Сохранение фертильности у онкобольных

Предлагаем вашему вниманию главу 12 модуля "Эмбриология".
Она называется “Сохранение фертильности у онкобольных”. В ней описаны
различные подходы к сохранению репродуктивной функции у мужчин и
женщин, больных раком.
Автор – Greta Verheyen.
1
После изучения этой главы слушатели должны иметь представление о
различных подходах к сохранению фертильности у мужчин и женщин, больных
раком.
2
Благодаря достигнутому прогрессу в лечении онкологических заболеваний
наблюдается увеличение числа долгоживущих людей, перенесших рак. Для
женщин со всеми типами рака шанс пятилетней выживаемости повысился за
последние 25 лет с 56% до 64%. К 2010 году ожидается, что приблизительно
один из каждых 250 подростков перенесет онкологическое заболевание в
детстве. Кроме того, наблюдается увеличение частоты диагностики рака у
девушек. К сожалению, применение агрессивной химиотерапии, особенно
алкилирующими препаратами, и ионизирующего облучения может привести к
поражению гонад и, соответственно, повлиять на фертильность пациентов.
Поскольку пациенты с онкологическими заболеваниями имеют основания для
обеспокоенности состоянием своей репродуктивной функции после лечения
рака, существует потребность сохранения фертильности. К сожалению,
медики не знакомы с современными возможностями сохранения
фертильности у пациентов с онкологическими заболеваниями, вероятно по
той причине, что большинство методик сохранения фертильности являются
новыми и экспериментальными.
3
В зависимости от возраста, пола или семейного положения пациентам, у
которых существует риск развития ятрогенного бесплодия и которые
заинтересованы в сохранении фертильности, могут быть рекомендованы
испытанные методы, такие как замораживание спермы и эмбрионов, или
экспериментальные методики сохранения фертильности, такие как
криоконсервация овариальной или тестикулярной ткани или криоконсервация
ооцитов.
4
На этом слайде показаны несколько криологических методов сохранения
фертильности у женщин с онкологическими заболеваниями. Все указанные
методы, за исключением криоконсервации ооцитов и эмбрионов, на данный
момент являются экспериментальными.
Цитированная литература:
Kim S. (2006) Fertility preservation in female cancer patients: current developments
and future directions; Fertility and Sterility (Фертильность и бесплодие): 85(1):1–
11.
5
Криоконсервация эмбрионов является хорошо изученной клинической
методикой. Однако для ее применения требуется стимуляция яичников,
получение ооцитов и оплодотворение in vitro, на что обычно требуется от 2 до
5 недель. Согласно Kim и соавт. (2006) для некоторых пациенток этот способ
является неосуществимым, а откладывать лечение рака ради консервации
эмбрионов может оказаться рискованным. Этот метод не приемлем для
девочек препубертатного возраста; он также часто неприемлем для женщин,
не имеющих партнера и не желающих использовать донорскую сперму для
оплодотворения своих ооцитов. Существуют также этические и юридические
вопросы, связанные с хранением эмбрионов, в частности вопрос утилизации
эмбрионов в случае смерти пациентки. Вместе с тем женщинам, имеющим
партнера и располагающим достаточным временем для проведения хотя бы
одного цикла ЭКО, следует в первую очередь рассматривать возможность
криоконсервации эмбрионов.
6
Существуют два различных способа криоконсервации эмбрионов человека.
Первый способ предусматривает криоконсервацию на раннем этапе развития
эмбрионов, когда морфология еще не является решающим фактором, и
эмбрионы обычно замораживаются на стадии зиготы (одной клетки с двумя
пронуклеусами). Второй способ предусматривает криоконсервацию эмбрионов
на стадии морулы (стадии дробления) или же на стадии бластоцисты, когда
потенциал развития эмбрионов уже определен.
Если криоконсервация производится на стадии бластоцисты, потенциал
развития эмбриона определяется с большей точностью, нежели на стадии
морулы. Выбор стадии развития эмбионов (зигота, морула, бластоциста) для
криоконсервации зависит от нескольких факторов, таких как загруженность
лаборатории и возможностей используемой системы культивирования.
