ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЕНЗЕНСКИЙ ИНСТИТУТ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ВРАЧЕЙ»
реклама
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЕНЗЕНСКИЙ ИНСТИТУТ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ВРАЧЕЙ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ На правах рукописи АЩИНА ЛЮДМИЛА АНДРЕЕВНА ОЦЕНКА ЦИТОКИН-ПРОДУЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ С АУТОИММУННОЙ ФОРМОЙ ХРОНИЧЕСКОЙ КРАПИВНИЦЫ 14.03.09. – клиническая иммунология, аллергология 14.03.10. – клиническая лабораторная диагностика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Баранова Надежда Ивановна Научный консультант: кандидат медицинских наук, Кулюцина Елена Романовна Пенза, 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………... 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………. 21 1.1. Этиологические факторы хронической крапивницы……………………… 21 1.2. Патогенетические механизмы хронической крапивницы…………………. 24 1.2.1. Патогенетические механизмы хронической аутоимммунной крапивницы………………………………………………………………………... 27 1.3. Иммунные нарушения у больных хронической крапивницей……………. 30 1.3.1.Нарушения цитокиновой регуляции при хронической крапивнице…….. 34 1.4. Применение тестов in vitro для изучения иммунологических нарушений. 38 1.5. Лечение больных хронической аутоиммунной крапивницей…………….. 42 ГЛАВА 2. ПРИМЕНЕНИЕ ТЕСТА EX VIVO ДЛЯ ОЦЕНКИ ЦИТОКИНПРОДУЦИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ У СПОСОБНОСТИ БОЛЬНЫХ КЛЕТОК ХРОНИЧЕСКОЙ ИММУННОЙ АУТОИММУННОЙ КРАПИВНИЦЕЙ………………………………………………………………….. 43 2.1. Оценка спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей…………………………………………………….. 2.2. Влияние препарата «Габриглобин-IgG» на 43 цитокин- продуцирующую способность клеток иммунной системы в тесте еx vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей…………………………… 47 2.2.1. Результаты отработки диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo на клетках иммунной системы здоровых людей……………………………………………...……………………………….. 47 2.2.2. Показатели продукции цитокинов клетками иммунной системы под действием препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей……………………………………… 49 ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУННОГО СТАТУСА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ АУТОИММУННОЙ КРАПИВНИЦЕЙ…………………….. 52 3 3.1. Характеристика основных иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей……………………………………… 3.2. Характеристика уровня 52 цитокинов в сыворотке крови у больных хронической аутоиммунной крапивницей……………………….……………... 56 ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ АУТОИММУННОЙ КРАПИВНИЦЕЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ ИДИОПАТИЧЕСКОЙ КРАПИВНИЦЕЙ………………………………………………………………….. 59 ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ АУТОИММУННОЙ КРАПИВНИЦЕЙ ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ ЛЕЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОМ «ГАБРИГЛОБИН-IGG»………………………………………………………… 65 5.1. Характеристика спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей после лечения препаратом «Габриглобин-IgG»………………………………………………………………. 5.2. Характеристика цитокин-продуцирующей способности 65 клеток иммунной системы под действием препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей после лечения... 71 5.3. Оценка иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей после лечения препаратом «Габриглобин-IgG»……………………………………………………………….. 74 5.4. Критерии отбора больных хронической аутоиммунной крапивницей на лечение препаратом «Габриглобин-IgG»……………………………………….. 80 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………… 93 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………………….. 110 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………... 111 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы В современной аллергологии крапивница представляет серьезную проблему. По распространенности хроническая крапивница (ХК) занимает третье место после поллиноза и бронхиальной астмы [34]. Ранее считалось, что ХК в 80-95% случаев является идиопатической [23,62]. Однако в связи с многочисленными исследованиями в данной области процент хронической идиопатической крапивницы (ХИК) заметно сократился и составляет 55%, и около 45% в структуре ХК составляет хроническая аутоиммунная крапивница (ХАК) [111]. Наиболее тяжелой фомой ХК является ХАК. Ввиду сложности и малой изученности иммунных механизмов в патогенезе ХАК, терапевтическая тактика лечения таких пациентов является малоэффективной. Известно, что в основе патогенетических механизмов ХАК лежит образование аутоантител к высокоафинному IgE рецептору и молекуле IgE, которые способны стимулировать выброс медиаторов из базофилов и тучных клеток, результатом чего является развитие уртикарной реакции [124]. Однако причина образования аутоантител у больных ХАК на сегодняшний день остается неизвестной. Также отмечено, что при ХАК развиваются различные дефекты иммунной системы, которые могут выражаться в гиперактивации Т- и В-систем иммунитета, активации систем свертывания крови, компонентов комплемента, дисбалансе системы цитокинов [73,97,98,165,170]. Доказано, что ключевую роль в патогенезе ХАК играют ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ [7,122,164,182]. Но немногочисленные данные по этому вопросу являются противоречивыми и не дают полного представления о цитокиновой регуляции при ХАК, в связи с чем, изучение иммунологических механизмов с участием цитокинов является особенно актуальным. В последнее время одним из перспективных методов изучения цитокинов является исследование их продукции клетками иммунной системы в тестах ex 5 vivo. Данные тесты создают своего рода модельные системы, наиболее приближенные к реальным условиям, исследовать которые можно вне организма. Кроме того, они позволяют дать оценку не только цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы, но и использовать их для изучения влияния фармакологических препаратов, с целью назначения терапии больным [52]. Одним из наиболее эффективных методов в лечении больных ХАК является применение внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ). В нашей стране в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (Москва) был разработан ВВИГ четвертого поколения – препарат «Габриглобин-IgG», высокая эффективность которого была доказана в ряде работ [13,41]. Однако механизмы действия данного препарата при ХАК до сих пор остаются малоизученными. Также, несмотря на большой процент пациентов с хорошими результатами от терапии, сохраняется процент с неудовлетворительными результатами. В связи с вышеизложенным для оптимизации терапии актуальным является разработка иммунологических критериев отбора больных ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG». Степень разработанности темы исследования ХАК была открыта в 1993 году M.Greaves и M.Hide [119]. Было показано, что в основе данной формы ХК лежит образование аутоантител, которые способны активировать тучные клетки и базофилы и вызывать их дегрануляцию [155]. Однако до сих пор причина их образования остается неясной. Большой вклад в изучение патогенетических механизмов ХАК внесли зарубежные ученые. Так, Boguniewicz M., Cugno M. доказали роль активации коагуляционного каскада [84,95]. Kasperska-Zajac A. и соавторы изучали роль гормональных нарушений в патогенезе данного заболевания [126]. Santos J. C. и соавторы исследовали цитокиновую регуляцию и роль хемокинов [165,166]. Кроме того, известны работы Caproni M. и соавторов, в которых рассматриваются вопросы нарушения цитокиновой регуляции и клеток иммунной системы при ХАК [86,88,89]. 6 Известен ряд ученых, включая Samia A.I., Tedeschi A., Ying S., работы которых посвящены изучению цитокинов у больных с данной патологией [164,173,182]. Однако до сих пор нет единого мнения о цитокиновой регуляции при ХАК. Из отечественных ученных, которые занимаются проблемой ХАК, известны Борзова Е.Ю., Гервазиева В.Б., Груздева М.С. Голубчикова Р.Н., Горячкина Л.А., Данилычева И.В., Калимолдаева С.Б., Молотилов Б.А., Орлова Е.А., Сигбатуллина Н.А. и другие. Но работы данных авторов посвящены, в основном, проблеме диагностики и лечения заболевания, а также исследованию отдельных немногочисленных иммунологических параметров. При этом остаются малоизученными вопросы, связанные с иммунными нарушениями у больных ХАК. Кроме того, до сих пор не было проведено комплексной оценки показателей клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента и цитокинов. В перечисленных выше работах по изучению цитокинов при ХАК, представлены результаты исследований, которые проводились в сыворотке крови, и до сих пор не было проведено изучения спонтанной и стимулированной продукции цитокинов клетками иммунной системы. Исследование цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы у больных с данной патологией является новым направлением в изучении патогенеза ХАК. Цель исследования Оценить цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы у больных с аутоиммунной формой хронической крапивницы и определить ее роль в оптимизации лечения. Задачи исследования 1. Оценить выработку ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в спонтанном и ФГА-индуцированном супернатанте в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей. 7 2. Отработать диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG» на клетках иммунной системы здоровых доноров. 3. Определить влияние диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на показатели выработки ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей. 4. Провести сравнительную оценку иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей и хронической идиопатической крапивницей. 5. Дать оценку влияния лечения препаратом «Габриглобин-IgG» на цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы, а также иммунологические показатели у больных хронической аутоиммунной крапивницей. 6. На основе показателей продукции цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo разработать критерии отбора больных хронической аутоиммунной крапивницей к проведению лечения препаратом «Габриглобин-IgG». Научная новизна Впервые проведена оценка продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы в спонтанном и ФГА-индуцированном супернатанте методом ex vivo у больных ХАК. Подобраны диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG» для использования в тесте ex vivo с клетками иммунной системы больных ХАК. Впервые изучено влияние диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на продукцию ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками в тесте ex vivo у больных ХАК. 8 Проведена комплексная сравнительная оценка показателей клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента, а также показателей ключевых цитокинов в сыворотке крови у больных ХАК и ХИК. Выявлено влияние препарата «Габриглобин-IgG» на цитокин- продуцирующую способность клеток иммунной системы у больных ХАК, а также показатели иммунитета. Разработаны иммунологические критерии отбора больных ХАК к проведению лечения препаратом «Габриглобин-IgG». Теоретическая и практическая значимость работы Результаты, полученные при изучении иммунологических показателей и цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы больных ХАК, а также влияния на них препарата «Габриглобин-IgG», будут способствовать пониманию иммунологических механизмов в патогенезе ХАК и механизмов действия данного препарата. Различия в основных иммунологических параметрах между больными ХАК и ХИК могут указывать на различие патогенетических механизмов данных форм ХК. Установлено, что тест ex vivo дает более полную информацию о цитокиновой продукции, в связи с чем, изучение уровня цитокинов у больных ХАК целесообразнее проводить в супернатанте клеток, а не в сыворотке крови. Определены диагностически значимые разведения препарата «ГабриглобинIgG» для использования в тесте ex vivo с клетками иммунной системы больных ХАК. На основании данных по продукции ключевых цитокинов, полученных в тесте ex vivo, разработаны критерии отбора больных ХАК, которым целесообразно назначать терапию препаратом внутривенного иммуноглобулина «Габриглобин-IgG». 9 Методология и методы исследования Методология настоящего исследования спланирована согласно поставленной цели. Предметом исследования стала цитокин-продуцирующая способность клеток иммунной системы и основные иммунологические показатели у больных ХАК, а также их изменения после лечения препаратом «Габриглобин-IgG». Научная литература, посвященная проблеме ХАК, была проанализирована Планирование и формально-логическими проведение методами исследований, направленных исследования. на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов. Основным объектом исследования являлась венозная кровь больных ХАК. Проведено клиническое, открытое, проспективное, рандомизированное исследование. Критериями включения пациентов в исследование явились: наличие аутоиммунной формы хронической крапивницы, возраст 18-60 лет, информированное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения: острая крапивница, психические заболевания, туберкулез любой локализации в активной фазе, онкологические заболевания, беременность и период лактации. Материалы исследованиия Исследования проводились на базе аллергологического отделения ГБУЗ Пензенской городской клинической больницы № 4 (Пенза, Россия), кафедре аллергологии и иммунологии и ЦНИЛ Государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ДПО ПИУВ МЗ РФ) с сентября 2011 года по ноябрь 2013 года. При выполнении данной работы было проведено комплексное аллергоиммунологическое обследование 120 пациентов с ХК в возрасте от 18 до 60 лет, из которых пациенты с ХАК составили 100 человек (основная группа) и пациенты 10 с ХИК – 20 человек (группа сравнения). В качестве контрольной группы было обследовано 30 практически здоровых лиц, сопоставимые по полу и возрасту с основной группой. Средний возраст больных ХАК составил 41+12 лет. Распределение больных ХАК по полу и возрасту представлено в таблице 1. Таблица 1 – Распределение больных ХАК по полу и возрасту Возраст (лет): Показатель Абсолютное число 18-29 30-40 41-49 50-60 Пол: Муж. Жен. % 21 25 25 30 21 25 25 30 20 80 20 80 В группе сравнения средний возраст пациентов составил 41+12 лет, среди которых было 14 женщин и 6 мужчин, что соответствовало группе больных ХАК. В контрольной группе возраст здоровых людей составил от 23 до 56 лет (средний возраст составил 34+9 лет) и среди них было 24 женщины и 6 мужчин, что также было сопоставимо с группой больных ХАК. Клинический раздел работы был проведен сотрудниками кафедры аллергологии и иммунологии ГБОУ ДПО ПИУВ МЗ РФ (заведующий кафедрой – д.