Механизмы Са -зависимого подавления секреции медиатора в новообразованных нервно- мышечных синапсах мыши
реклама
На правах рукописи Богачева Полина Олеговна Механизмы Са2+-зависимого подавления секреции медиатора в новообразованных нервномышечных синапсах мыши 03.00.13 – физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2009 2 Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова (заведующий – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский) НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова Ольга Петровна Балезина ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной и патологической физиологии факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова Владимир Борисович Кошелев доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории мембранологии с группой генетических исследований ГУ «Научный центр здоровья детей РАМН» Татьяна Павловна Сторожевых ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Российский Университет Дружбы Народов им. Патриса Лумумбы Защита диссертации состоится 9 ноября 2009 года в 1530 на заседании диссертационного ученого совета Д 501.001.93 биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет, аудитория М-1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова. Автореферат разослан 1 октября 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Б. А. Умарова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Механизмы образования и перестройки синаптических контактов - актуальный вопрос современной синаптологии, ключ к пониманию пластичности нейронов. Классической моделью синаптогенеза являются процессы формирования и удаления нервно-мышечных синапсов, происходящие на скелетных мышечных волокнах млекопитающих в период реиннервации мышцы прорастающим к ней двигательным нервом после его повреждения (Bennett et al., 1973; Argentieri et al., 1992; Burden, 2002; Lomo, 2003). Известно, что подрастающие моторные аксоны образуют на волокне избыточное число контактов, из которых большинство вскоре «замолкают», то есть перестают секретировать медиатор, а вслед за этим отторгаются, элиминируются. В результате на волокне сохраняется один синапс, а полисинаптическая иннервация сменяется на одиночную, моносинаптическую. Механизмы и процессы, приводящие к подавлению избыточных синапсов и их последующей элиминации, остаются не ясными, несмотря на актуальность и длительную историю изучения вопроса (Hoh et al., 1975; O`Brien et al., 1978; O`Brien et al., 1984; Barber, Lichtman, 1999; Constanzo et al., 1999; Lanuza et al., 2002; Santafe et al., 2002; Nelson et al., 2003; Buffelli et al., 2004; Li et al., 2004). В последние годы установлено, что в новообразованных моторных терминалях наряду с потенциал-зависимыми Са2+-каналами P/Q- и N-типа, запускающими секрецию медиатора, имеются потенциал-зависимые Са2+-каналы L-типа, принимающие особое участие в регуляции секреции медиатора (Atchison, 1989; Gray et al., 1992; Fu, Huang, 1994; Rosato-Siri, Uchitel, 1999). Показано, что именно вход кальция в терминали по L-типу Са2+-каналов (при генерации пресинаптического потенциала действия) приводит к подавлению секреции медиатора в новообразованных синапсах, их «замолканию» и, как следствие последующей элиминации избыточных синапсов. Соответственно, блокаторы Са2+-каналов L-типа (D-600, нифедипин и др.), напротив, способствуют растормаживанию подавленных синапсов и усилению синаптической передачи в период новообразования нервно-мышечных синапсов (Rosato-Siri, Uchitel, 1999; Santafe et al., 2001; Piriz et al., 2003). Явление Са2+-зависимого торможения секреции ацетилхолина (АХ) в новообразованных синапсах выявлено как в период реиннервации зрелых скелетных мышц, так и на ранних стадиях онтогенеза и формирования двигательной иннервации скелетных мышечных волокон. Высказываются предположения, что это торможение имеет отношение к подавлению активности избыточных синапсов и ускорению созревания моторной иннервации в виде одиночной концевой пластинки (Santafe et al., 2002). Механизмы Са2+-зависимого торможения секреции АХ в моторных синапсах в период их новообразования на скелетных мышечных волокнах остаются не изученными и представляют большой интерес для нервно-мышечной физиологии и клинической неврологии. Цели и задачи работы. Целью работы было изучить внутриклеточные механизмы, с помощью которых ионы кальция, поступающие в новообразованные 4 нервные терминали по L-типу Са2+-каналов, приводят к подавлению секреции медиатора и передачи сигналов в новообразованных моторных синапсах реиннервируемых скелетных мышц мыши. В работе были поставлены следующие конкретные задачи: 1. Исследовать явление Са2+-зависимого торможения секреции АХ с помощью агонистов и антагонистов Са2+-каналов L-типа, его особенности на разных сроках созревания синапсов, при ритмической залповой и спонтанной активности новообразованных контактов. 2. Выявить вклад депонированного кальция, выбрасываемого через рианодиновые рецепторы (РиР) терминалей, в Са2+-зависимое торможение секреции АХ в новообразованных синапсах. 3. Исследовать участие Са2+-зависимых К+-каналов большой и малой проводимости (ВК- и SK-типа) в реализации Са2+-зависимого торможения секреции АХ в новообразованных моторных терминалях 4. Выявить участие ряда Са2+-зависимых белков и ферментов – кальмодулина, кальмодулинкиназы II (CaMKII) и протеинкиназы С (PKС) в Са2+-зависимом торможении секреции АХ 5. Исследовать возможный вклад потенциал-активируемых К+v-каналов в Са2+зависимое торможение, осуществляемое с участием PKС. Научная новизна полученных результатов. В работе получен ряд новых ранее не известных фактов. Впервые показано, что Са2+-зависимое торможение секреции АХ в новообразованных нервномышечных синапсах мыши наблюдается не только при одиночной, но и при залповой вызванной активности синапсов, однако не затрагивает спонтанную секрецию медиатора. Впервые раскрыта роль кальция, входящего по L-типу Са2+каналов, в активации РиР и выбросе депонированного кальция, который также участвует в механизме Са2+-зависимого торможения секреции медиатора. Выявлен ранее не известный факт, что подавление активности пресинаптической CaMKII может принимать участие в Са2+-зависимом торможении синаптической передачи в новообразованных моторных синапсах. Наконец, впервые показано, что механизм Са2+-зависимого торможения АХ включает Са2+-зависимую активацию PKС, направленную на усиление активности потенциал-зависимых К+v-каналов терминалей в новообразованных моторных синапсах мыши. Теоретическое и практическое значение работы К числу фактов, имеющих общее теоретическое значение для физиологии синапсов, относится выявленный в работе внутриклеточный каскад реакций, приводящий к Са2+-зависимому торможению секреции медиатора в новообразованных моторных синапсах мыши. Показано, что входящий в терминали