Молекулярно-генетический анализ свиней с помощью AFLP

Логвинова Т.И.¹ Зиновьева Н.А.², Гладырь Е.А.¹
¹Кандидат биологических наук, доктор биологических наук, профессор
ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, п. Дубровицы Московской обл., Россия,
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СВИНЕЙ С ПОМОЩЬЮ AFLP
МАРКЕРОВ
В настоящее время в качестве маркеров для изучения биоразнообразия все большее
применение находит анализ полиморфизмов на уровне ДНК [2]. В качестве одного из
типов высокополиморфных ДНК-маркеров интерес представляют так называемые AFLP
маркеры. Технология AFLP (полиморфизм длин амплифицированных фрагментов)
широко используется в обнаружении генетического полиморфизма, оценке и
характеристике породных ресурсов, определении отношения между породами, создания
генетических карт и идентификации генов видов животных [3,4,5,6,7]. Нами разработана
система мультилокусного AFLP-анализа с использованием ДНК-анализатора с лазерным
детектором. Система позволят проводить одновременный анализ AFLP продуктов,
полученных с использованием трех пар праймеров: Е33/Т47, Е46/Т48 и Е33/Т62.
Цель настоящей работы заключалась в проведении молекулярно-генетического
анализа свиней с использованием мультилокусной системы AFLP-анализа.
Материалы и методы.
Исследование полиморфизма AFLP-маркеров проводилось в Центре биотехнологии
и молекулярной диагностики ГНУ ВИЖ. Выделение ДНК из проб ткани проводили с
помощью перхлоратного метода. Выборка свиней была представлена племенными
животными пород дюрок, йоркшир и ландрас канадской селекции. Анализ ДНК и
постановку ПЦР проводили согласно «Методическим рекомендациям по использованию
метода полимеразной цепной реакции в животноводстве» [1].
Анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов осуществляли по Vos
P. еt al. [8], используя три типа праймеровых комбинации: Е33/Т47, Е46/Т48 и Е33/Т62,
меченные флуоресцентными красителями FAM, R6G и TET. Анализ амплифицированных
ПЦР-продуктов проводили с помощью капиллярного электрофореза на генетическом
анализаторе АВI3130xl. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с
помощью программного обеспечения GenAIEx6 и Microsoft office Excel 2007.
Результаты исследований.
Анализ распределения полиморфных локусов по породам (табл. 1) показал высокую
степень полиморфизма у всех исследованных пород. Доля полиморфных локусов
варьировала от 76,0% у свиней породы дюрок до 83,9% у свиней породы ландрас.
Табл. 1. Процент полиморфных локусов по породам
Породы
% полиморфных локусов
Йоркшир
Ландрас
Дюрок
Среднее
83,3
83,9
76,0
81,0
Как показано на рисунке 1, наибольшим генетическим разнообразием
характеризовались группы свиней пород йоркшир и ландрас (388 и 391 пик,
соответственно), наименьшим – группа свиней породы дюрок (354 пика). Число
информативных пиков (встречаются с частотой 5% и более) у свиней пород ландрас и
дюрок совпадало с общим числом пиков (100%), в то время как у свиней породы йоркшир
этот показатель составлял 78,9%. Наибольшее число приватных пиков выявлено в группе
свиней породы ландрас (51 пик), наименьшее – в группе свиней породы дюрок (19
пиков). У свиней породы йоркшир число приватных пиков составило 34. Уровень
гетерозиготности так же различался в зависимости от породы и составил 17,5% у свиней
породы дюрок, 16,9% у свиней породы ландрас и 15,2% у свиней породы йоркшира.
Рис.1. Общая структура пиков по трем парам праймеров Е33/Т47, Е33/Т62 и Е46/Т48 в
зависимости от породы
Таким образом, разработанная нами система мультилокусного AFLP-анализа
является эффективным инструментом для обнаружения большого числа хорошо
воспроизводимых полиморфизмов в полуавтоматическом режиме.
Литература
1. Зиновьева Н.А. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной
цепной реакции в животноводстве / Н.А. Зиновьева, А.П. Попов, Л.К. Эрнст, Н.С.
Марзанов, В.В. Бочкарев, Н.И. Стрекозов, Г. Брем. - Дубровицы: ВИЖ, 1998. - 47 с.
2.Состояние всемирных генетических ресурсов животных в сфере продовольствия и
сельского хозяйства/ ФАО, 2010. ВИЖ РАСХН, 2010. Москва / Перевод с англ. FAO.
2007. The State of the Worlds Animal Genetic Resources for Food and Agriculture, edited by
Barbara Rischkowsky & Dafydd Pilling. Rome.
3. Ajmone-Marsan, P. Genetic distances within and across cattle breeds as indicated by biallelic
AFLP markers / P. Ajmone-Marsan, R. Negrini, E. Milanesi, E., Bozzi, R., Nijman., I.J., Buntjer,
A. Valentini, A. &Lenstra, J.A. // Anim Genet. 2002, 33: 280-286.
4. Buntjer, J.B. Phylogeny of bovine species based on AFLP fingerprinting / J.B. Buntjer, M.
Otsen, I.J. Nijman, M.T.R. Kuiper, J.A. Lenstra / Heredity. 2002. -88:46–51.
5. Negrini, R. Tuscany autochthonous cattle breeds: an original genetic resource investigated by
AFLP markers / R. Negrini, E. Milanesi, E., Bozzi, R., Pellecchia, M &. Ajmone-Marsan //
Anim Breeding and Genetics, 2006.-123: 10-16.
6. De Marchi, M. Assessing genetic diversity in indigenous Veneto chicken breeds using AFLP
markers // Anim Genet, 2006.- 37: 101-105.
7. SanCristobal M., Chevalet C., Peleman J. et al. Genetic diversity in European pigs utilizing
amplified fragment length polymorphism markers // Anim Genet. 2006. - 37:232–238.
8. Vos P., Hogers R., Bleeker M. et. al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting //
Nucleic acids Research 23, 1995. – 4407-14.