м.н., профессор Б.А. Молотилов). Диагноз ХАК устанавливался на этапе предварительного обследования на основании клинических проявлений болезни, анамнестических данных, а также результатов аллерго-иммунологического обследования. В дальнейшем из 100 пациентов с диагнозом ХАК 27 пациентам было проведено лечение препаратом «Габриглобин-IgG». Лечение препаратом проводилось по следующей схеме: в дозе 2,5 грамма в сутки (0,03-0,04 г/кг веса) в течение 4 дней. Данная терапия проводилась дополнительно к базисному лечению. 11 Клиническую эффективность лечения оценивали по разработанной 4-х бальной шкале [13]. При этом у всех пациентов определяли следующие параметры: проба с аутосывороткой, динамика количества высыпаний и изменение интенсивности зуда. О клинической эффективности терапии препаратом «Габриглобин-IgG» у пациентов с ХАК судили по динамике клинических проявлений заболевания и длительности ремиссии после лечения. Динамика клинических проявлений заболевания оценивалась в баллах от -1 до 2, где -1 – это увеличение количества высыпаний, усиление зуда и увеличение размеров пробы с аутосывороткой, 0 – это отсутствие изменений после курса лечения, 1 – уменьшение размеров пробы с аутосывороткой и количества высыпаний, снижение интенсивности зуда, 2 – негативация пробы с аутосывороткой, полная клиническая ремиссия заболевания. Длительность ремиссии оценивалась по шкале от 0 до 3 баллов, где 0 – отсутствие ремиссии после курса лечения, 1 – длительность ремиссии менее 6 месяцев, 2 – длительность ремиссии более 6 месяцев и 3 – длительность ремиссии более 12 месяцев. Затем полученные баллы суммировались и эффект от терапии препаратом «Габриглобин-IgG» у пациентов с ХАК оценивали по таблице 2. Таблица 2 – Метод учета результатов иммунотерапии Оценка результатов иммунотерапии Отличный Баллы Критерии эффективности иммунотерапии -9 Хороший -7 Удовлетворительный -5 Неудовлетворительный менее 4 Полная ремиссия заболевания в течение всего срока наблюдения Рецидивы заболевания наступают 1-2 раза в год, протекают в легкой форме и быстро купируются симптоматическими средствами Частота обострений не уменьшилась, но общее самочувствие стало значительно лучше, чем до иммунотерапии Лечение прекращено из-за отсутствия эффекта или в ответ на введение препарата у больного постоянно наблюдалось обострение заболевания 12 Методы исследования Аллергологические методы исследования Аллергологическое обследование включало постановку кожных проб с аутосывороткой и определение общего IgЕ. Внутрикожные аллергологического пробы отделения с аутосывороткой ГБУЗ Пензенской выполняли городской на базе клинической больницы № 4 (Пенза, Россия) по методу M. Hide [119]. Для выполнения постановки пробы с аутосывороткой у пациентов был осуществлен забор крови натощак из локтевой вены в стеклянные пробирки без катализатора свертывания в объеме 5 мл. Кровь оставляли для свертывания при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее кровь центрифугировании для получения сыворотки при 500 g в течении 15 минут. Сыворотку использовали для постановки внутрикожной пробы в день забора крови. Постановку пробы с аутосывороткой осуществляли путем внутрикожного введения 50 мкл неразведенной сыворотки во внутреннюю поверхность предплечья пациента. Положительным контролем являлся раствор гистамина (5 мг/мл, 0,02 мл), отрицательным – физиологический раствор (0,9% раствора NaCl, 0,02 мл). Расстояние между каждой внутрикожной инъекцией составляло не менее 5 см. Оценку реакции проводили через 30 и 60 минут. Внутрикожная проба с аутосывороткой оценивалась по размеру волдыря в месте инъекции по сравнению с отрицательным контролем. Пациентам с диаметром пробы 7 мм и более ставили диагноз ХАК. Пациентов, которые давали отрицательную пробу с аутосывороткой, относили в группу с ХИК [13]. Определение уровня общего IgE в сыворотке крови проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) коммерческими наборами фирмы «АлкорБио» (Россия) на кафедре аллергологии и иммунологии ГБОУ ДПО ПИУВ МЗ РФ. Концентрацию определяли на иммуноферментном анализаторе «Stat Fax» 3200. 13 Иммунологические методы исследования Иммунологические методы исследования являются очень важными и информативными при заболеваниях, сопровождающихся иммунными нарушениями. Так как иммунная система играет главную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний, то данные методы позволяют дать количественную и функциональную оценку основным иммунологическим параметрам и установить характер иммунопатологических изменений. В нашей работе иммунологические методы исследования позволили оценить роль иммунопатологических механизмов в патогенезе ХАК. Для оценки клеточного иммунитета было проведено исследование уровней основных популяций Т-лимфоцитов, а также вычисление соотношения CD4/CD8 – иммунорегуляторного индекса (ИРИ). Иммунофенотипирование субпопуляций Т-лимфоцитов проводили методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител (МКА) серии ИКО производства ООО «Сорбент» (Россия). На поверхности лимфоцитов выделялись следующие дифференцировочные антигены: CD4 – дифференцировочный антиген Т-хелперов, выполняющий роль рецептора для антигенов HLA 2-го класса; CD8 – дифференцировочный антиген цитотоксических Т-лимфоцитов, участвующих в распознавании молекул HLA 1 класса. Для выявления фиксированных на лимфоцитах МКА добавляли меченую ФИТЦ кроличью сыворотку против иммуноглобулинов (Ig) мыши. Препараты изучались на люминесцентном микроскопе МИКМЕД-2. Для оценки гуморального иммунитета было проведено исследование уровней сывороточных иммуноглобулинов классов А, M, G и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Определение уровней IgА, IgM, IgG проводили в сыворотке крови с помощью метода Mancini [143] – простой радиальной иммунодиффузии с использованием моноспецифических антисывороток к 14 соответствующим иммуноглобулинам производства ФГУП НПО «Микроген» (Россия). Уровень ЦИК определяли методом осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) по методу V. Haskova [116]. Использовали 3 и 4 % растворы ПЭГ «Panreac Sintesis» (Испания). Также было проведено исследование системы комплемента, которое включало в себя определение уровней С3- и С4-компонентов. Уровни данных показателей исследовали в сыворотке крови имунотурбидиметрическим методом наборами ЗАО «DiaSys» (Германия). Концентрацию исследуемых показателей измеряли на фотометрическом анализаторе АБ ФК-02-«НПП-ТМ» фирмы «Колибри». Дополнительно к исследованию основных иммунологических параметров было проведено изучение уровня антител к нативной ДНК, которое проводилось в сыворотке крови методом твердофазного ИФА наборами ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Оценка цитокинового профиля включала определение цитокинов в сыворотке крови, а также супернатанте спонтанной и ФГА-индуцированной продукции клеток иммунной системы. Кроме того, была проведена оценка цитокиновой продукции под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG». Определение цитокинов в сыворотке крови отражает текущее состояние иммунной системы. В нашем исследование было проведено изучение уровней ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в сыворотке крови методом твердофазного ИФА и наборами ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Концентрацию измеряли на иммуноферментном анализаторе «Stat Fax» 3200. Кроме исследования уровня цитокинов в сыворотке крови было проведено изучение продукции цитокинов клетками иммунной системы методом ex vivo. Данный метод является наиболее перспективным методом лабораторной диагностики и позволяет дать оценку спонтанной продукции цитокинов клетками 15 иммунной системы и их резервных возможностей в условиях, сопряженных с дефицитом или дисбалансом регуляторных факторов. Также метод ex vivo позволяет провести оценку влияния лекарственных препаратов на клетки иммунной системы больных. Для определения цитокинов в супернатанте клеток иммунной системы проводилась постановка, основанная на тесте в модификации Е.Г. Исаченко [31]. Методика постановки теста ex vivo для определения спонтанной и ФГАиндуцированной продукции клеток иммунной системы осуществлялась по следующей схеме. Забор крови производился натощак, из локтевой вены в стерильные стеклянные пробирки с гепарином. Полученную кровь разбавляли до концентрации 1:5 стерильной средой 199 с солями Хэнкса и глутамином производства «ПанЭко» (Россия), которая содержала 50 мкг/мл гентамицина. Далее для постановки спонтанной продукции клеток в пробирку добавляли 675 мкл разбавленной крови (1:5) и 75 мкл стерильной среды 199. Для постановки индуцированной продукции клеток использовали ФГА. Данный митоген был выбран в качестве стимулятора клеток иммунной системы из-за избирательной способности активировать Т-клетки, которые продуцируют изучаемые нами цитокины [66]. При постановке индуцированной продукции клеток иммунной системы использовали ФГА производства «ПанЭко» (Россия), с концентрацией 10 мг/мл, из которого готовили рабочий раствор путем разбавления его в 100 раз физиологическим раствором 0,9% NaCl до концентрации 0,1 мг/мл. В пробирку добавляли 675 мкл разбавленной крови (1:5) и 75 мкл ФГА с концентрацией 0,1 мг/мл (конечная концентрация ФГА в пробирке составила 0,01 мг/мл). Далее проводилась инкубация в течение 6 часов при 37°С. Пробирки охлаждали, центрифугировали 5 минут при 800g, супернатант отбирали и замораживали. Определение концентрации ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в супернатанте спонтанной и ФГА-индуцированной продукции клеток иммунной системы осуществлялось методом твердофазного ИФА наборами ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). 16 Методика проведения теста ex vivo с препаратом «Габриглобин-IgG» Методика постановки теста ex vivo для определения продукции цитокинов клетками иммунной системы под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» проводилась по следующей схеме: забор крови производился натощак из локтевой вены в стерильные стеклянные пробирки с гепарином. Полученную кровь разбавляли до концентрации 1:5 стерильной средой 199 с солями Хэнкса и глутамином производства «ПанЭко» (Россия), которая содержала 50 мкг/мл гентамицина. Далее к 675 мкл разбавленной крови (1:5) добавляли 75 мкл препарата «Габриглобин-IgG» в диагностически значимых разведениях. Пробирки инкубировали в термостате в течение 6 часов при 37°С. Затем охлаждали и центрифугировали 5 минут при 800g. Супернатант отбирали и замораживали при -20°С. Определение концентрации ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в супернатанте производилось методом твердофазного ИФА наборами ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG» подбирались на клетках иммунной системы 30 здоровых доноров методом ex vivo. Критерием подбора был максимальный процент здоровых людей, у которых наблюдалась высокая выработка изучаемых цитокинов. При постановке теста ex vivo были использованы разведения препарата 1:1, 1:3, 1:10. Данные разведения готовили путем разбавления препарата «Габриглобин-IgG» производства ЗАО «Иммуно-Гем» (Россия) стерильной средой 199. Учитывая, что концентрация иммуноглобулина в препарате была равна 0,05 г/мл, то при разведениях препарата она составила: Разведение 1:1 – концентрация иммуноглобулина 0,025 г/мл; Разведение 1:3 – концентрация иммуноглобулина 0,0125 г/мл; Разведение 1:10 – концентрация иммуноглобулина 0,0045 г/мл. 17 Конечные концентрации иммуноглобулина препарата «Габриглобин-IgG» в пробирке с кровью составили (разведение в 10 раз): Разведение 1:1 – концентрация иммуноглобулина 0,0025 г/мл=2,5 г/мкл; Разведение 1:3 – концентрация иммуноглобулина 0,00125 г/мл=1,25 г/мкл; Разведение 1:10 – концентрация иммуноглобулина 0,00045 г/мл=0,45 г/мкл. Методы статистической обработки результатов Для информационной конфиденциальности использовался персональный компьютер с созданием базы данных. Статистический анализ полученных результатов проводился с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0», а также с применением программы SPSS для ROC-анализа. При обработке полученных результатов аллерго-иммунологических исследований были использованы традиционные методы статистического анализа [67]. 1. Для проверки на нормальность распределения по выборке проводился тест Колмогорова-Смирнова, который считается значимым при уровне p < 0,05. Так как большинство иммунологических параметров имело ненормальное распределение, были использованы методы непараметрической статистики. 2. Для каждого параметра Х определяли следующие показатели: медиана (Ме) и интерквартильный размах 25% и 75%. 3. Сравнение количественных признаков в независимых группах проводили по методу Манна-Уитни. Проверялась гипотеза о равенстве средних рангов. Также применялся метод Вальд-Вольфовица, для проверки гипотезы о том, что исследуемые группы получены из одной генеральной совокупности, а также нулевой гипотезы об отсутствии различий между группами. При р<0,05 различие между количественными признаками считались статистически значимыми. 4. Сравнение количественных признаков в зависимых группах проводили по методу Вилкоксона. При р<0,05 различие между количественными признаками считались статистически значимыми. 18 Корреляционный 5. анализ для изучения взаимосвязи между количественными признаками и для оценки силы связи между критерием эффективности и иммунологическими показателями проводился методом ранговой корреляции по Спирмену. О направлении и силе связи между изучаемыми явлениями судили по коэффициенту корреляции. Коэффициент корреляции (R), характеризующий прямую связь, обозначали знаком «+», обратную – знаком «-». Корреляция считалась статистически значимой при р< 0,05. 6. Для оценки зависимости критерия эффективности с точки зрения причины отсутствия или наличия положительного эффекта от лечения проводилось сравнение групп пациентов по параметру эффективности методом Манна-Уитни. Считалось, что иммунологические показатели влияют на проводилось определение эффективность лечения при p<0,05. 