потенциал-активируемый Са2+-ток L-типа в комплексе с индуцированным им выбросом депонированного кальция, вызывают формирование Са2+–сигналов, реципрокно влияющих на активность Са2+зависимых ферментов терминали. Происходит: а) подавление облегчающего действия CaMKII на секрецию АХ; б) активация PKС, направленная на усиление 5 работы потенциал-зависимых К+v-каналов терминали и угнетение секреции АХ в исследуемых синапсах. Таким образом, показана способность двух пресинаптических Са2+-активируемых ферментов по-разному регулировать секрецию АХ, в зависимости от характера повышения уровня кальция в нервных терминалях. Эти данные приближают нас к пониманию Са2+-зависимых механизмов регуляции синаптической пластичности в химических синапсах. Результаты работы могут оказаться полезными при решении прикладных задач синаптологии: при разработке способов коррекции посттравматических перестроек периферических нервно-мышечных синапсов, для ускорения восстановления иннервации мышц. Основные положения работы, выдвигаемые на защиту 1. В новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши Са2+-зависимое торможение секреции АХ осуществляется с участием сочетанной активности Са2+-каналов L-типа и выброса депонированного кальция через РиР в составе моторных нервных терминалей. 2. Механизм Са2+-зависимого торможения секреции АХ предусматривает подавление потенцирующего действия CaMKII на выброс медиатора и синаптическую передачу в новообразованных синапсах мыши. 3. Вход кальция по L-типу Са2+-каналов приводит к активации Са2+-зависимой PKС, мишенью которой являются потенциал-активируемые К+v- каналы. Усиление активности К+v-каналов, опосредуемое PKС, является одним из механизмов Са2+-зависимого торможения секреции в новообразованных синапсах мыши. Апробация диссертации Результаты исследования были представлены на международной молодежной конференции Ломоносов-2007 (Москва, 2007), XX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), I Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов Симбиоз, Россия 2008 «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008), I Всероссийской (XVI) молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008), 6-ом Форуме Федерации Европейских Нейронаук (Женева, Швейцария, 2008), 38-ом ежегодном съезде Общества Нейронаук (Вашингтон, США, 2008), конференции с международным участием «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций», посвященной памяти Т.М. Турпаева (Москва, 2009), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), ежегодном съезде Британского Физиологического Общества «Физиология 2009» (Дублин, Ирландия, 2009). Публикации По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в их числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК. Структура и объем диссертации 6 Диссертационная работа изложена на 188 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристик материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы; иллюстрирована 53 рисунками. Список литературы включает 306 источников, из них 24 отечественных. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для исследования спонтанной и вызванной синаптической активности в интактных и новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши были выбраны моторные синапсы мышцы – длинного разгибателя пальцев m. extensor digitorum longus (m.EDL) мыши. Данная мышца иннервируется аксонами малоберцового нерва n. peroneus communis. В работе использовали беспородных мышей массой 20-30 г. Пережатие нерва. Пережатие малоберцового нерва проводили за 11 суток до электрофизиологического эксперимента под эфирным наркозом. Раздавливание нерва осуществляли при помощи глазного пинцета с тонкими плоскими браншами, защищенными пластиковыми наконечниками, на расстоянии 4-5 мм от иннервируемой мышцы m.EDL. Протяженность раздавленного участка нерва составляла 1 мм. Разрез зашивали и обрабатывали 1% спиртовым раствором бриллиантовой зелени. Спустя 7-8 суток после операции наблюдали первые признаки восстановления иннервации мышцы проросшим к ней нервом. Внутриклеточная регистрация спонтанных и вызванных потенциалов концевой пластинки. Для изучения активности новообразованных синапсов на 11 сутки после пережатия нерва животных декапитировали и выделяли изолированный нервно-мышечный препарат. Для предотвращения мышечных сокращений в ответ на стимуляцию нерва проводили процедуру рассечения мышечных волокон (Barstad, Lilleheil, 1968). Полученный «рассеченный» нервномышечный препарат помещали в камеру, заполненную физиологическим раствором Лайли для теплокровных, содержащим 135 мM NaCl, 1,0 мM MgCl2, 4 мM KCl, 0,9 мM NaH2PO4, 2,0 мM CaCl2, 11 мM глюкозы, 16 мM NaHCO3 . Раствор аэрировали карбогеном (96% О2, 4% СО2) до установления рН 7,2–7,4. Исследования проводили при комнатной температуре (21◦). Миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП) и потенциалы концевой пластинки (ПКП, не менее 50 в каждом синапсе) регистрировали внутриклеточно при помощи стеклянных микроэлектродов (сопротивление 5-10 МОм), заполненных 2,5 М раствором KCl. Для регистрации одиночных ПКП производили стимуляцию нерва импульсами длительностью 0,12-0,2 мм и частотой 0,3 Гц. Амплитуда стимула подбиралась индивидуально в соответствии с особенностями каждого препарата. Для регистрации залповой активности синапсов использовали режим ритмической стимуляции нерва с частотой 50 Гц. Для одиночных ПКП анализировали среднюю амплитуду, квантовый состав (рассчитываемый как отношение средней амплитуды ПКП к средней амплитуде МПКП), параметры временного хода. При анализе ритмически генерируемых ПКП оценивали амплитуду фазы «плато» залпа по средней амплитуде 20 последних ПКП в залпе, выраженной в процентах от амплитуды первого ПКП в залпе. 7 Статистическая обработка экспериментальных данных. Сравнение выборок производили по непараметрическому критерию Манна–Уитни. Использовали уровень значимости отличий между двумя выборками, равный 0,05. Все данные представлены как средние значения ± стандартные ошибки среднего, n - объем выборки (количество исследованных синапсов). Используемые в работе вещества: нифедипин (Biomol); верапамил (SigmaAldrich); S(-)-BAY K 8644 (Biomol); рианодин (Biomol); омега-агатоксин (Biomol); апамин (Sigma-Aldrich); паксиллин (Sigma-Aldrich); R-21574 (Serva); KN-62 (Biomol); хелеритрин (Sigma-Aldrich); бисиндолилмалейимид I (BIM) (SigmaAldrich); 4-аминопиридин (Biomol); бутандионмоноксим (BDM) (Biomol). