устойчивости и иммунного ответа может стать хорошей стратегией генетической трансформации в увеличении долговременности и эффективности устойчивости яблони к парше [Cao H. et al., 1997; Faize M. et al., 2003, 2004; Malnoy M. et al., 2007]. Помимо перечисленных выше «главных» генов устойчивости известны различные полигенные источники, обеспечивающие устойчивость яблони к парше. Это так называемые количественные локусы (quantitative trait loci – QTLs), которые несут горизонтальную (полевую) устойчивость к парше с незначительным фенотипическим проявлением и представляют собой аналоги резистентных генов (resistance gene analogs – RGA) [Soufflet-Freslon V. et al., 2008]. С тех пор как патоген стал преодолевать устойчивость основных генов резистентности, возникла необходимость пирамидирования главных генов или их сочетание с другими источниками устойчивости в одном генотипе для длительной устойчивости яблони к парше. Развитие селекционных технологий и методов молекулярного ДНК-маркирования, и появления технологии 29 маркерной селекции (marker assisted selection – MAS) дает возможность значительного повышения эффективности при решении данной задачи [Супрун И.И. и др., 2010; Ульяновская Е.В., 2007]. 1.5 Изучение генетического разнообразия яблони Важнейшей характеристикой любой селекционной коллекции является генетическая изменчивость или полиморфизм, обусловленный несколькими наследственными факторами с дискретным фенотипическим эффектом. Для изучения уровня генетического полиморфизма генофонда яблони необходимо использовать наиболее эффективные типы маркерных систем. Оценка уровня полиморфизма необходима для выбора селекционной стратегии по комбинированию хозяйственно-ценных признаков в программах по выведению новых сортов яблони [Oraguzie N.C. et al., 2001]. Первая генетическая карта яблони, построенная с применением изоэнзима, RFLP- и RAPD-маркеров, была опубликована Hemmat M. с соавторами (1994 г.) для гибрида Rome Beauty × White Angel. P. Conner (1997 г.) с соавторами предложил более подробную карту, что способствовало развитию селекции устойчивых к парше сортов яблони на молекулярном уровне [Sladana M. et al., 2010]. С использованием изоэнзимов, RFLPs, RAPDs, AFLPs, SCARs и SSRмаркеров при исследовании популяции 152 сеянцев была создана генетическая карта с 17 группами сцепления (как и гаплоидный набор хромосом яблони, n=17) для сортов Прима и Фиеста [Maliepaard C. et al., 1998]. В исследованиях по изучению генетики различных хозяйственно-ценных признаков яблони часто используют подробную генетическую карту яблони, созданную R. Liebhard с соавторами (2003 г.) [Liebhard R. et al., 2003]. F. Fernandez-Fernandez с соавторами (2008 г.) описал разработки генетической карты с использованием 247 микросателлитных маркеров, 4 SCAR-маркеров и 8 хорошо изученных генов, 5 из которых контролируют 30 ценные сельскохозяйственные признаки, такие как устойчивость к парше, мучнистой росе, гены колоноводности кроны и окраски плодов [FernandezFernandez F. et al., 2008]. Для оценки достоверности результатов картирования, полученных независимыми исследованиями, необходимы эффективные типы маркерных систем [Gardiner S.E. et al., 2007]. В этом отношении незаменимы микросателлитные маркеры, т.к. они кодоминантны, высоко полиморфны, широко распространены и их результаты легко воспроизвести. Микросателлиты идеально подходят для картирования локусов количественных признаков и универсальны между культурами [Kenis K. et al., 2005; Liebhard R. et al., 2002, 2003]. R. Liebhard c соавторами впервые идентифицировал 140 микросателлитных локусов и праймерные пары, их фланкирующие, со средним уровнем полиморфизма 6,1 аллеля на локус. Для всех маркеров была определена позиция на генетической карте потомства, полученного от скрещивания сортов яблони Fiesta × Discovery и идентифицировано 17 групп сцепления, соответствующих хромосомам яблони [Liebhard R. et al., 2002]. Рассмотрена возможность применения микросателлитных маркеров для других видов семейства Розоцветных. В дальнейшем идентифицированные микросателлитные локусы были использованы для создания генетической карты яблони [Alston F.H. et al., 2000; Liebhard R. et al., 2003]. В ходе исследований E. Silfverberg-Dilworth с соавторами идентифицировал 148 новых SSR-локусов в геноме яблони и провел их картирование на генетической карте Fiesta × Discovery [Silfverberg-Dilworth E. et al., 2006]. Микросателлитные маркеры идеально подходят для анализа филогенетических взаимоотношений на внутри- и межвидовом уровне. Так, M. Muzher Bayan с соавторами использовал SSR-маркеры в сочетании с AFLP- и RAPD-маркерными системами для изучения генетического родства шести сирийских сортов яблони. Уровень полиморфизма исследуемых образцов 31 составил 82,7%, 100% и 91,7%, выявленный соответственно RAPD-, SSR- и AFLP-маркерами [Bayan M.M. et al., 2007]. Микросателлитные маркеры успешно применялись в работе Christopher M. Richards с соавторами для оценки генетического полиморфизма 949 образцов сеянцев, полученных от 8 популяций Malus sieversii (Lebed.) M. Roem. из Казахстана [Christopher M.R. et al., 2009]. Главный недостаток микросателлитных маркеров – это необходимость их предварительного создания, картирования и апробации. Несмотря на то, что для яблони было создано около 160 SSR-маркеров, распределение их по всему геному не является гомогенным [Gianfranceschi L. et al., 1998; Hemmat M. et al., 2003; Hokanson S.C. et al., 1998; Liebhard R. et al., 2002; Vinatzer B.A. et al., 2004]. Почти все группы сцепления содержат области со значительными пробелами между двумя последовательными микросателлитами [Liebhard R. et al., 2003]. Создание новых микросателлитных маркеров может решить данную проблему. В настоящее время именно микросателлитные маркеры нашли широкое применение в популяционно-генетических исследованиях, направленные на изучение степени генетического полиморфизма яблони. A. Patocchi с соавторами оценил полиморфизм порядка двух тысяч образцов (359 сортов и 27 гибридных популяций объемом от 26 до 98 гибридных растений) из коллекции генетических ресурсов европейского консорциума по устойчивому возделыванию яблони (European High-quality Disease-Resistant Apples for a Sustainable agriculture project) с использованием 88 микросателлитных ДНКмаркеров. A. Patocchi показал, что SSR-маркеры могут использоваться для мультиплексной ПЦР [Patocchi A. et al., 2005]. Микросателлитные маркеры успешно применяются для оценки степени генетического полиморфизма на молекулярном уровне для идентификации клонов. Так, N.C. Oraguzie с соавторами в 2005 г. провел скрининг с помощью семи SSR-маркеров 66 клонов яблони для того, чтобы установить их генетическую идентичность [Oraguzie N.C. et al., 2005]. 32 Для генотипирования яблони SSR-маркеры широко применяются в различных странах. Так, в Испании, в Боснии и Герцеговине независимо проводились работы по выяснению генеалогии некоторых местных сортов, позволившие внести ясность в вопросы, касающиеся происхождения образцов [Bayan M.M. et al., 2007; Pereira-Lorenzo S. et al., 2007]. В 2010 г. F. Gasia с соавторами с применением десяти SSR-маркеров сравнили местные сорта яблони в Боснии и Герцеговины с международными сортами яблони, получив значительные статистически достоверными различия [Gasia F. et al., 2010]. S. Pereira-Lorenzo с соавторами (2008 г.) с применением десяти микросателлитных маркеров рассматривают местные сорта яблони с Канарских островов как ценный генетический ресурс для субтропических областей ввиду обнаружения пяти уникальных аллелей. Уровень полиморфизма используемых маркеров позволил среди образцов с Канарских островов распознать один образец, являющийся гибридом, полученным от сорта Голден Делишес, остальные 30 образцов были разделены на 14 генотипов [Mohan M. et al., 1997; Pereira-Lorenzo S. et al., 2008]. В Иране A. Gharghani с соавторами (2009 г.) исследовали полиморфизм 159 образцов дикой и домашней яблони, включая M. sieversii и M. orientalis, а также иранские и мировые сорта яблони. Согласно полученным результатам, иранские сорта яблони являются близкородственными с M. sieversii из центральной Азии и занимают промежуточное положение между дикими и одомашненными видами яблони, а M. orientalis ближе всего к русским и турецким видам яблони, следовательно, Иран является одним из мест, где происходило одомашнивание яблони [Gharghani A. et el., 2009]. Сорта яблони из коллекции ВНИИГиСПР проанализированы И.Н. Шамшиным с соавторами (2013 г.) с применением 15 микросателлитных маркеров, показавших высокое значение [Шамшин И.Н. и др., 2013]. 33 коэффициента полиморфизма Супруном И.И. с соавторами выполнены исследования по оценки уровня информативности отечественных SSR-локусов сортов яблони и получены из коллекции SSR-фингерпринты генетических ряда ресурсов СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК наряду с сортами плодовых родов Prunus и Pyrus с использованием мультиплексного фрагментного анализа на автоматическом генетическом анализаторе ABI-Prism 3130 [Супрун И.И. и др., 2013]. В последнее время большой интерес вызывают биохимические и физиологические процессы у яблони, которые обеспечивают различные экономически важные признаки, например, созревание и лежкость плодов [Sladana M. et al., 2010]. Многие сельскохозяйственно-ценные признаки яблони являются полигенными. К таким признакам относятся: продолжительность ювенильного периода, морозостойкость, продолжительность цветения, время созревания, размер, форма, цвет, вкус и аромат плодов и продуктивность [Janick J. et al., 1996]. Генетическое картирование локусов генов количественных признаков (QTLs) заключает в себе идентификацию и определение степени взаимосвязи между этими признаками и используемыми молекулярными маркерами [Gao Z.S. et al., 2005; Gardiner S.E. et al., 2007]. Подробная генетическая карта, покрывающая весь геном необходима для точной идентификации локусов количественных признаков. Если определенные области генома не достаточно покрыты молекулярными маркерами, позиции локусов количественных признаков на генетической карте нельзя считать достоверными [Kenis K. et al., 2007; King G.J. et al., 2000]. Применение маркерных технологий для выявления генетического полиморфизма на уровне ДНК, идентификации и картирования генов, установления филогенетических связей и QTL-анализе уже сейчас представляет собой мощный инструмент, как в теоретических генетических исследованиях, так и в прикладных работах, без которого невозможно повышение эффективности селекционного процесса [Седов Е.Н. и др., 2006; Супрун И.И. и др., 2012]. 34 1.6 Молекулярно-генетический полиморфизм гена самонесовместимости в пределах вида Malus domestica Самонесовместимость – характерная черта многих цветковых растений, препятствующая инбридингу и способствующая ауткроссингу, который приводит к свободному перекомбинированию наследственного материала популяции, реализуя гибридную мощность организмов [Суриков И.М., 1991]. Системы самонесовместимости делят на спорофитные (фенотип пыльцевого зерна определяется диплоидным геномом материнского растения) и гаметофитные (фенотип определяется только генами, которые несёт данное пыльцевое зерно). Яблоня, как и другие представители семейства Rosaceae, принадлежит к растениям с моногенным гаметофитным контролем реакции самонесовместимости [Ефимова И.Л., 2005]. Явление самонесовместимости представляет собой один из наиболее ярких примеров межклеточного взаимодействия и может служить удобной моделью для анализа экспрессии генов [Broothaerts W. et al., 1995]. В системе самонесовместимости гаметофита яблони хорошо известен ген самонесовместимости (S-ген). S-локус – это мультигенный комплекс, включающий S-РНКазный ген, экспрессирущийся в пестике, и специфический F-box ген пыльцы. Продукты S-гена в пестике – цитотоксические протеины с рибонуклеазной активностью (S-РНКазы) [McClure B.A. et al., 1989]. В процессе самонесовместимого взаимодействия S-РНКазы контролирует прорастание пыльцевой трубки, проникая в цитоплазму и деградируя пыльцевую РНК [Broothaerts W. et al., 1995]. Пыльцевые трубки, прорастающие из пыльцы с определенным аллелем S-гена ингибируются в пестиках растений, несущих тот же аллель [Janssens G. A. et al., 1995]. Следовательно, оплодотворение блокируется, когда S-аллель пыльцы совпадает с одним или несколькими S-аллелями аллелеассоциированные пестика протеины [Gao – Z.S. et высокоосновные al., 2005]. гликопротеины Sс приблизительной молекулярной массой около 30 кДа, которые широко 35 представлены в пестике. В основном S-РНКазный протеин состоит из пяти консервативных областей (C1–C5) и одного гипервариабельного участка (RHV), расположенного между С2 и С3. Данные участки играют главную роль в распознавании собственной и чужой пыльцы, т.к. все эти четыре участка расположены в области активной рестрикции, что дает возможность взаимодействовать с субстратами [Matsuura T. et al., 2001]. S-РНКазы есть как в самонесовместимых, так и в совместимых пыльцевых трубках, но их цитотоксическая роль в задержке прорастания пыльцы проявляется только в случае самонесовместимости [Luu D.T. et al., 2002]. Одна из первых работ, связанных с фертильностью некоторых сортов яблони, относится к 1939 г. В данной работе F. Kobel с соавторами изучал прорастанание пыльцевой трубки и различия между совместимыми, полусовместимыми и несовместимыми гибридами, определил 11 различных Sаллелей яблони (S1 - S11) для 20 местных сртов. Были описаны S-генотипы 14 диплоидных и 12 триплоидных видов [Kobel F. et al., 1939]. Однако S-генотип 5 дополнительно изученных триплоидов был частично установлен и оставшиеся аллели обозначили как Sx или Sy. Позднее в молекулярный анализ включили электрофорез S-РНКаз в гелях, а также изоэлектрическую фокусировку или неравновесный рН-градиент электорофокусирования и детекцию при помощи антител и рубонуклеазной активности, наряду с клонированием и секвенированием ДНК S-аллелей, начавшимися в последней декаде 20 века [Супрун И.И. и др., 2012]. В ранних исследованиях японских сортов яблони S. Komori с соавторами определяет буквенные символы для 10 S-аллелей (Sa-Si и Sz) и сообщает об их соответствии с 4 S-аллелями F. Kobel (2000 г.) [Komori S. et al., 1999]. S-РНКазы яблони были выделены и описаны H. Sassa с соавторами (1994) и W. Broothaerts с соавторами (1995) [Broothaerts W. et al., 1995; Sassa H. et al., 1994]. W. Broothaerts с соавторами в 1995 г. охарактеризовал S2 и S3-аллели гена самонесовместимости яблони. Продукт S2-аллеля был выделен из пестика сорта Голден Делишес и проявлял себя как РНКаза [Broothaerts W. et al., 1995]. Кроме 36 того, стали применятся биохимические и молекулярные методы для идентификации аллелей S-гена и классификации несовместимых групп яблони и других розоцветных [Ishimizu T. et al., 1999]. H. Sassa с соавторами (1994 г.; 1996 г.) описал аллели Sa-Sf по их продуктам, выявив характерную миграцию образцов в щелочных областях при проведении электрофореза [Sassa H. et al., 1994]. В последствии были добавлены 14 S-аллелей (S12-S25), сиквенс которых в последствии сравнивался с уже известными аллелями S-гена [Boskovic R. et al., 1999]. Общепринятые методы определения самонесовместимости культур сложны в оценке в связи с физиологическими факторами и воздействием окружающей среды самонесовместимых [Kobel F. et групп стали al., 1939], поэтому использовать для анализа изоферменты и S-гликопротеины [Sassa H. et al., 1994], результат которых также довольно трудно интерпретировать [Sakurai K. et al., 2000]. Богатое аллельное разнообразие S-гена позволяет применять ПЦР-анализ с аллелеспецифическими праймерами даже в сочетании с эндонуклеазами рестрикции [Broothaerts W. et al., 2003]. Применение таких маркеров позволяет получать точные знания о системе самонесовместимости у яблони и других культур, которые необходимы для оптимального подбора родительских пар в селекционных программах [Sakurai K. et al., 1997]. S. Matsumoto и K. Kitahara (2000 г.) выделили 9 аллелей S-гена у яблони [Matsumoto S. et al., 2000]. В настоящее время аллели S-РНКазы выделены и у других диких азиатских видов яблони: S34 и S35 из Malus sieversii, а также S`g из Malus transitoria [Matsumoto S. et al., 2001]. Предварительный анализ этих генетических последовательностей показал, что SCAR-маркеры могут успешно применяться для определения S-РНКазного генотипа M. sylvestris, что позволяет оценить степень сходства нуклеотидных последовательностей аллелей S-гена, распространенных в генплазме M. sylvestris и M. × domestica. В связи с несовершенством классификации S-аллелей W. Broothaerts (2003 г.) предложил четырем S-аллелям присвоить новые номера, а аллели, 37 имеющие в названии буквы греческого алфавита, соответственно пронумеровать. Шесть дополнительных аллелей были распознаны по их РНКазам: S8, S13, S14, S15, S17, S18 и S21, не смотря на то, что S14, S17 и S21 можно объединить в одну группу S14/17/21. Аллели, генетический продукт которых ранее не был описан, получили другие номера. Для облечения дальнейшего анализа S-генотипа определены общие сорта, которые могут функционировать как контроль отдельных аллелей S-гена [Broothaerts W., 2003]. Аллельные комбинации S-гена (S-генотипы) определяют разнообразными методами, однако молекулярно-генетический подход с применением мультиплексных смесей для ПЦР считается приоритетным. Кроме того, 10 SРНКаз яблони [(Sc, Sd, Se, St, Sg, Sg, Sh, Si, St, и Sz] клонированы и секвенированы в Японии [Matsumoto S. et al., 2000, 2001] так же как и 11 аллелей (S2, S3, S4, S5, S7, S9, S24, S26, S27a, S27b, S30(=28)) – в Европе [Broothaerts W. et al., 1995]. В настоящее время широко ведутся работы по определению S-генотипов различных сортов яблони, необходимые для мировой селекции данной культуры. Так, Taek Kim Hoy с соавторами изучил S-генотип 14 корейских сортов яблони, обнаружив аллели S1, S2, S3, S5, S7, S9, S19 [Hoy T.K. et al., 2006]. S.G. Dreesen Rozemarijn (2010 г.) с соавторами провели генотипирование более трехсот образцов M. sylvestris, M. × domestica и внутривидовых гибридов M. sylvestris – M. × domestica с применением молекулярных SCAR-маркеров. Оказалось, что разнообразие S-РНКаз было выше у M. sylvestris, чем у M. domestica, что свидетельствует о негативном влиянии одомашнивания на аллельный полиморфизм S-гена. Тем не менее, большинство S-аллелей M. domestica обнаружены и у M. sylvestris, что говорит об устойчивой структуре S-гена [Rozemarijn S.G.D. et al., 2010]. В 2010 г. описаны три новых аллеля S-гена: S44, S45 и S46 с соответствующими аллелеспецифическими праймерами. Основываясь на данных о нуклеотидной последовательности S-гена, большую популярность получили методы, основанные на ПЦР с применением специфических RFLP-маркеров [Shenshan L. et al., 2010]. 38 A. Hegedûs, проанализировав многолетние данные мировой литературы, обозначил наиболее распространенные в мировой генетической плазме яблони аллели S-гена: S2, S3, S7, S10 [Hegedûs A., 2006]. Необходимо отметить, что сорта Прима, Голден Делишес, Айдаред, Джонатан, Джонаголд, которые наиболее часто применяются как родительские формы у современных сортов и селекционных форм яблони в России, послужили наиболее широкому распространению в современной отечественной генплазме яблони таких аллелей как S2, S3 и S10 [Супрун И.И. и др., 2013]. Наличие у двух разных сортов общих S-генотипов является причиной их несовместимости при опылении, в этом случае скрещивание не дает потомства, следовательно, знание S-генотипов необходимо для улучшения эффективности перекрестного опыления. Полусовместимые сорта, которые несут по какомунибудь одному S-аллелю, зачастую произрастают совместно в одном саду, что не является оптимальным [Суриков И.М., 1991]. Для окультуренной яблони механизм самонесовместимости зачастую мешает регуляции сельскохозяйственного процесса выращивания, например, при интрогрессиии нужных генов, следовательно, знание S-генотипа необходимо для разработки оптимальных программ гибридизации [Супрун И.И. и др., 2012]. Данные об аллельном составе гена самонесовместимости являются неотъемлемой частью ДНК-паспортов сортов яблони. Причем получить такой паспорт представляется затруднительным без применения ДНК-маркерных технологий, для которых не требуются полевые испытания и специфические лабораторные анализы, необходимые для скрининга фенотипических проявлений данного признака. Тем более идентифицировать аллельный набор гена самонесовместимости у селекционных форм яблони с применением ДНКмаркерного анализа возможно еще до вступления их в фазу цветения – немаловажное преимущество анализа данного типа [Гостимский С.