В 2009 году Kolibianakis с соавт. четко продемонстрировали, что в сравнении с
медленным замораживанием витрификация обеспечивает лучшую
выживаемость при размораживании как для морул (отношение шансов: 6,35,
95%-ый доверительный интервал: 1,14-35,26), так и для бластоцист
(отношение шансов: 4,09, 95%-ый доверительный интервал: 2,45-6,84). Более
того, развитие криоконсервированных морул после оттаивания до стадии
бластоцисты значительно выше при витрификации, нежели при медленном
замораживании (отношение шансов: 1,56, 95%-ый доверительный интервал:
1,07-2,27).
7
Однако значимых различий по частоте наступления клинической беременности,
рассчитанной на количество переносов, между этими двумя методами
криоконсервации обнаружено не было (отношение шансов: 1,66, 95%-ый
доверительный интервал: 0,98-2,79).
Цитированная литература:
Kolibianakis EM et al. (2009) Cryopreservation of human embryos by vitrification or
slow freezing: which one is better? Clinical and Experimental Obstetrics and
Gynecology (Клиническое и экспериментальное акушерство и гинекология);
21(3): 270-274.
7
Альтернативой хранению эмбрионов является криоконсервация зрелых
ооцитов. При этом не требуется наличие мужчины-партнера и возникает
меньшее количество этических проблем. Однако внедрению этой методики в
стандартную клиническую практику должно предшествовать дальнейшее ее
изучение. Проблема применения этой процедуры состоит в необходимости
отложить лечение рака, поскольку для получения ооцитов требуется индукция
овуляции.
8
Замораживание зрелых ооцитов человека является технически сложной
задачей, потому что такие ооциты чувствительны к охлаждению.
Криопротекторы и/или охлаждение в ходе замораживания/размораживания
могут вызвать деполимеризацию веретена деления и, как следствие, привести
к анеуплоидии. Также может произойти уплотнение прозрачной оболочки в
результате преждевременного выхода кортикальных гранул из цитоплазмы
ооцита, однако эта проблема решается применением ИКСИ.
В качестве альтернативы замораживанию на стадии метафазы II для
криоконсервации ооцитов было предложено замораживание на стадии
зародышевого пузырька. На стадии зародышевого пузырька отсутствует
чувствительный аппарат веретена деления, который может быть поврежден.
Однако криоконсервация ооцитов на стадии зародышевого пузырька более
проблематична в плане выживаемости и созревания ооцитов до стадии
метафазы II. До тех пор, пока не будет разработана надежная методика
дозревания ооцитов in vitro, криоконсервация ооцитов на стадии
зародышевого пузырька нецелесообразна.
Витрификация ооцитов в качестве альтернативного метода криоконсервации
продемонстрировала потенциальные преимущества. В 2010 году Smith и
соавт. продемонстрировали, что частота выживаемости ооцитов человека
9
значительно выше при витрификации, нежели при медленном замораживании:
81% по сравнению с 67%. Частота наступления клинической беременности
также была значимо выше после витрификации, нежели после медленного
замораживания: 38 % по сравнению с 13 %.
Витрификация по определению - это переход из жидкой фазы в твердую с
экстремальным повышением вязкости во время резкого охлаждения.
Теоретически, в ходе витрификации можно избежать образования кристаллов
льда. На данный момент для обоих методов – медленного замораживания и
витрификации – нет сведений о каких-либо отдаленных неблагоприятных
последствиях для детей, родившихся из таких криоконсервированных ооцитов.
Цитированная литература:
Smith et al. (2010) Prospective randomized comparison of human oocyte
cryopreservation with slow-rate freezing or vitrification. Fertility and Sterility
(Фертильность и бесплодие); 2010, 18 февраля: [электронная публикация до
выхода номера в печать]
9
Криоконсервация овариальной ткани имеет больше преимуществ и влечет за
собой меньшее количество этических дилемм.
Идея криоконсервации овариальной ткани состоит в сохранении большого
числа незрелых фолликулов, без необходимости дожидаться созревания
ооцитов. Этот метод не требует отсрочки в лечении рака. Более того, он
позволяет сохранить сотни незрелых ооцитов in situ без необходимости
индукции овуляции.