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. ВЛИЯНИЕ БЛОКАДЫ Са2+-КАНАЛОВ L- И P/Q-ТИПА НА НЕРВНОМЫШЕЧНУЮ ПЕРЕДАЧУ В ИНТАКТНЫХ И РЕИННЕРВИРОВАННЫХ СИНАПСАХ Первая серия работы была посвящена анализу пресинаптических эффектов блокады Са2+-каналов L-типа в отношении секреции медиатора в интактных и новообразованных синапсах. Для блокады Са2+-каналов L-типа были выбраны разные по химическому строению избирательные блокаторы этих каналов: нифедипин (10 мкМ), относящийся к дигидропиридинам, и верапамил (5 мкМ), принадлежащий к фенилалкиламинам. Исследования новообразованных моторных синапсов на волокнах m.EDL проводили на 11 сутки после пережатия малоберцового нерва. Также были изучены пресинаптические эффекты агониста Са2+-каналов Lтипа S(-)-BAY К 8644 в концентрации 1 мкМ на параметры ритмически генерируемых ПКП. 1.1. Влияние модуляции активности Са2+-каналов L-типа на одиночную вызванную секрецию медиатора в интактных и новообразованных синапсах. Предварительный анализ параметров вызванных одиночных ПКП показал существенные различия в амплитуде, латентном периоде и длительности сигналов в новообразованных и зрелых синапсах (рис. 1), а также в характере их ответов на действие нифедипина. Мы установили, что нифедипин оказывает значительное облегчающее действие на секрецию медиатора в новообразованных синапсах: амплитуда одиночных ПКП увеличилась от 6,5±0,9 мВ (в контроле) до 9,3±0,8 мВ на фоне нифедипина, то есть на 43% (p<0,05). Квантовый состав ПКП также возрастал от 10,4±1,4 до 15,8±1,9 под действием нифедипина (n=69, p<0,05). Для понимания особенностей действия нифедипина были построены гистограммы амплитудного распределения ПКП. На рисунке 2 видно, что гистограмма амплитудных распределений ПКП новообразованных синапсов имеет асимметричную, скошенную форму – у нее имеется «хвост» высокоамплитудных ПКП. Такой вид гистограммы характерен для ранних стадий 8 иннервации мышечных волокон, когда имеет место полисинаптическая полиаксональная иннервация мышечных волокон и вклад в регистрируемый интегральный ПКП нескольких активных синаптических контактов. Рис. 1. Усредненные оригинальные записи ПКП. Каждая кривая - усреднение 50 ПКП, зарегистрированных в одном синапсе. а) Сравнение параметров одиночных ПКП интактных синапсов и синапсов на 11 сутки после пережатия нерва. б) Влияние нифедипина на амплитуду ПКП новообразованных синапсов на 11 сутки после пережатия нерва. Оказалось, что под действием нифедипина происходит не только сдвиг всей гистограммы в область высокоамплитудных значений, но и изменение ее формы увеличение дисперсии сигналов и, как правило, достоверное присутствие двух амплитудных пиков (рис. 2). Это позволяет предполагать, что сосуществующие на одном волокне терминали и синапсы функционально гетерогенны по своей чувствительности к нифедипину, а значит – и к входящему тормозному Са2+сигналу. Рис. 2. Эффект нифедипина и агатоксина на нормированные гистограммы амплитудных распределений ПКП новообразованных синапсов. а) нифедипин, б) агатоксин. Верапамил оказывал сходное действие на нервно-мышечную передачу в новообразованных синапсах. В контроле амплитуда ПКП составляла 5,9±0,7 мВ, а после аппликации верапамила – 8,6±0,9 мВ (p<0,05), то есть возросла на 45% (n=48). Квантовый состав же увеличился от 9,7±1,5 в контроле до 15,4±1,2 – на 58% (p<0,05). Таким образом, различные по химическому строению антагонисты потенциал-чувствительных Cа2+-каналов L-типа оказывают сходный потенцирующий эффект на секрецию медиатора в новообразованных синапсах. 9 Это свидетельствует о специфичности их пресинаптического действия, связанного именно с блокадой Са2+-тока L-типа. Способность блокаторов Са2+каналов L-типа вызывать облегчение выброса медиатора в новообразованных синапсах мыши и лягушки описана и в ряде других работ (Tonge, 1974; Sugiura, Ko, 1997; Santafe et al., 2001). Исследование спонтанной секреции АХ путем регистрации МПКП в новообразованных синапсах показало, что под действием нифедипина амплитуда МПКП достоверно не изменилась и составила 86,9±6,6 % от интактного контроля (p>0,05). Не наблюдалось также изменений и частоты МПКП на фоне действия нифедипина, что говорит о пресинаптическом действии блокаторов Са2+-каналов L-типа. В интактных синапсах оба выбранных нами блокатора не вызвали достоверных изменений ни амплитуды, ни квантового состава ПКП. Так, квантовый состав ПКП в зрелых интактных синапсах в среднем составлял 34,15±5,5, а после аппликации нифедипина – 35,8±4,9 (n=45, p>0,05). 1.2. Влияние модуляции Са2+-каналов L-типа на вызванную ритмическую активность в интактных и новообразованных моторных синапсах. Исследования ритмических залпов ПКП показали, что их рисунок в интактных и новообразованных синапсах существенно различается. В интактных синапсах вслед за коротким начальным облегчением развивается спад ПКП и выход на сниженный, но стабильный уровень – фазу «плато». В новообразованных же контактах имеет место продолжительное начальное облегчение передачи по ходу залпа, а средняя амплитуда ПКП на фазе «плато» превышает амплитуду первого ПКП в залпе (рис. 3). Рис. 3. Влияние нифедипина и верапамила на амплитуду ПКП новообразованных и зрелых синапсов в коротком залпе. Данные приведены в процентах от первого ПКП в залпе. а) новообразованные синапсы, б) зрелые интактные синапсы. Действие нифедипина на новообразованные синапсы привело к достоверному (р<0,05) подъему уровня фазы «плато» примерно на 20% - от 127,04±0,48% в контроле до 147,75±0,48% на фоне нифедипина (n=51) (рис. 3). Под действием верапамила (5 мкМ) в новообразованных синапсах также происходило достоверное (р<0,05) увеличение средней амплитуды ПКП на фазе 10 «плато» примерно на 29% - от 114,92±0,65% в контроле до 143,62±0,46% на фоне действия верапамила (n=48). Исследования интактных мышечных волокон m.EDL показали, что в зрелых нервно-мышечных синапсах верапамил и нифедипин не оказывали достоверного влияния на параметры залповой активности. Так, например, в контроле уровень фазы «плато» был равен 80,52±0,28% от средней амплитуды ПКП1, а на фоне действия верапамила его значение составило 82,78±0,23% (n=57), то есть верапамил не привел к изменению этого функционально важного параметра залповой активности в интактных синапсах (рис. 3). Итак, проведенные эксперименты показали, что присутствие блокаторов 2+ Са -каналов L-типа в омывающем нервно-мышечный препарат растворе вызывает ярко выраженное облегчение синаптической передачи при ритмической активности в новообразованных моторных синапсах m.EDL. В связи с этим, в следующей серии экспериментов мы решили проверить, как на синаптическую передачу в новообразованных синапсах повлияет воздействие, обратное блокаде L-типа кальциевых каналов - их активация. «Отпирание» Са2+-каналов L-типа при помощи специфического агониста дигидропиридиновой природы S(-)-BAY K 8644 (искусственно удерживающего Са2+-канал в открытом состоянии) в концентрации 1 мкМ привела к тому, что уровень фазы «плато» достоверно снизился на 11,5% по сравнению с уровнем фазы «плато» в контроле (р<0,05). Так, в контроле значение уровня фазы «плато» составляло 169,81±0,73% от средней амплитуды ПКП1 в залпах, а при