7. На пороговых основе полученных значений наиболее зависимостей значимых факторов (иммунологических показателей, имеющих достоверную связь с критерием эффективности) с помощью ROC-анализа и построения ROC-кривой. Пороговое значение выбиралось с учетом наибольших значений чувствительности и специфичности теста при условии значимого отличия (p<0,05) площади построенной ROC-кривой от критического значения 0,5. 19 Положения, выносимые на защиту 1. Хроническая аутоиммунная крапивница протекает с преобладанием аутоиммунного механизма заболевания. Спектр иммунологических нарушений характеризуется повышением продукции ИЛ-4, ИЛ-17 и IFNγ клетками иммунной системы в тесте ex vivo, а также уровней CD4+ популяции лимфоцитов, общего IgE, С3-компонента комплемента, антител к нативной ДНК, и снижением продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы в тесте ex vivo, снижением уровней CD8+ популяции лимфоцитов и ИЛ-4 в сыворотке крови. 2. Диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG», отработанные на клетках иммунной системы здоровых доноров в тесте ex vivo, составляют для выработки ИЛ-10, ИЛ-17, IFNγ – 1:3 и для выработки ИЛ-18 – 1:10. Показано повышение продукции ИЛ-17 и снижение продукции IFNγ клетками под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) в тесте ex vivo у больных ХАК. 3. Динамика иммунологических показателей у больных ХАК после проведения терапии препаратом «Габриглобин-IgG» характеризуется повышением продукции ИЛ-10, и снижением продукции ИЛ-17 и IFNγ клетками иммунной системы в тесте ex vivo, повышением уровня CD8+ популяции лимфоцитов, а также нормализацией соотношения CD4+/CD8+ популяций лимфоцитов и показателей антител к нативной ДНК. Степень достоверности и апробация результатов исследования Результаты настоящего исследования являются достоверными, так как был проведен достаточный объем исследований с использованием адекватных и современных методологических подходов. Обработка данных проводилась при помощи специализированных компьютерных программ, которые позволяют проводить статистический анализ больших массивов данных. 20 Диссертация обсуждена и одобрена на заседании межкафедральной комиссии ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Минздрава России (протокол № 16 от 25 декабря 2013 г.). Материалы диссертационной работы доложены на XVI Межрегиональной научно-практической конференции ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Минздрава России (Пенза, 2012); II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов (Саранск, 2013); Объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013); On-line конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (2013); III Международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2013). По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из которых 8 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования результатов диссертаций. 21 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Этиологические факторы хронической крапивницы Хроническая крапивница – это гетерогенная группа заболеваний с наличием уртикарных элементов на коже, которые длятся в течение 6 недель и более [55]. Известно, что данное заболевание может быть вызвано различными этиологическими факторами [22,63,161]. Так считается, что причиной ХК могут выступать пищевые продукты. Имеются сообщения о пациентах с ХК, у которых заболевание обусловлено употреблением в рацион пищевых добавок (бензойная кислота и тартразин) и консервантов. Также данное заболевание может быть вызвано различными лекарственными препаратами, например, ингибиторами ангиотензин-превращающего фермента и нестероидными противовоспалительными средствами [39,99]. Часто причиной ХК являются вирусные и бактериальные инфекции, а также паразитарные и грибковые заболевания [2,18,54,178]. Так, обострения ХК развиваются на фоне вирусных инфекций. Имеются работы по взаимосвязи ОРВИ, вызванной риновирусами, Коксаки и ECHOвирусами, герпеса простого, гепатитов В и С, вируса Эбштейна-Барра с ХК [5,8,63,185]. У пациентов с частыми ОРВИ отмечаются нарушения в интерфероновом статусе, которые проявляются в сниженной способности клеток к продукции интерферона на фоне его повышенного содержания в сыворотке крови. При этом возникают аномалии в иммунном ответе, что может явиться причиной ХК [56]. Кроме того у больных с данным заболеванием часто развивается бактериальная сенсибилизация на фоне очагов хронической инфекции [11,22, 40]. Ведущая роль при этом принадлежит очагам инфекции, которые локализуются в дыхательных путях, ЛОР-органах, желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) и женской половой сфере [36]. 22 В последнее время в отечественной и зарубежной литературе обсуждается роль хеликобактерной инфекции в патогенезе различных форм ХК [33,69,141]. Однако однозначного мнения о взаимосвязи ХК с инфекцией Helicobacter pylori на настоящий момент не существует. Так, многие авторы говорят о высокой встречаемости инфекции у больных ХК [9] и положительном влияния эрадикации данного возбудителя на течение заболевания. Например, установлено, что ремиссия ХК наступала в 60-100% случаев после эрадикации Helicobacter pylori [35,140]. Однако ряд исследователей, учитывая факт большой распространенности данной инфекции среди здорового населения (26-90%), отсутствия эффекта от ее эрадикации, большим числом спонтанных ремиссий ХК, отрицают данную взаимосвязь [117]. Из других инфекций, вызывающих ХК могут быть кандидозы, сопровождающиеся гиперчувствительностью к грибкам типа Candida ablicans, Penicillium chrisogenum и другим. Так вызываемая Candida инфекция обнаруживается у 43-70% больных [18]. Также часто у пациентов с ХК обнаруживаются паразитарные инфекции. Обычно это Lamblia intestinalis, Trichomonas hominis, Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum, Fasciola hepatica [16]. Патогенетическая роль паразитарных и глистных инвазий может быть обусловлена способностью их возбудителей стимулировать синтез IgE и участвовать в формирование IgE-опосредованной реакции [103]. О роли эндокринной системы в патогенетических механизмах ХК показано в некоторых работах [136]. Отмечено, что данное заболевание встречается в 2 раза чаще у женщин, чем у мужчин. Также показано, что гормональные изменения, связанные с менструальным циклом, беременностью, менопаузой, приемом контрацептивов, гормональной заместительной терапией, могут оказать влияние на течение ХК [127]. Немаловажная роль в патогенезе данной формы крапивницы принадлежит стрессу. В имеющихся источниках литературы было показано, что состояние нервной системы может оказывать влияние на обострение ХК. Также не 23 исключается и то, что психические факторы могут модулировать течение заболевания. Известны факты обострений течения крапивницы на фоне психоэмоциоанального напряжения и под влиянием отрицательных эмоций [65]. В ряде работ показана роль нейрогенного воспаления в патогенезе ХК, в развитии которого участвуют нейропептиды, и дискутируется вопрос о выделение психогенной крапивницы, как отдельной формы ХК [44,175]. Также ХК может быть вызвана вибрацией, давлением, солнечной радиацией, холодом, высокими температурами и другими триггерами. Это так называемая физическая крапивница, которая составляет 17-20% от ХК [62,168]. Однако в 80-95% случаев не удается установить этиологический фактор ХК. Такую крапивницу с неясным генезом назвали идиопатической [23,47]. В настоящее время в структуре хронической идиопатичсекой крапивницы выделяют аутоиммунную форму. Считается, что ХК может являться одним из симптомов таких аутоиммунных заболеваний как тиреоидит, ревматоидный артрит, синдром Шегрена, системная красная волчанка, витилиго и другие [101,113]. Например, в последнее время, хроническую аутоиммунную крапивницу часто связывают с аутоиммунным тиреоидитом [115,151]. Высокие уровни антител к тиреопероскидазе и тиреоглобулину, высокая встречаемость аутоиммунного тиреоидита у больных ХАК, а также ремиссия заболевания при лечении тиреоидита свидетельствует об их взаимосвязи [80,84]. Таким образом, ХК является сложным заболеванием и может быть вызвано различными этиологическими факторами. Хронические инфекции, гормональные нарушения, аутоиммунные заболевания, стрессы, воздействие внешних факторов влияют на течение ХК. 24 1.2. Патогенетические механизмы хронической крапивницы На сегодняшний день патогенез ХК сложен и недостаточно изучен. Однако каковым бы не был этиологический фактор, вызывающий ХК, ключевую роль в патогенезе различных форм данного заболевания играют тучные клетки и базофилы [54,85]. Известно, что при ХК тучные клетки обладают повышенной способностью к дегрануляции. При активации тучных клеток происходит выброс в межклеточную жидкость множества медиаторов, важнейшим из которых является гистамин [18,124]. Гистамин способен воздействовать на Н1 и Н2 рецепторы клеток кожи, вызывая увеличение локального кровотока в коже, дилатацию артериол, экссудацию плазмы из посткапиллярных венул, что приводит к формированию гиперемии, отека, зуда и волдыря [18,58]. Также показано, что гистамин активируют периферические окончания чувствительных С-волокон кожи, которые секретируют нейропептиды [45]. Нейропептиды (вещество Р и кальцитонин ген - связанный пептид) вызывают вазодилатацию и повышение сосудистой проницаемости. Кроме этого, нейропептиды (в большей степени, вещество Р) стимулируют мембран-ассоциированные G-белки тучных клеток, что приводит к высвобождению гистамина и других медиаторов [179]. Секреторные гранулы тучных клеток помимо гистамина содержат нейтральные протеазы: триптаза, химаза, карбоксипептидаза, катепсин Нейтральные протеазы способствуют повышению проницаемости сосудов кожи и аккумуляции клеток воспаления – нейтрофилов и эозинофилов [108,157]. Эозинофилы в свою очередь являются основным источником тканевого фактора, который способствует запуску коагуляционного каскада и синтезу тромбина. Тромбин вызывает увеличение проницаемости сосудов и активирует тучные клетки, вызывая их дегрануляцию [146]. Также при активации в тучных клетках синтезируются эйкозаноиды, которые обладают мощной провоспалительной активностью [174]. Так, простогландин D2 вызывает вазодилатацию и потенциирует действие гистамина и 25 других медиаторов, повышающих сосудистую проницаемость, усиливает зуд, вызываемый гистамином и другими медиаторами, а также является хемоаттрактантом нейтрофилов [156]. Лейкотриены С4, D4 и Е4 увеличивают сосудистую проницаемость, вызывают локальное сужение артериол с последующей вазодилатацией и повышением проницаемости венул [149]. Кроме того, тучные клетки являются источником различных цитокинов. В секреторных гранулах тучных клеток хранятся в преформированном виде фактор некроза опухолей α (ФНО-α) и интерлейкины-3, 4, 5, 6 и 13 [94]. Активация тучных клеток может происходить по иммуннологическому и неиммуннологическому механизму [38,82]. Иммунологическая активация возникает при аллергической крапивнице, обусловленной специфической гиперреактивностью, когда комплекс аллергенIgE-антитело связывается с IgE-рецепторами на поверхности тучной клетки, способствуя проявлению аллергической реакции 1 типа. Такая активация характерна также для ХК, вызванной употреблением пищевых добавок, лекарственных препаратов и консервантов. Кроме того, иммунологическую активацию вызывают иммунные комплексы, содержащие IgE или другие типы иммуноглобулинов, а также аутоантитела к IgE или α–цепи его высокоафинного рецептора [19]. Взаимодействие аллергена с молекулой IgE или ее рецептором является основным иммунным механизмом активации тучной клетки и лежит в основе возникновения острой крапивницы, но редко является причиной возникновения ХК [154]. Исследования последних лет показали, что ХК, в патогенезе которой лежал механизм образования аутоантител к IgE или к рецептору IgE относили к ХАК [118]. У некоторых пациентов с ХК присутствуют IgG антитела против низкоафинного IgE рецептора на эозинофилах (CD23). Взаимодействие этих антител с рецептором CD23 способствует активации эозинофилов и вызывает высвобождение эозинофильного катионный белка, который приводит к дегрануляции тучных клеток и выбросу гистамина [78]. Так, известно, что при 26 иммунной активации тучных клеток возникает «ранняя фаза» воспалительного ответа, которая приводит к немедленному высвобождению медиаторов тучных клеток и «поздняя фаза» воспалительного ответа, которая возникает через несколько часов и способствует привлечению различных клеток воспаления, включая эозинофилы, нейтрофилы, базофилы и СD4+ Т-клетки [58,133]. Формирование поздней фазы воспалительной реакции обусловлено действием цитокинов, продуцируемых тучными клетками и приводит к привлечению вторичных эффекторных клеток воспаления, например, нейтрофилов (ФНО-α, ИЛ-1,8), эозинофилов (ИЛ-4, 5) и других [157]. Вторичные клетки воспаления, в свою очередь, продуцируют различные цитокины, обусловливающие дополнительное привлечение лейкоцитов. Неиммуннологическая активация тучных клеток возможна под действием ряда нейропептидов (субстанция Р, вазоактивный интестинальный полипептид, пептид, кальцитонин-связанный пептид, нейрокинин), гормонов (эстрогены, АКТГ, гастрин), фактора активации тромбоцитов, фрагментов комплемента (С3а и С5а), вещества 48/80, морфина, кадеина и других веществ [118,177]. Отмечено, что при вирусных инфекциях происходит активация системы комплемента с образованием анафилотоксина С5а, который способствует активации тучных клеток и развитию уртикарной реакции [161]. Гормональные нарушения могут вызывать активацию комплемента и запуск каскада воспалительных реакций [126,160], а также активацию тучных клеток через Gq/11 белки [145]. В последние годы была показана патогенетическая значимость нейрогенного воспаления при ХК с участием нейропептидов. Этот механизм лежит в основе нейропептидом, развития который нейрогенной способствует крапивницы усилению [44]. секреции, Основным отеку и вазодилатации в коже, признается субстанция Р. Высвобождаясь из окончаний сенсорных нервов, субстанция Р взаимодействует с тучными клетками и запускается цепочка физиологических реакций, результатом которых является 27 дегрануляция тучных клеток с выбросом медиаторов: кининов, простагландинов, серотонина и гистамина. Эти вещества могут оказывать влияние на изменение тонуса и проницаемости микрососудов, развитие болевой реакции, а также миграцию лейкоцитов. Имеются факты взаимной связи аллергического и нейрогенного воспаления. В свою очередь существует и обратная связь: чувствительные нервные окончания способны активироваться под влиянием медиаторов воспаления, таких как брадикинин, гистамин, фактора активации тромбоцитов, простагландинов, создавая, таким образом, порочный круг, усиливая и распространяя первоначальное воспаление [138]. При неиммунной активации происходит дегрануляция тучных клеток с высвобождением преформированных медиаторов, но без синтеза эйкозаноидов и цитокинов и, соответственно, поздней фазы воспалительного ответа [50]. Таким образом, тучные клетки и их активация играют ключевую роль в развитии ХК. В настоящее время лечение крапивницы остается сложной проблемой и поэтому изучение патогенетических механизмов ХК представляется очень важным. 