А. и др., 1999]. Таким образом, анализ литературных данных показал, что применение в генетических исследованиях методов, основанных на ДНК-маркировании, 39 значительно повышает эффективность оценки растительного материала по многим интересующим хозяйственно-ценным признакам. Яблоня как ведущая мировая плодовая культура всегда будет актуальным объектом селекционных исследований. Изучение отечественной генплазмы яблони с целью создания сортов, отвечающих требованиям современных технологий, диктует необходимость развития новых направлений исследований, в частности: – изучение генетического полиморфизма яблони в сравнении с другими плодовыми культурами на внутри- и межвидовом уровне; – выявление доноров хозяйственно-ценных признаков при массовом скрининге селекционного материала яблони с возможностью одновременной идентификации нескольких генов в одном образце; – паспортизация генофонда яблони с применением оптимальной выборки микросателлитных маркеров с высоким уровнем аллельного полиморфизма; – создание базы данных ДНК-паспортов сортов яблони, в которых отражены результаты микросателлитного генотипирования; информация о генах, представляющих интерес для селекции, а также данные о гомо- или гетерозиготном состоянии локуса целевого гена; аллельный состав гена самонесовместимости. 40 2 УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 Условия проведения и материал исследований Исследования проводились с 2008 г. по 2011 г. в секторе генетических и статистических исследований исследовательского Северокавказского института Россельхозакадемии с садоводства использованием зонального и научно- виноградарства следующего оборудования: ДНК-амплификатор Терцик, Eppendorf Mastercycler gradient, микроцентрифуги Eppendorf Minispin, микродозаторов автоматических, термостат для микропробирок Термит, камеры для горизонтального электрофореза SE-2 и SE3 и вертикального – VE-3 фирмы Хеликон (Москва), трансиллюминатор Vilber Lourmat, реактивов и расходных материалов для ПЦР и электрофореза, автоматический генетический анализатор/секвенатор ABI Prism 3130. Материалом для исследований послужили отечественные сорта и элитные формы яблони коллекции генетических ресурсов СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК (в предоставленные рамках выполненных селекционерами Е.В. совместных проектов Ульяновской, Е.Н. РФФИ), Седовым, С.Н. Артюх и И.Л. Ефимовой, а также иностранные сорта яблони: Прима, Голден Делишес, Ред Делишес, Айдаред, Ренет Симиренко, Мекинтош (приложение 1-2) [Артюх С.Н. и др., 1998; Седов Е.Н., 2005; Ульяновская Е.В., 2008]. В качестве сорта-стандарта, несущего ген Vf, использовали сорт Прима американской селекции, что связано с наличием в международной научной литературе информации об аллельных состояниях изучаемых микросателлитных локусов у данного сорта. При проведении анализа образцов яблони на предмет наличия доминантной аллели гена Vm в качестве стандарта наличия гена использовали сорт Орловский пионер, селекции ВНИИСПК 41 (г. Орел). Это было обусловлено наличием многолетних данных о присутствии у данного сорта искомого гена, полученных путем фитопатологического тестирования. Кроме того, одна из родительских форм (SR 0523) данного сорта является общеизвестным донором гена Vm. Стандартами при анализе полиморфизма локуса S-гена послужили сорта иностранной селекции с известным из литературных данных аллельным набором S-локуса: Голден Делишес – S2, S3; Айдаред – S7; Мекинтош – S10 [Супрун И.И. и др., 2010]. 2.2 Молекулярные маркеры, использованные в работе В качестве ДНК-маркера гена Vm использовали Hi07h02 (F: CAAATTGGCAACTGGGTCTG; R: GTTTAGGTGGAGGTGAAGGGATG). В качестве ДНК-маркера гена Vf – внутригенный маркер (прямой праймер – VfC1F: 5`GGTTTCCAAAGTCCAATTCC3`; обратный праймер – VfC2R: 5`CGTTAGCATTTTGAGTTGAC3`), аллельный полиморфизм которого обусловлен наличием инсерций у рецессивной аллели гена [Супрун И.И. и др., 2009]. Праймерные пары использованных ДНК-маркеров были синтезированы фирмами ЗАО «Синтол», г. Москва, и фирмой «Бигль», г. Санкт-Петербург. В работе по определению степени генетического родства отечественных сортов яблони коллекции генетических ресурсов СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК использовали 12 нейтральных (то есть не сцепленных ни с каким признаком) микросателлитных маркеров, имеющих кодоминантный характер наследования и характеризующихся высоким уровнем полиморфизма. Микросателлитные маркеры (SSR) отбирали из базы данных www. hidras.unimi.it. Список использованных SSR-маркеров приведён в таблице 2. 42 Таблица 2 – Микросателлитные маркеры, использованные для изучения генетического родства сортов яблони коллекции генетических ресурсов СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК Название CH01f03b CH01h01 CH01h10 CH02c06 CH02d08 CH04e05 CH05f06 CH01f02 CH02c11 Hi02c07 CH02c09 CH03d07 Последовательность праймеров Температура отжига, ºC F GAGAAGCAAATGCAAAACCC 56,4 R CTCCCCGGCTCCTATTCTAC 62,5 F GAAAGACTTGCAGTGGGAGC 60,5 R GGAGTGGGTTTGAGAAGGTT 58,4 F TGCAAAGATAGGTAGATATATGCCA 60,9 R AGGAGGGATTGTTTGTGCAC 58,4 F TGACGAAATCCACTACTAATGCA 59,3 R GATTGCGCGCTTTTTAACAT 54,3 F TCCAAAATGGCGTACCTCTC 58,4 R GCAGACACTCACTCACTATCTCTC 65,2 F AGGCTAACAGAAATGTGGTTTG 58,4 R ATGGCTCCTATTGCCATCAT 56,4 F TTAGATCCGGTCACTCTCCACT 62,1 R TGGAGGAAGACGAAGAAGAAAG 60,3 F ACCACATTAGAGCAGTTGAGG 59,4 R CTGGTTTGTTTTCCTCCAGC 58,4 F TGAAGGCAATCACTCTGTGC 58,4 R TTCCGAGAATCCTCTTCGAC 58,4 F AGAGCTACGGGGATCCAAAT 58,4 R GTTTAAGCATCCCGATTGAAAGG 61,1 F TTATGTACCAACTTTGCTAACCTC 60,1 R AGAAGCAGCAGAGGAGGATG 60,5 F CAAATCAATGCAAAACTGTCA 53,5 R GGCTTCTGGCCATGATTTTA 56,4 Примечания: 1. F – прямой праймер 2. R – обратный праймер 43 Для изучения полиморфизма локуса S-гена сортов яблони коллекции генетических ресурсов СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК использовали ДНКмаркеры, приведенные в таблице 3. Таблица 3 – Нуклеотидные последовательности и размер ПЦР-продуктов маркеров, использованных для изучения полиморфизма локуса S-гена сортов яблони коллекции генетических ресурсов СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК S-аллель Название Последовательность размер праймеров ПЦРпродукт а (п. н.) S2 OWB 122 F GTTCAAACGTGACTTATGCG 449 OWB 123 R GGTTTGGTTCCTTACCATGG S3 S7 S10 FTC 177 F CAAACGATAACAAATCTTAC 500 FTC 226 R TATATGGAAATCACCATTCG FTC 143 F ACTCGAATGGACATGACCCAGT FTC 144 R TGTCGTTCATTATTGTGGGATGTC FTC 12 F CCAAACGTACTCAATCGAAG FTC 228 R ATGTCGTCCCGTGTCCTGAATC 302 209 Примечания: 1. F – прямой праймер 2. R – обратный праймер 2.3 Методы исследований Для следующей экстракции ДНК схемы: образцы использовали растительной ЦТАБ-метод, ткани придерживаясь яблони вносили в микропробирки и растирали с прогретым до 60 ºС 2-кратным ЦТАБ-буфером, содержащим 2 % ЦТАБ (цетилтриметиламмоний бромид), 1,4 M хлористого натрия, 0,1 M Трис-гидрохлорид, 20 мМ ЭДТА (этилендиаминотетраацетат). 44 При этом соблюдали соотношение 500 мкл буфера на 0,1 г ткани. Образцы инкубировали 3 часа при 60 ºС, после чего вносили равный объем хлороформа и инкубировали при перемешивании в течение 20 минут. На следующем этапе образцы центрифугировали 10 минут при 5000 об-1, отбирали супернатант, добавляли к нему 0,2 объема 5-кратного ЦТАБ-буфера, содержащего 5 % ЦТАБ и 350 мМ ЭДТА и инкубировали 10 минут при 60 ºС. После инкубации в пробирки с образцами вносили равный объем хлороформа и инкубировали при перемешивании 20 минут, центрифугировали 10 минут при 5000 об-1, в чистую пробирку отбирали верхнюю фазу, добавляли к ней равный объем буфера для преципитации (1 % ЦТАБ, 50мМ Трис-гидрохлорид, 10мМ ЭДТА) и оставляли на ночь при комнатной температуре. После преципитации ДНК, осадок растворяли в 500 мкл солевого буфера (1 М хлористый натрий, 10 мМ Трисгидрохлорид, 1 мМ ЭДТА), добавляли 1 см3 этилового спирта (96 %) и оставляли при -20 ºС на 2-3 часа. По истечении этого времени, центрифугировали образцы 10 минут при 13000 об-1, затем промывали осадок этиловым спиртом (70 %), высушивали и растворяли в 100 мкл стерильной дистиллированной воды. Экстракцию проводили согласно методике, а также в модификации, включающей дополнительную очистку проб [Doyle J.J. et al., 1987; Murray M.G. et al., 1980; Rogers S.O. et al., 1985]. Для экстракции ДНК с применением сорбентного метода использовали коммерческие наборы «Diatom mini prep 200» согласно инструкции, производимые ООО «БИОКОМ», г. Москва. ПЦР проводили по стандартным методикам с выполнением предварительной оптимизации ряда параметров, таких как температура отжига праймеров, длительность циклов отжига праймеров и элонгации, общее количество циклов, концентрация дезоксинуклеотидтрифосфатов, праймеров. Амплификацию осуществляли наборами для проведения ПЦР (Сибэнзим, г. Новосибирск, Россия) в реакционном объеме 25 мкл. Параметры ПЦР смеси: в 25 мкл смеси содержится 40-50 45 нг ДНК, 0,25 мкM dNTPs (дезоксинуклеотидтрифосфат), 0,2 мM каждого праймера; 2,5 мкл 10-кратного реакционного буфера, 2,5 мM MgCl2, 1 единица Taq-полимеразы. ПЦР-программу проводили по следующим схемам: 1. Идентификация гена Vf: 3 минуты при 94 ºС – начальная денатурация, далее 35 циклов: 1 минута денатурация при 94 ºС, 1 минута отжиг праймеров при 56 ºС, 1 минута синтез при 72 ºС; последний цикл синтеза 5 минут при 72 ºС (концентрация dNTPs – 0,1 мкM, каждого праймера – 0,3 мкM). 2. Идентификация гена Vm: 3 минуты при 94 ºС – начальная денатурация, далее 35 циклов: 1 минута денатурация при 94 ºС, 1 минута отжиг праймеров при 58 ºС, 1 минута синтез при 72 ºС; последний цикл синтеза 5 минут при 72 ºС (концентрация dNTPs – 0,1 мкM, каждого праймера – 0,3 мкM). 3. Идентификация аллелей S-гена: 5 минут при 94 ºС – начальная денатурация, далее 35 циклов: 30 секунд денатурация при 94 ºС, 40 секунд отжиг праймеров при 60 ºС, 30 секунд синтез при 72 ºС; последний цикл синтеза 5 минут при 72 ºС (концентрация dNTPs – 0,1 мкM, каждого праймера – 0,3 мкM). 4. Амплификация с SSR-маркерами: 5 минут при 94 ºС – начальная денатурация, далее 30-33 цикла в зависимости от маркера: 30 секунд денатурация при 94 ºС, 30 секунд отжиг праймеров при 60 ºС (температуру отжига праймеров подбирали индивидуально для праймерных комбинаций), 30 секунд синтез при 72 ºС; последний цикл синтеза 3 минуты при 72 ºС (концентрация dNTPs – 0,1 мкM, каждого праймера – 0,3 мкM). ДНК-амплификацию проводили в амплификаторе Терцик производства НПО ДНК-технологии (Россия) и Eppendorf Mastercycler gradient (Германия). Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР, полученных с ДНК-маркером гена Vf использовали 8%-ный акриламидный гель, а также 2%-ный агарозный гель на основе 0,5-кратного Трис-боратного буфера (0,045 M Трис, 0,045 M Борной кислоты, 1 мM ЭДТА, рН=8,2). Для анализа полиморфизма маркера гена Vm и при микросателлитном анализе использовали 8%-ный полиакриламидный гель на основе 1-кратного Трис-боратного буфера 46 (0,09 M Трис, 0,09 M Борной кислоты, 2 мM ЭДТА, рН=8,2). Полимеризацию геля проводили при комнатной температуре в течение 1 часа. В качестве катализаторов полимеризации использовали ТЕМЕД и аммония персульфат, из расчета 40 мкл ТЕМЕДа (100% раствор) и 350 мкл аммония персульфата 10%-ного на 40 см3 раствора геля. Электрофорез проходил при напряжении 120 V в течение 30 минут в камерах для горизонтального электрофореза SE-2 и SE-3, а также при напряжении 220 V в течение 240 минут в камерах для вертикального электрофореза VE-3 фирмы Хеликон (Москва). После окончания полимеризации лунки геля промывали электродным буфером (1-кратный Трис-боратный буфер) и проводили предварительный электрофорез без внесенных образцов, для удаления из геля остатков катализаторов и незаполимеризовавшегося акриламида, при напряжении 150 V, в течение 1 часа. Для электрофореза использовали 12 мкл реакционной смеси, которую смешивали с 1 мкл неденатурирующего буфера нанесения (40 % сахароза, 0,025 % бромфеноловый синий, 0,025 % ксилен цианол) и наносили в лунки геля под слой электродного буфера. После проведения электрофореза гелевые пластины помещали на 20 минут в раствор бромистого этидия (5 мкг/см3), и фотографировали в УФ-спектре. Для предварительной проверки концентрации ДНК в выделенных пробах использовали метод разведений полученных препаратов с последующим их электрофорезом в 2%-ном агарозном геле, содержащем 1 мкг/см3 бромистого этидия и визуализацией в УФ-спектре. При этом исходили из того, что порог чувствительности бромистого этидия в агарозных гелях составляет 10 нг ДНК [Остерман Л.А., 1981]. При постановке ПЦР на одну реакцию оптимальным было определено количество ДНК 40-50 нг. Размер аллелей определяли путем сравнения со стандартным образцом – pBR322/BsuR I (Хеликон, Россия). Фрагментный анализ SSR-маркеров проводили на автоматическом генетическом анализаторе-секвенаторе ABI Prism 3110. 47 2.4 Статистическая обработка данных При оценке результатов микросателлитного анализа матрица генетических дистанций была построена с использованием коэффициентов (индексов) подобия по M. Nei и W. Li (1979) [Nei M. et al., 1979]. Кластерный анализ выполнен методом попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (UPGMA) и методом ближайших соседей (NJ), с использованием FreeTree Application 0.9.1.50 (ZDAT v.o.s.). Графическое построение дендрограммы проведено в программе TreeView (Win32) 1.6.6. Фактическая (Ho) и ожидаемая (He) гетерозиготность, эффективное число аллелей (Na) рассчитаны в соответствии с Martines et al. (2006) с использованием программы GenAlEx 6.3 [Martinez L.E. et al., 2006]. Количество выявленных аллелей (Na) по изученным SSR-локусам характеризует количество аллелей, идентифицированное по конкретному SSRлокусу в изученной выборке генотипов. Функцией от доли полиморфных локусов, числа аллелей на локус и выравненности частот аллелей является эффективное число аллелей (Ne) и, таким образом, оно является мерой генетического разнообразия. Эффективное число аллелей оценивает величину, обратную гомозиготности, и представляет собой такое число аллелей, при одинаковой частоте которых гетерозиготность будет равна фактической. Отношение фактической гетерозиготности (Ho) к ожидаемой (He) характеризует уровень генетической полиморфности данных локусов внутри изученной группы сортов. 48 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3. 1 Апробация методов экстракции ДНК В связи с высоким содержанием загрязнителей (полисахариды и полифенольные соединения) в тканях яблони на начальном этапе работы была выполнена апробация различных методов экстракции ДНК с поиском оптимальных, требующих минимальных временных и финансовых затрат. В качестве исходных тканей для проведения экстракции ДНК яблони использовали нераскрывшиеся почки, кору 1-2 летних побегов, лист на различных этапах вегетационного развития, высушенный лист. Во время проведения экстракции на первом этапе для гомогенизации использовали растирание образцов в жидком азоте, с последующим внесением измельченной ткани в пробирку с экстрагирующим буфером, а также измельчение непосредственно в пробирке с буфером. В ходе работы не выявили различий по количеству экстрагируемой ДНК при использовании разных способов измельчения ткани. В дальнейшем использовали измельчение в буфере без использования жидкого азота и следующие методы экстракции ДНК: 1. Метод ЦТАБ, основанный на использовании цетилтриметиламмоний бромида в качестве основного детергента, входящего в состав лизирующего буфера. При усовершенствовании данного метода экстракции ДНК в качестве базовых использовали варианты ЦТАБ-метода [Murray M.G. et al., 1980; Doyle J.J. et al., 1987; Rogers S.O. et al., 1985]. Применяли экстрагирующий буфер следующего состава: ЦТАБ (2 %), 1,4 М хлористого натрия, 0,1 М Трисгидрохлорид, 20 мМ ЭДТА. В качестве модификации внесли дополнительные этапы очистки проб ДНК яблони. Для этого, после этапа вторичной депротеинизации (базовый метод), проводили преципитацию проб в буфере преципитации (1 % ЦТАБ, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА). После 49 преципитации ДНК, осадок растворяли в 500 мкл солевого буфера (1 М NaCl, 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА) и вносили 1 см3 этилового спирта (96 %) для осаждения ДНК при -20 °С. Переосаждение ДНК с предварительным растворением преципитатов в солевом буфере существенно повысило чистоту проб за счет освобождения от полисахаридных и белковых фракций. Дополнительная очистка была введена в соответствии с S.O. Rogers et al. (1985 г.), однако нами, для упрощения методики, был исключен этап переосаждения с ацетатом аммония. Также в состав экстрагирующего буфера вводили дополнительный компонент – поливинилпирролидон (PVP) в концентрации 1 % для очистки проб от полифенольных соединений. 2. Сорбентный метод экстракции, основанный на адгезии нитей ДНК к частицам сорбента (SiO2, диатомит) в буфере с высокой концентрацией солей. Использование сорбентного метода показало его эффективность только для стадии «молодого листа». Эктракцию ДНК данным методом проводили согласно протоколу производителя набором для экстракции «Diatom mini prep 200» (ООО «Биоком», г. Москва). В таблице 4 отображена эффективность экстракции ДНК из растительной ткани яблони на различных этапах вегетации с использованием перечисленных методов. Таблица 4 - Эффективность различных медов экстракции ДНК на различных этапах вегетации яблони Тип ткани ЦТАБ яблони [102] Метод экстракции ЦТАБ+PVP+2 ЦТАБ+2 доп. этапа доп. этапа очистки проб ДНК очистки проб ДНК -33 + + 48 62 Diat. Кора Почки Молодой + + лист +/+ Лист + Старый +/+ лист Примечания: 1. Diat. – сорбентный метод экстракции – набор «Diatom mini prep 200» 50 Результаты исследований показали, что наиболее эффективным для экстракции ДНК является использование листовых тканей в фазу распускания почек и начального этапа роста листовой пластинки. Данный факт является известным. В тоже время, модификация с PVP (1 %) в экстрагирующем буфере и двумя этапами очистки/переосаждения показала эффективность и для экстракции ДНК из листовой пластины на поздних стадиях вегетации. Это позволило получить пробы ДНК, пригодные для проведения ПЦР из листьев, гербаризованных на поздних этапах вегетации (за 1-2 недели до начала листопада и во время него), хотя в данном случае концентрация ДНК в получаемых препаратах была существенно ниже [Супрун И.И. и др., 2010]. Для предварительной проверки концентрации ДНК в выделенных пробах использовали метод разведений полученных препаратов с последующим их электрофорезом в 2%-ном агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия и визуализацией в ультрафиолете. При этом исходили из того, что порог чувствительности бромистого этидия в агарозных гелях составляет 10 нг ДНК [Aharon A. et al., 2001]. Для проверки количества экстрагированной ДНК при электрофорезе в лунки геля вносили пробы равного объема. По интенсивности свечения электрофоретического спектра ДНК определяли ее относительную концентрацию (рисунок 1). 1 2 3 4 5 6 7 8 Рисунок 1 – Электрофорез проб ДНК, экстрагированных методом ЦТАБ на разных этапах вегетационного развития листа (целевой спектр отмечен стрелкой), где 1 – 3 – молодой лист (использовали различное количество растительной ткани для экстракции: 1; 2; 3 ≈ 1,5; 1; 0,75 см2 листа); 4 – 7 – полностью сформировавшийся лист (≈1,5 см2 листа); 8 – старый лист (≈1,5 см2 листа) 51 Как видно из рисунка 1, наилучшие условия экстракции ДНК обеспечиваются из молодых листьев яблони. Модифицированный ЦТАБ-метод был апробирован как при использовании свежей ткани листа, так и для листьев яблони, гербаризованных на разных этапах вегетации. Во всех случаях его применение позволяло экстрагировать пробы ДНК со степенью чистоты, достаточной для проведения ПЦР, следовательно, данная модификация метода ЦТАБ была признана эффективной и универсальной и использовалась в работе. 