введении в опытный раствор ВAY К 8644 уровень «плато» снизился до 158,26±0,48% (n=48). Это означает, что под действием активатора кальциевых каналов L-типа происходит подавление уровня выброса АХ при залповой активности новообразованных синапсов. В зрелых интактных терминалях на фоне действия S(-)-ВAY К 8644 значение уровня фазы «плато» было значительно, достоверно (р<0,05) выше, чем в контроле: в контроле уровень «плато» составлял 69,2±0,87% от средней амплитуды ПКП1, а при введении в опытный раствор S(-)-ВAY К 8644 уровень «плато» поднялся до 90,46±0,95% (n=51). Таким образом, только в новообразованных моторных синапсах мыши наблюдается облегчение выброса АХ при действии антагонистов Са2+-каналов Lтипа (нифедипина и верапамила) и торможение выброса АХ при действии агонистов Са2+-каналов L-типа (S(-)-ВAY К 8644). Причем Са2+-зависимое торможение секреции АХ проявляется лишь при вызванной – одиночной и ритмической – активности синапсов и не затрагивает спонтанную секрецию АХ. Для понимания механизмов Са2+-зависимого торможения секреции АХ в новообразованных синапсах, важно было выяснить, участвует ли в нем лишь вход кальция по L-типу каналов, либо также и другие источники поступления кальция в терминаль, в частности – вход наружного кальция по потенциал-зависимым Са2+-каналам P/Q-типа, а также выброс депонированного кальция из рианодинчувствительных Са2+-депо терминалей. 11 1.3. Влияние блокады Са2+-каналов P/Q-типа на одиночную вызванную секрецию медиатора в интактных и новообразованных синапсах. В интакных нервно-мышечных синапсах мыши основными потенциалактивируемыми Са2+-каналами, обеспечивающими вход триггерного кальция, запускающего секрецию медиатора, являются Са2+-каналы P/Q-типа (Uchitel et al., 1992). Их блокада за короткое время приводит к подавлению секреции медиатора на 90% (Katz et al., 1996). В новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши также описан пул потенциал-зависимых Са2+-каналов P/Q-типа. Какую роль играют эти каналы в период существования в терминалях Са2+-зависимого торможения секреции АХ - оставалось не ясным. Для решения этого вопроса мы исследовали изменения режима вызванной секреции АХ в новообразованных нервно-мышечных синапсах m.EDL мыши на фоне действия селективного блокатора Ca2+-каналов P/Q-типа омега-агатоксина в концентрации 70 нМ. Добавление агатоксина в омывающий нервно-мышечный препарат раствор приводило в новообразованных синапсах к падению амплитуды ПКП в первые же 5 минут инкубации на 67%, от 7,05±1,18 мВ в контроле до 2,53±0,09 мВ (p<0,05). Далее, на протяжении 40 минут амплитуда ПКП недостоверно колебалась в пределах 10% этого значения пока, наконец, к исходу часовой инкубации вызванный ответ на стимуляцию нерва вовсе не исчезал (n=51). При этом агатоксин не оказывал влияния на амплитуду МПКП новообразованных терминалей, что свидетельствует о пресинаптическом действии этого токсина. Анализ гистограмм распределений амплитуд ПКП показывает, что асимметричная, имеющая «хвост» высокоамплитудных ПКП гистограмма, характерная для полисинаптического пула новообразованных контактов, после инкубации с агатоксином, резко сдвигается в сторону более низких амплитуд, приобретая компактную симметричную форму (рис. 2). Это свидетельствует о том, что агатоксин (в отличие от нифедипина) одинаково негативно повлиял на все популяции синапсов, сосуществующих на мышечном волокне. Следовательно, в новообразованных терминалях мыши вход кальция по каналам P/Q-типа направлен исключительно на обеспечение запуска Са2+-зависимой секреции АХ и не участвует в процессах Са2+-зависимого подавления выброса медиатора. 2. ВЛИЯНИЕ ДЕПОНИРОВАННОГО КАЛЬЦИЯ НА ВЫЗВАННУЮ СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА В НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСАХ. По данным литературы, в нейронах и других типах клеток вход кальция по L-типу Са2+-каналов часто сопряжен с выбросом депонированного кальция через рианодиновые рецепторы (РиР) (Sukhareva et al., 2002; Yu et al., 2007; Berrout, Isokawa, 2009). Роль системы депонированного кальция в новообразованных синапсах до сих пор никем не изучалась. Поэтому в следующей серии нашей работы мы изучали изменения одиночных ПКП и залповой активности новообразованных синапсов на фоне действия рианодина в концентрации 5 мкМ, вызывающей блокаду РиР и в концентрации 0,5 мкМ, приводящей к активации и удержанию РиР в открытом состоянии (Balezina, Bukiya, 2005). 2.1. Влияние рианодина на одиночную вызванную секрецию медиатора 12 Аппликация рианодина в концентрации, блокирующей РиР и выброс депонированного кальция из пресинаптических Са2+-депо (5 мкМ), приводила к значительному увеличению амплитуды и квантового состава ПКП в новообразованных синапсах m.EDL. Так, квантовый состав ПКП в контроле равнялся 13.12±1,5, а после добавления рианодина (5 мкМ) поднялся до 22,36±3,3 (p<0,05), что составляет 170% от контроля (n=67). Амплитуда МПКП под действием рианодина не изменяется, что указывает на пресинаптический характер облегчающего действия этого реагента на амплитуду ПКП. При добавлении в омывающий нервно-мышечный препарат раствор рианодина в низкой, активирующей РиР концентрации (0,5 мкМ), наблюдается прямо противоположный эффект. Квантовый состав ПКП снижается от 18,38±2,07 в контроле до 13,51±1,1 – то есть на 26% (p<0,05, n=61). На гистограмме амплитудных распределений ПКП виден симметричный сдвиг огибающей в сторону низких амплитуд под действием рианодина в концентрации 0,5 мкМ. Амплитуда МПКП осталась при этом неизменной, благодаря чему мы можем считать данный тормозный эффект рианодина пресинаптическим, направленным на торможение квантового выброса АХ в новообразованных синапсах. 2.2. Влияние рианодина на залповую вызванную секрецию медиатора. Введение в раствор Лайли рианодина в концентрации 5 мкМ привело к значительному повышению уровня фазы «плато» ПКП в ритмических залпах ПКП, регистрируемых в новообразованных синапсах m.EDL. Уровень фазы «плато» в залпе в контроле составил 174,16±1,49% от средней амплитуды ПКП1 и был достоверно (р<0,05) ниже значения уровня фазы «плато» на фоне действия рианодина 5 мкМ - 306,8±5,79% (n=58) (рис. 4). Таким образом, «выключение» кальциевых депо, то есть Са2+зависимого выброса депонированного кальция, в новообразованных синапсах на ранних стадиях мышечной реиннервации привело к развитию хорошо выраженного облегчения выброса медиатора в условиях Рис. 4. Изменение амплитуды ПКП в ходе ритмической стимуляции нерва. залповой активности новообразованных Добавление же рианодина в синапсов на фоне действия рианодина в низкой концентрации (0,5 мкМ) концентрации 5 и 0,5 мкМ. Данные приведены в привело к полному исчезновению % от первого ПКП в залпе. продолжительного облегчения передачи в коротком залпе ПКП, наблюдавшемуся в контроле. На фоне действия 0,5 мкМ рианодина ярко выражено падение уровня «плато» в залпе. Если в контроле значение фазы плато составило 170,98±0,49% от средней амплитуды ПКП1, то при введении рианодина (0,5 мкМ) уровень фазы «плато» упал до значения 114,42±0,35% (n=63, р<0,05) (рис. 4). 