10
Существуют три способа дозревания незрелых фолликулов: гетеротопическая
или ортотопическая аутотрансплантация, ксенотрансплантация и
культивирование in vitro. Оптимальная методика будет состоять в создании
эффективной системы культивирования, которая обеспечит рост и созревание
незрелых ооцитов in vitro. Однако имеющиеся на данное время методики
культивирования и культуральные среды не позволяют обеспечить развитие
фолликулов в течение длительного времени. Поскольку по соображениям
этики и безопасности клиническое использование ксенотрансплантации
запрещено, в настоящее время аутотрансплантация остается единственной
клинически применимой методикой. Аутотрансплантация замороженнойразмороженной ткани может возобновить функцию яичников. К данному
моменту в результате аутотрансплантации замороженной-размороженной
овариальной ткани уже есть несколько случаев рождения живых детей.
11
Криоконсервация овариальной ткани человека осуществляется успешно, при
этом отмечаются хорошие показатели выживаемости и дальнейшего развития
фолликулов. Однако эта процедура является технически сложной. Поскольку
овариальная ткань состоит из многих различных типов клеток, оптимизировать
условия ее криоконсервации намного сложнее, чем, к примеру, при
криоконсервации одной клетки. При проведении этой процедуры основную
опасность представляют собой образование внутриклеточного льда и
повышенная концентрация солей. Стандартный метод криоконсервации
овариальной ткани человека – медленное контролированное замораживание с
использованием в качестве криопротектора пропандиола,
диметилсульфоксида или этиленгликоля в сочетании с сахарозой.
Цитированная литература:
Hovatta O et al. (1996) Cryopreservation of human ovarian tissue using
dimethylsulphoxide and propanediol-sucrose as cryoprotectants. Human
Reproduction (Репродукция человека); 11(6): 1268-1272.
12
Поскольку образование внеклеточного и внутриклеточного льда может
повлиять на выживаемость ткани, криоконсервация овариальной ткани
методом витрификации может быть более предпочтительной, по крайней
мере, теоретически. Как показано на слайде, несколько статей указывают, что
витрификация овариальной ткани не менее эффективна, чем медленное
замораживание, а овариальная строма имеет значительно лучшую
морфологическую целостность после витрификации, нежели после
контролированного замораживания. Основной задачей криотехнологии должно
быть сохранение интактных фолликулов, а не гарантия простоты и
доступности технологии для операторов в ущерб качеству фолликулов после
их размораживания.
Keros V et al. (2009) Vitrification versus controlled-rate freezing in cryopreservation
of human ovarian tissue. Human Reproduction (Репродукция человека); 24(7):
1670-1683.
Kagawa N et al. (2009) Successful vitrification of bovine and human ovarian tissue.
Reproductive Biomedicine Online (Репродуктивная биомедицина онлайн); 18(4):
568-577.
Wang Y et al. (2008) Novel needle immersed vitrification: a practical and convenient
method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue
cryopreservation. Human Reproduction (Репродукция человека); 23(10): 2256-
13
2265.
Isachenko V et al. (2007) Cryopreservation of human ovarian tissue: comparison of
rapid and conventional freezing. Cryobiology (Криобиология); 55(3): 261-268.
13
При аутотрансплантации овариальной ткани возникает незначительное
количество этических и технических проблем. Трансплантация овариальной
ткани может быть ортотопической или гетеротопической. В дальнейшем
предстоит определить, какая из локализаций является более эффективной.
Аутотрансплантацию овариальной ткани не следует проводить
онкопациенткам с высоким риском метастазирования в яичники.
Преимуществом ортотопической аутотрансплантации является возможность
естественного зачатия; уже есть несколько случаев рождения детей в
результате применения этой методики. Долговечность овариального
трансплантата неизвестна, в некоторых случаях может понадобиться
повторная трансплантация. По этой причине использование гетеротопических
локализаций может быть более удобным. Однако следует помнить, что
получение здоровых ооцитов для ЭКО после гетеротопической овариальной
трансплантации представляет значительную сложность.