1.2.1. Патогенетические механизмы хронической аутоиммунной крапивницы В 1993 году группой M.Greaves и M.Hide была выделена аутоиммунная форма хронической крапивницы [119]. По данным разных авторов установлено, что ХАК составляет 30-50% от ХИК [74,87,112]. Патогенез ХАК является сложным и недостаточно изученным. Однако известно, что в основе его лежит образование аутоантител, которые способны активировать тучные клетки и базофилы и вызывать их дегрануляцию [155]. Было выявлено, что у больных ХАК, аутоантитела направленные против высокоафинного рецептора IgE (FcεRI) образуются в 35-50% случаев, а к молекуле IgE – в 5-10% [124]. Известно, что IgE обладает цитофильными свойствами и связывается с высокоафинным рецептором FcεRI на поверхности тучных клеток. При контакте 28 IgE cо специфическим антигеном на клетках, несущих FcεRI – рецептор, происходит выброс гистамина, медиаторов и цитокинов, которые проявляют свои эффекты, взаимодействуя с определенными рецепторами клеток. Высокоафинный рецептор FcεRI состоит из четырех пептидных цепей: внутриклеточные γ1, γ2, и β цепи и внеклеточная α-цепь, которая несет на себе сайт связывания с молекулой IgE. При помощи ряда исследований было установлено, что связывание аутоантител с рецептором FcεRI происходит путем взаимодействия их с α-цепью [119]. Также считается, что для активации тучных клеток аутоантитела должны связаться хотя бы с двумя областями α-цепи FcεRI или двумя молекулами IgE. Результатом этого взаимодействия является активация тучных клеток и базофилов, и высвобождение гистамина и других медиаторов [150]. Такая активация получила название прямой анафилаксии. «Обратный тип» анафилактической реакции, активирующей тучные клетки и базофилы, сопряжен с вовлечением антител к FcεI-цепи IgE (анти-IgE), антител к α– цепи FcεRI (антиFcεRI) или антител анти-IgG действующих на комплексы IgG-IgE, связанные с FcεRI. Именно такой механизм, по-видимому, обеспечивает уртикарную реакцию при ХАК [18]. Аутоантитела анти-IgE и анти-FcεRI можно обнаружить и при других аллергических и аутоиммунных заболеваниях, и иногда в сыворотке здоровых людей. Однако при исследовании было выяснено, что аутоантитела, образующиеся при ХАК, относятся преимущественно к IgG1 и IgG3 подклассам. Именно они способны вызывать дегрануляцию тучных клеток и базофилов [130,171]. В своих работах M. Greaves показал, что аутоантитела против молекулы IgE и FcεRI-рецептора имеют патогенетическое значение, так как способны высвобождать гистамин из базофилов человека и тучных клеток in vitro. Данные аутоантитела отсутствуют в сыворотке здоровых доноров, и клинические улучшения болезни наблюдались после снижения этих аутоантител в крови пациентов [113,114]. 29 Также обсуждается роль тиреоидных аутоантител в патогенезе ХАК, которые присутствуют при патологии щитовидной железы [76]. С одной стороны, было показано, что антитела к тиреоглобулину способны активировать комплемент, который способствует активации тучных клеток [123]. Предполагается, что при аутоиммунном воспалении щитовидной железы может происходить выброс провоспалительных медиаторов, цитокинов и снижаться порог дегрануляции тучных клеток [14]. Однако ряд авторов ставят под сомнение роль тиреоидных аутоантител в патогенезе ХАК, так как отсутствует связь между их количеством и тяжестью данного заболевания [92,102]. Также в патогенезе ХАК показана роль системы комплемента. Установлено, что при взаимодействии аутоантител с рецептором FcεRI на поверхности тучной клетки происходит активация системы комплемента, в результате чего образуется С5а компонент. В свою очередь он может взаимодействовать с рецептором на поверхности тучных клеток и приводить к их дегрануляции. Являясь сильнейшим хемоаттрактантом, он способен привлекать в очаг воспаления нейтрофилы и эозинофилы, которые вовлекаются в процесс воспаления [111,170]. В последние годы появились данные о вовлечении в патогенез ХАК хемокинов. Показано, что хемокины CXCL8, CXCL10, CCL2, CCL5 играют немаловажную роль при развитии ХК и вызывают продукцию гистамина и серотонина тучными клетками, а также продукцию провоспалительных медиаторов [90]. Предполагается, что провоспалительные хемокины наряду с цитокинами участвуют в дезрегуляции иммунной системы при ХК [166]. Ряд авторов показывают важную роль в патогенезе ХАК активации коагуляционного каскада [84,95]. В результате этого продуцируется тромбин, который вызывает увеличение проницаемости сосудов, производство С5а анафилатоксина, активацию и дегрануляцию тучных клеток [77]. При этом тучные клетки выделяют ряд провоспалительных медиаторов, одними из которых являются TNF – α и ИЛ-6. Эти цитокины способны индуцировать экспрессию 30 тканевого фактора, являющегося главным инициатором свертывания крови. А активированные протеазы свертывания в свою очередь могут приводить к синтезу различных провоспалительных цитокинов. Таким образом, при ХАК, как и при ряде одновременная перекрестное других аутоиммунных активация иммунной взаимодействие заболеваниях, и может коагуляционных усиливает и поддерживает происходить систем. Такое воспаление и коагуляцию при этом заболевании. Таким образом, тромбин, образующийся при активации коагуляционной системы, может играть немаловажную роль в патогенезе ХАК [96,97,172]. Также обсуждается роль Helicobacter pylori в патогенезе ХАК [81]. Существует предположение, что вследствие ангигенной мимикрии, которую вызывает данный возбудитель, могут образовываться аутоантитела, играющие значимую роль в патогенезе данного заболевания. Таким образом, патогенез ХАК является достаточно сложным. В него вовлечены нарушения в коагуляционной системе, инфекции, а также сопряженность с другими аутоиммунными заболеваниями и иммунологические нарушения. На сегодняшний день многое известно, однако основная причина появления патологических аутоантител остается не выясненной. 1.3. Иммунные нарушения у больных хронической крапивницей Исследование иммунологических показателей у больных ХК в настоящее время актуально заболевания. для Однако изучения работы по патогенетических их изучению механизмов в настоящее данного время немногочисленны. Известно, что при ХК наблюдалось повышение уровня NKклеток и соотношение CD4/CD8 со снижением уровня CD8 клеток [121,176]. Исследования биопсии кожи у больных ХИК выявили повышение количества CD3, CD4, CD8, CD25 клеток, а также эозинофилов, нейтрофилов и базофилов по сравнению со здоровыми людьми [88,182]. В тоже время, Талгатбекова Д.Ж. и 31 соавторы, отмечают снижение функциональной активности (РТМЛ) Т-клеток у больных ХК, ассоциированной с хроническими инфекциями [57]. В ряде работ показано, что у больных с ХК и урогенитальной инфекцией наблюдался дисбаланс иммунной системы, который проявлялся в снижении Th1-иммунного ответа и нарушениях в системе цитокинов [57,71]. Также, показано, что при обострении ХК наблюдается базопения, повидимому, за счет привлечения базофилов в область уртикарных высыпаний [108]. Было выявлено, что базофилы больных ХК отличались меньшей чувствительностью к анти-IgE и С5а компоненту комплемента, но отвечали более мощной продукцией медиаторов, при инкубации с сывороткой от здоровых доноров [106]. В ряде работ было показано, что пациенты с острой фазой ХК отличаются биомаркерами в зависимости от степени тяжести воспаления. Так, было выявлено, что концентрация С-реактивного белка и показатели ИЛ-6 достоверно повышены у больных с тяжелой формой ХК, по сравнению с пациентами со средней тяжестью болезни [125]. Авторы делают вывод о связи острофазового ответа с активацией фибринолиза при ХК. Более того, у данных пациентов увеличивается риск кардиоваскулярных расстройств, которые могут провоцировать системные ответы [128]. При аутоиммунной форме ХК наблюдается иммунная дезрегуляция, которая характеризуется одновременной активацией Т- и В-лимфоцитов. Так, при исследовании у больных ХАК было выявлено повышение уровня В-лимфоцитов и CD3 клеток в периферической крови. По материалам ряда авторов аутоиммунные заболевания могут развиваться на фоне нарушения толерантности Т- и Влимфоцитов к аутоантигенам, в результате чего запускается механизм развития воспаления и происходит повреждение собственных тканей организма [98]. Однако на сегодняшний день доказано, что при формировании аутоиммунного процесса, нарушения в работе иммунной системы и клинические проявления во многом зависят от баланса клонов Th1, Th2, а также Th17 лимфоцитов, который базируется на соотношении продуцируемых ими регуляторных цитокинов. 32 Очевидно, что регуляторные цитокины, продуцируемые этими клонами, играют ведущую роль в патогенезе ХАК и до настоящего времени изучены недостаточно. Имеющиеся немногочисленные данные по этому вопросу свидетельствуют о несбалансированности хелперных клонов лимфоцитов, приводящих к развитию аутоиммунных заболеваний [66]. Так, в ряде работ показано, что в ходе иммунного ответа при аутоиммунных патологиях происходит нарушение двух взаимосвязанных процессов, а именно: активация CD4+ Т-лимфоцитов Th1 типа, характеризующаяся избыточным синтезом ИЛ-2, IFN-γ, ИЛ-17, с одновременным повышением цитокинов Th2 типа, которое сопровождается значительным увеличением ИЛ-4 и ИЛ-5 [61,169]. На настоящий момент объяснение этого феномена в доступной литературе отсутствует. На наш взгляд одновременная активация происходит потому, что в исследования берутся пациенты с ХАК, имеющие в патогенезе как атопический механизм развития с участием Th2, так и чисто аутоиммунный механизм развития заболевания с участием Th1. Работ по отдельному рассмотрению цитокиновых механизмов с генетическими маркерами у атопических и неатопических пациентов нет. На неоднозначность Th1/Th2 взаимодействия у больных ХАК указывают также исследования, в которых параллельно проводили изучение иммунофенотипа клеток CD3, CD4, CD8, оценивали их связь с рецепторами хемокинов, молекулами адгезии ICAM, VCAM, а также с продукцией ИЛ-4, ИЛ-5, IFN-γ [86,88]. Авторами делается вывод о повышении CD4+ Т-лимфоцитов у больных ХАК по сравнению с контрольной группой, а также сильной инфильтрации нейтрофилов и участии в патогенезе системы хемокинов. При сравнении абсолютного количества эозинофилов между больными ХАК и ХИК, у пациентов с аутоиммунной формой крапивницы их уровень был значительно ниже [73]. Есть немногочисленные исследования по изучению уровней иммуноглобулинов, ЦИК, компонентов комплемента в сыворотки крови при ХК. Так, в работе Chodirker W.B. и соавторов, показано повышение уровня IgM у 33 больных с данной патологией [91]. Также, Данилычева И.В. и соавторы, определяли уровни иммуноглобулинов, ЦИК и других показателей у больных ХК и выявили, что у большинства пациентов наблюдалась гипергаммаглобулинемия, а повышение уровней IgA и IgM носило транзиторный характер. Авторами было выявлено и повышение уровней ЦИК у больных ХК с аутоиммунными нарушениями [25]. Многие авторы исследовали в своих работах уровень IgE у больных ХК, однако однозначных данных по указанному показателю в настоящее время нет. Так, ряд авторов отмечают повышение его уровня у больных с данной патологией [19,121,129,153,163,183]. При этом считается, что повышенный уровень IgE встречается чаще у больных с легкой формой ХК, чем у пациентов с более тяжелыми проявлениями заболевания [53,129]. Однако, в исследованиях Иваненко Т.В. и соавторов, уровень IgE в сыворотке крови у больных ХК не отличался от контрольной группы [29]. Высокий уровень IgE у больных с ХК может быть обусловлен многими причинами. Так предполагается, что в тропических странах это может быть связано с гельминтозными инфекциями. Наличие различных атопических заболеваний (атопическая экзема, астма, аллергический ринит) также сопровождаются повышенным уровнем IgE. Поэтому Nassif A., учитывая высокий уровень IgE у большинства больных ХК, предполагает в своей работе наличие атопического механизма в развитии данного заболевания [148]. Нет и однозначного мнения по уровню IgE при ХАК. Так одни авторы отмечают более низкий уровень IgE у больных с данной патологией [73,121]. В противоположность Сигбатуллина Н.А. и соавторы, отмечают повышенный уровень IgE у 68% больных с положительной кожной пробой с аутосывороткой [53]. Данные по уровню С3- и С4- компонентов комплемента при ХК в настоящее время малочисленные. Есть исследования, которые показывают, что уровень данных показателей у больных ХК был ниже по сравнению с 34 контрольной группой, что свидетельствует о вовлечении и активации системы комплемента при данной патологии [91]. Однако другие авторы отмечают, что уровень С3-компонента комплемента у больных ХК в сочетании с метаболическим синдромом был выше по сравнению с больными ХК без метаболического синдрома [181]. В недавней работе Altrichter S. и соавторов, было проведено сравнение больных ХК с положительными и отрицательными антителами IgE-anti-TPO и выявлено, что в группе больных ХК с положительными антителами IgE-anti-TPO уровень С4-компонента комплемента был снижен. Авторами делается вывод, что возможно данные антитела к ТПО могут вызывать аутоиммунную активацию тучных клеток, при котором дополнительно происходит активация системы комплемента, что сопровождается расходом и снижением уровня С4-компонента комплемента [75]. 