13 В результате двух подходов – анализа эффектов блокады и активации РиР – нами получены взаимодополняющие и логически не противоречащие друг другу результаты. Они позволяют говорить о том, что в терминалях новообразованных моторных синапсов m.EDL мыши эффективно работает выброс депонированного кальция через РиР, который направлен на подавление секреции АХ. В связи с этим важно было выяснить, может ли выброс депонированного кальция запускаться при входе в терминаль кальция по L-типу каналов. Для ответа на этот вопрос мы проводили регистрацию и анализ одиночной вызванной активности новообразованных синапсов на фоне сочетанного действия нифедипина (10 мкМ) и рианодина (5 мкМ). 2.3. Изменение параметров вызванной активности новообразованных синапсов на фоне совместного действия нифедипина и рианодина. Инкубация реиннервированного нервно-мышечного препарата m.EDL мыши с нифедипином приводила к значительному облегчению секреции медиатора. Квантовый состав ПКП достоверно увеличивался от 12,2±1,5 в контроле до 19,4±2,3 (p<0,05). Последующее добавление рианодина в концентрации, блокирующей РиР (5 мкМ), не вызывало дополнительного прироста амплитуды или квантового состава одиночных ПКП. Квантовый состав на фоне совместного действия нифедипина и рианодина составил 17,7±1,5 (n=69). Таким образом, наши данные показывают, что в новообразованных нервномышечных синапсах мыши Са2+-зависимое торможение секреции медиатора может происходить с участием как минимум, двух типов Са2+-сигналов: поступлении наружного кальция по Са2+-каналам L-типа и сопряженном с ним выбросе депонированного кальция через РиР. Каковы возможные молекулярные мишени этих тормозных кальциевых сигналов, оставалось неясным. Данные литературы свидетельствуют, что Са2+зависимое торможение секреции медиатора может происходить с участием Са2+активируемых К+-каналов либо Са2+-зависимых ферментов нервных терминалей. В связи с этим, в следующих сериях работы были исследованы пресинаптические эффекты избирательных блокаторов К+Са-каналов и ряда Са2+-зависимых ферментов. 3. ВЛИЯНИЕ БЛОКАТОРОВ КАЛЬЦИЙ-АКТИВИРУЕМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ НА СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА В НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСАХ. В этой серии экспериментов были изучены эффекты избирательных блокаторов К+Са-каналов двух разных типов: апамина (блокатора + SK-типа) и паксиллина (блокатора низкопроводящих К Са-каналов + высокопроводящих К Са-каналов BK-типа) на амплитуду и квантовый состав ПКП новообразованных синапсов m.EDL мыши. Мы установили, что апамин (0,5 мкМ) не вызывает достоверных изменений амплитуды и квантового состава одиночных ПКП или картины залповой активности новообразованных синапсов. Так, уровень фазы плато в контроле был равен 121,71±0,33% от амплитуды ПКП1, а на фоне действия апамина – 14 123,75±0,36% (n=45). Эти данные говорят о полном неучастии низкопроводящих (SK) K+Ca-каналов в регуляции секреции медиатора в реиннервированных синапсах. Под действием паксиллина (1 мкМ) квантовый состав ПКП новообразованных синапсов претерпевает небольшое, но достоверное увеличение. В контроле значение квантового состава ПКП равнялось 13,4±2, а на фоне паксиллина – 16,3±1,1 (p<0,05). Однако при последующем добавлении в омывающий раствор нифедипина наблюдался дополнительный прирост квантового состава ПКП до 20,2±2, что достоверно (p<0,05) превышает значения квантового состава в контроле и на фоне действия паксиллина (n=84). Тот факт, что на фоне действия паксиллина аппликация нифедипина приводит к дополнительному повышению квантового состава ПКП (сопоставимому с облегчающим действием чистого нифедипина) указывает на не связанное между собой функционирование Са2+-каналов L-типа и K+Ca-каналов BK-типа в новообразованных синапсах. Подтверждает этот вывод и гистограмма распределений амплитуд ПКП, приведенная на рисунке 5. Видно, что паксиллин приводит к относительно небольшому симметричному сдвигу огибающей гистограммы в сторону высоких амплитуд, но нифедипин на этом фоне дает еще более сильный сдвиг в высокоамплитудную область и вызывает появление дополнительного пика на гистограмме, характерного именно Рис. 5. Гистограмма амплитудных распределений для эффектов блокады Са2+-каналов ПКП новообразованных синапсов на фоне L-типа. действия паксиллина и последующего Таким образом, полученные добавления нифедипина. данные свидетельствуют о том, что 2+ Са -ток, входящий в терминаль по каналам L-типа, вызывает торможение секреции АХ без участия K+Ca-каналов. 4. ВЛИЯНИЕ КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМЫХ ФЕРМЕНТОВ НА СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА В НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСАХ МЫШИ. В качестве дальнейшего шага в поисках механизма Са2+–зависимого торможения в новообразованных синапсах мыши мы предположили, что кальций, входящий в терминаль по каналам L-типа, может избирательно активировать Са2+-зависимые ферменты, которые далее и осуществляют торможение секреции АХ. Действительно, в нервных терминалях центральных и периферических синапсов описаны многочисленные белки и ферменты, активность которых избирательно регулируется ионами кальция. К их числу принадлежат, в частности, кальмодулин, кальмодулинкиназы, протеинкиназы С (PKС) (Colbran, Brown, 2004; Yamauchi, 2005; Dunlap, 2007; Liu et al., 2007; Santafe et al, 2007; 15 Shakiryanova et al., 2007; Wong et al., 2009). Их возможное участие в Са2+зависимом торможении секреции АХ мы исследовали в следующих сериях нашей работы. 4.1. Влияние блокады кальмодулина и CaMKII на параметры одиночной вызванной секреции в новообразованных синапсах. Блокада кальмодулина при помощи его специфического антагониста R24571 (кальмидазола) в концентрации 2 мкМ никак не повлияла на амплитуду и квантовый состав одиночных ПКП в течение 90 минут инкубации с этим реагентом. Так, квантовый состав ПКП составил 11,74±0,63 в контроле и 11,22±1,07 на фоне действия кальмидазола (p>0,05, n=53). Это свидетельствует о том, что если кальций, входящий в терминаль по каналам L-типа, и воздействует на кальмодулин аксоплазмы, то это никак не отражается на вызванных одиночных актах секреции АХ. По-видимому, активность кальмодулина не принимает участия в Са2+-зависимом торможении секреции медиатора. На протяжении 90 минут инкубации с блокатором CaMKII KN-62 (3 мкМ) квантовый состав ПКП также не изменился: его значение составило 11,03±0,84 в контроле и 10,65±0,9 на фоне действия KN-62 (p>0,05, n=41) .