3.2 Идентификация генов Vf и Vm у отечественных сортов и селекционных форм яблони В связи с актуальностью вопроса создания иммунных к парше сортов яблони, а также наличием информации об имеющихся ДНК-маркерах к гену устойчивости Vf, комплекс исследований, направленных на внедрение технологии ДНК-маркирования в селекцию яблони, включал в себя несколько последовательных этапов. Для апробации ДНК-маркера гена устойчивости яблони к парше Vf использовали ДНК сорта Прима селекции США – общеизвестного донора указанного гена. При постановке ПЦР и дальнейшем проведении электрофоретического анализа у данного сорта выявили ПЦР продукт, соответствующий доминантному аллелю гена, что позволило использовать его как положительный стандарт наличия гена Vf. Также на начальном этапе эксперимента в качестве сортов-стандартов были взяты сорта Василиса, Солнышко, Рассвет, обладающие геном Vf иммунитета к парше по данным фитопатологического тестирования. Апробация ДНК-маркера гена Vf при различных температурах отжига праймеров показала, что при повышении температуры отжига до 60 ºС амплификация не наблюдалась. На этапе оптимизации параметров ПЦР для ДНК-маркера гена Vf оптимальной была определена температура отжига 56 ºС при следующей схеме протекания реакции: 3 минуты при 94 ºС – начальная 52 денатурация, следующих 35 циклов: 1 минута денатурация при 94 ºС, 1 минута отжиг праймеров при 56 ºС, 1 минута синтез при 72 ºС; последний цикл синтеза 5 минут при 72ºС. Оптимальной концентрацией дезоксинуклеотидтрифосфатов в ПЦР-смеси определили концентарцию 0,2 мкM, в дальнейшем концентрация дезоксинуклеотидтрифосфатов была снижена до 0,1 мкM без ухудшения синтеза целевых продуктов. Оптимальной концентрацией для праймеров была определена концентрация 0,3 мкM. ДНК вносили в количестве по 40-50 нг в реакцию [Супрун И.И. и др., 2010]. Использование для ДНК-анализа оптимального метода экстракции ДНК, а также параметров ПЦР, позволивших получать максимальный синтез целевых участков, дало возможность четко идентифицировать аллели гена устойчивости яблони к парше Vf. На рисунке 2, приведены результаты ДНК-анализа ряда сортов и элитных форм яблони, на заключительном этапе апробации ДНК-маркера. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 МВ Рисунок 2 – Электрофоретический анализ ПЦР продуктов ДНК маркера гена Vf у отечественных сортов и элитных форм яблони, где 1-3 – элитные формы яблони: 1 – 12/2-21-4, 2 – 12/2-20-1, 3 – 12/1-21-68; 4-9 – сорта яблони: 4 – Василиса, 5 – Первинка, 6 – Солнышко, 7 – Рассвет, 8 – Орловский пионер, 9 – Прима, МВ – маркер молекулярного веса ДНК 53 Как видно из рисунка 2, у образцов 1, 3, 4, 6, 7, 9 синтезируется продукт специфичный только для них (отмечен стрелкой). Данный продукт с молекулярной массой 286 п. н. синтезируется с участка доминантного аллеля гена Vf. В данном случае сортом-стандартом наличия гена Vf являлся сорт Прима, который в настоящее время наиболее часто используется как сортдонор этого гена в селекционных программах яблони. Образцы 1, 3, 4, 6, 7, как и стандарт, имеют указанный ПЦР-фрагмент. Это свидетельствует о наличии у них доминантного аллеля искомого гена, причем у сортов Василиса, Солнышко, Рассвет наличие гена Vf было подтверждено проводимыми ранее фитопатологическими исследованиями [Супрун И.И. и др., 2010]. С использованием оптимизированных экспериментальных параметров ПЦР был проведен ДНК-анализ ряда сортов и форм яблони (рисунок 3, 4). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 МВ Рисунок 3 – Электрофоретический анализ ПЦР продуктов ДНК маркера гена Vf сортов и элитных форм яблони, где 1 – Ренет Симиренко (стандарт Vf-); 2 – 12/1-21-33; 3 – 12/1-21-62; 4 – Айдаред; 5 – 12/1-21-43; 6 – 12/3-21-9; 7 – Ред Делишес; 8 – Голд Раш; 9 – Прима стандарт Vf+); МВ – маркер молекулярного веса ДНК Как видно из рисунка 3 специфический ПЦР-фрагмент (уровень отмечен стрелкой), подтверждающий наличие гена Vf, обнаружен у 4 элитных форм яблони: 12/1-21-33, 12/1-21-62, 12/1-21-43, 12/3-21-9, а также сорта Голд Раш. 54 В процессе работы электрофоретического были разделения оптимизацированы такие продуктов как ПЦР параметры напряжение электрического поля и время электрофореза. Изначально использовали полиакриламидный гель в концентрации 8 %, который в дальнейшем был заменен на 2 %-ный агарозный, оказавшийся более удобным в применении, причем оптимальным было определено напряжение электрического поля 5 V/см при времени проведения электрофореза 30 минут. На рисунке 4 представлен пример электрофоретического разделения продуктов ПЦР в 2 %-ном агарозном геле. Рисунок 4 – Электрофоретический анализ ПЦР продуктов ДНК маркера гена Vf у сортов и селекционных форм яблони в 2 % агарозном геле, где МВ – маркер молекулярной массы ДНК; 1, 10 – сорт-стандарт Прима; 2– Зефир; 3 – Юбилей Москвы; 4 – Ноктюрн; 5 – Фея; 6 – 44-29-61-СЗ; 7 – 44-27-74-В; 8 – 44-29-9-С; 9 – 44-29-39-В; 11 – 44-27-38-В; 12 – 44-29-30-З; 13 – 44-25-71-СЗ; 14 – 44-27-29-В; 15 – 44-24-38-С; 16 – К-90; 17 – 44-24-49-Ю; 18 – 44-27-38-В Результаты электрофореграммы, изображенной на рисунке 4 (стрелкой отмечен целевой фрагмент), подтверждают перспективность использования 2 % агарозного геля для электрофоретического разделения продуктов ПЦР. 55 С применением оптимизированных параметров ПЦР и электрофореза был проведен массовый скрининг селекционного материала яблони, обладающего комплексом ценных агробиологических признаков [Супрун И.И. и др., 2011]. В таблице 5 показаны результаты идентификации гена Vf у сортов и элитных форм яблони отечественной селекции. Таблица 5 – Сорта и элитные формы яблони селекции СКЗНИИСиВ совместно с ВНИИСПК с идентифицированным геном Vf иммунитета к парше Сорта и элитные формы яблони Родительская форма с геном Vf 1) Василиса, Екатеринодарское, Кармен, Любава, Прима Ноктюрн, Тайна, Юнона, 12/1-21-33, 12/1-21-80, 12/2-20-20, 12/3-20-16, 12/2-20-27, 12/2-21-2, 12/3-20-17, 28-41-44, 12/3-20-15, 28-42-32, 44-24-49-Ю, 44-27-52-СЗ, 44-27-60-С, 44-27-74-В, 44-27-75-З, 44-29-9-С, К-90 2) Зефир, Красный Янтарь, Рассвет, 28-36-43, Редфри 28-38-52, 44-24-36-Ю, 44-24-38-С, 44-24-39-Ю, 44-29-30-З, 44-29-39-В, 44-29-61-СЗ 3) Солнышко, Юбилей Москвы,12/1-21-62, 12/1-21-68, 12/2-20-38, 12/2-21-10 M. floribunda Sieb. 821 4) 12/1-21-13, 12/1-21-16, 12/1-21-26, 12/1-21-43, 12/1-21-48, 12/2-20-50, 12/2-20-53, 12/2-21-4, 12/2-21-33, 12/2-21-70, 12/3-20-31, 12/3-21-6, Балсгард 0247 Е 12/3-21-9, 12/3-21-28, 12/3-21-32 Ред спур 5) 12/2-20-1 Форма 2034 6) 29-5-44 56 Для указанных сортов и селекционных форм яблони ранее было проведено фитопатологическое тестирование на искусственном инфекционном фоне во ВНИИСПК г. Орел, в ходе которого была выявлена их высокая степень устойчивости к патогену, что свидетельствует о наличии у них гена Vf. Таким образом, полученные результаты молекулярно-генетического анализа по идентификации гена Vf подтверждают данные фитопатологической оценки и имеющиеся сведения о происхождении изученных сортов и селекционных форм яблони и свидетельствуют об эффективности выбранного метода. На следующем этапе работы проводилась апробация ДНК-маркера к гену Vm с оптимизацией параметров ПЦР и электрофореза. В качестве стандартной была взята ДНК сорта яблони Прима, что связано с наличием информации о размере ПЦР-продукта по данному маркеру в литературных источниках. Из основных параметров следует отметить температуру отжига праймерной пары. В ходе экспериментальной работы была определена температура отжига дезоксинуклеотидтрифосфатов 58 °С. в Оптимальной ПЦР-смеси концентрацией определили концентрацию 0,1 мкM; концентрация для праймеров – 0,3 мкM. ДНК вносили в количестве по 40-50 нг в реакцию [Супрун И.И. и др., 2009]. При проведении анализа образцов яблони на предмет наличия доминантного аллеля гена Vm в качестве стандарта наличия гена использовали сорт Орловский пионер, селекции ВНИИСПК (г. Орел). При постановке ПЦР и дальнейшем проведении электрофоретического анализа у данного сорта выявлялся ПЦР продукт размером порядка 230 п. н. – отмечен стрелкой (рисунок 5), что соответствует литературным данным о размере ПЦР продукта в случае наличия доминантного аллеля гена [Седов Е.Н. и др., 2006]. На рисунке 5 представлено электрофоретическое разделение продуктов ПЦР у сортов и элитных селекционных форм яблони отечественной селекции. Из рисунка видно, что специфический ПЦР-фрагмент в 230 п. н., соответствующий доминантному аллелю гена Vm, обнаружен у 6 элитных форм яблони: 31-34-40, 29-7-101, 31-31-128, 27-2-276, 27-2-222, 27-2-218. 57 МВ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Рисунок 5 – Электрофоретический анализ ПЦР продуктов ДНК маркера гена Vm у сортов и элитных селекционных форм яблони, где МВ – маркер молекулярной массы ДНК; 1 – сорт-стандарт Орловский пионер; 2 – 31-34-40; 3 – Юбилей Москвы; 4 – Ноктюрн; 5 – Фея; 6 – 29-7-101; 7 – 31-31-128; 8 – 44-29-9-С; 9 – 27-2-276; 10 – 27-2-222; 11 – 27-2-218; 12 – 44-29-30-З; 13 – 44-25-71-СЗ; 14 – 44-27-29-В; 15 – 44-27-32-СЗ В ходе выполнения анализа биоматериала ряда сортов и форм яблони селекции ВНИИСПК ген Vm был идентифицирован у сорта Первинка и следующих элитных форм: 31-34-40, 31-31-128, 27-2-276, 27-2-222, 29-7-101, 27-2-218 [Супрун И.И. и др., 2010]. Результаты работы позволяют говорить об информативности использования выбранного ДНК-маркера для идентификации гена Vm. Полученные экспериментальные данные подтверждают дальнейших исследований, направленных на перспективность идентификацию генов устойчивости к парше Vf и Vm в селекционном материале яблони, в том числе и в образцах, несущих одновременно два гена устойчивости. 58 3.3 Совершенствование ДНК-маркерной идентификации гена Vf иммунитета яблони к парше При использовании известного на сегодняшний день ДНК-маркера VfC к гену Vf, созданного на основе данных о его нуклеотидной последовательности, наряду с аллель-специфичным фрагментом размером 286 п. н., синтезируется два неспецифических фрагмента размером 484 и 646 п. н. у образцов как с доминантным, так и с рецессивным аллелем гена Vf [Урбанович О.Ю. и др., 2009; Afunian M.R. et al., 2004]. Несмотря на то, что наличие указанных неспецифических фрагментов не препятствует достоверной идентификации доминантного аллеля, это может снижать эффективность одновременной идентификации данного гена в сочетании с генами других хозяйственноценных признаков при проведении мультиплексной ПЦР. Так, к примеру, доминантный аллель гена устойчивости к мучнистой росе Pl-1 характеризуется ДНК-маркером OPAT20-450 с размером амплифицируемого фрагмента 450 п. н. [Markussen T. et al., 1995]. Для гена устойчивости к данному заболеванию яблони – Pl-2 известен ДНК-маркер с размером фрагмента, специфичного для доминантного аллеля в 269 п. н. Для гена Pl-w создан ДНК-маркер с целевым фрагментом, размером 250 п. н. [Evans K.M. at al., 2003]. Для повышения перспективности и эффективности возможного применения мультиплексной ПЦР для одновременной идентификации гена Vf с указанными генами устойчивости к мучнистой росе, задачей данного исследования являлось создание ДНК-маркера к гену Vf, позволяющему получать единичный ПЦР продукт для доминантного аллеля и отсутствие такового для рецессивного. После выравнивания нуклеотидных последовательностей аллелей Vfa1 (HcrVf1), Vfa2 (HcrVf2) и Vfa4 (HcrVf3) (номера в базе данных NCBI AJ297739, AJ297740 и AJ297741) в программе ClustalW (www.ebi.ac.uk./clustalw/.), провели их сравнение с учетом того, что Vfа4 является доминантным аллелем 59 гена устойчивости яблони к парше Vf и определили полиморфный участок для создания нового ДНК-маркера [Afunian M.R. et al., 2004]. Учитывая все перечисленные условия, были подобраны подходящие участки, на которые можно производить отжиг праймеров. Они изображены на рисунке 6. На представленном рисунке жирным шрифтом обозначены позиции праймеров ДНК-маркера, известного из литературных источников и использованного нами в работе: F-прямой и R-обратный праймер. Выделен жирным шрифтом, курсивом и подчеркнут участок последовательности Vfа4, отобранный в качестве целевого для создания нового ДНК-маркера. Участок последовательности Vfа4, на который был создан дополнительный обратный праймер, имеет, достаточный уровень отличия от последовательностей Vfа1 и Vfа2. Новое сочетание праймеров F+R1 дает возможность синтезировать продукт ПЦР размером около 140 п. н. только с последовательности Vfа4. F Vfа2 Vfа4 Vfа1 CTTAAAAATCTAGTTTCTCTTCATCTCAGTTTTTGTGGTTTCCAAAGTCCAATTCCTAGC 908 CTTAAAAATCTAGTTTCTATTCATCTCAGTGATTGTGGTTTCCAAGGTCCAATTCCTAGC 916 CTTAAAAATCTAGTTTCTCTTCATCTCAGGTTTTGTGGTTTCCAAGGTCCAATTCCTAGC 1194 ****************** ********** ************* ************** ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… Vfа2 CAACTTACAGGACAACTTCCAAGAAGTATTCAGAATATGACTGGTCTTACAACTCTTAAT 1088 Vfа4 ------------------------------------ATG--TGGTC-------------- 1019 Vfа1 CAACTTACAGGACAACTTCCAAGCAGTTTTCAAAATATGACTGGTCTTAAAGTTCTTAAT 1374 *** ***** R1 Vfа2 Vfа4 Vfа1 CTCGGGGGGAACGAATTCAATTCTACCATACCTGAATGGTTGTATAGCTTGAACAATCTC 1148 --CAGATGGAATAAAGTCA--------------------TTGT----------------- 1040 CTTGAGAGTAACTACTTCAATTCTACCATACCTAAATGGTTGTATGGCTTGAACAATCTC 1434 * ** * *** **** …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… Vfа2 AGCTTAGAAAAATTGTACATATCTGAAAATCATTTTAATGGAACTTTCACAGAAGTTATT 1346 Vfа4 AGCTTAGAAAAATTGGACATATCTGTAAATCAATTTAATGGAACTTTCACAGAAGTTATT 1156 Vfа1 AGCTTAGAAAAATTGGACATATCTGGAAATCATTTTAATGGAACTTTCACAGAAGTTATT 1794 *************** ********* ****** *************************** R Vfа2 Vfа4 Vfа1 GGTCAACTCAAAATGCTAACGGATTTGGATATATCTTATAATTCGTTAGAAGGTGTGGTG 1406 GGTCAACTCAAAATGCTAACGTATTTGGATATATCTTATAATTCGTTAGAAAGTGCAATG 1216 GGTCAACTCAAAATGCTAACGGATTTGGATATATCTTATAATTGGTTTGAAGGTGTGGTG 1854 *************** ********* ****** *************************** Рисунок 6 – Позиции праймеров на последовательностях доминантного аллеля гена Vf – Vfа4 и его гомологов – Vfа1 и Vfа2. 60 Нуклеотидная последовательность созданного дополнительного обратного праймера ДНК-маркера гена Vf: 5` TGACTTTATTCCATCTG 3`. В ходе экспериментальной проверки выявили синтез продукта, специфичного для доминантного аллеля ПЦР размером около 140 п. н., однако помимо этого синтезировался продукт размером около 510 п. н., который не препятствует идентификации доминантного аллеля (рисунок 7). 500 п.н. 200 п.н. 100 п.н. МВ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Рисунок 7 – Электрофоретический анализ ПЦР продуктов нового ДНК маркера гена Vf (сочетание праймеров F+R1), где МВ – маркер молекулярной массы ДНК, 1 – сорт-стандарт Прима; 2-5, 8, 9 – образцы, несущие доминантный аллель гена; 6, 7 – образцы с рецессивным аллелем Как видно из рисунка 7, неспецифический фрагмент размером около 510 п. н. не влияет на процесс идентификации доминантного аллеля Vf-гена, следовательно, созданный ДНК-маркер может применяться для мультиплексной ПЦР при одновременной идентификации гена Vf с генами устойчивости яблони к мучнистой росе. Это обусловлено тем, что размеры продуктов ПЦР основных наиболее часто применяемых маркеров к генам Pl-1, Pl-2 Pl-w значительно отличаются от размера ПЦР-фрагмента разработанного праймера, специфичного для доминантного аллеля гена Vf размером около 140 п. н. (таблица 6). 61 Таблица 6 – Названия праймеров основных генов устойчивости яблони к парше и мучнистой росе с соответствующими размерами ПЦР-фрагментов Название Ген яблони Размер ПЦР-продукта, праймера VfC п. н. Vf-ген 286 (Rvi6) устойчивости к парше 646 (неспецифический фрагмент) 484 (неспецифический фрагмент) Созданный Vf-ген 140 ДНК-маркер (Rvi6) устойчивости к парше 510 (неспецифический фрагмент) OPAT20450 Pl-1-ген устойчивости к 450 мучнистой росе OPU02SCAR Pl-2-ген устойчивости к 269 мучнистой росе EM M02 Pl-w-ген устойчивости к 250 мучнистой росе Согласно таблице 6, ПЦР-продукт разработанного маркера размером около 510 п. н. никак не отражается на достоверности идентификации Vf-гена. Тем не менее, существует вероятность того, что данный фрагмент может снижать эффективнсть использования разработанного ДНК-маркера в мультиплексной идентификации. Таким образом, данное исследование должно быть продолжено по следующим направлениям: – в связи с тем, что неспецифический продукт 510 п. н. не перекрывает по размеру фрагменты амплификации маркеров Pl-1, Pl-2, Pl-w, провести апробацию мультиплексных комбинаций данного маркера в сочетании с маркерами генов устойчивости яблони к мучнистой росе; 62 – с учетом полученных экспериментальных данных продолжить разработку нового ДНК-маркера к гену Vf с размером единичного целевого фрагмента 140-170 п. н., без синтеза неспецифически амплифицированных фрагментов. 3.4 Молекулярно-генетическая идентификация аллелей гена самонесовместимости в сортах яблони Для изучения аллельного полиморфизма гена самонесовместимости яблони целевыми были выбраны аллели, наиболее распространенные в мировом генофонде яблони в соответствии с литературными данными: S2, S3, S7, S10 [Hegedûs A., 2006]. В выборку для исследования вошли перспективные и введенные в Госреестр селекционных достижений, допущенных к использованию в СевероКавказском регионе сорта яблони селекции СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК. Для апробации системы молекулярно-генетической идентификации аллелей гена самонесовместимости яблони были отобраны распространенные аллели данного гена: S2, S3, S7, S10 и исследовано 33 сорта. На начальном этапе работы для ДНК-маркеров к изучаемым аллелям гена самонесовместимости подобрали оптимальные температурно-временные параметры полимеразной цепной реакции: 5 минут при 94 ºС – начальная денатурация; следующие 35 циклов: 30 секунд денатурация при 94 ºС, 40 секунд отжиг праймеров при 60 ºС, 30 секунд синтез при 72 ºС. Последний цикл синтеза 5 минут при 72 ºС [Супрун И.И. и др., 2010]. Оптимальной концентрацией дезоксинуклеотидтрифосфатов и праймеров были определены концентрации 0,1 мкM и 0,3 мкM соответственно. Следует отметить, что первоначально использовали концентрацию дезоксинуклеотидтрифосфатов 0,3 мкM, однако, снижение концентрации данного компонента реакционной смеси позволило снизить синтез «нецелевых» фрагментов, без ухудшения синтеза 63 фрагментов ПЦР, с областей, фланкируемых ДНК-маркерами целевых аллелей гена самонесовместимости. Это повысило эффективность ПЦР-идентификации искомых аллелей. В ходе анализа полиморфизма локуса S-гена стандартами послужили сорта иностранной селекции с известным из литературных данных аллельным набором S-локуса: Голден Делишес – S2, S3; Гала – S5; Айдаред – S7; Мекинтош – S10 [Супрун И.И. и др., 2010]. На рисунках 8-10 продемонстрированы примеры электрофоретического разделения продуктов ПЦР с ДНК-маркерами к аллелям гена самонесовместимости, изученными в ходе выполнения исследований. На всех представленных электрофореграммах стрелками указан размер фрагментов маркера молекулярного веса ДНК, наиболее близких по размеру к целевым продуктам ПЦР у каждого из аллелей. 500 п.н. 400 п.н. МВ К 1 2 3 4 5 6 7 8 МВ К 9 10 11 12 13 14 Рисунок 8 – Электрофореграмма ДНК-идентификации аллеля S2 (450 п. н.), где МВ-маркер молекулярного веса ДНК («шаг» маркера 100 п. н.); К – положительный контроль (сорт Голден Делишес - стандарт «+» по аллелям S2; S3). 1-15 сорта яблони: 1 – Корей, 2 – Орловское Полесье, 3 – Старт, 4 – Имрус, 5 – Юбиляр, 6 – Свежесть, 7 – Строевское, 8 – Первинка, 9 – Славянин, 10 – Орловский Пионер, 11 – Болотовское, 12 – Ноктюрн, 13 – Василиса, 14 – Любава 64 500 п.н. МВ К 1 2 3 4 5 6 7 8 МВ К 9 10 11 12 13 14 Рисунок 9 – Электрофореграмма ДНК-идентификации аллеля S3 (500 п. н.), где МВ – маркер молекулярного веса ДНК («шаг» маркера 100 п. н.); К – положительный контроль (сорт Голден Делишес – стандарт «+» по аллелям S2; S3). 1-15 сорта яблони: 1 – Красный янтарь, 2 – Орловское Полесье, 3 – Старт, 4 – Кармен, 5 – Юбиляр, 6 – Свежесть, 7 – Строевское, 8 – Первинка, 9 – Славянин, 10 – Орловский Пионер, 11 – Болотовское, 12 – Имрус, 13 – Любава, 14 – Тайна 200 п.н. МВ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 МВ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Рисунок 10 – Электрофореграмма ДНК-идентификации аллеля S10 (209 п. н.), где МВ-маркер молекулярного веса ДНК («шаг» маркера 100 п. н.); 1, 10 – сорт Мекинтош (стандарт «+» по аллелю S10); 2-9,11-18 – сорта российской селекции: 2 – Красный янтарь, 3 – Золотое летнее, 4 – Кармен, 5 – Талида, 6 – Родничок, 7 – Тайна, 8 – Талисман, 9 – Зефир, 11 – Екатеринодарское, 12 – Юбилей Москвы, 13 – Ноктюрн, 14 – Фея, 15 – Дин Арт, 16 – Рассвет, 17 – Зимнее утро, 18 – Юбилей Москвы 65 Из результатов исследований видно, что у сортов яблони Строевское, Болотовское, Ноктюрн (рис. 8); Старт, Свежесть, Имрус, Тайна (рис. 9); Золотое летнее, Талида, Родничок, Талисман, Екатеринодарское, Юбилей Москвы (рис. 10) присутствуют ПЦР-фрагменты одного размера с соответствующими сортами-стандартами иностранной селекции (от 209 до 500 п. н.). Это свидетельствует о наличии у перечисленных сортов яблони искомых аллелей гена самонесовместимости [Супрун И.