1.3.1. Нарушения цитокиновой регуляции при хронической крапивнице Известно, что немаловажную роль в патогенезе ХК играют цитокины. Цитокины содержат в себе большое количество эндогенных биологически активных соединений, которые участвуют в иммунной регуляции и процессах воспаления. Поэтому, изучение цитокинов при ХК актуально в настоящее время и может открыть новые возможности в понимании патогенеза данного заболевания [21,94]. Известно, что при нейрогенной крапивнице, происходит выброс нейропептидов, особый интерес среди которых вызывает вещество Р. Есть работы, указывающие на взаимосвязь уровня субстанции Р с провоспалительными цитокинами TNF-α, ИЛ-1-β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-12 [100]. Авторами показано, что субстанция Р индуцирует выработку данных цитокинов, которые участвуют в нейроиммунорегуляции. Также есть исследования, касающиеся роли SP – рецептора, который экспрессирован на всех клетках иммунной системы и является мощным модулятором нейроиммунорегуляции 35 [135]. Было показано, что SP специфически активирует транскрипционный фактор (в частности, NF-kB), который включается в контроль цитокиновой экспрессии и стимулирует моноциты и макрофаги к продукции воспалительных цитокинов, включая ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12 и TNF-α. Накапливающиеся в коже под влиянием хемоаттрактантов (LtB4, ИЛ-5, и ИЛ-8, гранулоцитарно- макрофагальный колониестимулирующий фактор – RANTES) лимфоциты, эозинофилы, нейтрофилы секретируют фактор, высвобождающий гистамин из тучных клеток. Эозинофилы являются источником эозинофильного катионного белка, вызывающего появление в коже волдырей и гиперемии. При хроническом течении заболевания наблюдаются периваскулярные инфильтраты, состоящие из Т-лимфоцитов, моноцитов, тучных клеток, эозинофилов и нейтрофилов [60]. Патогенез семейного холодового аутовоспалительного синдрома связывают с изменениями белка криопина (из-за мутации гена CIAS1), который активирует каспазу 1, что приводит к высвобождению ИЛ-1 и секреции воспалительных цитокинов ИЛ-6, TNF-α, ИЛ-3 [64]. Есть единичные публикации, касающиеся роли других посредников (в частности, PGD2, лейкотриена Е4, хемотаксических факторов, фактора активации тромбоцитов, TNF-α) в возникновении холодовой крапивницы [167]. Высокая терапевтическая эффективность антагониста рецептора ИЛ-1 – препарата Анакинра в предотвращении синдромов ХК, подтверждает тот факт, что ИЛ-1 играет центральную роль при этом заболевании [120]. При сравнительном изучении провоспалительных цитокинов TNF-α, ИЛ-1β, ИЛ-12р70 и ИЛ-6 у пациентов ХИК и ХАК было выявлено их достоверное повышение в группе пациентов с ХИК. У больных ХАК были выявлено повышение продукции Т-клетками регуляторных цитокинов ИЛ-17 и ИЛ-10. Противоположные данные были получены у больных с ХИК, где изучаемые показатели были снижены [165]. Немаловажную роль в развитии ХК играют цитокины ИЛ-15 и ИЛ-21. Huilan Z. и соавторы в своем исследовании показали, что у больных ХК 36 наблюдалось снижение уровня данных цитокинов, а у пациентов с положительной пробой с аутосывороткой, напротив уровень ИЛ-21 был более высоким по сравнению со здоровыми людьми. Известно, что ИЛ-21, который продуцируется Th17-клетками, усиливает пролифирацию CD4+ и CD8+ популяций лимфоцитов, увеличивает активность NK клеток, а также подавляет синтез IgE. А ИЛ-15 вызывает продукцию ИЛ-5 Th2-клетками. Авторы, предположили, что Th17-популяция лимфоцитов и цитокины ИЛ-21 и ИЛ-15 играют ключевую роль в патогенезе ХАК [121]. Есть исследования, показывающие, что хронически высокие уровни IFN-γ и IFN-α могут приводить к образованию аутоантигенов и развитию аутоиммунного заболевания [169]. Этот процесс может быть как следствием генетической предрасположенности, так и результатом влияния специфических агентов (вирусов, бактерий, факторов окружающей среды). Есть сообщения о том, что назначение в терапии IFN-γ и IFN-α может приводить к обострению различных аутоиммунных заболеваний или запускать развитие различных аутоиммунных расстройств у генетически предрасположенных лиц [93]. Относительно уровня IFN-γ мнения исследователей неоднозначны: одни авторы отмечают его повышение у больных ХАК [33,182]. По данным других исследований уровень IFN-γ у больных ХК не отличается от показателей здоровых лиц [106]. В ряде работ показана роль противовоспалительных цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10, подавляющих функцию IFN-γ и IFN-α [165,122]. Дело в том, что по ИЛ-4 данных литературы много, но они порой противоречивы. Так, одни исследователи указывают на повышение уровня ИЛ-4 у больных ХАК по сравнению со здоровыми людьми [104]. Другие авторы наоборот, не находят повышения показателей ИЛ-4 у данной категории больных по сравнению с контрольной группой [165]. Что касается показателей ИЛ-10, то в имеющейся литературе все авторы указывают на его повышение у больных ХАК [7,109]. Известно, что ИЛ-10 является продуктом Тreg1, обладающим супрессорной активностью. Более того, 37 хорошо известна способность ИЛ-10 подавлять функциональную активность макрофагов. После проведения специфической иммунотерапии авторами было отмечено снижение показателей ИЛ-10, что являлось прогностическим критерием эффективности лечения [137,180]. Также есть немногочисленные исследования по определению уровня ИЛ-18 у больных ХАК. Одни авторы считают, что данный цитокин может стимулировать продукцию IFN-γ и тем самым запускать развитие аутоиммунного заболевания [164]. На основании других, недавно проведенных исследований, было выявлено, что повышенные уровни ИЛ-18 коррелируют с тяжестью заболевания у пациентов с положительным результатом пробы с аутосывороткой и с результатами теста высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров под действием сыворотки крови больных ХАК. Данный факт может свидетельствовать об участии ИЛ-18 в качестве непосредственного фактора высвобождающего гистамин [134,173]. О существенной роли в механизме развития ХАК ИЛ-3 говорят ряд исследований, проведенных как по выявлению количества базофилов (CD63, CD203, CD123), результаты которых оказались достоверно ниже, чем в контрольной группе, так и по поверхностной экспрессии ИЛ-3 рецептора на базофилах, которая была достоверно выше данных контроля [105,106,139]. Нарушение цитокин-хемокиновой сети при ХИК было отмечено в работе Santos J.C. и соавторов, где оценивали связь между лигандами провоспалительных сывороточных хемокинов CXCL8, CXCL9, CXCL10, CCL2 и экспрессией толл-лайк-рецептора (TLR-4). Был сделан вывод о высокой чувствительности моноцитов к экспрессии CCL2, CXCL8, поддерживающих воспаление у больных ХИК [166]. При более глубоком изучении механизмов снижения IFN-α у пациентов ХИК был сделан вывод о том, что снижение врожденного иммунитета у данных пациентов связано с повреждением pDC в результате чего активирован TLR 9 [107]. 38 При изучении мРНК цитокинов и Толл-подобных рецепторов (TLR2) у больных ХАК, было выявлено вовлечение в патогенез данного заболевания мРНК ИЛ-10, IFN-γ и TLR2 [109]. Сравнительный анализ по выработке ИЛ-8 и ИЛ-4 у пациентов с ХИК и ХАК был проведен в работе [89], где авторами делается вывод о том, что при ХИК поддерживается характерная картина воспаления с участием нейтрофилов, молекул адгезии и повышением показателей ИЛ-8. Напротив, при ХАК участвуют базофильные гранулоциты и связанные с ними молекулы ИЛ-4. Приведенные публикации были посвящены изучению цитокинов в кровотоке без анализа выработки цитокинов в ситуациях, сопряженных с дисбалансом регуляторных факторов, а именно в цельной крови без выделения мононуклеарных клеток. Однако в последние годы активно развивается новое направление в современной иммунодиагностике – метод ex vivo, позволяющий оценивать цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы у больных с различными заболеваниями, а также влияние фармакологических препаратов [52]. Однако подобного рода исследования при ХАК до сих пор не проводились. Применение тестов ex vivo при изучении иммунных нарушений у больных ХАК может открыть новые аспекты в понимании патогенеза данного заболевания. 1.4. Применение тестов in vitro для изучения иммунологических нарушений В последние годы все большее внимание уделяется роли повышенной и нерегулируемой активации тех или иных клеточных популяций иммунокомпетентных клеток (ИКК), что встречается при многих патологических состояниях. Такие изменения в иммунной системе могут сопровождаться увеличенным синтезом ряда провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. В настоящее время используются различные подходы для изучения продукции цитокинов клетками иммунной системы. Особенно актуальным 39 является изучение функционирования клеток иммунной системы и продукции ими цитокинов под действием различных фармакологических препаратов в тестах in vitro и ex vivo. Несмотря на то, что метод in vitro требует выделения клеточных культур, существует большое количество исследовательских работ с его применением. Так, известны работы авторов на выделенной культуре лейкоцитов [48]. Например, Щегловитова О.Н. и соавторы исследовали влияние различных доз фармакологического препарата Placentex-integro на способность лейкоцитов крови здоровых людей продуцировать цитокины [72]. Другие авторы вели свои исследования на культуре нейтрофильных гранулоцитов с целью изучения влияния различных лекарственных препаратов на клетки здоровых людей [30], а также больных с воспалительными процессами и инфекционными заболеваниями. Например, Нестерова И.В. и соавторы исследовали действие препарата Бестим на нейтрофилы больных хроническим панкреатитом [43]. Хараева З.Ф. и соавторы изучали влияние препарата «суперлимф» на нейтрофилы больных инфекционными заболеваниями [68]. Известна и работа исследователей на макрофагах в тесте in vitro. Например, Агаева Е.В. и соавторы вели свои исследования применительно к трансплантологии. Они изучали действие мезенхимных стромальных клеток, которые используются при трансплантации на цитокин-продуцирующую активность макрофагов [1]. Имеется достаточное количество работ исследователей и на лимфоцитах. Одни из них изучали влияние фармакологических препаратов на активность и цитокин-продуцирующую активность лимфоцитов здоровых людей и пациентов с патологиями [10,20,42]. Так, Добротина Н.А. и соавторы исследовали действие иммуномодулирующего препарата полиоксидония на Т-клетки здоровых людей и пациентов с термической травмой [27]. Другие, изучали функциональную активность и продукцию цитокинов лимфоцитами у больных с различными иммунными дефектами. Например, Вараксин Н.А и соавторы, определяли спонтанную и ФГА-индуцированную продукцию цитокинов выделенных лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией [17]. Также, известны работы ученых на 40 выделенных моноцитах. Например, Разумная Ф.Г. и соавторы определяли влияние различных доз препарата афобазола на функциональную активность моноцитов, и продукцию ими цитокинов [51]. Известны работы и зарубежных авторов, которые работали с базофилами, тучными клетками, мононуклеарами и лимфоцитами в тестах in vitro. Так Majlesi Y. и соавторы исследовали эффекты различных статинов на базофилах здоровых доноров [142], а Krauth M.T. с соавторами изучали аналогично эффекты статинов на тучных клетках человека [132]. В отличие от них Bessler H. с соавторами работал с цельной кровью и определял влияние различных фармакологических препаратов на продукцию цитокинов ИКК крови [83]. Интересна недавняя работа Pezeshkpoor F. и соавторов, в которой исследовали влияние аторвастатина на больных ХИК при лечении данным препаратом. Исследование проводилось на выделенной культуре лимфоцитов от пациентов ХИК до и после лечения, которую стимулировали PMA (Phorbol Myristate Acetate) и затем в супернатанте определяли цитокины [159]. Тесты in vitro проходят с выделением определенных клеточных культур и, соответственно, требуют наличия условий и оборудования для культивирования клеток. Процедура выделения клеток может привести к их активации, клетки лишаются своего естественного окружения, которое может включать в себя цитокины, аутоантитела к ним и растворимые рецепторы цитокинов. Для максимального приближения к реальным условиям в настоящее время используется подход, основанный на стимуляции цельной крови специфическими активаторами ex vivo, что позволяет оценить как реактивность лейкоцитов и лимфоцитов, так и степень влияния различных фармакологических препаратов на продукцию цитокинов клетками иммунной системы. Так, Исаченко Е.Г. и соавторы определяли продукцию цитокинов клетками крови у здоровых доноров и больных различными аллергическими заболеваниями. Авторы использовали цельную кровь, без выделения клеточных культур и оценивали спонтанную и ЛПС-стимулированную продукцию цитокинов. В работе ими был предложен 41 способ оценки резервных возможностей ИКК, с помощью которого можно судить о возможности развития аллергического процесса [32]. Зурочка В.А. и соавторы, применив в лекарственного своем исследовании препарата Бестима метод на ex vivo, определяли спонтанную, ФГА- влияния и ЛПС- стимулированную выработку цитокинов ИКК здоровых людей [28]. Интересна работа Ширинского И.В. и соавторов, которые на модели стресса in vitro показали влияния гормона мелатонина на продукцию цитокинов ИКК [70]. Из недавних работ известна работа Титовой Н.Д., которая исследовала эффекты пищевых красителей на стимуляцию лимфоцитов и секрецию цитокинов клетками крови [59]. Таким образом, методы ex vivo довольно широко применяются в настоящее время, однако не существует единой методики выполнения данных тестов. Рыжиковой С.Л. и соавторами была предложена стандартизация методики определения продукции цитокинов клетками крови ex vivo [52]. Тесты in vitro и ex vivo позволяют исследовать влияние различных фармакологических препаратов, гормонов, пищевых добавок и других соединений на состояние клеток иммунной системы, выработку ими цитокинов, определять резервные возможности клеток иммунной системы у здоровых лиц и при различных патологиях. Таким образом, данные тесты создают своего рода модельные системы, исследовать которые мы можем вне организма. Однако, если сравнивать методы in vitro и ex vivo, то метод ex vivo применяется в настоящее время более широко, так как имеет массу преимуществ. Для метода ex vivo используется цельная кровь без выделения клеточных культур, что упрощает методику анализа и снижает нежелательную активацию или гибель клеток. Также, культивирование клеток крови идет в более естественном окружении, сохраняется баланс всех гуморальных факторов, что соответствует условиям in vivo. Таким образом, данный метод, по мнению большинства исследователей, должен занять центральное место в современной иммунодиагностике [66]. 