Полученные данные означают, что CaMKII тоже, по видимому, не является той мишенью, на активацию которой направлен Са2+-сигнал, формирующийся в терминали при входе кальция по L-типу Са2+-каналов в новообразованных моторных сианпсах мыши . Однако по данным литературы, активность данного фермента может двунаправлено регулироваться и неоднозначно зависеть от действия различных Са2+-сигналов (Liu et al., 2007; Wang, 2008). В связи с этим, в следующей серии экспериментов мы проводили блокаду CaMKII на фоне вызванного нифедипином облегчения секреции медиатора. 4.2. Влияние блокады CaMKII на активность новообразованных синапсов на фоне действия нифедипина. Нифедипин вызывал увеличение квантового состава ПКП на 74,4±6,37% и увеличение амплитуды ПКП на 58,4±7,32% (р<0,05). При этом амплитуда МПКП достоверно не изменялась. На фоне вызванного нифедипином пресинаптического облегчения передачи, блокатор CaMKII KN-62 вызывал достоверное снижение квантового состава ПКП до исходных контрольных значений. Аналогично снижалась и амплитуда ПКП (p<0,05). То есть KN-62 полностью подавлял вызванный нифедипином прирост амплитуды и квантового состава ПКП (n=68). Таким образом, нами впервые было показано, что облегчающее действие CaMKII на секрецию медиатора в новообразованных моторных терминалях полностью купируется кальциевым сигналом, возникающим в терминалях при входе кальция по L-типу Са2+-каналов. Однако при блокаде этого сигнала специфическим блокатором нифедипином может проявляться способность 16 CaMKII облегчать секрецию медиатора и вызывать прирост амплитуды и квантового состава ПКП. Возможность неактивного (или подавленного) состояния СаМКII на фоне действия в терминалях Са2+-сигналов определенной модальности и генеза недавно показана в центральных синапсах. В новообразованных синапсах гиппокампа, в частности, это объясняется функционированием СаМКII в едином надмолеклуярном комплексе с Са2+-зависимыми фосфатазами, чья активность может доминировать и маскировать активность СаМКII (Menegon et al., 2002). Наряду с анализом возможной роли CaMKII, представлялось интересным исследовать возможное участие и другого Са2+-зависимого фермента, протеинкиназы С которая могла бы активироваться входящим в терминаль кальциевым L-током и принимать участие в торможении секреции АХ (Maasch et al., 2000). Роль РКС и механизмы ее действия в новообразованных синапсах мало изучены. Поэтому мы решили проверить возможность ее вклада в исследуемый тормозный эффект. 4.3. Влияние блокады PKC на активность новообразованных синапсов. Мы установили что два разных по химической структуре блокатора PKC – хелеритрин (4 мкМ) и бисиндолилмалеимид I (BIM) (1 мкМ) – вызывают достоверный (p<0,05) прирост квантового состава ПКП на 58% (от 11,9±1,2 в контроле до 18,6±2,2; n=48) и 66% (от 12,3±2,1 в контроле до 20,4±2,4; n=45) соответственно, что сопоставимо с облегчающим действием нифедипина. Более того, на фоне блокады PKC происходят характерные изменения формы гистограммы амплитудного распределения ПКП – дисперсия сигналов и появление полимодальности, аналогичные наблюдаемым при действии нифедипина (рис. 6). Полученные данные позволяют предположить, что, возможно, не только CaMKII, но и PKС также является мишенью для кальция, входящего по каналам L-типа в незрелые моторные нервные терминали реиннервирумых мышечных волокон m.EDL. В настоящее время в научной литературе мало данных о избирательной Рис. 6. Гистограмма амплитудных распределений возможности активации PKС одиночных ПКП новообразованных синапсов под прицельной действием хелеритрина. кальцием, входящим в терминаль по каналам L-типа. Такая возможность показана, например, для хромафинных клеток (Park, Kim, 2009). Мы исследовали возможность такой активации PKС в новообразованных синапсах мыши. Для этого в следующей серии анализировали действие хелеритрина на параметры ПКП на фоне блокады Са2+-каналов L-типа нифедипином. 17 4.4. Действие хелеритрина на активность новообразованных синапсов на фоне блокады Ca2+-каналов L-типа. Если PKС действительно может активироваться входом кальция через Са2+каналы L-типа, то на фоне блокады этих каналов не должно происходить дополнительного прироста квантового состава ПКП при последующей инактивации PKС. Действительно, в контроле квантовый состав равнялся 11,4±0,95, на фоне действия нифедипина достоверно возрастал до 17,47±1,3 (p<0,05), но при последующем добавлении хелеритрина достоверно не изменился и составил 16,14±1,01 (n=72). Не происходило также и Рис. 7. Изменение квантового состава одиночных дополнительных изменений формы амплитудных ПКП новообразованных синапсов под действием гистограммы хелеритрина, BIM, нифедипина и совместным распределений (рис. 7). действием нифедипина и хелеритрина. Данные Полученные данные приведены в процентах от контроля. позволяют предполагать, что в новообразованных синапсах PKС чувствительна к кальцию, поступающему по Са2+-каналам L-типа, и ее активность в этом случае направлена и сопряжена с Са2+-зависимым торможением секреции медиатора. 5. ВЛИЯНИЕ БЛОКАДЫ ПОТЕНЦИАЛ-АКТИВИРУЕМЫХ К+-КАНАЛОВ НА АКТИВНОСТЬ НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСОВ. В настоящее время известно, что моторные нервные терминали периферических синапсов позвоночных обладают разнообразным пулом К+каналов, в том числе - потенциал-активируемыми К+-каналами (обозначаемыми как K+v-каналы), избирательно блокируемыми тетраэтиламмонием, дендротоксином и 4-аминопиридином (Зефиров, Ситдикова, 2002) и обеспечивающими вторую фазу пресинаптического потенциала действия. От активности этих каналов и длительности второй фазы пресинаптического потенциала действия будет зависеть поступление в терминаль триггерного кальциевого тока (по P/Q-каналам), запускающего выброс медиатора. В связи с этим, мы решили проверить, не могут ли в качестве субстрата для PKС выступать K+v-каналы терминали. Для этого мы исследовали эффекты двух разных по химической природе и механизмам действия блокаторов K+v-каналов – 4-аминопиридина и бутандионмоноксима (BDM), и их взаимодействие с эффектами блокады PKC. 5.1. Влияние 4-аминопиридина и BDM на одиночную вызванную активность новообразованных синапсов. 18 Добавление в экспериментальный раствор BDM в концентрации 20 мМ приводило к значительному достоверному возрастанию амплитуды ПКП реиннервированных синапсов: в контроле средняя амплитуда ПКП равнялась 6,7±0,26 мВ, а после добавления BDM – 12,2±1,3 мВ (p<0,05). Квантовый состав ПКП также увеличивался от 11,3±1 в контроле до 25,4±2,8 (p<0,05, n=39) (рис. 8). При аппликации 4-аминопиридина амплитуда ПКП возрастала от 9,8±0,85 мВ в контроле до 14,8±1,18 мВ. (p<0,05). Квантовый состав увеличился от контрольного значения 18,8±1,98 до 29,5±2,13 на фоне действия 4-аминопиридина (p<0,05, n=54), т.