И. и др., 2011]. По результатам молекулярно-генетического анализа отечественных сортов яблони были идентифицированы целевые аллели гена самонесовместимости, представленные в таблице 7. Таблица 7 – Идентифицированные аллели S-гена в отечественных сортах яблони Сорт яблони Идентифицированные аллели гена самонесовместимости яблони S2 S3 S7 S10 2 3 4 5 1. Аленушкино - - - + 2. Афродита - - - + 3. Болотовское + + - - 4. Василиса - - - + 5. Дин Арт - - + - 6. Екатеринодарское - - - + 7. Зефир - - + - 8. Зимнее утро - - + - 9. Золотое летнее - + - + 10. Имрус - + - + 11. Казачка кубанская - + - + 12. Кармен + - - - 1 66 Окончание таблицы 7 1 2 3 4 5 13. Корей - - - + 14. Красный янтарь + - + - 15. Кубанское багряное - + - - 16. Любава - - - + 17. Маяк станичный + + 18. Ноктюрн + - - - 19. Орловское полесье - - + - 20. Персиковое + - - - 21. Рассвет + - + - 22. Родничок - - - + 23. Свежесть - + - - 24. Славянин - - - + 25. Солнышко - + + - 26. Союз + - + + 27. Старт - - + - 28. Строевское + + - - 29. Тайна + - - - 30. Талида + - - + 31. Фея - - - - 32. Юбилей Москвы - - + - 33. Юбиляр - - - + Примечание: + обозначает наличие аллели S-гена – обозначает отсутствие аллели S-гена Согласно таблице 7, на каждый генотип перечисленных сортов яблони приходится от одного до трех различных аллелей гена самонесовместимости. Несмотря на то, что в ходе выполнения 67 исследования проводили идентификацию только четырех аллелей из всех известных для яблони, у каждого из изученных сортов был идентифицирован как минимум один из аллелей. Для ряда сортов, таких как Болотовское (S2 S3), Золотое летнее (S3 S10), Имрус (S3 S10), Казачка кубанская (S3 S10), Красный янтарь (S2 S7), Маяк станичный (S3 S10), Рассвет (S2 S7), Солнышко (S3 S7), Строевское (S2 S3), Талида (S2 S10), а также триплоидного сорта Союз (S2 S7 S10), аллельный состав S-гена был установлен полностью [Suprun I.I. et al., 2011]. Частота встречаемости выявленных у исследованных образцов яблони аллелей S-гена показана на рисунке 11. Рисунок 11 – Частота встречаемости аллелей S-гена в изученных образцах яблони Как видно из рисунка 11, наиболее распространенным оказался аллель S10, который был обнаружен у 15 сортов яблони: Аленушкино, Афродита, Василиса, Екатеринодарское, Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, Корей, Любава, Маяк станичный, Родничок, Славянин, Союз, Талида и Юбиляр. Аллели S2, S3, S7 выявлены у 10, 9 и 10 генотипов соответственно. 68 При анализе имеющейся информации о происхождении изученных отечественных сортов яблони стало видно, что наиболее распространенными родительскими формами являются американские сорта яблони Голден Делишес, Прима и Айдаред несущие соответственно S2 S3, S2 S10 и S3 S7аллели гена самонесовместимости. Соответственно, указанные аллели широко представлены в таких сортах яблони как: Аленушкино (S10), Афродита (S10), Болотовское (S2 S3), Василиса (S10), Екатеринодарское (S10), Золотое летнее (S3 S10), Имрус (S3 S10), Казачка кубанская (S3 S10), Корей (S10), Кубанское багряное (S3), Любава (S10), Маяк станичный (S3 S10), Ноктюрн (S2), Персиковое (S2), Родничок (S2), Свежесть (S3), Славянин (S10), Строевское (S2 S3), Тайна (S2), Талида (S2 S10). Также у многих изученных сортов яблони обнаружен S7-аллель гена самонесовместимости: Дин Арт (S7), Зефир (S7), Красный янтарь (S2 S7), Орловское полесье (S7), Зимнее утро (S7), Рассвет (S2 S7), Солнышко (S3 S7), Союз (S2 S7 S10), Старт (S7), Юбилей Москвы (S7). Таким образом, данные об аллельном составе S-гена у изученных сортов яблони соответствуют имеющимся сведениям об их происхождении, подтверждая достоверность молекулярно-генетических методов. Информация об аллельном составе гена самонесовместимости у изученных сортов яблони может быть использована для подбора оптимальных комбинаций при гибридизации с целью ускорения селекционного процесса и получения максимального числа гибридных сеянцев. Наряду с этим, знание аллельного состава S-гена может позволить прогнозировать эффективность перекрестного опыления сортов и форм с различными комбинациями аллелей гена, что немаловажно в случае разработки сортовых схем садовых насаждений у плодовых культур, в том числе и яблони. Для повышения эффективности перекрестного опыления сортов яблони важно использовать в качестве родительской пары сорта, несущие различные комбинации аллелей гена самонесовместимости. С этой целью, при подборе наиболее эффективных опылителей необходимо, чтобы сорта из группируемой пары отличались как минимум по одному аллелю S-гена или, что еще более 69 предпочтительно, несли разные аллельные пары. Главное условие – отсутствие полного совпадения аллельной комбинации [Hegedûs A., 2006]. Из изученных сортов яблони отечественной селекции были определены оптимальные с точки зрения совместимости группы, представленные в таблице 8. Таблица 8 – Совместимость изученных сортов яблони при перекрестном опылении Сорт яблони 1 Аленушкино (S10) Афродита (S10) Болотовское (S2 S3) Василиса (S10) Группа совместимых сортов яблони Аллели S-гена 2 3 Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Кубанское багряное, Свежесть S3 Болотовское, Строевское S2 S3 Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Красный янтарь, Рассвет S2 S7 Солнышко S3 S7 Фея Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Кубанское багряное, Свежесть S3 Болотовское, Строевское S2 S3 Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Красный янтарь, Рассвет S2 S7 Солнышко S3 S7 Фея Аленушкино , Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Фея Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Кубанское багряное, Свежесть S3 Болотовское, Строевское S2 S3 Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Красный янтарь, Рассвет S2 S7 Солнышко S3 S7 Фея 70 Продолжение таблицы 8 3 Василиса, S10 Любава, 1 Дин Арт (S7) 2 Аленушкино, Афродита, Екатеринодарское, Корей, Родничок, Славянин, Юбиляр Болотовское, Строевское Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, Маяк станичный Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна Кубанское багряное, Свежесть Талида Фея Екатеринодарское Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна (S10) Кубанское багряное, Свежесть Болотовское, Строевское Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское полесье, Старт, Юбилей Москвы Красный янтарь, Рассвет Солнышко Фея Зефир Аленушкино, Афродита, Василиса, (S7) Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Болотовское, Строевское Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, Маяк станичный Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна Кубанское багряное, Свежесть Талида Фея Зимнее утро Аленушкино, Афродита, Василиса, (S7) Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Болотовское, Строевское Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, Маяк станичный Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна Кубанское багряное, Свежесть Талида Фея 71 S2 S3 S3 S10 S2 S3 S2 S10 S2 S3 S2 S3 S7 S2 S7 S3 S7 S10 S2S3 S3 S10 S2 S3 S2 S10 S10 S2 S3 S3 S10 S2 S3 S2 S10 - Продолжение таблицы 8 1 2 3 Золотое летнее Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 (S3 S10) полесье, Старт, Юбилей Москвы Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Красный янтарь, Рассвет S2S7 Фея Имрус Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 (S3 S10) полесье, Старт, Юбилей Москвы Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Красный янтарь, Рассвет S2S7 Фея Казачка Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 кубанская полесье, Старт, Юбилей Москвы (S3 S10) Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Красный янтарь, Рассвет S2 S7 Фея Кармен Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 (S2) Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Золотое летнее, Имрус, Казачка S3 S10 кубанская, Маяк станичный Кубанское багряное, Свежесть S3 Солнышко S3S7 Фея Корей Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 (S10) Кубанское багряное, Свежесть S3 Болотовское, Строевское S2 S3 Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Красный янтарь, Рассвет S2 S7 Солнышко S3 S7 Фея Красный янтарь Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 (S2 S7) Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Золотое летнее, Имрус, Казачка S3 S10 кубанская , Маяк станичный Кубанское багряное, Свежесть S3 Фея - 72 Продолжение таблицы 8 3 Василиса, S10 Любава, 1 Кубанское багряное (S3) 2 Аленушкино, Афродита, Екатеринодарское, Корей, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское полесье, Старт, Юбилей Москвы Союз Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна Красный янтарь, Рассвет Талида Фея Любава Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна (S10) Кубанское багряное, Свежесть Болотовское, Строевское Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское полесье, Старт, Юбилей Москвы Красный янтарь, Рассвет Солнышко Фея Маяк станичный Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское (S3 S10) полесье, Старт, Юбилей Москвы Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна Красный янтарь, Рассвет Фея Ноктюрн Аленушкино, Афродита, Василиса, (S2) Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское полесье, Старт, Юбилей Москвы Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, Маяк станичный Кубанское багряное, Свежесть Солнышко Фея Орловское Аленушкино, Афродита, Василиса, полесье Екатеринодарское, Корей, Любава, (S7) Родничок, Славянин, Юбиляр Болотовское, Строевское Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, Маяк станичный Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна Кубанское багряное, Свежесть Талида Фея 73 S7 S2 S7 S10 S2 S2S7 S2 S10 S2 S3 S2 S3 S7 S2 S7 S3 S7 S7 S2 S2 S7 S10 S7 S3 S10 S3 S3S7 S10 S2 S3 S3 S10 S2 S3 S2 S10 - 1 Персиковое (S2) Рассвет (S2 S7) Родничок (S10) Свежесть (S3) Славянин (S10) Продолжение таблицы 8 3 Василиса, S10 Любава, 2 Аленушкино, Афродита, Екатеринодарское, Корей, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское полесье, Старт, Юбилей Москвы Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, Маяк станичный Кубанское багряное, Свежесть Солнышко Фея Аленушкино, Афродита, Василиса, Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская , Маяк станичный Кубанское багряное, Свежесть Фея Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна Кубанское багряное, Свежесть Болотовское, Строевское Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское полесье, Старт, Юбилей Москвы Красный янтарь, Рассвет Солнышко Фея Аленушкино, Афродита, Василиса, Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское полесье, Старт, Юбилей Москвы Союз Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна Красный янтарь, Рассвет Талида Фея Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна Кубанское багряное, Свежесть Болотовское, Строевское Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское полесье, Старт, Юбилей Москвы Красный янтарь, Рассвет Солнышко Фея 74 S7 S3 S10 S3 S3S7 S10 S3 S10 S3 S2 S3 S2 S3 S7 S2 S7 S3 S7 S10 S7 S2 S7 S10 S2 S2S7 S2 S10 S2 S3 S2 S3 S7 S2 S7 S3 S7 - 1 Солнышко (S3 S7) Союз (S2 S7 S10) Старт (S7) Строевское (S2 S3) Тайна (S2) Талида (S2 S10) Продолжение таблицы 8 3 Василиса, S10 Любава, 2 Аленушкино, Афродита, Екатеринодарское, Корей, Родничок, Славянин, Юбиляр Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна Талида Фея Кубанское багряное, Свежесть Фея Аленушкино, Афродита, Василиса, Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Болотовское, Строевское Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, Маяк станичный Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна Кубанское багряное, Свежесть Талида Фея Аленушкино , Афродита, Василиса, Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское полесье, Старт, Юбилей Москвы Союз Фея Аленушкино, Афродита, Василиса, Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское полесье, Старт, Юбилей Москвы Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, Маяк станичный Кубанское багряное, Свежесть Солнышко Фея Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское полесье, Старт , Юбилей Москвы Кубанское багряное, Свежесть Солнышко Фея 75 S2 S2 S10 S3 S10 S2 S3 S3 S10 S2 S3 S2 S10 S10 S7 S7 S10 S10 S7 S3 S10 S3 S3S7 S7 S3 S3S7 - Окончание таблицы 8 1 2 3 Фея Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 (-) Кубанское багряное, Свежесть S3 Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт , Юбилей Москвы Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Болотовское, Строевское S2 S3 Красный янтарь, Рассвет S2 S7 Талида S2 S10 Союз S2 S7 S10 Солнышко S3 S7 Золотое летнее, Имрус, Казачка S3 S10 кубанская, Маяк станичный Юбилей Москвы Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 (S7) Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Болотовское, Строевское S2 S3 Золотое летнее, Имрус, Казачка S3 S10 кубанская, Маяк станичный Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Кубанское багряное, Свежесть S3 Талида S2 S10 Фея Юбиляр Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 (S10) Кубанское багряное, Свежесть S3 Болотовское, Строевское S2 S3 Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Красный янтарь, Рассвет S2 S7 Солнышко S3 S7 Фея Как видно из таблицы 8, наибольшим количеством совместимых при опылении сортов яблони обладает сорт Фея селекции ГНУ СКЗНИИСиВ, у которого не обнаружили ни одного из четырех искомых аллелей, а наименьшим – Союз селекции СКЗНИИСиВ совместно с ВНИИСПК, несущий 3 распространенных аллеля S-гена: S2, S7 и S10. Cреднее количество совместимых сортов по данной выборке составило около восемнадцати – это 76 такие сорта как: Аленушкино, Афродита, Василиса, Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр. Варьирование числа подходящих для перекрестного опыления сортов составило от 10 (Талида) до 24 сортов яблони (Кубанское багряное, Свежесть). Полученные данные представляют ценный исходный материал для селекции, подтверждающий эффективность и актуальность методов ДНК-маркирования. В связи с широким вовлечением в селекционный процесс сортов иностранной селекции, а также интродуцированных и культивируемых в южном регионе России, были определены оптимальные с точки зрения совместимости пары для изученных сортов яблони и наиболее распространенных иностранных доноров хозяйственно-ценных признаков с известным из литературных источников аллельным составом S-гена (таблица 9). Таблица 9 – Совместимость изученных сортов яблони при перекрестном опылении Сорт яблони Группа совместимых сортов яблони иностранной отечественной селекции селекции 1 2 Айдаред Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна (S3 S7) Аленушкино, Афродита, Василиса, Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Талида Фея Алкмене Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна (S5 S22) Кубанское багряное, Свежесть Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское полесье, Старт , Юбилей Москвы Аленушкино, Афродита, Василиса, Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Болотовское, Строевское Красный янтарь, Рассвет Талида 77 Аллели S-гена 3 S2 S10 S2 S10 S2 S3 S7 S10 S2 S3 S2 S7 S2 S10 1 Гала (S2 S5) Глостер (S4 S19) Голден Делишес (S2 S3) Голд Раш (S2 S28) Продолжение таблицы 9 2 3 Союз S2 S7 S10 Солнышко S3 S7 Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, S3 S10 Маяк станичный Фея Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, S3 S10 Маяк станичный Кубанское багряное, Свежесть S3 Солнышко S3S7 Фея Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Кубанское багряное, Свежесть S3 Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт , Юбилей Москвы Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Болотовское, Строевское S2 S3 Красный янтарь, Рассвет S2 S7 Талида S2 S10 Союз S2 S7 S10 Солнышко S3 S7 Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, S3 S10 Маяк станичный Фея Аленушкино , Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Союз S7 S10 Фея Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы 78 1 Джонаголд (S2 S3) Джонатан (S7 S9) Либерти (S3 S5 S10) Мутсу (S2 S3 S20) Присцилла (S3 S9) Продолжение таблицы 9 2 3 Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, S3 S10 Маяк станичный Кубанское багряное, Свежесть S3 Солнышко S3S7 Фея Аленушкино , Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Союз S7 S10 Фея Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Болотовское, Строевское S2 S3 Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, S3 S10 Маяк станичный Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Кубанское багряное, Свежесть S3 Талида S2 S10 Фея Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Красный янтарь, Рассвет S2 S7 Фея Аленушкино , Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Союз S7 S10 Фея Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Союз S2 S7 S10 Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Красный янтарь, Рассвет S2S7 Талида S2 S10 Фея 79 1 Редфри (S3 S7) Спартан (S9 S10) Фиеста (S3 S5) Флорина (S3 S9) Фуджи (S1 S9) Продолжение таблицы 9 2 3 Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Талида S2 S10 Фея Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Кубанское багряное, Свежесть S3 Болотовское, Строевское S2 S3 Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Красный янтарь, Рассвет S2 S7 Солнышко S3 S7 Фея Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Союз S2 S7 S10 Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Красный янтарь, Рассвет S2S7 Талида S2 S10 Фея Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Союз S2 S7 S10 Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Красный янтарь, Рассвет S2S7 Талида S2 S10 Фея Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Кубанское багряное, Свежесть S3 Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт , Юбилей Москвы Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Болотовское, Строевское S2 S3 80 1 Эльстар (S3 S5) Согласно Окончание таблицы 9 2 3 Красный янтарь, Рассвет S2 S7 Талида S2 S10 Союз S2 S7 S10 Солнышко S3 S7 Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, S3 S10 Маяк станичный Фея Аленушкино, Афродита, Василиса, S10 Екатеринодарское, Корей, Любава, Родничок, Славянин, Юбиляр Дин Арт, Зефир, Зимнее утро, Орловское S7 полесье, Старт, Юбилей Москвы Союз S2 S7 S10 Кармен, Ноктюрн, Персиковое, Тайна S2 Красный янтарь, Рассвет S2S7 Талида S2 S10 Фея таблице 9, наибольшее количество совместимых с исследованными отечественными сортами яблони селекции ГНУ СКЗНИИСиВ равно 33. Это характерно для таких сортов яблони иностранной селекции как Алкмене, Глостер и Фуджи. Наименьшее количество совместимых при опылении сортов яблони обнаружено у Айдаред (S3 S7), Либерти (S3 S5 S10) и Редфри (S3 S7) – 15, 13 и 11 соответственно. Cреднее количество совместимых сортов по данной выборке составило около двадцати – это такие сорта как: Гала (S2 S5), Голден Делишес (S2 S3), Джонатан (S7 S9), Присцилла (S3 S9), Спартак (S9 S10), Фиеста (S3 S5), Эльстар (S3 S5). Варьирование числа подходящих для перекрестного опыления сортов составило от 11 (Редфри) до 33 сортов яблони (Алкмене, Глостер, Фуджи). Данные, представленные в таблице 8 необходимы не только для рационального планирования оптимальных комбинаций при гибридизации с целью максимального количества гибридного потомства, но и разработки сортовых схем садовых насаждений для повышения эффективности опыления. 81 3.5 Исследование полиморфизма микросателлитных локусов сортов яблони отечественной селекции Одно из наиболее перспективных направлений применения микросателлитных маркеров при работе с генетическими ресурсами растений – это определение структуры коллекций и степени генетического сходства, а также идентификация и ДНК-паспортизация образцов коллекции и решение спорных вопросов авторства сортов растений. На сегодняшний день микросателлитные ДНК-маркеры являются наиболее распространенным типом ДНК-маркерных систем, используемых в данных исследованиях. Идентификация и паспортизация сортов может выполняться на основании информации об аллельных состояниях использованных маркеров у каждого отдельно взятого сорта. В связи с высокой степенью полиморфизма SSR-маркеров был использован относительно небольшой набор микросателлитных маркеров – 12, являющийся достаточным для оценки уровня полиморфизма в исследуемой выборке генотипов согласно данным, полученным в иностранных работах по изучению генетического разнообразия яблони. Немаловажными критериями при отборе микросателлитных маркеров для изучения обширного генофонда, являются уровень аллельного полиморфизма, выявляемого по каждому из локусов при анализе целевой генплазмы, и высокое «качество» амплификации, позволяющее наиболее эффективно и достоверно проводить анализ их полиморфизма. Кроме того, при первоначальном отборе маркеров учитывается уровень полиморфизма, идентифицированный у них при анализе мирового генофонда, а также позиция на генетической карте вида – наиболее оптимально использовать набор SSR-маркеров, равномерно распределенных по геному. При апробации отобранных 12 микросателлитных маркеров был оптимизирован ряд экспериментальных параметров. В результате проведенных лабораторных исследований была определена следующая схема полимеразной 82 цепной реакции: 5 минут при 94 ºС – начальная денатурация, следующих 30-33 цикла в зависимости от маркера: 30 секунд денатурация при 94 ºС, 30 секунд отжиг праймеров при 60 ºС, 30 секунд синтез при 72 ºС; последний цикл синтеза 3 минуты при 72 ºС. Температуру отжига праймеров подбирали индивидуально для праймерных комбинаций [Супрун И.