14
Несмотря на обнадеживающие результаты применения криоконсервации и
трансплантации овариальной ткани с целью сохранения фертильности у
женщин с онкологическими заболеваниями, применение этих методик
сопряжено с некоторыми проблемами, требующими решения. Две наиболее
серьезные проблемы, требующие безотлагательного решения, – ишемия
тканей и риск переноса раковых клеток.
15
В 2010 году Wyns с соавт. предложили два различных подхода к сохранению
фертильности у мальчиков препубертатного возраста: минимизация
поражения яичек вследствие лечения рака или предохранение
сперматогониальных стволовых клеток in vivo; а также криоконсервация
тестикулярной ткани в виде суспензии клеток, фрагментов ткани или целого
органа до проведения гонадотоксичного лечения.
Для снижения пагубного воздействия гонадотоксичной терапии были
исследованы различные методики, такие как экранирование яичек и
использование гонадопротекторов. Во всех возможных случаях необходимо
применять защиту яичек от воздействия радиации путем их экранирования
или расположения вне зоны облучения. Более того, на данный момент не
существует эффективных гонадопротекторов для применения на людях.
Потенциальной альтернативной методикой сохранения фертильности
мальчиков препубертатного возраста может быть сохранение тестикулярной
ткани в надежде, что будущие технологии предоставят возможность ее
безопасного использования. Препубертатная тестикулярная ткань содержит
сперматогониальные стволовые клетки, из которых в свою очередь
формируются гаплоидные сперматозоиды. Эти клетки можно сохранять
криоконсервацией в виде суспензии клеток или в виде ткани.
16
Использование суспензии клеток предназначено для облегчения задачи
криоконсервации, поскольку гетерогенность клеток во фрагментах ткани
усложняет процедуру замораживания тканей. Изготовление препарата
суспензии клеток требует механического измельчения и/или энзимного
растворения ткани, что создает угрозу выживаемости клеток и межклеточным
взаимодействиям, необходимым для пролиферации и дифференциации клеток.
Криоконсервация фрагментов тестикулярной ткани может рассматриваться в
качестве альтернативного метода, который позволяет сохранить межклеточные
контакты между клетками Сертоли и зародышевыми стволовыми клетками.
По причине небольшого количества сперматогониальных стволовых клеток в
тестикулярной ткани и небольшого размера яичка у детей может быть более
целесообразно производить криоконсервацию целого яичка.
16
В 2008 году Geens и соавт. в своем докладе сообщали о выживаемости
тестикулярных сперматозоидов после размораживания суспензии, равной 2982% для различных животных моделей. Остается спорным вопрос о том, когда
лучше готовить суспензию клеток: до криоконсервации или после нее.
Значительное влияние на выживаемость после размораживания и на
структуру семявыносящих канальцев оказывает тип криопротектора и скорость
замораживания, как было продемонстрировано Goossens и соавт.в 2008 году и
Keros и соавт. в 2007 году. В 2006 и 2007 годах коллективы под руководством
Kvist и Keros соответственно опубликовали протоколы замораживания
препубертатной тестикулярной ткани человека, в обоих случаях были
получены хорошие показатели структурной целостности. Метод
криоконсервации целого яичка, аналогичный методу криоконсервации целого
яичника, еще предстоит разработать.
Цитированная литература:
Geens M et al. (2008) Autologous spermatogonial stem cell transplantation in man:
current obstacles for a future clinical application. Human Reproduction
(Репродукция человека); 14(2): 159-176.
Goossens E et al. (2008) Cryosurvival and spermatogenesis after allografting
prepubertal mouse tissue: comparison of two cryopreservation protocols. Fertility
and Sterility (Фертильность и бесплодие); 89(3): 725-727.
17
Keros V et al. (2007) Methods of cryopreservation of testicular tissue with viable
spermatogonia in pre-pubertal boys undergoing gonadotoxic cancer treatment.
Human Reproduction (Репродукция человека); 22(5): 1384-1395.