е. на 57%, что сравнимо с облегчающими эффектами при блокаде Ca2+-каналов L-типа или PKС (рис. 8). Оба блокатора также вызывали не только сдвиг гистограмм амплитудных распределений ПКП в область высокоамплитудных значений, но и их дисперсию, расширение и распад на несколько подобно действию Рис. 8. Гистограмма амплитудных распределений пиков, одиночных ПКП новообразованных синапсов под нифедипина. действием BDM и 4-АР. 5.2. Влияние 4-аминопиридина на активность новообразованных синапсов в условиях блокады PKC. В последней серии экспериментов мы проверяли возможность регуляции K+v-каналов PKС в реиннервированных синапсах мыши. Для этого исследовали изменения амплитуды и квантового состава ПКП, вызываемые 4аминопиридином, на фоне предварительной блокады PKС хелеритрином. Хелеритрин вызывал прирост амплитуды и квантового состава ПКП новообразованных синапсов. Так, в контроле квантовый состав равнялся 14,3±1,6, а после инкубации с хелеритрином – 20,5±1,7 (p<0,05). На этом фоне 4аминопиридин терял свою способность к дальнейшему облегчению секреции медиатора и квантовый состав равнялся 20,7±2 (p>0,05, n=73) (рис. 9). Амплитуда же и частота спонтанной секреции оставались неизменными под действием обоих веществ. 19 Рис. 9. Изменение квантового состава и амплитуды одиночных ПКП новообразованных синапсов под действием хелеритрина и 4-аминопиридина на фоне хелеритрина. а) Квантовый состав ПКП, б) Гистограммы амплитудных распределений ПКП. Блокада K+v-каналов на фоне предварительной блокады PKC не приводит к дополнительным сдвигам или изменению формы гистограммы амплитудных распределений ПКП (рис. 9). При проведении противоположной процедуры, когда на фоне предварительного блока K+v-каналов 4-аминопиридином мы провели воздействие на нервно-мышечный препарат хелеритрином, оказалось, что хелеритрин также теряет способность вызывать дополнительный прирост амплитуды или квантового состава ПКП. В этом случае квантовый состав от контрольного уровня в 17,3±2,06 поднялся до 28,9±2,2 на фоне действия 4-аминопиридина (p<0,05) и остался равным 28,9±2,4 при дальнейшей аппликации хелеритрина (p>0,05, n=62). Эти данные свидетельствуют в пользу наличия функционального сопряжения между Са2+-зависимой активностью PKС и усилением активности К+каналов терминали. В научной литературе на данный момент отсутствуют данные о подобных взаимодействиях K+v-каналов и PKС в зрелых или новообразованных нервно-мышечных синапсах. Однако прямое фосфорилирование субъединиц K+vканалов PKС, приводящее к их усиленной активации или подавлению, показано для нейронов слуховой зоны ствола мозга (Desai et al., 2008), зрелых нейронов мозга (Wang et al., 2004) и для кардиомиоцитов (Schrader et al., 2009). Совокупность полученных фактов позволяет говорить о том, что нами впервые обнаружен еще один возможный механизм Са2+-зависимого торможения секреции АХ в новообразованных синапсах – за счет избирательной Са2+зависимой активации пресинаптической PKС, действие которой в новообразованных терминалях направлено на усиление активности K+-тока по потенциал-активируемым К+v-каналам терминали. Таким образом, мы показали, что механизм действия тормозного Са2+-сигнала, создаваемого входом медленного Са2+-тока по L-типу Са2+-каналов (в совокупности с выбросом депонированного кальция), реализуется через специфический внутриклеточный каскад реакций с участием PKС и замыкается на усилении активности пресинаптического K+v-тока, приводя к снижению секреции медиатора и подавлению работы функционирующих новообразуемых синапсов (рис. 10). 20 Рис. 10. Схема механизмов Са2+-зависимого торможения секреции медиатора в новообразованных нервно-мышечных синапсах. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные исследования показали, что в нервно-мышечных синапсах мыши в период их новообразования на скелетных мышечных волокнах, наряду с Са2+-активируемым выбросом АХ имеется также Са2+-зависимое торможение секреции АХ, осуществляемое кальцием, входящим в терминали по «медленным» потенциал-активируемым Са2+-каналам L-типа. Выключение этих каналов избирательными блокаторами приводит к облегчению выброса АХ, а потенцирование их активности - напротив, к подавлению секреции АХ. Мы установили, что Са2+-зависимое торможение передачи не затрагивает спонтанную секрецию АХ и направлено на подавление вызванного выброса медиатора, в особенности - при ритмической активности синапсов. Нами также показано, что в исследуемых нервных терминалях функциональное назначение разных пресинаптических Са2+-входов не одинаково. Так, Са2+-ток, входящий в терминали по P/Q-типу Са2+-каналов не участвует в торможении секреции АХ и предназначен для запуска вызванного выброса медиатора. Тормозный же Са2+сигнал, как оказалось, формируется не только входящим Са2+-током L-типа, но и сопряженным с ним выбросом депонированного кальция через РиР. Известные сегодня случаи Са2+-зависимого торможения секреции медиатора обычно предполагают активацию Са2+-зависимых К+-каналов терминали (Yazejian et al., 2000; Pattillo et al., 2001), кальмодулин-зависимое торможение Са2+-каналов (Dunlap, 2007), либо –модуляцию Са2+–зависимых ферментов (Liu et al., 2007; Santafe et al., 2007; Shakiryanova et al., 2007; Wong et al., 2009; Lee et al., 2009). Мы установили, что в новообразованных моторных терминалях Са2+зависимое торможение передачи осуществляется без участия К+Са-каналов и сохраняется в случае их избирательной блокады. 21 Нами впервые выявлен вклад Са2+-активируемых ферментов – СаМКII и PKС в механизм Са2+-зависимого торможения секреции АХ. Анализ сочетанного действия блокаторов Са2+-каналов и Са2+-зависимых ферментов на секрецию АХ показал , что в условиях входа в терминали кальция по каналам L-типа наблюдается подавление способности пресинаптической СаМКII облегчать выброс медиатора. В то же время мы впервые показали, что входящий L-ток способен прицельно активировать PKC, обеспечивающую усиление работы K+vканалов, и это приводит к подавлению секреции АХ. Наличие в терминалях реципрокно действующих Са2+-сигналов (запускающих и тормозящих секрецию АХ) предполагает их пространственное и структурнофункциональное разобщение. Действительно, недавно показано, что в моторных нервных терминалях мышей Са2+-каналы L-типа локализованы вне активных зон, а входящий по ним Са2+-ток может лишь опосредованно влиять на секрецию АХ (Urbano et al., 2001; Гайдуков и др., 2009). Известно и о компартментализации Са2+-зависимых ферментов в нервных терминалях, их прицельной активации строго определенными Са2+-сигналами. Например, показана избирательная активация пресинаптической СаМКII депонированным кальцием в моторных терминалях дрозофилы (Shakiryanova et al., 2007), активация PKC входом кальция по L-типу Са2+-каналов в хромаффинных клетках (Park, Kim, 2009). Аналогичным образом, по-видимому, реализуются и обнаруженные нами механизмы Са2+зависимого торможения секреции АХ в нервно-мышечных синапсах мыши. В целом, способность определенных Са2+-сигналов подавлять выброс медиатора можно рассматривать как проявление ауторегуляции синапсов по принципу отрицательной обратной связи с участием разных механизмов и пресинаптических Са2+-входов (Yazejian et al., 2000; Pattillo et al., 2001; Dunlap, 2007; Балезина и др., 2007; Федорин, Балезина, 2008). В исследованной нами модели – в новообразованных моторных синапсах мыши - такое торможение, согласно нашим и литературным данным (Santafe et al., 2002), может выполнять специфическую роль. Оно может быть направлено на подавление активности и элиминацию избыточного числа синаптических контактов для перехода от поли- к моносинаптической иннервации мышечных волокон. 