И. и др, 2011]. В качестве стандарта при отработке экспериментальных параметров ПЦР использовали ДНК сорта яблони Прима и Голден Делишес в связи с наличием литературных данных о размере фрагментов по SSR-локусам, использованным в работе. Для предварительной оценки «качества» амплификации на начальном этапе использовали электрофорез в 8%-ном неденатурирующем полиакриламидном геле (рисунок 12-13). МВ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 МВ Рисунок 12 – Электрофоретический анализ аллельного полиморфизма микросателлитного локуса CH02с06, где МВ – маркер молекулярного веса ДНК; 1-17 - электрофоретические позиции продуктов ПЦР различных сортов яблони: 1 – Прима, 2 – Зефир, 3 – Екатеринодарское, 4 – Юбилей Москвы, 5 – Ноктюрн, 6 – Фея, 7 – Талида, 8 – Любава, 9 – Родничок, 10 – Тайна, 11 – Талисман, 12 – Дин Арт, 13 – Кубань, 14 – Зимнее утро, 15 – Союз, 16 – Маяк станичный, 17 – Афродита 83 1 2 3 4 5 6 7 8 МВ Рисунок 13 – Электрофоретический анализ аллельного полиморфизма микросателлитного локуса CH01F03b, где МВ – маркер молекулярного веса ДНК; 1-7 - электрофоретические позиции продуктов ПЦР различных сортов яблони; 8 – сорт Прима В ходе апробации SSR-маркеров выявили, что для некоторых маркеров при указанных выше параметрах ПЦР, наблюдался более высокий уровень синтеза целевых фрагментов по отношению к другим маркерам. Примером могут служить SSR-маркеры CH02с06 и CH01F03b – рисунки 12 и 13 соответственно. Очевиден более высокий уровень синтеза целевых продуктов по маркеру CH02с06 в сравнении с маркером CH01F03b, который характеризуется оптимальным уровнем синтеза целевых фрагментов. Однако, данное обстоятельство интерпретации в дальнейшем результатов не фрагментного создавало анализа на затруднений при автоматическом генетическом анализаторе ABI Prism 3130 как по указанным, так и по остальным SSR-маркерам. Следует отметить, что сорта-триплоиды Родничок, Союз, Зефир использовали на этапе апробации маркеров. В выборку сортов для SSR-генотипирования, в дальнейшем были включены сорта только с диплоидным геномом. Микросателлитные ДНК-маркеры были сгруппированы в мультиплексные наборы (3-4 маркера в наборе) для одновременного анализа по нескольким локусам. При этом диапазон размеров амплифицируемых 84 фрагментов SSR-маркеров не перекрывался, что необходимо для их эффективной идентификации. При этом для каждого из маркеров применяли разные флуоресцентные красители (FAM, TAMRA, R6G, ROX). В результате выполнения фрагментного анализа на автоматическом генетическом анализаторе/секвенаторе ABI Prism 3130 были получены четкие, воспроизводимые результаты. Следует отметить, что такой тип анализа полиморфизма микросателлитных локусов позволяет получить данные об их размере с точностью до одного нуклеотида. Полученная информация является наиболее точной для составления ДНК-паспортов генотипов (сортов, клонов, селекционных форм). На рисунке 14 в качестве примера проиллюстрированы результаты электрофоретического анализа с использованием метода капиллярного электрофореза на автоматическом генетическом анализаторе/секвенаторе ABI Prism 3130 (результаты представлены в рабочем окне программы GeneMapper 4.0). CH01h01 CH01h10 CH02c06 CH01f03b Рисунок 14 – Фрагментный электрофоретический анализ ДНК сорта яблони Красный Янтарь по мультиплексному набору, включающему SSRмаркеры CH01H10, CH01h01, CH01f03b и CH02c06. 85 Согласно рисунку 14, в рабочем окне программы GeneMapper 4.0 показаны результаты электрофоретического анализа для четырех микросателлитных маркеров: CH01H10, CH01h01, CH01f03b и CH02c06. Два пика представлены для маркеров, по локусам которых выявлено два продукта – следовательно, локусы гетерозиготны. В данном случае это маркеры CH01h01, CH01f03b и CH02c06. По локусу CH01h10 идентифицирован один пик на электрофореграмме, что говорит о его гомозиготности. На рисунках 15-16 представлены результаты электрофоретического анализа ДНК четырех сортов яблони отечественной селекции: Золотая корона, Имрус, Старт и Болотовское по мультиплексному набору, включающему SSRмаркеры CH01H10, CH01h01, CH01f03b и CH02c06, на автоматическом генетическом анализаторе/секвенаторе ABI Prism 3130 в двух рабочих окнах программы GeneMapper. CH01h10 CH01h01 CH01f03b CH02c06 Рисунок 15 – Фрагментный электрофоретический анализ ДНК сортов яблони Золотая корона и Имрус по мультиплексному набору, включающему SSR-маркеры CH01H10, CH01h01, CH01f03b и CH02c06. 86 Как видно из рисунка 15, два пика характерны для всех четырех маркеров, т.е. данные локусы гетерозиготы, не смотря на то, что на одной из фореграмм (сорт яблони Имрус) наблюдается незначительное перекрывание пиков по маркерам CH01H10 и CH01h01. CH01h01 CH01h10 CH01f03b CH02c06 Рисунок 16 – Фрагментный электрофоретический анализ ДНК сортов яблони Старт и Болотовское по мультиплексному набору, включающему SSRмаркеры CH01H10, CH01h01, CH01f03b и CH02c06. 87 На рисунке 16 показано, что для обоих сортов два продукта выявлено только по локусу CH02c06 – следовательно, локусы гетерозиготны. У сорта Старт на электрофореграмме идентифицирован один пик по локусу CH01h01, а у сорта Болотовское – по локусам CH01H10, CH01h01 и CH01f03b, что свидетельствует об их гомозиготности. Из использованных в работе 12 маркеров наиболее высокий уровень полиморфизма по результатам анализа выборки из 31 сорта яблони показал маркер CH02c11 – 10 аллелей (таблица 10). Таблица 10 – Полиморфизм использованных в работе микросателлитных маркеров Маркер Диапазон размеров Количество амплифицированных выявленных фрагментов, п. н. аллелей CH01f03b CH01h01 CH01h10 CH02c06 CH02d08 CH04e05 CH05f06 CH01f02 CH02c11 Hi02c07 CH02c09 CH03d07 Примечания: 141-182 118-137 94-120 204-256 215-258 178-230 171-189 173-210 219-241 104-166 235-259 188-228 5 6 7 9 9 9 7 8 10 9 7 7 Ho He 0,710 0,742 0,548 0,897 0,800 0,867 0,871 0,839 0,806 0,897 0,774 0,679 0,736 0,754 0,602 0,827 0,776 0,798 0,723 0,763 0,752 0,781 0,772 0,776 1. Ho – наблюдаемая гетерозиготность 2. He – ожидаемая гетерозиготность Согласно таблице 10, маркеры проявили различный уровень полиморфизма: от пяти до десяти аллелей на один микросателлитный локус. К группе маркеров, проявивших наиболее низкий уровень полиморфизма, принадлежат: CH01f03b и CH01h01. По данным анализа 31 сортa яблони 88 отечественной селекции, число аллелей на один локус было равным 5 и 6 соответственно. К группе маркеров со средним уровнем полиморфизма относятся: CH01h10, CH05f06, CH01f02, CH02c09, CH03d07. Микросателлитные маркеры: CH02c06, CH02d08, CH04e05 и Hi02c07 показали высокий уровень полиморфизма – десять аллелей на локус и вполне наглядно отображают общую картину аллельного разнообразия в их группе. Суммарно, по 12 изученным локусам было выявлено 93 аллеля. Величина ожидаемой гетерозиготности варьировала в диапазоне от 0,602 (CH01h10) до 0,827 (CH02c06). Фактическая (наблюдаемая) гетерозиготность была определена в пределах от 0, 548 (CH01h10) до 0,897 (CH02c06, Hi02c07). При этом для локусов CH02c06, CH02d08, CH04e05, CH05f06, CH01f02, CH02c11, Hi02c07 и CH02c09 фактическая гетерозиготность превышает ожидаемую, также указывая на высокий уровень генетического полиморфизма данных локусов внутри изученной группы сортов. По результатам проведенного фрагментного анализа все сорта яблони обладали уникальным аллельным набором, позволяющим идентифицировать их среди сортов изученной выборки. Данные об аллельных комбинациях SSR-маркеров у изученных сортов яблони представлены в таблице 11. 89 Таблица 11 – ДНК-паспорта изученных сортов яблони, составленные по данным фрагментного анализа SSR-маркеров Сорта яблони Микросателлитные локусы отечественной селекции 1 1. Золотая корона CH01f03b CH01h01 CH01h10 CH02c06 CH02d08 CH04e05 CH05f06 CH01f02 CH02c11 Hi02c07 CH02c09 CH03d07 2 3 4 5 6 141:174 122:124 94:112 238:242 227:229 7 178 8 9 10 11 12 13 181:189 173:183 223:237 108:114 225:259 190:208 2. КВ Зарево 141:162 3. Апорт АСС 148:182 120:124 4. Имрус 141:182 120:137 100:120 246:254 233:250 201:230 177:185 173:183 219:233 112:150 241:251 188:208 5. Строевское 6. Юбилей Москвы 122 94:100 238:256 229:233 178:213 181:189 183:208 223:231 108:114 100 120:124 104:112 252:254 227 178:224 174 120:122 104:112 252:254 258 178:224 185:189 177:183 229:237 7. Старт 148:174 8. Афродита 162:174 120:122 100:104 242:252 9. Болотовское 162 124 10. Свежесть 141:182 120 100:104 220:254 219:258 100 208:228 254:256 229:258 178:230 185:189 185:210 233:241 104:114 245:259 190:204 174 120 259 116 259 183:185 183:185 221:239 108:114 247:259 185 192:204 204 259 190:208 238:254 229:258 178:213 181:189 183:185 233:237 104:116 245 208 241:257 0 258 178:205 185:210 233:237 114:116 235:259 190:204 183:185 229:239 116:122 94:118 238:256 258 205 185 205:226 179:185 183:210 227:241 90 116 Продолжение таблицы 11 1 2 11. Солнышко 174 12. Красный 3 4 5 120:124 104:112 204:242 6 258 7 8 9 10 11 205:226 185:189 177:210 233:237 116:122 13 259 192:204 174:182 118:124 100 232:238 229:233 13. Амулет 174:182 118:122 100 232:238 227:233 178:205 185:210 233 114:116 14. Юнона 162:182 120:124 100 238:242 229:258 178:213 185:189 183:185 233 104:116 235:245 208 15. Любава 141:162 124 99 242:254 229:258 213:230 181:189 233:237 104:116 235:245 208 16. Фортуна 174 118:122 100 204:232 янтарь 17. Талида 18. Кармен 19. Золотое летнее 162:182 120:124 94:100 162 122:124 100 171:181 185:210 231:233 104:116 235:241 190:228 189 183 178:205 171:189 183:210 223:231 116 235 208:228 235:241 220:228 233:258 213:221 181:185 185:210 237:241 108:116 235:259 208:228 238:242 229:258 213:230 181:189 183:185 233:237 114:116 235:245 208 141:174 120:124 104:112 242:254 215:227 178:213 179:181 173:177 233:237 108:112 235:245 190 20. Талисман 162:174 122 100 21. Василиса 162 120:122 100 22. Рассвет 174 18:120 100:104 23. Ноктюрн 238 0 178 12 141:182 124 204:254 229:258 178:205 181:189 183 223:233 114:116 241:245 190:228 238 229:258 213:230 185:189 183:185 204 215:258 178:213 185:189 177:210 231:233 94:100 242:254 229:258 178:230 185:189 91 183 233 233 104:108 116 235 208 235:251 220:228 114:116 235:245 190:220 1 24. Кубанское багряное 25. Зори Кубани 2 4 5 162:174 120:126 100:104 220:232 6 215 7 8 9 10 178:226 179:189 177:191 221:233 112:116 235:259 208:220 174:182 120:122 94:100 254:256 229:258 205:230 185:189 175:185 233:241 26. Зимнее 174 утро 27. Дин Арт 3 120:137 100 254:256 221:233 174:182 122:137 94:100 238:254 227:233 28. Маяк 162 станичный 29. Персиковое 141:162 0 245:259 204:208 0 171:185 173:210 231 112:114 241:251 179 185:189 185:210 233 104:114 235:251 190:204 118:122 94:100 238:242 229:258 205:230 124 Окончаниетаблицы 11 11 12 13 189 185 233:237 114:148 245:257 188 208 100 0 215:229 178:226 181:189 183:210 233:237 104:114 235:259 0 0 227:254 205:230 181:189 0 30. Нимфа 162:182 122:137 100 31. Кубань 162:182 122:124 100 185 238:254 227:229 178:230 181:189 183:185 231:233 233 Примечание: Цифрами обозначен размер амплифицированных фрагментов в парах оснований (п. н.) 92 0 235:259 104:114 235:245 190:208 Результаты исследований показали, что гетерозиготность, характеризующаяся одновременным присутствием двух амплифицированных фрагментов разного размера, значительно варьировала. В среднем гетерозиготность в данной выборке сортов яблони по исследованным локусам равна 24 (таблица 11). У сортов Персиковое, Нимфа по локусам CH02c06, CH03d07 и Hi02c07; Фортуна, Зимнее утро, Зори Кубани, Свежесть по локусам CH02do8, CH04e05, Hi02c07 и CH03d07 по некоторым микросателлитным маркером не были обнаружены амплифицированные фрагменты, что соответствует нулевому значению в таблице 11. Количество гомо- и гетерозигот в изученных сортах яблони по каждому микросателлитному маркеру представлено на рисунке 17. Рисунок 17 – Соотношение количества гомо- и гетерозигот по микросателлитным локусам в изученных образцах яблони Согласно рисунку 17, максимальное количество гетерозигот было выявлено по следующим SSR-локусам: CH02c06 (26 генотипов), CH04e05 (26 генотипов), CH05f06 (27 генотипов) и CH01f02 (26 генотипов). Меньше всего 93 гетерозигот обнаружили по локусам CH01h10 (17 генотипов) и CH03d07 (19 генотипов). Количество гомозигот также оказалось различным: от 3-4 (по микросателлитным локусам CH01h10, CH04e05, CH05f06, Hi02c07 соответственно) до 14 (CH01h10 генотипов). Частота встречаемости выявленных у исследованных образцов яблони аллелей по каждому микросателлитному маркеру в абсолютных величинах, а также их процентное соотношение показаны на приведенных ниже гистограммах (рисунок 18 – 25), полученных с помощью программы GenAlEx 6.3. Frequency Allele Frequency 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 Pop1 141 148 162 174 182 118 120 122 124 126 137 94 99 100 104 112 118 120 CH01f03b CH01h01 CH01h10 Locus Рисунок 18 – Частота аллелей микросателлитных маркеров CH01f03b, CH01h01, CH01h10, выявленная при изучении отечественных сортов яблони Приведённая на рисунке 18 гистограмма показывает, что из трех представленных маркеров самым полиморфным являлся CH01h10, у которого было обнаружено 7 аллелей. Маркер CH01h01 выявил 6 аллелей. По маркеру CH01f03b все изученные сорта яблони имели всего лишь 5 аллелей. Интересно отметить, что по данному маркеру наибольшее число амплифицированных фрагментов имело молекулярный вес 100 п. н. – 60 % (рисунок 19). 94 CH01f03b CH01h01 CH01h10 Рисунок 19 – Процентное соотношение аллелей микросателлитных маркеров CH01f03b, CH01h01, CH01h10, выявленное при изучении отечественных сортов яблони На рисунке 19 наглядно показано соотношение каждого выявленного аллеля по трем микросателлитным маркерам в изученной выборке сортов яблони. Наибольшее число амплифицированных фрагментов имело молекулярный вес от 104 (13%) и 120 (29%) п. н. до 162 (31%) и 174 п. н. (34 %). Реже остальных встречались аллели с молекулярным весом 148 п. н. (3 %), 126 п. н. (2 %) и 118 п. н. (1 %) по маркерам CH01f03b, CH01h01, CH01h10 соответственно. Рисунок 20 отображает частоту аллелей микросателлитных маркеров CH02с06, CH02d08 и CH04e05, полученную при изучении 31 сорта яблони. 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 CH02c06 229 233 250 254 258 178 179 201 205 213 221 224 226 230 Pop1 204 220 232 238 242 246 252 254 256 215 219 221 227 Frequency Allele Frequency CH02d08 CH04e05 Locus Рисунок 20 – Частота аллелей микросателлитных маркеров CH02с06, CH02d08, CH04e05, выявленная при изучении отечественных сортов яблони 95 Приведенная на рисунке 20 гистограмма иллюстрирует, что маркеры CH02с06, CH02d08, CH04e05 проявили одинаковый уровень полиморфизма – 9 выявленных аллелей на локус, причем наиболее распространенными оказались аллели с молекулярным весом от 178 до 258 п. н. (рисунок 21). Следует отметить, что по данным маркером встречались нуль аллели: по маркеру CH02с06 у сортов Персиковое и Нимфа, по маркеру CH02d08 – у Фортуны, по маркеру CH04e05 – у сорта яблони Зимнее утро. CH02с06 CH02d08 CH04e05 Рисунок 21 – Процентное соотношение аллелей микросателлитных маркеров CH02с06, CH02d08, CH04e05, выявленное при изучении отечественных сортов яблони Как видно из рисунка 21, по маркерам CH02с06, CH02d08 и CH04e05 наибольшее число амплифицированных фрагментов имело молекулярный вес 238 п. н. (26 %), 258 п. н. (35 %) и 178 п. н. (33 %) соответственно. Меньше всего выявленно аллелей с молекулярным весом 246 п. н. (2 %) – по маркеру CH02с06; 219 п. н., 221 п. н., 250 п. н., 254 п. н. (по 2 %) – маркер CH02d08, а также 201 п. н. и 221 п. н. (CH04e05) – по 2 %. Частота аллелей микросателлитных маркеров CH02c11 в абсолютных величинах показана на рисунке 22. 96 CH05f06, CH01f02, 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 CH05f06 CH01f02 241 239 237 233 231 229 227 223 221 219 210 208 191 185 183 177 175 173 189 185 183 181 179 177 Pop1 171 Frequency Allele Frequency CH02c11 Locus Рисунок 22 – Частота аллелей микросателлитных маркеров CH05f06, CH01f02, CH02c11, выявленная при изучении отечественных сортов яблони Согласно рисунку 22, максимальный уровень полиморфизма характерен для маркера CH02c11 – 10 аллелей с молекулярным весом в основном от 231 до 237 п. н. (73 %). У маркеров CH05f06 и CH01f02 было обнаружено 7 и 8 аллелей соответственно, а также встречались амплифицированные фрагменты с одинаковым молекулярным весом – 185 п. н. (рисунок 23). CH05f06 CH01f02 CH02c11 Рисунок 23 – Процентное соотношение аллелей микросателлитных маркеров CH05f06, CH01f02, CH02c11, выявленное при изучении отечественных сортов яблони 97 Из рисунка 23 следует, что реже остальных встречались аллели с молекулярным весом 175, 177, 191, 208, 219 и 227 п. н., в то время как наибольшее число амплифицированных фрагментов имело молекулярный вес 189 п. н. (39 %), 183 п. н. (32 %) и 233 п. н. (44 %) по маркерам CH05f06, CH01f02 и CH02c11соответственно. Уровень полиморфизма микросателлитных маркеров Hi02c07, CH02c09, CH03d07, выявленный при изучении отечественных сортов яблони, отображен на рисунке 24. 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 Hi02c07 CH02c09 228 220 208 204 192 190 188 259 257 251 247 245 241 235 166 150 148 122 116 114 112 108 Pop1 104 Frequency Allele Frequency CH03d07 Locus Рисунок 24 – Частота аллелей микросателлитных маркеров Hi02c07, CH02c09, CH03d07, выявленная при изучении отечественных сортов яблони. Приведённая на рисунке 24 гистограмма иллюстрирует, что маркеры CH02c09 и CH03d07 показали средний уровень аллельного разнообразия (семь аллелей), тогда как маркер Hi02c07 обнаружил достаточно высокую степень полиморфизма – девять аллелей на локус. Причем, у маркера Hi02c07 амплифицированные фрагменты имели меньший молекулярный вес – от 104 до 166 п. н. Аллели с большим молекулярным весом от 235 до 259 п. н. были выявлены у маркера CH02c09 (рисунок 25). 98 Hi02c07 CH02c09 CH03d07 Рисунок 25 – Процентное соотношение аллелей микросателлитных маркеров Hi02c07, CH02c09, CH03d07, выявленное при изучении отечественных сортов яблони Как видно из рисунка 25, размер амплифицированных фрагментов варьировал от 104 до 259 п. н. По маркерам Hi02c07, CH02c09 и CH03d07 наибольшее число аллелей имело молекулярный вес 116 п. н. (34 %), 235 п. н. (31 %) и 208 п. н. (37 %), а наименьшее – 148-166 п. н. (6%), 247 п. н. (2 %) и 192 п. н. (4 %) соответственно. На основании комплекса данных о частоте встречаемости аллелей и о размере амплифицированных последовательностей для каждого аллеля, а также уровня гетерозиготности была проведена оценка степени генетического сходства изученных сортов яблони. При этом для построения матрицы генетических дистанций использовали коэффициент (индекс) подобия по M. Nei и W. Li [Nei M. et al., 1979]. Для кластеризации образцов в генетического сходства использовали кластирования с арифметическим соответствии со степенью их метод попарного невзвешенного усреднением (UPGMA) и методом ближайших соседей (NJ), с использованием FreeTree Application 0.9.1.50 (ZDAT v.o.s.). Графическое построение дендрограммы проведено в программе TreeView (Win32) 1.6.6 (рисунок 26). 