42 1.5. Лечение больных хронической аутоиммунной крапивницей В настоящее время одним из самых новых и перспективных направлений в лечении больных ХАК является применение ВВИГ, так как данные препараты воздействуют на патогенез заболевания. Известны работы по использованию ВВИГ для лечения больных с данной патологией в зарубежных странах [131,144,158]. В нашей стране в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (Москва) был разработан препарат «Габриглобин-IgG». Данный препарат представляет собой ВВИГ четвертого поколения с нерасщепленной, сохранившей все свои биологические функции, молекулой IgG [37]. Механизм действия препарата «Габриглобин-IgG» при аутоиммунных заболеваниях достаточно сложен. Описано несколько путей, через которые «Габриглобин-IgG» может оказывать свое действие при данных патологиях. Во-первых, препарат способен к связыванию, нейтрализации и уменьшению продукции аутоантител, которые играют патогенетическую роль при аутоиммунных заболеваниях. Во-вторых, соединяясь с циркулирующими в организме иммунными комплексами, препарат изменяет их свойства, в результате чего теряется их способность активировать комплемент. В-третьих, доказана способность препарата «Габриглобин-IgG» уменьшать воспалительный процесс за счет воздействия на секрецию провоспалительных хелперы/супрессоры [3,4]. цитокинов Также, была и изменения доказана хорошая соотношения клиническая эффективность препарата «Габриглобин-IgG» у больных ХАК [13]. В работе Молотилова Б.А. и соавторов был проведен сравнительный анализ эффективности различных видов терапии больных ХАК. Авторами рекомендуется для лечения пациентов применять препарат «Габриглобин-IgG», который не только давал высокую эффективность, но и вызывал минимум нежелательных эффектов [41]. Таким образом, применение ВВИГ и в частности, препарата «ГабриглобинIgG» на сегодняшний день является самым эффективным при лечении больных ХАК, так как данные препараты заболевания. воздействуют на патогенетические механизмы 43 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 2. Применение теста ex vivo для оценки цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы у больных хронической аутоиммунной крапивницей 2.1. Оценка спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей На сегодняшний день доказано, что цитокины играют важную роль в патогенезе ХАК. Они участвуют в иммунной регуляции, процессах аутоиммунитета и воспаления, вследствие чего их изучение при данном заболевании является особенно актуальным. В последнее время одним из перспективных направлений исследования показателей иммунной системы стало применение тестов ex vivo в оценке спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов клетками иммунной системы. Данные тесты имеют большой ряд преимуществ по сравнению с другими методами лабораторной диагностики, за счет максимального приближения условий исследования к in vivo и дают более точную информацию о нарушениях в иммунной системе [52]. Более того, изучение спонтанной секреции цитокинов позволяет оценить активацию клеток в организме обследуемого человека, а митоген-индуцированная – их потенциальную способность к синтезу цитокинов, что очень важно для оценки иммунологической реактивности [26]. С этой целью в работе было проведено исследование методом ex vivo спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы у больных ХАК по сравнению с контрольной группой. Результаты исследования представлены в таблице 3. 44 Таблица 3 – Показатели спонтанной и индуцированной продукции цитокинов клетками иммунной сиситемы у больных ХАК Показатель ИЛ-4 сп., пг/мл ИЛ-4 инд., пг/мл ИЛ-10 сп., пг/мл ИЛ-10 инд., пг/мл ИЛ-17 сп., пг/мл ИЛ-17 инд., пг/мл ИЛ-18 сп., пг/мл ИЛ-18 инд., пг/мл IFNγ сп., пг/мл IFNγ инд., пг/мл Больные ХАК n=100 Контрольная группа n=30 Mediana [LQ-UQ] Mediana [LQ-UQ] 0,55 [0,2-3,5]* 1,2 [0,4-3,3] 8,1 [0-17,8] 11,6 [3,5-24,8] 56,15 [31,7-98,1]* 86,9 [55,95-112,6]* 38,5 [28,0-54,9]* 43,1 [23,8-53,9]* 11,3 [0-33,6]* 198,6 [56,1-357,4]* 0 [0-0] 1,0 [0,7-3,3] 11,3 [6,05-18,9] 8,85 [0,7-21,25] 5,4 [0-22,0] 6,1 [0-23,5] 80,4 [54,0-123,0] 72,5 [52,0-97,0] 0 [0-0] 73,0 [57,6-105,0] Уровень достоверности (р) 0,000072 0,79 0,23 0,49 0,00068 0,000028 0,0009 0,01 0,00038 0,028 Примечание: * – статистически значимые различия больных ХАК и контрольной группы. Используемые сокращения: сп. - спонтанная продукция цитокинов клетками иммунной системы; инд. – ФГА- индуцированная продукция цитокинов клетками иммунной системы. Как видно из данных таблицы 3, в группе больных ХАК был отмечен достоверно более высокий уровень спонтанной выработки ИЛ-4, который составил 0,55 пг/мл [0,2-3,5] по сравнению с группой контроля, в которой данный показатель составил 0 пг/мл [0-0] (Mann-Whitney test, р=0,000072). Являясь продуктом Th2 клеток, ИЛ-4 способен вызывать активацию В-лимфоцитов и их стимуляцию к продукции IgE. Полученные в работе результаты могут свидетельствовать об активации Th2-популяции лимфоцитов к выработке данного цитокина. Однако уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 в группе пациентов достоверно не отличался от показателя контрольной группы, что может указывать на то, что резервные возможности клеток иммунной системы по продукции данного цитокина между сравниваемыми группами были сопоставимыми. При исследовании уровня спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-10 клетками иммунной системы у больных ХАК и контрольной группы не было выявлено достоверных различий. 45 Самые значительные изменения у пациентов в сравнении с контрольной группой касались показателей ИЛ-17 и выражались в 10-кратном повышении уровня спонтанной продукции этого цитокина и 14-кратном увеличении уровня ФГА-индуцированной продукции (Mann-Whitney test, р=0,00068 и р=0,000028, соответственно). Доказано, что ИЛ-17 играет важную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний, а его уровень повышен у больных с данной патологией [79]. Полученные результаты свидетельствуют об активации Th17популяции лимфоцитов и повышенной продукции ИЛ-17 клетками иммунной системы у больных ХАК. При оценке показателей спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-18 у больных ХАК был выявлен статистически значимый более низкий уровень спонтанной продукции данного цитокина, который составил 38,5 пг/мл [28,0-54,9] по сравнению с контрольной группой (80,4 пг/мл [54,0-123,0]) (MannWhitney test, р=0,0009). Аналогичные изменения были получены по уровню ФГАиндуцированной продукции ИЛ-18 в группе больных ХАК, который был достоверно более низким и составил 43,1 пг/мл [23,8-53,9] по сравнению с группой контроля, где уровень данного показателя составил 72,5 пг/мл [52,0-97,0] (Mann-Whitney test, р=0,01). В настоящее время доказано участие ИЛ-18 в патогенезе аутоиммунных заболеваний, в связи с чем, снижение уровня данного цитокина может свидетельствовать об ослабление его роли у больных ХАК. Также был проведен сравнительный анализ спонтанной и ФГА- индуцированной продукции IFNγ между группой больных ХАК и контрольной группой. Было выявлено, что уровень спонтанной продукции IFNγ клетками иммунной системы у больных ХАК, составивший 11,3 пг/мл [0-33,6], был достоверно более высоким по сравнению с группой контроля (0 пг/мл [0-0]) (Mann-Whitney test, р=0,00038). При изучении показателей ФГА-индуцированной продукции IFNγ у больных было выявлено повышение его уровня до 198,6 пг/мл [56,1-357,4] по сравнению с контрольной группой, в которой данный показатель составил 73,0 пг/мл [57,6-105,0]. Уровень достоверности (p) при этом был равен 0,028, а mediana изучаемого показателя в группе больных ХАК была выше в 2,7 46 раза по сравнению с контрольной группой. Полученные в работе результаты согласуются с данными литературы о повышенном уровне IFNγ у больных ХАК, а также могут свидетельствовать об активации аутоиммунитета у наблюдаемых пациентов [33]. Таким образом, на основании полученных результатов при исследовании методом ex vivo спонтанной и ФГА-индуцированной продукции изучаемых цитокинов у больных ХАК был выявлен ряд существенных нарушений. Было отмечено статистически значимое повышение спонтанной продукции ИЛ-4, спонтанной продукции ИЛ-17, спонтанной продукции IFNγ, ФГА- индуцированной продукции ИЛ-17 и ФГА-индуцированной продукции IFNγ, а также достоверно более низкий уровень спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы у больных ХАК по сравнению с контрольной группой (рисунок 1). Полученные данные дают основание предполагать, что в патогенезе ХАК одновременно участвуют Th1, Th2 и Th17 – популяции Т-лимфоцитов. 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ИЛ-4 сп. ИЛ-17 сп. ИЛ-17 инд. Больные ХАК ИЛ-18 сп. ИЛ-18 IFNγ сп. инд. IFNγ инд. Здоровые люди Рисунок 1 – Достоверно значимые изменения уровней спонтанной и ФГА-индуцированной продукции изучаемых цитокинов у больных ХАК по сравнению со здоровыми людьми Используемые сокращения: сп. - спонтанная продукция цитокинов клетками иммунной системы; инд. – ФГА- индуцированная продукция цитокинов клетками иммунной системы 47 Глава 2.2. Влияние препарата «Габриглобин-IgG» на цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей В настоящее время тесты ex vivo кроме оценки спонтанной и ФГАиндуцированной продукции цитокинов клетками широко используются для оценки влияния фармакологических препаратов на клетки иммунной системы больных людей с целью назначения лечения. Данный подход был использован и в нашей работе. Было проведено изучение влияния диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на продукцию ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы у больных ХАК. 2.2.1. Результаты отработки диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo на клетках иммунной системы здоровых людей Для отработки диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» был применен изучаемый метод ex vivo. В исследование были взяты разведения препарата «Габриглобин-IgG» – 1:1, 1:3, 1:10. Полученные в нашей работе результаты представлены в таблице 4. Таблица 4 – Распределение здоровых людей (%) с максимальной выработкой цитокинов клетками иммунной системы при различных разведениях препарата «Габриглобин-IgG» Разведения «ГабриглобинIgG» Количество здоровых людей (%) с максимальной выработкой цитокинов клетками иммунной системы ИЛ-10 ИЛ-17 ИЛ-18 IFNγ 1:1 1:3 1:10 11 67 22 30 50 20 20 10 70 0 60 40 48 Как видно из данных таблицы 4, при постановке теста ex vivo у 67% здоровых людей максимальная выработка ИЛ-10 клетками иммунной системы наблюдалась при разведении препарата «Габриглобин-IgG» 1:3, у 22% – при разведении 1:10 и лишь у 11% – при разведении препарата 1:1. Из этого следовало, что оптимальным разведением препарата по выработке ИЛ-10 клетками иммунной системы явилось – 1:3. При изучении показателей выработки ИЛ-17 клетками иммунной системы было установлено, что у 50% здоровых людей максимальная выработка данного цитокина отмечалась при разведении препарата «Габриглобин-IgG» 1:3, у 30% – при разведении препарата 1:1 и у 20% – при разведении 1:10. В связи с этим, оптимальное разведение препарата «Габриглобин-IgG» по выработке ИЛ-17 клетками иммунной системы составило – 1:3. При исследовании продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы было выявлено, что у 70% здоровых доноров максимальная продукция ИЛ-18 наблюдалась при разведении препарата «Габриглобин-IgG» 1:10, у 20% – при разведении 1:1 и лишь у 10% – при разведении 1:3. Исходя из полученных данных, диагностически значимое разведение препарата по выработке ИЛ-18 клетками иммунной системы составило – 1:10. При изучении показателей продукции IFNγ клетками иммунной системы было выявлено, что оптимальным разведением препарата «Габриглобин-IgG» явилось – 1:3, так как у 60% здоровых людей максимальная продукция данного цитокина клетками отмечалась при данном разведении и лишь у 40% - при разведении препарата 1:10. Таким образом, при изучении показателей продукции ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы было выявлено, что диагностически значимое разведение препарата «Габриглобин-IgG» для выработки ИЛ-10, ИЛ-17, IFNγ клетками иммунной системы составило – 1:3, а для ИЛ-18 – 1:10. Следовательно, в работу по изучению влияния препарата «Габриглобин-IgG» на выработку цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы больных ХАК были взяты следующие разведения препарата: для ИЛ-10, ИЛ-17 и IFNγ – 1:3, а для ИЛ-18 – 1:10. 49 2.2.2. Показатели продукции цитокинов клетками иммунной системы под действием препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей В предыдущей главе нами были подобраны диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG» на клетках иммунной системы здоровых людей, с целью использования их в тесте ex vivo у больных ХАК. Также нас интересовал вопрос изучения влияния диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы у наблюдаемых пациентов. В соответствие с целью и задачами нашего исследования, был проведен сравнительный анализ уровня цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в супернатанте клеток имунной системы, стимулированных препаратом «Габриглобин-IgG» (диагностически значимые разведения 1:3 и 1:10) между больными ХАК и контрольной группой. Таблица 5 – Показатели продукции цитокинов клетками иммунной системы под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo у больных ХАК Показатель ИЛ-10, пг/мл ИЛ-17, пг/мл ИЛ-18, пг/мл INFγ, пг/мл «ГабриглобинIgG», используемые разведения 1:3 1:3 1:10 1:3 Больные ХАК n=100 Mediana [LQ-UQ] 9,9 [1,45-18,45] 55,35 [33,8-111,0]* 43,7 [31,3-56,3] 19,6 [4,6-42,3]* Контрольная группа n=30 Mediana [LQ-UQ] 18,3 [4,7-20,4] 9,95 [5,7-28,6] 42,6 [37,9-49,1] 44,05 [22,4-55,1] Уровень достоверности (р) 0,345 0,00091 0,794 0,045 Примечание: * – статистически значимые различия больных ХАК и контрольной группы Как видно из данных таблицы 5, показатель продукции ИЛ-10 клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) у больных ХАК был более низким по 50 сравнению с контрольной группой. При этом в группе пациентов mediana данного показателя была в 2 раза ниже по сравнению с mediana в группе контроля. Однако уровень ИЛ-10 в сравниваемых группах не имел статистически значимого различия, из-за большого разброса значений данного показателя. Полученные результаты согласуются с данными по спонтанной и ФГАиндуцированной продукции ИЛ-10, которые также не имели достоверных различий между группой больных ХАК и контрольной группой. При изучении продукции ИЛ-17 клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) в группе пациентов и контрольной группе были получены следующие данные. Так, уровень данного показателя у больных ХАК составил 55,35 пг/мл [33,8-111,0], что было достоверно более высоким по сравнению с показателем контрольной группы (9,95 пг/мл [5,7-28,6]) (Mann-Whitney test, р=0,00091). Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что препарат «Габриглобин-IgG» способен вызывать повышенную продукцию ИЛ-17 клетками иммунной системы у больных ХАК по сравнению с группой контроля. Также, полученные данные согласуются с достоверно более высоким показателем спонтанной продукции ИЛ-17 (Mann-Whitney test, р=0,00068) и достоверно более высоким уровнем ФГА-индуцированной продукции данного цитокина (MannWhitney test, р=0,000028) у больных ХАК по сравнению с контрольной группой. Анализ продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы с диагностически значимым разведением препарата «Габриглобин-IgG» (1:10) в группе больных ХАК и контрольной группе не выявил статистически значимых различий. Так, значения данного показателя у пациентов и в группе контроля практически находились на одном уровне. При изучении продукции IFNγ клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3), было выявлено, что уровень данного показателя был статистически более низким у больных ХАК и составил 19,6 пг/мл [4,6-42,3] по сравнению с показателем 51 контрольной группы (44,05 пг/мл [22,4-55,1]) (Mann-Whitney test, р=0,045). Также было отмечено, что mеdiana показателя IFNγ у больных ХАК была ниже в 2 раза по сравнению с контрольной группой. Таким образом, сравнительный анализ результатов, полученных в тесте ex vivo с диагностически значимыми разведениями препарата «Габриглобин-IgG», позволил выявить, что данный препарат вызывал повышение продукции ИЛ-17 и снижение продукции IFNγ клетками иммунной системы у больных ХАК по сравнению с контрольной группой (рисунок 2). 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50 ИЛ-17 ХАК ИЛ-17 зд. IFNγ ХАК IFNγ зд. Median 25%-75% Min-Max Рисунок 2 – Достоверно значимые различия показателей выработки цитокинов клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) у больных ХАК по сравнению с контрольной группой Учитывая дефект в Th1- и Th17- популяциях лимфоцитов у больных ХАК, можно предположить, что препарат «Габриглобин-IgG» оказывал воздействие именно на данные популяции Т-лимфоцитов. 52 Глава 3. Характеристика иммунного статуса у больных хронической аутоиммунной крапивницей 3.1. Характеристика основных иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей На сегодняшний день известно, что у больных ХАК наблюдаются нарушения в иммунной системе, которые затрагивают клеточный, гуморальный иммунитет, систему комплемента и ряд других важных показателей [25,121]. Также имеются немногочисленные данные по изучению цитокинового профиля у больных ХАК [165]. Однако, исследований с учетом показателей клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента, антител к нативной ДНК, а также цитокинов в сыворотке крови и супернатанте спонтанной и стимулированной продукции клеток иммунной системы у больных ХАК до настоящего времени проведено не было. В работе были проанализированы основные иммунологические параметры у больных ХАК в сравнении с контрольной группой, результаты которых представлены в таблице 6. Для характеристики основных показателей клеточного иммунитета у наблюдаемых больных было проведено изучение уровней CD4+ и CD8+ популяций лимфоцитов, а также показателя ИРИ. Как видно из данных таблицы 6, у больных ХАК наблюдался достоверно более высокий уровень CD4+ популяции лимфоцитов, который составил 47,0% [42,0-52,0] по сравнению с контрольной группой, в которой данный показатель составил 42,0% [38,0-46,0] (Mann-Whitney test, р=0,008). При изучении уровня CD8+ популяции лимфоцитов было выявлено, что данный показатель в группе больных ХАК составил 18,0% [16,0-21,0], что было достоверно ниже по сравнению с показателем в группе контроля, который составил 22% [18,0-29,0] (Mann-Whitney test, р=0,006). В связи с выявленным дисбалансом уровней CD4+ и CD8+ популяций лимфоцитов у больных ХАК, 53 показатель ИРИ был также достоверно более высоким по сравнению с контрольной группой (Mann-Whitney test, р=0,0007). Полученные результаты свидетельствуют о сдвигах в основных показателях клеточного иммунитета, которые проявляются в снижении уровня СD8+ и повышении уровня СD4+ популяций лимфоцитов, что согласуется с данными литературы [88]. При оценке основных показателей гуморального иммунитета у больных ХАК было проведено изучение уровней IgA, IgM, IgG, общего IgE и ЦИК в сравнении с контрольной группой. Как видно из полученных данных, уровни IgA, IgM, IgG у пациентов с ХАК достоверно не отличались от аналогичных показателей в группе контроля. Однако уровень общего IgE у пациентов составил 91,5 МЕ/мл [29,0-249,0], что было достоверно выше по сравнению со значениями контрольной группы, в которой данный показатель составил 21,5 МЕ/мл [12,5-34,5] (Mann-Whitney test, р=0,00018). Таблица 6 – Характеристика основных иммунологических показателей в группе больных ХАК Показатели CD4+, % CD8+, % CD4/CD8 IgA, г/л IgM, г/л IgG, г/л IgE, МЕ/мл ЦИК 3%, у.е ЦИК 4%, у.е С3, мг/дл С4, мг/дл АТ к ДНК, МЕ/мл Больные ХАК n=100 Mediana [LQ-UQ] 47,0 [42,0-52,0]* 18,0 [16,0-21,0]* 2,3 [2,0-3,2]* 2,0 [1,6-2,75] 1,7 [1,2-2,3] 13,0 [11,0-15,0] 91,5 [29,0-249,0]* 13,0 [8,0-26,0] 29,0 [17,0-50,0] 164,0 [138,0-215,0]* 24,5 [20,0-35,0] 10,7 [8,1-39,7]* Контрольная группа n=30 Mediana [LQ-UQ] 42,0 [38,0-46,0] 22,0 [18,0-29,0] 1,8 [1,5-2,2] 2,4 [1,5-3,1] 1,5 [0,95-1,8] 15,0 [10,6-17,0] 21,5 [12,5-34,5] 11,0 [8,0-14,0] 26,0 [21,0-33,0] 141,0 [106,0-164,0] 22,0 [18,0-29,0] 5,95 [3,7-8,5] Примечание: * – статистически значимые различия больных ХАК и контрольной группы 54 Сравнительный анализ уровня ЦИК 3% и 4% между группой больных ХАК и контрольной группой не выявил статистически значимых различий. Также в работе был проведено изучение системы комплемента у больных ХАК, которое включало в себя определение уровней С3- и С4-компонентов. Известно, что система комплемента является одной из важнейших защитных систем врожденного иммунитета и компоненты данной системы участвуют в процессах выведения иммунных комплексов и реакциях аутоиммунного воспаления, в связи с чем, исследование уровня данных показателей при аутоиммунных патологиях представляется очень важным. Как видно из данных таблицы 6, уровень С3-компонента комплемента у больных ХАК составил 164,0 мг/дл [138,0-215,0], что было достоверно более высоким по сравнению с аналогичным показателем в группе контроля, который составил 141,0 мг/дл [106,0-164,0] (Mann-Whitney test, р=0,015). Известно, что С3-компонент комплемента является сильным анафилотоксином, который вызывает выброс гистамина из тучных клеток и базофилов. Повышенный уровень данного показателя у пациентов объясняется активацией комплемента по альтернативному пути. При изучении уровня С4-компонента комплемента между группой больных ХАК и контрольной группой не было выявлено достоверно значимых различий. Показатель антител к нативной ДНК является специфическим маркером аутоиммунного процесса, и определение его уровня представляется необходимым у больных ХАК [49]. В настоящем исследование при изучении содержания антител к нативной ДНК у больных ХАК было отмечено, что уровень данного показателя оказался достоверно выше в 1,8 раза в группе пациентов и составил 10,7 МЕ/мл [8,1-39,7] по сравнению с контрольной группой, в которой данный показатель составил 5,95 МЕ/мл [3,7-8,5] (Mann-Whitney test, р=0,023). Известно, что ДНК-связывающие заболеваниях и аутоантитела обладают образуются способностью при расщеплять аутоиммунных ДНК, являясь каталитическими антителами. Связанные с ядерными антигенами антитела вместе с белками системы комплемента образуют крупные иммунные комплексы, 55 накопление которых в разных тканях может приводить к патологическому эффекту. Полученные результаты согласуются с данными литературы о повышенном уровне антител к нативной ДНК у больных ХАК, что служит доказательством наличия аутоиммунного процесса при данном заболевании [12]. Таким образом, на основании изучения показателей клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента и антител к нативной ДНК у больных ХАК в сравнении с контрольной группой был выявлен ряд иммунологических нарушений (рисунок 3). % Рисунок 3 – Достоверно значимые изменения в иммунологических показателях у больных ХАК по сравнению с контрольной группой Примечание: К – значения контрольной группы, % – отклонения от группы контроля Так, у пациентов наблюдался дисбаланс по содержанию популяций Т-лимфоцитов, который проявлялся в повышении уровней CD4+ и снижении CD8+ популяций лимфоцитов. Также было отмечено повышение уровней общего IgE, С3-компонента комплемента и антител к нативной ДНК. Выявленные изменения в иммунологических показателях у больных ХАК доказывают ведущий аутоиммунный механизм при данном заболевании. 56 3.2. Характеристика уровня цитокинов в сыворотке крови у больных хронической аутоиммунной крапивницей Цитокины играют ключевую роль в регуляции всех функций иммунитета, и их изучение является неотъемлемой частью для оценки работы клеток иммунной системы. В настоящее время уровень цитокинов определяют в различных биологических жидкостях разнообразными методами. Исследование их уровня в сыворотке крови является самым доступным методом и отражает системный характер их функционирования. В главе 2.1. нами было проведено изучение уровня цитокинов у больных ХАК в спонтанной и ФГА-индуцированной продукции клеток иммунной системы. Но также нас интересовал вопрос изучения уровня цитокинов и в сыворотке крови у больных ХАК. С этой целью было проведено определение уровней ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в сыворотке крови у больных ХАК в сравнении с контрольной группой. Полученные данные представлены в таблице 7. Таблица 7 – Показатели цитокинов в сыворотке крови у больных ХАК Показатели ИЛ-4, пг/мл ИЛ-10, пг/мл ИЛ-17, пг/мл ИЛ-18, пг/мл IFNγ, пг/мл Больные ХАК n=100 Mediana [LQ-UQ] 0,39 [0-0,71]* 0 [0-3,0] 0 [0-0] 87,1 [61,4-198,2] 0 [0-5,5] Контрольная группа n=30 Mediana [LQ-UQ] 4,6 [0,21-5,0] 1,0 [0-3,4] 0 [0-1,0] 111,0 [60,0-121,3] 0 [0-7,0] Примечание: * – статистически значимые различия больных ХАК и контрольной группы Как видно из данных таблицы 7, у больных ХАК уровень ИЛ-4 в сыворотке крови составил 0,39 пг/мл [0-0,71], что было достоверно более низким по сравнению с группой контроля, в которой данный показатель составил 4,6 пг/мл [0,21-5,0] (Mann-Whitney test, p=0,000032). Также было выявлено, что mеdiana у больных ХАК была почти в 12 раз ниже, чем в контрольной группе. Полученный 57 результат о более низком уровне ИЛ-4 в сыворотке крови у больных ХАК по сравнению со здоровыми людьми согласуется с данными литературы [165]. Сравнительный анализ уровней ИЛ-10, ИЛ-17 и IFNγ между группой пациентов и контрольной группой не выявил достоверных различий. Полученные результаты могут быть связаны с тем, что цитокины являются коротко дистантными субстанциями, поэтому их не всегда можно определить в системном кровотоке. При сравнении уровня ИЛ-18 в сыворотке крови между группой больных ХАК и группой контроля, также не было выявлено статистически значимых различий. Однако, как видно из данных таблицы 7, уровень ИЛ-18 у больных ХАК, который составил 87,1 пг/мл [61,4-198,2] имел тенденцию к снижению по сравнению с группой контроля, в которой данный показатель составил 111,0 пг/мл [60,0-121,3]. При этом, mеdiana показателя ИЛ-18 у пациентов была ниже в 1,3 раза по сравнению с контрольной группой. Полученные данные согласуются с данными литературы, о том, что уровень ИЛ-18 в сыворотке крови у больных ХАК не отличался от здоровых людей, и изменялся только в зависимости от тяжести заболевания [164]. Таким образом, при изучении уровней ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в сыворотке крови в группе больных ХАК в сравнении с контрольной группой, было выявлено только статистически значимое снижение уровня ИЛ-4, при этом, показатели других изучаемых цитокинов достоверно не различались (рисунок 4). 58 6 5 4 3 2 1 0 -1 ИЛ-4 ХАК ИЛ-4 зд. Median 25%-75% Min-Max Рисунок 4 – Достоверно значимое изменение ИЛ-4 в сыворотке крови у больных ХАК На основании полученных результатов, можно сделать вывод о том, что определение уровня цитокинов в сыворотке крови у больных ХАК не является достаточно информативным по сравнению с изучением цитокинов методом ex vivo. 59 Глава 4. Сравнительная характеристика иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей и хронической идиопатической крапивницей До недавнего времени ХИК составляла 80-95% в структуре ХК [23,62]. Однако в связи с многочисленными исследованиями в данной области и диагностикой ХАК, процент ХИК заметно сократился и составляет 55% [111]. Несмотря на то, что клинические проявления разных форм ХК являются практически одинаковыми, механизмы развития их различаются. Исследованиями последних лет доказано, что при аутоиммунной форме ХК важную роль в патогенезе играет процесс образования патологических аутоантител, которые вызывают ряд диагностических иммунологических критериев ХАК нарушений является [155]. Одним из положительная важных проба с аутосывороткой, которая позволяет отнести пациентов именно в группу с аутоиммунной формой ХК. В тоже время, пациенты с ХИК имеют отрицательную пробу с аутосывороткой, так как в патогенезе данной формы ХК, по-видимому, играют роль другие механизмы развития патологии [13]. В связи с вышесказанным, актуальным является сравнительное изучение иммунологических показателей между больными ХАК и ХИК. С этой целью нами было проведено исследование основных показателей клеточного, гуморального иммунитета, компонентов комплемента, а также уровней цитокинов в сыворотке крови в группах больных ХАК и ХИК. Кроме того, данные показатели были проанализированы у больных ХИК в сравнении с контрольной группой. Полученные в работе результаты представлены в таблице 8. 