22 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. ВЫВОДЫ Блокада пресинаптических Са -каналов L-типа нифедипином (10 мкМ) и верапамилом (5 мкМ) приводила к возрастанию, а их активация агонистом ВAY K 8644 (1 мкМ) – к снижению квантового состава одиночных и ритмически генерируемых ПКП, демонстрируя способность входящего в нервные терминали Са2+-тока L-типа вызывать торможение секреции АХ в новообразованных моторных синапсах мыши. Частота МПКП не менялась под действием нифедипина в покое и на фоне К+-деполяризации терминали, демонстрируя устойчивость спонтанной секреции АХ к тормозному действию Са2+-тока, входящего в терминали по каналам L-типа. Стимулирование выброса депонированного кальция рианодином (0,5мкМ) приводило к снижению квантового состава одиночных и ритмически генерируемых ПКП, а блокада РиР рианодином (5мкМ) напротив, облегчала секрецию медиатора. На фоне нифедипина рианодин (5 мкМ) терял способность вызывать дополнительный прирост уровня секреции АХ, демонстрируя, что в торможении секреции АХ, вызванной входом кальция по L-типу каналов участвует и выброс депонированного кальция. Отсутствие пресинаптических эффектов блокатора SK-типа К+Са-каналов апамина (1мкМ) и способность нифедипина повышать квантовый состав ПКП, несмотря на его предварительное увеличение, вызываемое блокатором BK-каналов паксиллином (1 мкМ), свидетельствуют о неучастии К+Са каналов в реализации тормозного действия Са2+-тока L-типа на секрецию АХ. Блокатор кальмодулина R24571 (2 мкМ) и кальмодулинкиназы II KN-62 (3 мкМ) не оказывали влияния на квантовый состав ПКП, однако на фоне его предварительного увеличения, вызванного нифедипином, блокатор кальмодулинкиназы II приводил к подавлению квантового состава ПКП до контрольного уровня. Блокаторы PKС хелеритрин (4 мкМ) и BIM (1 мкМ) вызывали прирост квантового состава ПКП, сопоставимый с действием нифедипина. На фоне действия нифедипина хелеритрин терял способность к дальнейшему облегчению секреции АХ. Блокаторы K+v-каналов 4-аминопиридин (6 мкМ) и BDM (20 мМ) увеличивали вызванный выброс АХ. Предварительная инкубация мышц с хелеритрином предотвращала дополнительное облегчение секреции АХ 4аминопиридином. На фоне действия 4-аминопиридина хелеритрин также не оказывал дальнейшего потенцирующего действия на нервно-мышечную передачу. Таким образом, можно предполагать, что в новообразованных нервных терминалях Са2+-зависимое торможение секреции АХ происходит с участием Са2+-тока L-типа и выброса депонированного кальция, которые тормозят облегчающее действие кальмодулинкиназы II на секрецию АХ и стимулируют тормозное действие PKC, осуществляемое путем поддержки активности пресинаптических К+v-каналов. 2+ 23 Список работ, опубликованных по теме диссертации Богачева П.О. Роль кальция в работе новообразуемых нервно-мышечных синапсов мыши. // Материалы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», г. Москва, 2007. Богачева П.О., Балезина О.П. Модулирующее действие кальция на активность новообразуемых нервно-мышечных синапсов мыши. // Тезисы докл. XX Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова, г. Москва, 2007, С. 152-153. 3. Балезина О.П., Богачева П.О., Орлова Т. Ю. Влияние блокаторов кальциевых каналов L-типа на активность новообразуемых синапсов мыши. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2007. Т. 143 (2). С. 128-32. 4. Богачева П.О., Балезина О.П. Влияние блокаторов Са2+-каналов L-типа и рианодиновых рецепторов на активность новообразуемых синапсов мыши // Статья в сборнике научных трудов по материалам I Всероссийского, с международным участием, конгресса студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008» - «Биология: традиции и инновации в 21 веке», г. Казань, 2008. С. 16-18. 5. Богачева П.О. Подавление секреции медиатора с участием Ca2+-каналов L-типа и рианодиновых рецепторов в новообразованных синапсах мыши. // Тезисы докл. I Всероссийской (XVI) молодежной научной конференции "Молодежь и наука на севере", г. Сыктывкар, 2008г. Т. 2. С. 201. 6. Bogacheva P.O., Balezina O.P. Acetylcholine release's suppression through the activity of L-type calcium channels and ryanodine receptors in newly formed motor synapses in mice. // Abstr. 6th Federation of European Neurosciences Societies (FENS) Forum, Geneva; Switzerland, 2008. V. 4. P. 143.3. 7. Bogatcheva P.O., Balezina O.P. Acetylcholine release's suppression through the activity of L-type calcium channels and ryanodine receptors in newly formed motor synapses in mice. // Abstr. Neuroscience 2008 - 38th annual meeting of the Society for Neuroscience. Washington, DC, USA, 2008. V. 4. P. 722.2/B46. 8. Богачева П.О., Балезина О.П. Модуляция работы новообразованных нервномышечных синапсов мыши при помощи пресинаптических рианодиновых рецепторов и кальциевых каналов L-типа. // Тезисы докл. конференции с международным участием, посв. 90-летию со дня рожд. Т.М. Турпаева «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций», г. Москва, 2008, С. 36-37. 9. Богачева П.О., Ежова Е.В., Балезина О.П. Подавление секреции медиатора в новообразованных синапсах мыши с участием Ca2+-зависимых киназ. // Статья в сборнике научных трудов по материалам международной конф. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», г. Пущино, 2009, Т. 1, С. 167-171. 10. Bogatcheva P.O., Balezina O.P. Downregulation of ACh secretion in reinnervated mouse neuromuscular junctions involving PKC activity and Voltage-dependent K+channels. // Abstr. Annual meeting of the Physiological Society “Physiology 2009”, Dublin, Ireland, 2009. 11. Балезина О.П, Богачева П.О. Подавление секреции медиатора с участием Сa2+каналов L-типа и рианодиновых рецепторов в новообразованных синапсах мыши. // Известия РАН. Серия биологическая. 2009. №. 5. С. 591-597. 24 Список использованных сокращений АХ – ацетилхолин МПКП – миниатюрный потенциал концевой пластинки; ПКП – потенциал концевой пластинки; РиР – рианодиновые рецепторы; BDM – бутандион моноксим; CaMKII – кальмодулинкиназа II типа; PKC – протеинкиназа С.