99 Рисунок 26 – Дендрограмма генетического сходства изученных сортов яблони, построенная по методу UPGMA 100 Результаты кластеризации в целом отражают генетическую разнородность и происхождение сортов из изученной выборки. Это выражается в одновременном присутствии как явно выделяющихся кластеров и наличии кластеров, включающих всего два генотипа или выделение отдельных генотипов в отдельную ветвь кластера (сорт Свежесть), так и кластеров второго порядка со сложной структурой, которые состоят из последовательно включаемых в кластер отдельных генотипов. В такой кластер входят сорта Персиковое, Маяк станичный, Ноктюрн, Любава, Василиса, Кубань спур, Кармен, Болотовское, Юнона. Данные сорта входят в один кластер с сортами Талида, КВ Зарево, Золотая корона. При этом объединение их идет на таких же дистанциях генетического сходства, как и разделение ряда некоторых кластеров сортов – около 0,1. Это соответствует информации о происхождении данных сортов (таблица 12). Сорт Свежесть (Антоновка краснобочка × PR12T67 (Уэлси × F2 M. floribunda), расположенный на отдельной ветви кластера, как и выделенные в отдельный кластер, хотя и со значительной генетической дистанцией между ними, сорта Имрус (Антоновка обыкновенная × OR18T13) и Зимнее утро (Либерти × Скарлет Стаймаред) имеют происхождение от сортов, не представленных в родительских формах ни у одного из изученной выборки. Также достоверность данных, полученных при кластеризации, подтверждается объединением в один кластер сортов Афродита, Старт, Солнышко, Юбилей Москвы и Строевское, которые имеют общую материнскую форму 814 (M. floribunda × Голден Делишес). Кроме того, видно, что в один кластер были объединены сорта Талисман, Амулет, Красный янтарь, Фортуна, Рассвет, из которых все, за исключением сорта Фортуна, происходят из гибридной комбинации Редфри × Папировка тетраплоидная. В таблице 12 приведена информация о происхождении изученных сортов и распределение их по кластерам. 101 Таблица 12 – Родительские формы изученных сортов яблони, распределенных между кластерами Сорт Родительские формы 1 2 Кластер 1 Болотовское Скрыжапель × 1924 (IV поколение от M. floribunda) Василиса Прима × Уэлси тетраплоидный Кармен Прима × Уэлси тетраплоидный Кубань спур Клон сорта Кубань (Антоновка обыкновенная × Вагнера призовое) Любава Прима × Уэлси тетраплоидный Маяк станичный Аленушкино × Кубань Ноктюрн Прима × Уэлси тетраплоидный Персиковое Кубань спур × Кальвиль снежный Талида Голден Спайер × Уэлси тетраплоидный Юнона Прима × Уэлси тетраплоидный Кластер 2 Афродита Форма 814 (M. floribunda × Голден Делишес) – свободное опыление Старт Форма 814 (M. floribunda × Голден Делишес) × Мекинтош тетраплоидный Солнышко Форма 814 (M. floribunda × Голден Делишес) – свободное опыление Юбилей Москвы Форма 814 (M. floribunda × Голден Делишес) – свободное опыление Строевское Форма 814 (M. floribunda × Голден Делишес) – свободное опыление 102 Окончание таблицы 12 1 2 Кластер 3 Фортуна Прима × Алкмене Амулет Редфри × Папировка тетраплоидная Рассвет Редфри × Папировка тетраплоидная Красный янтарь Редфри × Папировка тетраплоидная Талисман Редфри × Папировка тетраплоидная Кластер 4 Дин Арт С6-47 (Пепин шафранный × Джонатан) × Прима Зори Кубани Уэлси × Кубань спур Апорт АСС Апорт кубанский × Кандиль кубанский Кластер 5 Кубанское Ред Делишес × Джонаред румяное Золотое летнее Голден Делишес тетраплоидное – свободное опыление Кластер 6 Свежесть Антоновка краснобочка × PR12T67 (Уэлси × F2 M. floribunda) Нимфа Ренет Симиренко 17-36 × Кубань спур Кластер 7 Зимнее утро Либерти × Скарлет Стаймаред Имрус Антоновка обыкновенная × OR18T13 Кластер 8 КВ Зарево Мекинтош важек × (Ранетка Ермолаева × Мелба) Золотая корона Голден Делишес – свободное опыление Как видно из результатов кластеризации (рисунок 26, таблица 12) затруднительным представляется определение несколько крупных кластеров, 103 объединяющих все изученные генотипы. Очевидной причиной этого могут являться следующие факторы: – присутствие нескольких небольших групп сортов (по 5-6), имеющих общие родительские формы (как одну из родительских форм, так и обе, в ряде случаев); – разное генетическое происхождение родительских форм сортов из изученной выборки; – наличие ряда сортов (КВ Зарево, Имрус, Зимнее утро, Свежесть), имеющих в качестве родительских форм уникальные сорта, не повторяющиеся в генеалогии ни у одного из остальных сортов изученной выборки; – родительские формы некоторых изученных сортов имеют в своем происхождении сорта, являющиеся прямыми родителями других сортов из изученной выборки. Такая сложная структура дендрита и невозможность однозначного распределения сортов яблони на несколько крупных кластеров было отмечено и ранее в ряде работ, посвященных изучению генетического разнообразия яблони [Шамшин И.Н. и др., 2013; Hokanson S.C. et al., 1998; SilfverbergDilworth E. et al., 2006]. Есть предположение, что формирование кластеров с высокой достоверностью затруднено в связи с наличием большого количества уникальных и редких аллелей среди изучаемых генотипов яблони, а также наблюдаемым высоким полиморфизмом анализируемых SSR-локусов [Шамшин И.Н. и др., 2013]. Факт того, что сорта с одной родословной в большинстве своем объединены в общие кластеры, говорит об объективной оценке и эффективности использования SSR-маркеров в этих целях. Возможность различать генетически близкие сорта, полученные в результате гибридизации одной родительской пары, также подтверждает перспективность использования микросателлитов в идентификации сортов, в том числе и с одинаковым происхождением. 104 В связи с вышесказанным, рекомендуем учитывать результаты кластеризации при планировании селекционной работы. Для получения наибольшей изменчивости в гибридных популяциях не следует использовать сорта, вошедшие в один кластер, в качестве родительских пар при гибридизации. Наряду с этим, данные SSR-генотипирования могут быть использованы в дальнейшем для подтверждения генеалогии сортов и гибридов при возникновении спорных вопросов, в случае если одна или обе их родительские формы входят в перечень изученных нами сортов яблони. Результаты выполненных исследований нашли отражение в научноисследовательской деятельности Функционального научного центра «Садоводство», что подтверждено соответствующе й справкой о внедрении результатов диссертационной работы. 105 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1 Разработан модифицированный метод экстракции ДНК, позволяющий получать пробы ДНК с необходимой чистотой для проведения ПЦР на любом этапе вегетационного развития листьев, в том числе из листьев, гербаризованных на поздних этапах вегетации, что повышает универсальность применения ДНК-маркерного анализа. 2 По результатам скрининга, направленного на молекулярно- генетическую идентификацию генов устойчивости Vm и Vf в селекционных формах и сортах яблони выявлено наличие гена Vf у 12 сортов и 46 элитных форм яблони селекции СКЗНИИСиВ. Ген Vm идентифицирован у сорта яблони Первинка и следующих ценных селекционных форм: 31-34-40, 31-31-128, 27-2-2776, 27-2-222, 29-7-101, 27-2-218. 3 Создан ДНК-маркер последовательности гена Vf, на основании который данных может быть о нуклеотидной использован при одновременной идентификации гена устойчивости яблони к парше Vf и других генов хозяйственно-ценных признаков яблони. 4 Выполнена молекулярно-генетическая идентификация аллелей гена самонесовместимости S2, S3, S7, S10 у 33 отечественных сортов яблони. 5 Установлена частота встречаемости изученных аллелей S-гена в отечественной генплазме яблони в соответствии с уровнем их распространения в мировом генофонде. 6 В результате анализа полиморфизма 12 микросателлитных маркеров в репрезентативной выборке из 31 сорта яблони отечественной селекции выявлено, что наибольшим уровнем полиморфизма обладает маркер CH02c11 – 10 аллелей, а минимальным – CH01f03b и CH01h01 – 5 и 6 аллелей соответственно. 7 На основании данных SSR-анализа для всех изученных генотипов яблони получены уникальные ДНК-фингерпринты, идентифицировать их среди сортов изученной выборки. 106 позволяющие РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ 1. Использовать ДНК-маркерный анализ в селекционных программах на устойчивость яблони к парше для идентификации генов Vf и Vm, ввиду ценности полученных результатов для создания устойчивых к парше сортов. 2. Учитывать самонесовместимости максимального данные при количества о присутствии/отсутствии подборе родительских гибридного пар потомства аллелей для с гена получения возможностью формирования сортовых схем садовых насаждений согласно информации об аллельных комбинациях S-гена у изученных сортов. 3. Использовать изученные в ходе исследования SSR-маркеры при дальнейшем исследовании генетического разнообразия отечественного генофонда яблони, а также при необходимости идентификации достоверности данных о родительских формах (происхождении) селекционных образцов. ДНК-фингерпринты сортов могут быть использованы для решения спорных вопросов о сортовой принадлежности посадочного материала. 107 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Артюх, С.Н. Сорта яблони / С.Н. Артюх, И.Л. Ефимова // Сад и виноградник. Краснодар. – 1998. – С. 103-112. 2. Артюх, С.Н. Принципиальные подходы к развитию плодоводства нового века – проблемы и задачи / С.Н. Артюх, А.Н. Фисенко, И.А. Драгавцева, Г.Н. Теренко, В.П. Попова // Проблемы и перспективы стабилизации и развития садоводства и виноградарства: Материалы междунар. науч.-практ. конф. «Садоводство и виноградарство 21 века». Краснодар. – 1999. – С. 105-110. 3. Артюх, С.Н. Проблемы селекции садовых растений на юге России / С.Н. Артюх, А.П. Луговской, Л.И. Дутова // Формы и методы научного и организационно-экономического обеспечения отраслей в условиях рыночных отношений (садоводство и виноградарство). Краснодар. – 2001. – С. 134-140. 4. Ульяновкая, Е.В. Атлас лучших сортов плодовых и ягодных культур Краснодарского края. Яблоня / Е.В. Ульяновкая. – ГНУ СКЗНИИСиВ Россельхозакадемии. – 2008. – 104 с. 5. Барсукова, О.Н. Расовый состав Venturia inaequalis (Cke.) Wint. на Кавказе / О.Н. Барсукова // Микология и фитопатология. – 1985. – Т. 19. Вып. 6. – С.499-502. 6. Бондарь, Л.В. Расовый состав возбудителя парши яблони в Белоруссии и селекции яблони на иммунитет к парше / Л.В. Бондарь // Селекция яблони в СССР. Орел. – 1981. – С. 89-95. 7. Браун, А.Д. Яблоня. Селекция плодовых растений / А.Д. Браун. – М.: Колос, 1981. – С. 13-61. 8. Гешеле, Э.Э. К биологии возбудителя парши яблони в условиях Сибири / Э.Э. Гешеле // Труды Омского с.-х. института им. С.М. Кирова. – 1958. – Т. 22. Вып. 2. – С. 117-122. 108 9. Гостимский, С.А. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений / С.А. Гостимский, З.Г. Кокаева, В.К. Боброва // Генетика. – 1999. – Т. 35. – С.1538-1549. 10. Гучетль, С.З. Применение RAPD-ПЦР маркеров для дифференциации физиологических рас Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni, поражающих подсолнечник в Краснодарском крае / С.З. Гучетль, Т.А. Чедюстникова, М.В. Ивебор, Т.С. Антонова, Н.М. Арасланова, С.А. Рамазанова // Сельскохозяйственная биология. – 2008. – № 5. – С. 82-87. 11. Егоров, Е.А. Программа Северо-Кавказского центра по селекции плодовых, ягодных, цветочно-декоративных культур и винограда на период до 2030 года / Е.А. Егоров. – Краснодар: ГНУ СКЗНИИСиВ, 2013. – 202 с. 12. Ефимова, И.Л. Оценка самоплодности сортов яблони. Селекционногенетическое совершенствование породно-сортового состава садовых культур на Северном Кавказе / И.Л. Ефимова; под ред. Э.В. Макарова. – Краснодар, 2005. – С. 102-104. 13. Ефимова, И.Л. Устойчивость сортов яблони к грибным заболеваниям на юге России / И.Л. Ефимова, Г.В. Якуба // Плодоводство и ягодоводство России. – 2010. – Т.24. – №2. – С 403-409. 14. Ефимова, И.Л., Якуба Г.В. Поражаемость сортов яблони грибными болезнями в условиях Краснодарского края // Плодоводство и ягодоводство России. – 2012. – Т.30. – С 352-358. 15. Жданов, В.В. Генетико-иммунологические основы, результаты и перспективы селекции яблони на устойчивость к болезням и вредителям / В.В. Жданов, Е.Н. Седов. // Юбилейный сб.– Орел: ВНИИСПК. – 1995. – С. 88-101. 16. Жданов, В.В. Селекция яблони на устойчивость к парше / В.В. Жданов, Е.Н. Седов. – Тула: Приок. кн. изд-во, 1991 – 207 с. 17. Ищенко, Л.А. Достижения и проблемы иммунитета плодовых и ягодных культур / Л.А. Ищенко // Генетические основы селекции на иммунитет плодовых, ягодных культур и винограда. Мичуринск. – 1987. – С. 3-14. 109 18. Казенас, Л.Д. Болезни плодовых и ягодных культур Алма-Атинской зоны плодоводства / Л.Д. Казенас // Труды республиканской станции защиты растений. – 1953. – Т. 1. – С. 179-257. 19. Козловская, З.А. Сравнительная оценка потенциала устойчивости к парше сортов и гибридов яблони в эпифитотийный год / З.А. Козловская, С.А. Ярмолич, Г.М. Марудо // Плодоводство. Самохваловичи. – 2005. – Т.17. – Ч.1. – С. 30-34. 20. Конарев, В.Г. Белки как генетические маркеры растений / В.Г. Конарев. – М.: Колос, 1983. – 320 с. 21. Куликов, И.М. Инновационные направления в производстве сертифицированного посадочного материала плодовых и ягодных культур / И.М. Куликов // Плодоводство и ягодоводство России. – 2008. – Т.18. – С. 3-7. 22. Куликов, И.М. Производство плодов и ягод в мире / И.М. Куликов, О.З. Метлицкий // Плодоводство и ягодоводство в России. – 2006. – T.7. – С. 99-112. 23. Льюин, Б. Гены / Б. Льюин. – М.: Мир, 1987. – 544 с. 24. Матвеева, В.К. Парша яблони в Алма-Атинской области / В.К. Матвеева, Л.П. Сахарова // Вестник сельскохозяйственной науки. Алма-Ата. – 1965. – №7. – С. 122-124. 25. Остерман, Л.А. Методы исследования нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. – М.: Наука, 1981. – 288 с. 26. Пономаренко, В.В. Генетический потенциал видов рода Malus Mill. устойчивости к парше / В.В. Пономаренко // Совершенствование сортимента и технологий возделывания плодовых и ягодных культур: Материалы международной научно-практич. конф. Орел. – 2010. – С. 56-78. 27. Савельев, Н.И. Генетические основы селекции яблони / Н.И. Савельев. – Мичуринск: Изд-во ВНИИГиСПР им. Мичурирна, 1998. – 304 с. 28. Савельев, Н.И. Достижения по селекции сортов яблони с генетической устойчивостью к парше / Н.И. Савельев // Современные тенденции развития промышленного садоводства. Барнаул. – 2008. – С. 130-135. 110 29. Савельев, Н.И. Яблоня. Создание новых сортов и доноров ценных признаков на основе идентификации генов плодовых растений / под ред. Н.И. Савельева. – Мичуринск: ВНИИГИСПР им. И.В. Мичурина, 2002. – 20 с. 30. Савельева, Н.Н. Экономическая эффективность иммунных к парше сортов яблони в период полного плодоношения / Н.Н. Савельева, Н.И. Савельев // Оптимизация технолого-экономических параметров структуры агроценозов и регламентов возделывания плодовых культур и винограда. Краснодар: СКЗНИИСиВ. – 2008. – Т.1. – С.60-64. 31. Сахарова, Л.П. Биологические особенности двух рас возбудителя парши яблони на юго-востоке Казахстана / Л.П. Сахарова // Вестник сельскохозяйственной науки. – 1968. – №3. – С. 117-122. 32. Сиволап, Ю.М. Использование продуктов полимеразной цепной реакции для картирования генома ячменя (Hordeum vulgare L.) / Ю.М. Сиволап, Р.Н. Календарь, В.П. Нецветаев // Генетика. – 1997. – Т. 33. – С. 53-60. 33. Седов, Е.Н. История, задачи, методы и результаты селекции яблони / Е.Н. Седов // Сельскохозяйственная биология. – 2007. – №1. – С. 3-15. 34. Седов, Е.Н. Помология. Яблоня / Е.Н. Седов. – Орел: ВНИИСПК, 2005. – 576 с. 35. Седов, Е.Н. Селекция семечковых культур на устойчивость к парше и мучнистой росе – приоритетное направление науки / Е.Н. Седов // Садоводство и виноградарство. – 1992. – №1. – С. 11-14 36. Седов, Е.Н. Селекция и агробиологическая оценка новых сортов яблони / Е.Н. Седов, М.А. Макаркина, З.М. Серова // Доклады РАСХН. – 2006. – №3. – С. 74-82. 37. Седов, Е.Н. Методика отбора устойчивых к парше сортов и сеянцев яблони на искусственных инфекционных фонах / Е.Н. Седов, В.В. Жданов. – М., 1985. – 48 с. 38. Седов, Е.Н. Отбор иммунных к парше гибридов яблони на искусственном инфекционном фоне / Е.Н. Седов, В.В. Жданов // Микология и фитопатология. – 1987. – Т. 21. – Вып. 5. – С. 463-466. 111 39. Седов, Е.Н. Пути селекции яблони на стабильную устойчивость к парше / Е.Н. Седов, В.В. Жданов // Четвертый съезд Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова: Тезисы докл. Кишинев. – 1982. – С. 165-166. 40. Седов, Е.Н., Жданов В.В. Устойчивость яблони к парше (сорта и селекция) / Е.Н. Седов, В.В. Жданов. – Орел, 1983. – 113 с. 41. Смольякова, В.М. Элементы концепции экологизации защиты плодовых и ягодных культур от вредных организмов / В.М. Смольякова, Л.А. Пузанова, Г.В. Якуба, Н.А. Холод // Основные итоги научных исследований. Краснодар. – 2005. – С. 108-111. 42. Созинов, А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции / А.А. Созинов. – М., 1985. – 245 с. 43. Суворова, Г.Н. Филогенетическое родство некоторых сортов, видов и гибридов рода Fagopyrum Mill., установленное RAPD-анализом / Г.Н. Суворова, Х. Фунатсуки, Ф. Терами // Генетика. – 1999. – Т. 35. – С. 1659-1664. 44. Супрун, И.И. Генотипирование подвоев яблони отечественной селекции с использованием мультиплексного STR-анализа / И.И. Супрун, Я.И. Алексеев, О.П. Малюченко, А.В. Бабаков, Я.В. Ушакова // Садоводство и виноградарство. – 2012. – №4. – С. 20-23. 45. Супрун, И.И. Молекулярно-генетические аспекты самонесовместимости яблони [Электронный ресурс] / И.И. Супрун, И.В. Степанов, С.В. Токмаков // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университет. – 2012. №06 (80). – Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2012/06/pdf/26.pdf. 46. Супрун, И.И. Изучение аллельного разнообразия генов синтеза этилена Md-ACS1 и Md-ACO1 в отечественной генплазме яблони / И.И. Супрун, С.В. Токмаков // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2013. – Т. 17. – № 2. – С. 298-302. 47. Супрун, И.И. Генотипирование сортов яблони российской селекции с использованием микросателлитных маркеров / И.И. Супрун, С.В. Токмаков, 112 О.П. Малюченко, Я.В. Ушакова, А.В. Бабаков // Известия ТСХА. – 2011. – Вып.6. – С.162-166. 48. Супрун, И.И. Идентификация аллелей S2, S3, S5, S6 гена самонесовместимости у сортов черешни из коллекции СКЗНИИСиВ / И.И. Супрун, С.В. Токмаков, И.В. Степанов // Методологическое обеспечение селекции садовых культур и винограда на современном этапе. Краснодар. СКЗНИИСиВ. – Т.1. – 2013. – С. 97-101. 49. Супрун, И.И. Генотипирование сортов яблони российской селекции с использованием микросателлитных маркеров / Супрун И.И., Токмаков С.В., Малюченко О.П., Ушакова Я.В., Бабаков А.В. // Известия ТСХН. – 2011. – Вып. 6. – С. 162-166. 50. Супрун, И.И. Разработка мультиплексных наборов SSR-маркеров для использования в изучении генетического разнообразия в пределах родов Malus, Prunus и Pyrus / И.И.Супрун, С.В. Токмаков, И.В. Степанов, И.М. Балапанов // Метологическое обеспечение селекции садовых культур и винограда на современном этапе. Краснодар. ГНУ СКЗНИИСиВ. – 2013. – Том 1. – 282 с. 51. Супрун, И.И. Изучение аллельного полиморфизма гена самонесовместимости и цитологических особенностей опыления сортов яблони [Электронный ресурс] / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская // Плодоводство и виноградарство Юга России. – 2012. – № 13 (01). – Режим доступа: http://journal.kubansad.ru/pdf/12/01/02.pdf. 52. Супрун, И.И. Использование молекулярно-генетических методов установления закономерностей наследования для выявления доноров значимых признаков яблони [Электронный ресурс] / И.И Супрун, Е.В. Ульяновская, Е.Н. Седов, Г.А. Седышева, З.М. Серова // Плодоводство и виноградарство Юга России. – 2012. – № 13 (01). – Режим доступа: http://journal.kubansad.ru/pdf/12/01/02.pdf. 53. Супрун, И.И. Методологические аспекты использования ДНКмаркирования в селекции яблони на устойчивость к парше / И.И. Супрун, Е.В. 113 Ульяновская, Я.В. Ушакова // Труды Кубанского государственного университета. – 2010. – №1(22). – С. 86-88. 54. Супрун, И.И. Использование методов ДНК-маркирования для идентификации аллелей гена самонесовместимости яблони / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова // Труды Кубанского государственного использования ДНК-маркерной университета. – 2010. – №1 (22). – С. 57-59 . 55. Супрун, И.И. Перспективы технологии для повышения эффективности селекции яблони / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова // Высокоточные технологии производства, хранения и переработки плодовой и ягодной продукции: Материалы научнопрактич. конференции. Краснодар. – 2010. – С. 38-43. 56. Супрун, И.И. Селекционно-генетическое изучение российской генплазмы яблони с применением молекулярного ДНК-маркирования / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова // Нетрадиционное растениеводство. Селекция и генетика. Эниология. Экология и здоровье. Алушта, Украина. – 2010. – С. 337-340. 57. Супрун, И.