Kvist K et al. (2006) Cryopreservation of intact testicular tissue from boys with
cryptorchidism. Human Reproduction (Репродукция человека); 21(2): 484-491.
17
В качестве обнадеживающих методов восстановления фертильности у
мальчиков препубертатного возраста можно рассматривать следующие три
подхода.
Первая методика - это ретрансплантация очищенной суспензии клеток в яички
пациента. При этом после трансплантации изолированных тестикулярных
стволовых клеток в яичках, лишенных зародышевых клеток, повторно
инициируется сперматогенез. Эффективность такого подхода у человека еще
предстоит доказать.
Вторая методика состоит в аутотрансплантации фрагментов тестикулярной
ткани или целых яичек. Однако на данный момент данные о трансплантации
тестикулярной ткани у человека отсутствуют.
Третья методика состоит в дозревании клеток in vitro до такой стадии, когда
они уже смогут нормально оплодотворить ооциты при ИКСИ. Эта процедура
потенциально применима для пациентов с онкологическими заболеваниями.
На данный момент не удалось создать систему культивирования, которая бы
обеспечила in vitro полный сперматогенез из сперматогониев
18
Для сохранения фертильности при проведении химиотерапии, после которой
существует высокий риск стерильности, гормональная терапия
неэффективна.
Пациентам с онкологическими заболеваниями следует рекомендовать
замораживание нескольких образцов спермы, даже при сниженной
численности или подвижности сперматозоидов. В некоторых случаях качество
спермы пациента является низким еще до проведения лечения рака. Даже при
необходимости безотлагательного проведения химиотерапии целесообразно
приложить все усилия для сохранения образцов спермы, поскольку последние
достижения в области оплодотворения in vitro, в частности методика инъекции
сперматозоида в цитоплазму ооцита, позволяют успешно замораживать и
использовать весьма ограниченные количества спермы. Имеются случаи
успешного забора спермы из пост-мастурбационной мочи, методом
ректальной электроэякуляции под анестезией и методом аспирации
тестикулярных сперматозоидов.
19
Методы криоконсервации включают использование растворов
криопротекторов серийного производства на основании глицерина, быстрое
замораживание парами жидкого азота или медленное контролируемое
замораживание, хранение в закрытых системах (безопасные соломинки),
Хранение в жидком азоте при температуре ниже -196°C или в его парах. После
забора тестикулярных сперматозоидов методом биопсии производится их
подготовка к замораживанию методом механического измельчения с
последующим энзимным растворением. Замораживание тестикулярной
спермы выполняется аналогично замораживанию эякулята спермы.
20
Данный слайд подытоживает информацию, представленную в этой главе.
•Криоконсервация спермы и эмбрионов до проведения химиотерапии
являются стандартной клинической практикой для пациентов
постпубертатного возраста.
•Использование криоконсервированных неоплодотворенных ооцитов уже
привело к рождению здоровых детей.
•Существуют методы криоконсервации овариальной и тестикулярной ткани,
однако они требуют оптимизации.
•Общепринятых методик по использованию криоконсервированной
препубертатной тестикулярной ткани не существует.
•Успешно проведены эксперименты по реимплантации как овариальной, так и
тестикулярной ткани как на животных, так и , в некоторых случаях, на людях.
•Методики дозревания ооцитов из примордиальных фолликулов и
сперматозоидов из сперматогониев находятся на стадии разработки.
21
Программа исследований включает:
•
Дальнейшее изучение методов использования замороженнойразмороженной овариальной ткани, которые являются в значительной
мере экспериментальными. Также предстоит разработать оптимальную
методику замораживания
•
Необходимо дальнейшее развитие методик реимплантации овариальной
ткани и дозревания ооцитов из примордиальных фолликулов in vitro
•
Выявление оптимального метода криоконсервации тестикулярной ткани.
•
Определение в качестве преимущественного метода замораживание
суспензии тестикулярных клеток или фрагментов тестикулярной ткани
•
Разработка методики сперматогенеза in vitro
•
Разработка эффективной и безопасной методики реимплантации
тестикулярных клеток или тканей
22
23
23
24
24
25
25