И. Молекулярно-генетическая идентификация аллелей гена самонесовместимости у сортов яблони отечественной селекции / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова, Е.Т. Ильницкая // Доклады РАСХН. – 2011. – № 5. – C. 15-18. 58. Супрун, И.И. Скрининг селекционного материала яблони на наличие гена устойчивости к парше Vf c применением методов молекулярного маркирования / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова, Е.Н. Седов, Г.А. Седышева, З.М. Серова // Труды Кубанского государственного аграрного университета. – 2011. – Т. 1 – № 3 (30). – С. 84-86. 59. Супрун, И.И. Использование методов молекулярного ДНК- маркирования в целях идентификации генов устойчивости к парше / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова, Е.Н. Седов, З.М. Серова // Вклад фундаментальных инновационной научных экономики исследований Краснодарского 114 в развитие края: современной Материалы научно- практической конференции грантодержателей РФФИ и администрации Краснодарского края. – Краснодар. – 2009. – С. 102-103. 60. Суриков, И.М. Несовместимость и эмбриональная стерильность растений / Суриков И.М. – М., 1991. – 220 с. 61. Ульяновская, Е.В. Создание современных сортов яблони по заданным признакам / Е.В. Ульяновская // Критерии прецизионных технологий садоводства и виноградарства. Краснодар. – 2007. – С. 53-58. 62. Ульяновская, Е.В. Ускоренное создание иммунных к парше сортов яблони с использованием молекулярно-генетических методов исследования / Ульяновская Е.В., Седов Е.Н., Супрун И.И., Седышева Г.А., Серова З.М. – Краснодар, 2011. – 55 с. 63. Ульяновская, Е.В. Ускоренное создание генотипов яблони с повышенными показателями адаптивности и качества на основе выявленных закономерностей наследования значимых признаков / Е.В. Ульяновская, И.И. Супрун // Метологическое обеспечение селекции садовых культур и винограда на современном этапе. Краснодар: ГНУ СКЗНИИСиВ. – 2013. – Том 1. – 282 с. 64. Ульяновская, Е.В. Методологические подходы к созданию иммунных к парше сортов яблони с использованием молекулярно-генетических методов исследования / Е.В. Ульяновская, И.И. Супрун, Е.Н. Седов, Г.А. Седышева, З.М. Серова // Агро ХХI. – 2013. – № 1-3. – С.18-19. 65. Ульяновская, Е.В. Ускоренное создание генотипов яблони с повышенными показателями адаптивности и качества на основе выявленных закономерностей наследования значимых признаков / Е.В. Ульяновская, И.И. Супрун // Методологическое обеспечение селекции садовых культур и винограда на современном этапе. Краснодар: ГНУ СКЗНИИСиВ – 2013. – Т. 1. – С. 47-52. 66. Ульяновская, Е.В. Ускоренное создание иммунных к парше сортов яблони с использованием молекулярного ДНК-маркирования / Е.В. Ульяновская, И.И. Супрун // Защита и карантин растений. – 2013. – № 5. – С. 22-24. 115 67. Ульяновская, Е.В. Создание иммунных к парше сортов и форм яблони с использованием молекулярно-генетических методов / Е.В. Ульяновская, И.И. Супрун, Е.Н. Седов, Г.А. Седышева, З.М. Серова // Вестник РАСХН. – 2012. – № 3. – С. 42-44. 68. Урбанович, О.Ю. Анализ полиморфизма SSR-локусов видов Malus / О.Ю. Урбанович, З.А. Козловская, А.А. Хацкевич // Известия Национальной академии наук Беларуси. – 2010. – №1. – С. 12-17. 69. Урбанович, О.Ю. Молекулярные методы идентификации и генотипирования яблони и груши / О.Ю. Урбанович; Институт генетики и цитологии НАН Беларуси. – Минкск: Право и экономика, 2013. – 210 c. 70. Хавкин, Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве / Э.Е. Хавкин // Сельскохозяйственная биология. – 1997. – №5. – С. 3-19. 71. Хохрякова, Т.М. О географическом видообразовании фитопатогенных аскомицетов на плодовых в СССР / Т.М. у Хохрякова // Микология и фитопатология. – 1978. – Т. 12. – Вып. 2. – С. 154-163. 72. Шамшин, И.Н. Анализ генетического полиморфизма генома яблони с использованием микросателлитных последовательностей ДНК / И.Н. Шамшин, А.М. Кудрявцев, Н.И. Савельев // Метологическое обеспечение селекции садовых культур и винограда на современном этапе. Краснодар: ГНУ СКЗНИИСиВ. – 2013. – Т. 1. – С. 39-42 с. 73. Шибата, Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярногенетический анализ биоптатов. Молекулярная клиническая диагностика / Д.К. Шибата. – М.: Мир, 1999. – 572 с. 74. Чан, В-Т.В. Гибридизация нуклеиновых кислот. Молекулярная клиническая диагностика / В-Т.В. Чан. – М.: Мир, 1999. – 594 с. 75. Янковский, Н.К. Молекулярно-генетические методы в руках детектива / Н.К. Янковский // Соросовский образовательный журнал. – 1996. – № 2. – С. 21-27. 76. Alston, F.H. A Malus gene list / F.H. Alston, K.L. Phillips, K.M. Evans // Acta Hort. – 2000. – Vol. 538. – Р. 561-570. 116 77. Afunian, M.R. Linkage Vfa4 in Malus × domestica and Malus floribunda with Vf resistanse to the apple scab pathogen Venturia inaequalis / M.R. Afunian, P.H. Goodwin, D.M. Hunter // Plant Pathology. – 2004. – Vol. 53. – P. 461-467. 78. Aharon, A. DNA microarrays for functional plant genomics / A. Aharon, O.Vorst // Plant Mol. Biol. – 2001. – Vol. 48. – P. 99-118. 79. Aldwinckle, H.S. Early determination of genotypes for apple scab resistance by forced flowering of test cross progenie / H.S. Aldwinckle, H.L.Gustafson, R.C. Lamb // Euphytica. – 1976. – Vol. 25. – P. 185-191. 80. Avise, J.C. Molecular markers, natural history and evolution / J.C. Avise, 1994. – 122 p. 81. Baldi, P. Clonning and linkage mapping of resistance gene homologues in apple / P. Baldi, A. Patocchi, E. Zini, C. Toller, R. Velasco, M. Komjanc // Theor. Appl. Genet. – 2004. – Vol. 109. – P. 231-239. 82. Barnes, E.H. The role of phloridzin in the postparasite physiology of the apple scab disease / E.H. Barnes, E.B. Williams // Can. J. Microbiol. – 1961. – Vol. 7. – P. 525-534. 83. Bayan, M.M. Genetic Identification of Some Syrian Local Apple (Malus sp.) Cultivars Using Molecular Markers / M.M. Bayan, A.A.Y. Rania, E.-H. Ola, M.I. Omayma // Research Journal of Agriculture and Biological Sciences. – 2007. – Vol. 3 (6). – P. 704-713. 84. Benaouf, G. Genetics of host-pathogen relationships between Venturia inaequalis race 6 and 7 and Malus species/ G. Benaouf, L. Parisi // Phytopathology. – 2000. – Vol. 90. – P. 236-242. 85. Bolar, J.P. Synergistic activity of endochitinase and exochitinase from Trichoderma atroviride (T. harzianum) against the pathogenic fungus (Venturia inaequalis) in transgenic apple plants/ J.P. Bolar, J.L. Norelli, G.E. Harman, S.K. Brown, H.S. Aldwinckle // Transgenic Research. – 2001. – Vol. 10. – P. 533–543. 86. Bolar, J.P. Expression of endochitinase from Trichoderma harzianum in transgenic apple increases resistance to apple scab and reduces vigor / J.P. Bolar, J.L. 117 Norelli, K.-W. Wong, C.K. Hayes, G.E. Harman, H.S. Aldwinckle // Phytopathology. – 2000. – Vol. 90. – P. 72–77. 87. Boskovic, R. Correlation of stylar rybonuclease isoenzymes with incompatibility alleles in apple / R. Boskovic, K.R. Tobuut // Euphytica. – 1999. – Vol. 107. – P. 29–43. 88. Вotstein, D. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms / D. Вotstein, R.L.White, M. Skolnick, R.V. Davis // Amer. J. Hum. Genet. – 1980. – Vol. 32. – P. 314 – 331. 89. Boudichevskaia, A. Development of molecular markers for Vr1, a scab resistance factor from R12740-7A apple / A. Boudichevskaia, H. Flachowsky, C. Fischer, V. Hanke, F. Dunemann // Acta Hortic. – 2004. – Vol. 663. – P 171-175. 90. Boudichevskaia, A. Development of multiallelic SCAR marker for the scab resistance gene Vr1/ Vh4/ Vx from R12740-7A apple and it`s utility for molecular breeding / A. Boudichevskaia, H. Flachowsky, C. Fischer, V. Hanke, F. Dunemann // Tree Genetics and Genomes. – 2006. – Vol. 2. – P. 186-195. 91. Broothaerts, W. New findings in apple S-genotype analysis resolve previous confusion and request the re-numbering of some S-alleles / W. Broothaerts // Theor. Appl. Genet. – 2003. – Vol. 106. – P. 703–714. 92. Broothaerts, W. cDNA cloning and molecular analysis of two selfincompatibility alleles from apple / W. Broothaerts, G. Janssens, P. Proost, W. Broekaert // Plant. Mol. Biol. – 1995. – Vol. 27. – P. 449-511. 93. Bus, V.G.M. The Vh8 locus of a new gene-for-gene interaction between Venturia inaequalis and the wild apple Malus sieversii is closely linked to the Vh2 locus in Malus pumila R12740-7A / V.G.M. Bus, F.N.D. Laurens, W.E. Van De Weg, R.L. Rusholme, E.H.A. Rikkerink, S.E. Gardiner, H.C.M. Bassett, L.P. Kodde, K.M. Plummer // New Phytologist. – 2005. – Vol. 166. – P. 1035-1049. 94. Bus, V.G.M. The Vh2 and Vh4 scab resistance genes in two differential hosts derived from Russian apple R12740-7A map to the same linkage group of apple / V.G.M Bus, E.H.A Rikkerink, E.W.V. de Weg, R.L. Rusholme, S.E. 118 Gardiner, H.C.M. Bassett, L.P. Kodde, L. Parisi, F.N.D. Laurens, E. Meulenbroek, K.M Plummer // Molecular Breeding. – 2005. – Vol. 15. – P. 103–116. 95. Castiglioni, P. An AFLP-Based Procedure for the Efficient Mapping of Mutations and DNA Probes in Barley / P. Castiglioni, C. Pozzi, M. Heun, V. Terzi, K.J. Muller, W. Rohde, F. Salamini // Genetics. – 1998. – Vol. 149. – P. 2039-2056. 96. Cao, H. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats / H. Cao, J. Glazebrook, J.D. Clarke, S. Volko, X. Dong // Cell. – 1997. – Vol. 88. – P. 57–63. 97. Cheng, F.S. Development of a DNA marker for Vm, a gene conferring resistance to apple scab / F.S.Cheng, N.F.Weeden, S.K. Brown // Genome. – 1998. – Vol. 41. – P. 208-214. 98. Christopher, M.R. Genetic diversity and population structure in Malus sieversii, a wild progenitor species of domesticated apple / M.R. Christopher, G.M. Volk, A.A. Reilley, A.D. Henk, D.R. Lockwood, P.A. Reeves, P.L. Forsline // Tree Genetics & Genomes. – 2009. – Vol. 5. – P. 339–347. 99. Daeton, D. Disease Resistance / D. Daeton, R.L. Bell, E.B. Williams // Methods in Fruit Breeding. – 1983. – P.189-215. 100. De Nettancourt, D. Incompatibility in angiosperms / D. De Nettancourt // Theoretical and Applied Genetics. – 1977. – Vol. 3. – P. 55-69. 101. Diwan, N. Automated sizing of fluorescent-labeled simple sequence repeat (SSR) markers to assay genetic variation in soybean / N.Diwan, P.B. Cregan // Theor. Appl. Genet. – 1997. – Vol. 95. – P. 723-733. 102. Doyle, J.J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue / J.J.Doyle, J.L. Doyle // Phytochem. Bull. – 1987. – Vol. 19. – P. 11-15. 103. Dudley, J.W. Molecular markers in plant improvement-manipulation of genes affecting quantitative traits / J.W. Dudley // Crop science. – 1993. – Vol. 33. – P. 660-668. 104. Durel, C.E. An overview of the position and robustness of scab resistance QTLs and major genes by aligning genetic maps of five apple progenies / C.E.Durel, 119 F.Calenge, L.Parisi, Van de Weg, W.E. Kodde, R.Liebhard, C.Gessler, M.Thiermann, F.Dunemann, F.Gennari, S. Tartarini // Acta Hort. – 2004. – Vol. 663. – P. 135-140. 105. Durel, C.E. Genetic dissection of partial resistance to race 6 of Venturia inaequalis in apple / C.E. Durel, L. Parisi, F. Laurens, V.de Weg, R. Liebhard, M.F. Jourjon // Genome. – 2003. – Vol. 46. – P. 224-234. 106. Evans, K.M. Identification of SCAR markers linked to Pl-w moldew resistance in apple / K.M.Evans, C.M. James // Theor. Appl. Genet. – 2003. – Vol. 106. – P. 1178-1183 107. Faize, M. Chitinases of Trichoderma atroviride induce scab resistance and some metabolic changes in two cultivars of apple / M. Faize, M. Malnoy, F. Dupuis, M. Chevalier, L. Parisi, E. Chevreau // Phytopathology. – 2003. – Vol. 93. – P. 1496– 1504. 108. Faize, M. Expression of wheat puroindoline-b reduces scab susceptibility in transgenic apple (Malus domestica Borkh.) / M. Faize, S. Sourice, F. Dupuis, L. Parisi, M.F. Gautier, E. Chevreau // Plant Science. – 2004. – Vol. 167. – P. 347-354. 109. Fernandez-Fernandez, F. Development of an STS map of an interspecific progeny of Malus / F. Fernandez-Fernandez, K.M. Eans, J.B. Clarke, C.L. Govan, C.M. James, S. Maric, K.R. Tobutt // Tree Genetic & Genomic. – 2008. – Vol. 4. – P. 469-479. 110. Fischer, C. Apple breeding in the Federal Centre for plant breeding research, Institute for fruit breeding at Dresden-Pillnitz, Germany / C. Fischer // Acta Hortic. – 2000. – Vol. 538. – P. 225-227. 111. Gao, Z.S. Genomic cloning and linkage mapping of the Mal d 1 (PR-10) gene family in apple (Malus domestica) / Z.S. Gao, W.E. V. De Weg, J.G. Schaart, H.J. Schouten, D.H. Tran, L.P. Koddle, I.M.V. Der Meer, A.H.M. Van Der Geest, J. Koddle, H. Breiteneder, K. Hoffmann-Sommergruber, D. Bosch, L.J.W.J. Gilissen // Theor. Appl. Genet. – 2005. – Vol. 111. – P. 171-183. 112. Gardiner, S.E. Apple / S.E. Gardiner, V.G.M. Bus, R.L. Rusholme, D. Chagne, E.H.A. Rikkerink // Genome Mapping and Molecular Breeding. – 2007. – P. 1-62. 120 113. Gasia, F. Genetic assessment of apple germplasm in Bosnia and Herzegovina using microsatellite and morphologic markers / F. Gasia, S. Silvio, P. Naris, K. Mirsad, I. Peji // Scientia Horticulturae. – 2010. – Vol. 126. – P. 164-171. 114. Gau, A.E., Koutb M., Piotrowski M., Kloppstech K. Accumulation of pathogenesis-related proteins in the apoplast of a susceptible cultivar of apple (Malus domestica cv. Elstar) after infection by Venturia inaequalis and constitutive expression of PR genes in the resistant cultivar Remo / A.E. Gau, M. Koutb, M. Piotrowski, K. Kloppstech // European Journal of Plant Pathology. – 2004. – Vol. 110. – P. 703–711. 115. Gessler, C. Venturia inaequalis resistance in apple / C. Gessler, A. Patocchi, S. Sansavini, S. Tartarini, L. Gianfranceschi // Critical Reviews in Plant Sciences. – 2006. – Vol. 25. – P. 475-477. 116. Gharghani, A. Genetic identity and relationships of Iranian apples (Malus×domestica Borkh) cultivars and landraces, wild apple species and representative old apple cultivars based on SSR markers / A. Gharghani, Z. Zamani, A. Talaie, N.C. Oraguzie, R. Fatahi, H. Hajnajari, C. Wiedow, S.E. Gardiner // Genet. Resour. Crop. Evol. – 2009. – Vol. 56. – P. 829-842. 117. Gianfranceschi, L. Molecular selection in apple for resistance to scab caused by Venturia inaequalis / L. Gianfranceschi, B. Koller, N. Seglias, M. Kellerhals, C. Gessler // Theor. Appl. Genet. – 1996. – Vol. 93. – P. 199-204. 118. Gianfranceschi, L. Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple / L. Gianfranceschi, N. Seglias, R. Tarchini, M. Komjanc, C. Gessler // Theor Appl Genet. – 1998. – Vol. 96. – P.1069-1076. 119. Goodman, R.N. The Hypersensitive Reaction in Plants to Pathogens / R.N. Goodman, A.J. Novacky, 1994. – 256 p. 120. Gopaljee, J. The Venturia Apple Pathosystem: PathogenicityMechanisms and Plant Defense Responses / J. Gopaljee, K. Thakur, P. Thakur // Journal of Biomedicine and Biotechnology. – 2009. – P.10 121. Grodzicker, T. Cold Spring Harbor / T. Grodzicker, J. Williams, P. Sharp, J. Sambrook // Symp. Quant. Biol. – 1974. – Vol. 39. – P.439 121 122. Gygax, M. Molecular markers linked to the apple scab resistance gene Vbj derived from Malus baccata jacki / M. Gygax, L. Gianfranceschi, R. Liebhard, M. Kellerhals, C. Gessler, A. Patocchi // Theor. Appl. Genet. – 2004. – Vol. 109. – P. 1702-1709. 123. Hegedûs, A. Review of the self-incompatibility in apple (Malus×domestica Borkh., syn.: Malus pumila Mill.) / A. Hegedûs // International Journal of Horticultural Science. – 2006. – Vol. 12. – P. 31–36. 124. Hemmat, M. Identification and mapping of markers for resistance to apple scab from ‘Antonovka’ and ‘Hansen’s baccata №2’ / M. Hemmat, S.K. Brown, H.S. Aldwinckle, S.A. Mehlenbacher, N.F. Weeden // Acta Horticulturae. – 2003. – Vol. 622. – P. 153-161. 125. Hemmat, M. Tagging and mapping scab resistance genes from R127407A apple / M. Hemmat, S.K. Brown, N.F. Weeden // Journal of the American Society of Horticultural Science. – 2002. – Vol. 127. – P. 365-370. 126. Hokanson, S.C. Microsatellite (SSR) markers reveal genetic identities, genetic diversity and relationships in a Malus domestica Borkh. core subset collection / S.C. Hokanson, A.K. Szewc-McFadden, W.F. Lamboy, J.R. McFerson // Theor. Appl. Genet. – 1998. – Vol. 97. – P. 671-683. 127. Hoy, T.K. Determination of Self-Incompatibility Genotypes of Korean Apple Cultivars Based on S-Rnase PCR / T.K. Hoy, G. Hatteri, Y. Hirata, D.I. Kim, J.H. Hwang, Y.U. Shin, I.S. Nou // Journal of Plant Biology. – 2006. – Vol. 49 (6). – P. 448-454. 128. Ignazio, V. Development and evaluation of a 9K SNP array for Peach by internationally coordinated SNP detection and validation in breeding germplasm / Ignazio V., B. Nahla, S. Simone, B. Gilmore, C.T. Lawley, K. Gasic, D. Micheletti, U.R. Rosyara, F. Cattonaro, E. Vendramin, D. Main, V. Aramini, A.L. Blas, T.C. Mockler, D.W. Bryant, L. Wilhelm, M. Troggio, B. Sosinski, M.J. Aranzana, P. Arus, A. Lezzoni, M. Morgante, C. Peace // PloS ONE. – 2012. – Vol. 7 (4). – P. 356-368. 122 129. Ishimizu, T. PCR-based method for identifying the S-genotypes of Japanese pear cultivars / T. Ishimizu, K. Inoue, M. Shimonaka, T.Saito, O. Terai, S. Norioka // Theor. Appl. Genet. – 1999. Vol. 98. – P. 961–967. 130. Janick, J. Apples / J. Janick, J.N. Cumminis, S.K. Brown, M. Hemmat // Fruit breeding. – 1996. – Vol. 1. – P. 1-77. 131. Jansen, R.C. A Comment on Codominant Scoring of AFLP Markers / R.C. Jansen, H. Geerlings, A. Oeveren J.V., R.C. Van Schaik // Genetics. – 2001. – Vol. 158. – P. 925-926. 132. Janssens, G.A. A molecular method for S-allele identification in apple based on allele-specific PCR / G.A. Janssens, I.J. Goderis, W.F. Broekaert, W. Broothaerts // Theor. Appl. Genet. – 1995. – Vol. 91. – P. 691-698. 133. Kalendar, R. IRAP and REMAP: Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques / R. Kalendar, T. Grob, M. Regina, A. Suoniemi, A.H. Schulman // Theoretical and Applied Genetics. – 1999. – Vol. 98. – P. 704-711. 134. Kalendar, R. IRAP and REMAP for retrotransposon-based genotyping and fingerprinting / R. Kalendar, A.H. Schulman // Nature Protocols. – 2006. Vol. 1 (5). – P. 2478-2484. 135. Kenis, K. Genetic linkage maps of two apple cultivars (Malus x domestica Borkh.) based on AFLP and microsatellite markers / K. Kenis, J. Keulemans // Molecular Breeding. – 2005. Vol. 15 (2). – P. 205-219. 136. Kenis, K. Study of tree architecture of apple (Malus x domestica Borkh.) by QTL analysis of growth traits / K. Kenis, J. Keulemans // Molecular Breeding. – 2007. – Vol. 19. – P. 193-208. 137. King, G.J. Quantitative genetic analysis and comparison of physical and sensory descriptors relating to fruit flesh firmness in apple (Malus pumila Mill.) / G.J. King, C. Maliepaard, J.R. Lynn, F.H. Alston, C.E. Durel, K.M. Evans, B. Griffon, F. Laurens, A.G. Manganaris, E. Schrevens, S. Tartarini, J. Verhaegh // Theor. Apple. Genet. – 2000. – Vol. 100. – P. 1074-1084. 123 138. Kobel, F. Weitere Untersuchungen über die Befruchtungsverh ltnisse der Apfel-und Bimsorten / F. Kobel, P. Steinegger, J. Anliker // Landw. Jb. Schweiz. – 1939. – Vol. 53. – P. 160–191. 139. Komori, S. Discrimination of cross incompatibility by number of seeds per fruit and fruit set percentage in apples / S. Komori, J. Soejima, Y. Ito, H. Bessho, K. Abe, N. Kotoda // Bull. Natl. Inst. Fruit Tree Sci. – 1999. – Vol. 33. – P. 97–112. 140. Kuc, J. The effect to amino acids on the susceptibility of apple varieties to scab / J. Kuc, E. Barnes, A. Daftsions, E.B. Williams // Phytopatology. – 1959. Vol. 49. – P. 313-315. 141. Kurata, N., Umehara Y., Tanoue H., Sasaki T. Physical mapping of the rice genome with YAC clones // Plant. Mol. Biol. Vol. 35. – 1997. – P. 101-113. 142. Laima, A. Development of a dense SNP-based linkage map of an apple rootstock progeny using the Malus Infinium whole genome genotyping array / F. Fernandes-Fernandes J. Jansen, E. Banchi, K.M. Ewans, R. Viola, R. Velasco, J.M. Dunwell, M. Troggio, D.J. Sargent // BMC Genomics. – 2012. Vol. 13. – P. 203-213. 143. Laurens, F. Review of the current apple breeding programs in the world: objectives for scion cultivar improvement / F. Laurens // Acta Hortic. – 1999. – Vol. 484. – P. 163-170. 144. Lespinasse, V. Apple scab. Resistance and durability. New races and strategies for the future / V. Lespinasse // Progress in temperate fruit breeding. – 1994. – P. 105-106. 145. Liebhard, R. Development and characterization of 140 new microsatellites in apple (Malus domestica Borkh.) / R. Liebhard, L. Gianffranceschi, B. Koller, C.D. Ryder, R. Tarchini E., V.De Weg, C. Gessler // Molecular Breeding. – 2002. – Vol. 10. – P. 217-241. 146. Liebhard, R. Creating a saturated reference map for the apple (Malus domestica Borkh.) genome / R. Liebhard, B. Koller, L. Gianffranceschi, C. Gessler // Theor. Appl. Genet. – 2003. – Vol. 106. – P. 1497–1508. 124 147. Litt, M. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene / M. Litt, J.A. Luty // Am.J.Hum.Genet. – 1989. – Vol. 44. – P. 388-396. 148. Luu, D.T. S-Rnase uptake by compatible pollen tubes in gametophytic self-incompatibility / D.T. Luu, X. Qin, D. Morse, M. Cappadocia // Nature. – 2002. – Vol. 407. – P. 649–651. 149. MacHardy, W.E. Apple Scab, Biology, Epidemiology, and Management / W.E. MacHardy, 1996. – 545 p. 150. MacHardy, W. E. Parasitic and biological fitness of Venturia inaequalis: relationship to disease management strategies / W.E. MacHardy, D.M. Gadoury, C. Gessler // Plant Disease. – 2001. – Vol. 85. – P. 1036–1051. 151. MacLennan, D.H. Chemotherapy of the apple scab disease with butyric acid derivatives / D.H. MacLennan, J. Kuc, E.B. Williams // Phytopathology. – 1963. – Vol. 53. – P. 1261-1266. 152. Maliepaard, C. Aligning male and female linkage maps of apple (Malus pumila Mill.) using multi-allelic markers / C. Maliepaard, F. Alston, G.V. Arkel, L.M. Brown, E. Chevreau, F. Dunemann, K.M. Evans, S. Gardiner, P. Guilford, A.W. Van Heusden, J. Janse, F. Laurens, J.R. Lynn, A.G. Manganaris, A.P.M. den Nijs, N. Periam, E. Rikkerink, P. Roche, C. Ryder, S. Sansavini, H. Schmidt, S. Tartarini, J.J. Verhaegh, M. Vrielink-van Ginkel, G.J. King // Theor. Appl. Genet. – 1998. – Vol. 97. – P. 60-73. 153. Malnoy, M. Overexpression of the apple MpNPR1 gene confers increased disease resistance in Malus domestica / M. Malnoy, Q. Jin, E. E. Borejsza-Wysocka, S.Y. He, H.S. Aldwinckle // Molecular Plant-Microbe Interactions. – 2007. – Vol. 20. – P. 1568-1580. 154. Markussen, T. Identification of PCR-based markers linked to the powdery-mildew-resistance gene PlI from Malus robusta in cultivated apple / T. Markussen, J. Kruger, H. Schmidt, F. Dunneman // Plant Breeding. – 1995. – Vol. 114. – P. 530-534. 125 155. Martinez, L.E. SSR-based assessment of genetic diversity in South American Vitis vinifera varieties / L.E. Martinez, P.F.Cavagnaro, R.W. Masuelli, M. Zuniga // Plant Sci. – 2006. – Vol. 170. – P. 1036-1044. 156. Matsumoto, S. Discovery of a new selfincompatibility allele in apple / S. Matsumoto, K. Kitahara // Hortscience. – 2000. – Vol. 35. – P. 1329-1332. 157. Matsumoto, S. A functional S-allele, ‘Sg’, in the wild apple possessing a single amino acid, S-Rnase ‘Sg0-Rnase’, different from ‘Sg-Rnase’ in Malus 9 domestica cultivars / S. Matsumoto, K. Kitahara, H. Komatsu, J. Soejima // J. Hortic. Sci. Biotechnol. – 2001. – Vol. 76. – P. 163-166. 158. Matsuura, T. Crystal structure at 1.5-A resolution of Pyrus pyrifolia pistil ribonuclease responsible for gametophytic self-incompatibility / T. Matsuura, H. Sakai, M. Unno, K. Ida, M. Sato, F. Sakiyama, S. Norioka // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 48. – P. 45261-45269. 159. McClure, B.A. Style self-incompatibility gene products of Nicotiana alata are ribonucleases / B.A. McClure, P.R. Ebert, M.A. Anderson, R.J. Simpson, F. Sakiyama, A.E. Clarke // Nature. – 1989. – Vol. 342. – P. 955-957. 160. McCouch, S.R. Microsatellite marker development, mapping and applications in rice genetics and breeding / S.R. McCouch, X. Chen, O. Panaud, S. Temnykh // Plant Mol. Biol. – 1997. – Vol. 35. – P. 89-99. 161. Mohan, M. Genome mapping, molecular marker and marker-assisted selection in crop plants / M. Mohan, S. Nair, A. Bhagwat, T.G. Krishna, M. Yano, C.R. Bhatia, T. Sasaki // Molecular Breeding. – 1997. – Vol. 3. – P. 87-103. 162. Morgante, M. PCR-amplified microsatellite markers in plant genetics / M. Morgante, A.M. Oliveri // Plant J. – 1993. – Vol. 3. – P. 175-182. 163. Mueller, U.G. AFLP genotyping and fingerprinting / U.G. Mueller, L. Wolfenbarger // Trends Ecol. – 1999. – Vol. 14. – P. 389-394. 164. Murray, M. G. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA / M.G. Murray, W.F. Thompson // Nucleic Acids Research. – 1980. – Vol. 10. – P. 4321-4325. 126 165. Nei, M. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases / M. Nei, W.-H. Li // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1979. – Vol. 76. – P. 5269-5273. 166. Oraguzie, N.C. Genetic diversity and relationship in Malus sp. Germplasm collections as determined by Random Amplified Polymorphic DNA / N.C. Oraguzie, S.E. Gardiner, H.C.M. Basset, S. Mirko, R.D. Ball, V.G.M. Bus, G. W. Allan // Journal of American Society of Horticultre Science. – 2001. – Vol. 126 (3). – P. 318-328. 167. Oraguzie, N.C. DNA fingerprinting of apple (Malus spp.) rootstocks using Simple Sequence Repeats / N.C. Oraguzie, T. Yamamoto, J. Soejima, T. Suzuki, H.N. De Silva // Plant Breed. – 2005. – Vol. 124. – P. 197-202. 168. Patocchi, A. Vr2: a new apple scab resistance gene / A. Patocchi, B. Bigler, B. Koller, M. Kellerhals, C. Gessler // Theoretical and Applied Genetics. – 2004. – Vol. 109. – P. 1087-1092. 169. Patocchi, A. Identification by genome scanning approach (GSA) of a microsatellite tightly associated with the apple scab resistance gene Vm / A. Patocchi, M. Walser, S. Tartarini, G.A.L. Broggini, F. Gennari, S. Sansavini, C. Gessler // Genome. – 2005. – Vol. 48. – P. 630-636. 170. Pereira-Lorenzo, S. Evaluation of genetic identity and variation of local apple cultivars (Malus domestica Borkh.) from Spain using microsatellite markers / S. Pereira-Lorenzo, A.M. Ramos-Cabrer, M.B. Diaz-Hernandez // Genet. Resour. Crop. Evol. – 2007. – Vol. 54. – P. 405-420. 171. Pereira-Lorenzo, S. Genetic assessment of local apple cultivars from La Palma, Spain, using simple sequence repeats (SSRs) / S. Pereira-Lorenzo, A.M. Ramos-Cabrer, A.J. Gonzalez-Diaz, M.B. Diaz-Hernandez // Scientia Horticulturae. – 2008. – Vol. 117. – P. 160-166. 172. Rogers, S.O. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues / S.O. Rogers, A.J. Bendich // Plant Molecular Biology. – 1985. – Vol. 5 – P. 69-76, 127 173. Rozemarijn Dreesen, S.G. Analysis of Malus S-Rnase gene diversity based on comparative study of old and modern apple cultivars and European wild apple / S.G. Rozemarijn Dreesen, B.T.M. Vanholme, K. Luyten, L. Van Wynsberghe, G. Fazio, I. Roldan-Ruiz, J. Keulemans // Mol. Breeding. – 2010. – Vol. 26. – P. 693709. 174. Saji, S. A physical map with yeast artificial chromosome (YAC) clones covering 63% of the 12 rice chromosomes / S. Saji, Y. Umehara, A.A. Baltazar, H. Yamane, H.A. Tanoue // Genome. – 2001. – Vol. 44. – P. 32-37. 175. Sakurai, K. Determining the selfincompatibility alleles of Japanese apple cultivars / K. Sakurai, S.K. Brown, N.F. Weeden // Hort. Science. – 1997. – Vol. 32. – P. 1258-1259. 176. Sakurai, K. Self-incompatibility alleles of apple cultivars and advanced selections / K. Sakurai, S.K. Brown, N.F. Weeden // Hort. Science. – 2000. – Vol. 35. – P. 116-119. 177. Sassa, H. Identification of selfincompatibility related glycoproteins in styles of apple (Malus domestica) / H. Sassa, N. Mase, H. Hirano, H. Ikehashi // Theor. Appl. Genet. – 1994. – Vol. 89. – P. 201-205. 178. Satish, K. Novel genomic approaches unravel genetic architecture of complex traits in apple / K. Satish, D.J. Garrick, M.C.A.M. Bink, C. Whitworth, D. Chagne, R.K. Volz // BMC Genomics. – 2013. – Vol. 14. – P. 393-406. 179. Schulman, A.H. Molecular markers to assess genetic diversity / A.H. Schulman // Euphytica. – 2007 – Vol. 158 (3). – P. 313-321. 180. Schlotterer, C. Polymorphism and locus-specific effects on polymorphism at microsatellite loci in natural Drosophila melanogaster populations / C. Schlotterer, M. Soller // Genetics. – 1997. – Vol. 146. – P. 309-320. 181. Shenshan, L. Characterization of three new S-alleles and development of an S-allele-specific PCR system for rapidly identifying the S-genotype in apple cultivars / Shenshan L., Maofu L., Zhenhai H., Kun W., Tianzhong L. // Tree Genetics & Genomes. – 2010. – Vol. 6. – P. 161-168. 128 182. Shulaev, V. Multiple Models for Rosaceae Genomics / V. Shulaev, S.S. Korban, B. Sosinski, A.G. Abbott, H.S. Aldwinckle, K.M. Folta, A. Iezzoni, D. Main, P. Arus, A.M. Dandekar, K. Lewers, S.K. Brown, T.M. Davis, S.E. Gardiner, D. Potter, R.E. Veilleux // Plant Physiology. – 2008. – Vol. 147 .– P. 985-1003. 183. Silfverberg-Dilworth, E. Microsatellite markers spanning the apple (Malus × domestica Borkh.) genome / E. Silfverberg-Dilworth, C.L. Matasci, W.E. Van de Weg, M.P.W. Van Kaauwen, M. Walser, L.P. Kodde, V. Soglio, L. Gianfranceschi, C.E. Durel, F. Costa, T. Yamamoto, B. Koller, C. Gessler, A. Patocchi // Tree Genetics &Genomes. – 2006. – Vol. 2. – P. 202-224. 184. Sladana, M. Application of molecular markers in apple breeding / M. Sladana, M. Lukic, R. Cerovic, M. Mitrovic, R. Boskovic // Genetika. .– 2010. – Vol. 42 (2). – P. 359-375. 185. Soriano, J.M. Identification and mapping of the novel apple scab resistance gene Vd3 / J.M. Soriano, S.G. Joshi, M. van Kaauwen, Y. Noordijk, R. Groenwold, B. Henken,, W.E. van de Weg, H.J. Schouten // Tree Genetics & Genomes. – 2009. – Vol. 5. – P. 475-482. 186. Soufflet-Freslon, V. Inheritance studies of apple scab resistance and identification of Rvi14, a new major gene that acts together with other broadspectrum QTL / V. Soufflet-Freslon, L. Gianfranceschi, A. Patocchi, C.-E. Durel // Genome. – 2008. – Vol. 51 (8). – P. 657-667. 187. Suprun, I. Genetic resources of rosaceous fruit crops in southern Russia and their use in the / I. Suprun, G. Eremin, E. Ulyanovskaya, A. Lugovskoy, V. Kochetkov // Sixth Rosaceous Genomics Conference. – 2012. – P. 123. 188. Suprun, I.I. Molecular genetic identification of alleles of selfincompatibility gene in Russian apple varieties / I.I. Suprun, E.V. Ul`yanovskaya, Ya.V. Ushakova, E.T. Il`nitskaya // Russian Agricultural Sciences. – 2011. – Vol. 37 (5). – P. 373-375 189. Suprun, I. Use of DNA-markers on Russian genetic resources collections and breeding of Rosaceous fruit crops / I. Suprun, S. Tokmakov, E. Ilnitskaya, I. Stepanov // Sixth Rosaceous Genomics Conference. – 2012. – P. 124. 129 190. Tanksley, S.D. Molecular markers in plant breeding // Plant. Mol. Biol. Rep. – 1983. – Vol. 1. – P. 3-8. 191. Tanksley, S.D. Advanced backcross QTL analysis: a method for the simultaneous discovery and transfer of valuable from unadapted germplasm into elite breeding lines / S.D. Tanksley, J.C. Nelson // Theor. Appl. Genet. – 1996. – Vol. 92. – P. 191-203. 192. Tartarini, S. Characterisation and genetic mapping of a major scab resistance gene from the old Italian apple cultivar “Durello di Forli” / S. Tartarini, F. Gennari, D. Pratesi, C. Palazzetti, S. Sansa vini, L. Parisi, V. Fouillet, C.E. Durel // Acta Hort. – 2004. – Vol. 663. – P. 129-133. 193. Thomas, M.R. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphism when analysed as sequence-tagged sites (STSs) / M.R. Thomas, N.S. Scott // Theor. Appl. Genet. – 1993. – Vol. 86. – P. 985-990. 194. Velasco, R. The genome of the domesticated apple (Malus × domestica Borkh) / R. Velasco, A. Zharkikh, A. Jason // Nature Genetics. – 2010. – Vol. 42. – P. 833-839. 195. Vinatzer, B.A. Apple contains receptor-like genes homologous to the Cladosporium fulvum resistance gene family of tomato with a cluster of genes cosegregating with Vf apple scab resistance / B.A. Vinatzer, A. Patocchi, L. Gianfranceschi, S. Tartarini, N.B. Zhang, C. Gessler, S. Sansvini // Molecular PlantMicrobe Interactions. – 2001. – Vol. 14. – P. 508-515. 196. Vinatzer, B.A. Isolation of two microsatellite markers from BAC clones of the Vf scab resistance region and molecular characterization of scab-resistant accessions in Malus germplasm / B.A. Vinatzer, A. Patocchi, S. Tartarini, L. Gianfranceschi, S.Sansavini, C. Gessler // Plant Breed. – 2004. – Vol. 123. – P. 321326. 197. Vos, P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. / P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker, M. Rejans, T.van de Lee, M. Hornes, A. Fritjers, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper, M. Zabeau // Nucl. Acids Res. – 1995. – Vol. 23. – P.44074414. 130 198. Wang, G.L. RFLP mapping of genes conferring complete and partial resistance to blast in a durably resistance rice cultivar / G.L. Wang, D.J. Mackill, M. Bonman, S.R. McCouch, M.C. Champoux, R. Nelson // Genetics. – 1994. – Vol. 136. – P. 1421-1434. 199. Waugh, R. Genetic distribution of Bare-1-like retrotransposable elements in the barley genome revealed by sequence-specific amplification polymorphisms (SSAP) / R. Waugh, K. McLean, A.J. Flavell, S.R. Pearce, A. Kumar, B.B. Thomas, W. Powell // Molecular General Genetics. – 1997. – Vol. 253 (6). – P. 687-694. 200. Weber, J.L. Human DNA polymorphism and methods of analysis / J.L. Weber // Curr. Opin. Biotechnol. – 1990. – Vol. 1. – P. 166-171. 201. Williams, E.B. Resistance in Malus to Venturia inaequalis / E.B. Williams, J. Kus // Annu. Rev. Phytopatol. – 1969. – Vol. 7. – P. 223-246. 202. Xu, M. A cluster of four receptor-like genes resides in the Vf locus that confers resistance to apple scab disease / M. Xu, S.S. Korban // Genetics. – 2002. – Vol. 162 (4). – P. 1995-2006. 131 ПРИЛОЖЕНИЯ Табличный материал к диссертационно й работе «Использование технологий ДНК-маркирования в селекционно-генетических исследованиях яблоги» Приложение А1 Таблица А1 – Изучаемые сорта яблони Сорт яблони 1 1. Аленушкино 2. Апорт АС 3.Дин Арт 4.Зефир 5.Золотая корона 6.Золотое летнее Родительские формы 2 Селекция ГНУ СКЗНИИСиВ Джонатан×Пармен зимний золотой Апорт кубанский × Кандиль кубанский С6-47 (Пепин шафранный × Джонатан) × Прима Редфри × Папировка тетраплоидная Голден Делишес Голден Делишес тетраплоидное Уэлси × Кубань спур Селекционеры 3 Артюх С.Н., Дутова Л.И. и др. Артюх С.Н. Артюх С.Н., Рапопорт И.А. и др. Ульяновская Е.В. Артюх С.Н. Ульяновская Е.В. , Дутова Л.И. и др. 7. Зори Кубани Наумова Л.С., Ефимова И.Л. и др. 8.Зимнее утро Либерти × Скарлет Стаймаред Артюх С.Н. 9. Кубанское багряное Ред Делишес × Джонаред Сергеев Л.М., Наумова Л.С. и др. 10.Кубань спур Радиационный клон сорта Артюх С.Н., Кубань (Антоновка Сергеев Л.М. и др. обыкновенная × Вагнера призовой) 11.Маяк станичный Аленушкино × Кубань 16-40 Артюх С.Н., Кошелева Т.А. 12. Нимфа Ренет Симиренко 17-36 × Артюх С.Н., Кубань спур Рапопорт И.А. и др. 13.Персиковое Кубань спур × Кальвиль Артюх С.Н., снежный Ефимова И.Л. и др. 14.Талида Голден Спайер × Уэлси Ульяновская Е.В. тетраплоидный 132 Продолжение таблицы А1 1 2 3 15.Фея Мантет × Папировка Дутова Л.И., тетраплоидная Ульяновская Е.В. и др. 16.Фортуна Прима × Алкмене Дутова Л.И., Рагулина Т.В. и др. Селекция ВНИИСПК 17.Афродита Форма 814 (M. floribunda × Седов Е.Н., Серова Голден Делишес) З.М. и др. 18.Болотовское Скрыжапель × 1924 (IV Седов Е.Н., Серова поколение от M. floribunda) З.М. и др. 19.Имрус Антоновка обыкновенная × Седов Е.Н., З.М. OR18T13 Серова и др. 20.Орловское полесье Форма 814 (M. floribunda × Седов Е.Н., Серова Голден Делишес) З.М. и др. 21.Первинка Антоновка краснобочка × SR Седов Е.Н., Серова 0523 З.М. и др. 22.Свежесть Антоновка краснобочка × Седов Е.Н., Серова PR12T67 (Уэлси × F2 M. З.М. и др. floribunda) 23.Славянин Антоновка краснобочка × SR Седов Е.Н. 0523 24.Солнышко Форма 814 (M. floribunda × Седов Е.Н., Серова Голден Делишес) З.М. и др. 25.Старт Форма 814 (M. floribunda × Седов Е.Н., Серова Голден Делишес) × Мекинтош З.М. и др. тетраплоидный 26.Строевское Форма 814 (M. floribunda × Седов Е.Н., Серова Голден Делишес) З.М. и др. 27.Юбилей Москвы Форма 814 (M. floribunda × Седов Е.Н., Серова Голден Делишес) З.М. и др. 28.Юбиляр Форма 814 (M. floribunda × Седов Е.Н., Серова Голден Делишес) З.М. и др. Селекция СКЗНИИСиВ совместно с ВНИИСПК 29.Амулет Редфри × Папировка Ульяновская Е.В., тетраплоидная Дутова Л.И. и др. 30.Василиса Прима × Уэлси Ульяновская Е.В., тетраплоидный Дутова Л.И. и др 31.Екатеринодарское Прима × Уэлси Ульяновская Е.В., тетраплоидный Дутова Л.И. и др. 32.Кармен Прима × Уэлси Ульяновская Е.В., тетраплоидный Дутова Л.И. и др. 33.Красный янтарь Редфри × Папировка Ульяновская Е.В., тетраплоидная Дутова Л.И. и др. 133 Окончание таблицы А1 1 2 3 34.Любава Прима × Уэлси Ульяновская Е.В., тетраплоидный Дутова Л.И. и др. 35.Ноктюрн Прима × Уэлси Ульяновская Е.В., тетраплоидный Дутова Л.И. и др. 36.Рассвет Редфри × Папировка Ульяновская Е.В., тетраплоидная Дутова Л.И. и др. 37.Родничок Ветеран × Бессемянка Ульяновская Е.В., Дутова Л.И. и др. 38.Союз Редфри × Папировка Ульяновская Е.В., тетраплоидная Дутова Л.И. и др. 39.Тайна Прима × Уэлси Ульяновская Е.В., тетраплоидный Дутова Л.И. др. 40.Талисман Редфри × Папировка Дутова Л.И., Седов тетраплоидная Е.Н. и др. 41.Юнона Прима × Уэлси Ульяновская Е.В., тетраплоидный Дутова Л.И., Седов Е.Н. и др. Селекция Ставропольской опытной станции по садоводству 42.Казачка кубанская Джонатан × Мекинтош Кузнецов П.В. красный Иностранная селекция 43.Айдаред Вагнер × Джонатан Американская селекция 44.Голден Делишес Случайный сеянец Американская селекция 45.Голд Раш Голден Делишес × КО-ОП 17 Американская селекция 47.Мекинтош Свободное опыление сорта Канадская селекция Феймез 48. Прима сеянцы 14-510 (F2 26829- 2-2 Американская × Голден Делишес) × NY селекция 123249 49.Ред Делишес Красноплодный клон Голден Американская Делишес селекция 50. Ренет Симиренко Неизвестное происхождение Обнаружен Симиренко Л.П. 134 Приложение А2 Таблица А2 – Изучаемые элитные формы яблони селекции ГНУ СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК Элитная форма яблони 1 1) 12/1-21-13 2) 12/1-21-16 3) 21/1-21-19 4) 5) 6) 7) 8) 12/1-21-26 12/1-21-33 12/1-21-43 12/1-21-48 12/1-21-62 9) 12/1-21-68 10) 12/1-21-74 11) 12/1-21-80 12) 12/2-20-1 13) 12/2-20-20 14) 12/2-20-27 15) 12/2-20-38 16) 12/2-20-50 17) 12/2-20-53 18) 12/2-21-2 19) 12/2-21-4 20) 12/2-21-10 21) 12/2-21-33 22) 12/2-21-70 23) 12/3-20-15 24) 12/3-20-16 25) 12/3-20-17 26) 12/3-20-31 Родительские формы 2 Айдаред × Балсгард 0247 Е Айдаред × Балсгард 0247 Е Голден Делишес тетраплоидный × [Вольф Ривер × (Вольф Ривер × M. astrosanguinea 804/240-57)] Айдаред × Балсгард 0247 Е Аленушкино × Прима Айдаред × Балсгард 0247 Е Айдаред × Балсгард 0247 Е Голден Делишес тетраплоидный × [F2 M. floribunda × Голден Делишес тетраплоидный] Голден Делишес тетраплоидный × [F2 M. floribunda × Голден Делишес тетраплоидный] Голден Делишес тетраплоидный × [Вольф Ривер × (Вольф Ривер × M. astrosanguinea 804/240-57)] Прима × Старк Джон Граймс Ред спур × Уэлси тетраплоидный Прима × Корей Прима × Корей Голден Делишес тетраплоидный × [F2 M. floribunda × Голден Делишес тетраплоидный] Айдаред × Балсгард 0247 Е Айдаред × Балсгард 0247 Е Прима × Старк Джон Граймс Айдаред × Балсгард 0247 Е Ренет Симиренко × (M. floribunda 821 × Мелба Айдаред × Балсгард 0247 Е Айдаред × Балсгард 0247 Е Прима × Старк Джон Граймс Прима × Старк Джон Граймс Прима × Старк Джон Граймс Балсгард 0247 Е × Голден Делишес тетраплоидный 135 Окончание таблицы А2 1 27) 12/3-21-6 28) 12/3-21-9 29) 12/3-21-17 30) 12/3-21-20 31) 12/3-21-28 32) 12/3-21-32 33) 27-2-218 34) 27-2-222 35) 27-2-276 36) 29-7-101 37) 30-61-116 38) 31-34-40 39) 31-31-128 40) 29-5-44 41) 44-24-36-Ю 42) 44-24-38-С 43) 44-24-39-Ю 44) 44-24-49-Ю 45) 44-27-52-СЗ 46) 44-27-60-С 47) 44-27-74-В 48) 44-27-75-З 49) 44-29-9-С 50) 44-29-30-З 51) 44-29-39-В 52) 44-29-61-СЗ 53) К-90 2 Айдаред × Балсгард 0247 Е Айдаред × Балсгард 0247 Е Голден Делишес тетраплоидный × [Вольф Ривер × M. astrosanguinea 804/240-57)] Голден Делишес тетраплоидный × [Вольф Ривер × (Вольф Ривер × M. astrosanguinea 804/240-57)] Айдаред × Балсгард 0247 Е Айдаред × Балсгард 0247 Е 16-37-116 (Антоновка краснобочка) × Бессемянка мичуринская 18-56-146 (SR0523 × 1924) × Бессемянка мичуринская 18-56-146 (SR0523 × 1924) × Бессемянка мичуринская 16-37-86 (Антоновка краснобочка × SR0523) × 18-61-139 (OR40T34 – свободное опыление) Первинка × 23-16-93 (814 – свободное опыление) 224-18 (SR0523 × Важак) × 22-34-95 (814 × ПА-29-1-1-63) 224-18 (SR0523 × Важак) × 22-34-95 (814 × ПА-29-1-1-63) Голден Делишес × 2034 Редфри × Папировка тетраплоидная Редфри × Папировка тетраплоидная Редфри × Папировка тетраплоидная Прима × Уэлси тетраплоидный Прима × Алкмене Прима × Казачка Прима × Уэлси тетраплоидный Прима × Алкмене Прима × Уэлси тетраплоидный Редфри × Папировка тетраплоидная Редфри × Папировка тетраплоидная Редфри × Папировка тетраплоидная Прима × Уэлси тетраплоидный 136