60 Таблица 8 – Характеристика основных иммунологических показателей у больных ХАК и ХИК Показатели CD4+, % CD8+, % CD4/CD8 IgA, г/л IgM, г/л IgG, г/л IgE, МЕ/мл ЦИК 3%, у.е ЦИК 4%, у.е С3, мг/дл С4, мг/дл ИЛ-4, пг/мл ИЛ-10, пг/мл ИЛ-17, пг/мл ИЛ-18, пг/мл IFNγ, пг/мл Больные ХАК n=100 Mediana [LQ-UQ] 47,0 [42,0-52,0] 18,0 [16,0-21,0]* 2,3 [2,0-3,2]* 2,0 [1,6-2,75] 1,7 [1,2-2,3] 13,0 [11,0-15,0] 91,5 [29,0-249,0] 13,0 [8,0-26,0] 29,0 [17,0-50,0] 164,0 [138,0-215,0]* 24,5 [20,0-35,0] 0,39 [0-0,71] 0 [0-3,0]* 0 [0-0] 87,1 [61,4-198,2]* 0 [0-5,5] Больные ХИК n=20 Mediana [LQ-UQ] 46,0 [42,0-48,0] 23,0 [19,0-30,0] 1,9 [1,5-2,1] 2,15 [1,9-2,45] 1,53 [1,05-2,2] 11,5 [9,6-15,0] 98,5 [35,5-304,0]** 14,0 [10,0-23,0] 32,0 [21,0-50,0] 143,5 [93,5-156,0] 22,0 [16,0-28,0] 0 [0-0]** 19,3 [0,8-78,8]** 0 [0-0,8] 156,4 [99,2-382,4] 0 [0-0] Контрольная группа n=30 Mediana [LQ-UQ] 42,0 [38,0-46,0] 22,0 [18,0-29,0] 1,8 [1,5-2,2] 2,4 [1,5-3,1] 1,5 [0,95-1,8] 15,0 [10,6-17,0] 21,5 [12,5-34,5] 11,0 [8,0-14,0] 26,0 [21,0-33,0] 141,0 [106,0-164,0] 22,0 [18,0-29,0] 4,6 [0,21-5,0] 1,0 [0-3,4] 0 [0-1,0] 111,0 [60,0-121,3] 0 [0-7,0] Примечание: * – статистически значимые различия больных ХАК и ХИК; ** – статистически значимые различия больных ХИК и контрольной группы При сравнительном анализе уровня CD4+-популяции лимфоцитов между больными ХАК и ХИК не было выявлено статистически значимых различий. Также у больных ХИК в сравнении с контрольной группой данный показатель достоверно не различался. Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных ХИК уровень CD4+-популяции лимфоцитов соответствовал уровню здоровых лиц. В отличие от этого, уровень данного показателя у больных ХАК был достоверно повышен и составил 47,0% [42,0-52,0] по сравнению с контрольной группой, в которой данный показатель составил 42,0% [38,0-46,0] (Mann-Whitney test, р=0,008) (см. главу 3.1). При исследовании уровня CD8+-популяции лимфоцитов в группе больных ХАК было выявлено достоверно значимое снижение уровня данного показателя, который составил 18,0% [16,0-21,0] по сравнению с группой больных ХИК, где аналогичный показатель составил 23,0% [19,0-30,0] (Mann-Whitney test, р=0,019). При сравнительном анализе уровня CD8+-популяции лимфоцитов между 61 больными ХИК и контрольной группой не было выявлено достоверно значимых различий. Из полученных результатов по уровню CD8+-популяции лимфоцитов следует, что только при ХАК возникает снижение показателей цитотоксических Т-лимфоцитов. При изучении показателя ИРИ между больными ХАК и ХИК было получено, что в группе больных ХАК уровень данного показателя составил 2,3 [2,0-3,2], что было достоверно выше по сравнению с группой ХИК, в которой данный показатель составил 1,9 [1,5-2,1] (Mann-Whitney test, р=0,0178). В то же время показатель ИРИ у больных ХИК не имел достоверных различий с группой контроля. Полученные данные по показателям клеточного иммунитета, свидетельствуют о дисбалансе основных популяций лимфоцитов у больных ХАК, который не наблюдается у больных ХИК. Сравнительное изучение основных классов иммуноглобулинов – IgA, IgM, IgG между группами больных ХАК и ХИК, а также между больными ХИК и контрольной группой не показало статистически значимых различий. Не было получено достоверных различий и по показателю общего IgЕ между больными ХАК и ХИК. Однако было выявлено, что у больных ХИК уровень общего IgE был достоверно более высокий и составил 98,5 МЕ/мл [35,5-304,0], по сравнению с группой контроля, где уровень данного показателя составил 21,5 МЕ/мл [12,5-34,5] (Mann-Whitney test, р=0,0014). Как было описано в главе 3.1 у больных ХАК данный показатель также был достоверно более высоким по сравнению с контрольной группой (Mann-Whitney test, р=0,00018). Полученные данные свидетельствуют о том, что уровни общего IgЕ у больных ХАК и ХИК не различались и были достоверно более высокими по сравнению с контрольной группой. При сравнительном анализе уровня ЦИК 3% и 4% между группами больных ХАК и ХИК, а также между больными ХИК и контрольной группой не было отмечено достоверно значимых различий. 62 При изучении системы комплемента были выявлены следующие особенности. Как видно из данных таблицы 8, уровень С3-компонента комплемента у больных ХАК составил 164,0 мг/дл [138,0-215,0], что было достоверно более высоким по сравнению с группой ХИК, где данный показатель составил 143,5 мг/дл [93,5-156,0] (Mann-Whitney test, р=0,003). Полученные результаты свидетельствуют о том, что повышение С3-компонента комплемента происходит только при аутоиммунном варианте ХК. При исследовании данного показателя между группой ХИК и группой контроля не было выявлено статистически значимых различий. Кроме того, и по показателю С4-компонента комплемента больные ХАК и ХИК, а также больные ХИК и контрольная группа достоверно не различались. При изучении уровня ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN-γ в сыворотке крови были получены следующие результаты. У больных ХАК уровень ИЛ-4 достоверно не отличался от показателей больных ХИК. Наряду с этим было отмечено, что у больных ХИК уровень ИЛ-4 составил 0 пг/мл [0-0], что было достоверно ниже по сравнению с группой контроля, где данный показатель составил 4,6 пг/мл [0,21-5,0] (Mann-Whitney test, р=0,00001). Как уже было указано в главе 3.2, у больных ХАК уровень указанного цитокина также был достоверно снижен по сравнению с показателями контрольной группы (MannWhitney test, p=0,000032). Таким образом, уровни ИЛ-4 в сыворотке крови не были различны между больными ХАК и ХИК и были снижены по сравнению с группой контроля. Исследование уровня ИЛ-10 показало, что у больных ХАК данный показатель составил 0 пг/мл [0-3,0], что было достоверно более низким по сравнению с больными ХИК, у которых аналогичный показатель составил 19,3 пг/мл [0,8-78,8] (Mann-Whitney test, р=0,0018). Кроме того, было отмечено, что уровень ИЛ-10 у больных ХИК был повышенным по сравнению с контрольной группой, в которой данный показатель составил 1,0 пг/ мл [0-3,4], что может 63 свидетельствовать о возможном его участии в патогенетических механизмах ХИК (Mann-Whitney test, р=0,0086). При сравнительном анализе уровня ИЛ-18, было отмечено, что данный показатель был достоверно снижен у больных ХАК и составил 87,1 пг/мл [61,4-198,2] по сравнению с группой больных ХИК, где его уровень составил 156,4 пг/мл [99,2-382,4] (Mann-Whitney test, р=0,041). Учитывая роль ИЛ-18 не только в аутоиммунном, но и в противоинфекционном иммунитете, можно предположить о возможной роли инфекционных агентов в патогенезе ХИК. В то же время при изучении уровня ИЛ-18 между больными ХИК и контрольной группой не было выявлено достоверно значимых различий, однако была отмечена тенденция к повышению уровня данного показателя у больных ХИК. Кроме того, в работе было проведено исследование IFN-γ между группами больных ХАК и ХИК, а также группой больных ХИК и контрольной группой, которое не выявило каких-либо достоверно значимых различий. Таким образом, при изучении основных иммунологических параметров у больных ХАК в сравнении с ХИК нами было выявлено, что у больных ХАК наблюдался достоверно сниженный уровень CD8+-популяции лимфоцитов, повышенный показатель ИРИ, повышенный уровень С3-компонента комплемента, сниженный уровень ИЛ-10 и сниженный уровень ИЛ-18 (рисунок 5). 64 180 * 160 140 120 ** 100 * 80 60 40 * * ** 20 ** * 0 CD8+ ИРИ Больные ХАК С3 IgE ИЛ-4 Больные ХИК ИЛ-10 ИЛ-18 Здоровые Рисунок 5 – Достоверно значимые изменения в иммунологических показателях у больных ХАК и ХИК Примечание: * - статистически значимые различия больных ХАК и ХИК; ** - статистически значимые различия больных ХИК и контрольной группы При исследовании основных иммунологических показателей у больных ХИК в сравнении с контрольной группой были отмечены достоверно повышенные уровни общего IgЕ и ИЛ-10, а также сниженный уровень ИЛ-4 (рисунок 5). На основании полученных данных можно судить о том, что иммунные нарушения при ХАК и ХИК носят различный характер. 65 Глава 5. Характеристика иммунологических параметров у больных хронической аутоиммунной крапивницей после проведения лечения препаратом «Габриглобин-IgG» Исследованиями последних лет доказано, что больные ХАК относятся к категории пациентов, которые наиболее тяжело поддаются терапии и требуют особого подхода в лечении, которое было бы направлено на патогенетические механизмы заболевания. В настоящее время одним из наиболее перспективных методов лечения таких больных является терапия с использованием ВВИГ, одним из которых является отечественный препарат «Габриглобин-IgG» [13]. С целью уточнения механизмов влияния препарата «Габриглобин-IgG» был проведен анализ основных иммунологических показателей у больных ХАК после лечения данным препаратом в сравнении с больными до начала терапии и контрольной группой. 5.1. Характеристика спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» В главе 2 нами было показано, что оптимальным методом исследования цитокинов у больных ХАК является изучение их продукции клетками иммунной системы в тесте ex vivo, по сравнению с определением их уровня в сыворотке крови. В связи с этим, был проведен сравнительный анализ спонтанной и ФГАиндуцированной продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы в тесте ex vivo между больными ХАК до и после проведенного лечения препаратом «Габриглобин-IgG», а также между больными 66 ХАК после лечения и контрольной группой. Полученные результаты представлены в таблице 9. Таблица 9 – Характеристика показателей выработки ключевых цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных ХАК до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» Показатель ИЛ-4 сп., пг/мл ИЛ-4 инд., пг/мл ИЛ-10 сп., пг/мл ИЛ-10 инд., пг/мл ИЛ-17 сп., пг/мл ИЛ-17 инд., пг/мл ИЛ-18 сп., пг/мл ИЛ-18 инд., пг/мл IFNγ сп., пг/мл IFNγ инд., пг/мл Больные ХАК до Больные ХАК после лечения лечения n=27 n=27 Mediana Mediana [LQ-UQ] [LQ-UQ] 0,8 [0,2-3,2] 0,4 [0-2,5]** 1,8 [0,5-4,8] 1,0 [0,5-3,1] 9,75 [0-11,1] 10,8 [2,1-19,4] 10,1 [4,3-20,0]* 28,0 [11,4-39,5]** 58,3 [45,0-98,1]* 23,75 [9,2-59,4]** 95,55 [62,6-105,0]* 42,4 [20,5-83,3]** 32,9 [27,0-60,1] 34,0 [24,3-41,6]** 40,85 [26,05-51,2] 29,3 [22,4-40,9]** 29,9 [0-33,6] 6,05 [1,1-22,65]** 234,9 [82,25-353,7]* 38,35[3,55-198,1]** Контрольная группа n=30 Mediana [LQ-UQ] 0 [0-0] 1,0 [0,7-3,3] 11,3 [6,05-18,9] 8,85 [0,7-21,25] 5,4 [0-22,0] 6,1 [0-23,5] 80,4 [54,0-123,0] 72,5 [52,0-97,0] 0 [0-0] 73,0 [57,6-105,0] Примечание: * – статистически значимые различия больных ХАК до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG»; ** – статистически значимые различия больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» и контрольной группы. Используемые сокращения: сп. - спонтанная продукция цитокинов клетками иммунной системы; инд. – ФГА- индуцированная продукция цитокинов клетками иммунной системы. При анализе спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 у больных ХАК после лечения по сравнению с больными до лечения не было выявлено достоверно значимых изменений. Однако при проведении корреляционного анализа по показателю ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 между больными ХАК до и после лечения была отмечена обратная достоверно значимая корреляция (Spearmen test, R=-0,5, p=0,021). При сравнительном анализе уровня спонтанной продукции ИЛ-4 между группой больных после терапии и контрольной группой был отмечен достоверно более высокий уровень данного показателя в группе больных ХАК после лечения (Mann-Whitney test, р=0,042). Однако при исследовании уровня ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 в 67 группах пациентов и контроля не было получено статистически значимых различий. Оценка спонтанной продукции ИЛ-10 у больных ХАК до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» не показала статистически значимых изменений. Также не было отмечено достоверно значимых различий по данному показателю и при сравнении больных после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» и группой контроля. Однако, как видно из данных таблицы 9, уровень ФГАиндуцированной продукции ИЛ-10 клетками иммунной системы у больных после лечения, который составил 28,0 пг/мл [11,4-39,5] был достоверно более высоким по сравнению с больными до лечения, у которых данный показатель составил 10,1 пг/мл [4,3-20,0] (Wilcoxon test, р=0,013). Также было отмечено, что mediana данного показателя у больных после проведения терапии возрастала в 2,8 раза по сравнению с больными до лечения. Кроме того, уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-10 клетками иммунной системы у больных после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» был достоверно более высоким по сравнению с группой контроля, в которой данный показатель составил 8,85 пг/мл [0,7-21,25] (Mann-Whitney test, р=0,032). Известно, что ИЛ-10 является продуктом Tr1 клеток, который относится к противовоспалительным цитокинам. Он способен снижать секрецию провоспалительных цитокинов, тем самым участвуя в реакциях аутоиммунитета [152]. При исследовании уровня спонтанной продукции ИЛ-17 между больными ХАК до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» было выявлено достоверно значимое снижению данного показателя с уровня 58,3 пг/мл [45,0-98,1] у больных до проведения терапии до уровня 23,75 пг/мл [9,2-59,4] у больных после проведения терапии (Wilcoxon test, р=0,018). При этом mediana данного показателя у больных ХАК после лечения препаратом «ГабриглобинIgG» была в 2,5 раза ниже по сравнению с больными до лечения. При сравнении результатов по спонтанной продукции ИЛ-17 клетками иммунной системы между больными ХАК после лечения и контрольной группой было выявлено 68 достоверное значимое повышение уровня данного показателя у больных после лечения (23,75 пг/мл [9,2-54,9]) по сравнению с группой контроля, в которой данный показатель составил 5,4 пг/мл [0-22,0] (Mann-Whitney test, р=0,037). При сравнительном анализе уровня ФГА-индуцированной продукции ИЛ-17 клетками иммунной системы между больными ХАК до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» были получены следующие данные. Так, у больных ХАК после проведения терапии было выявлено достоверно значимое снижение уровня данного показателя в 2,3 раза с 95,55 пг/мл [62,6-105,0] до 42,4 пг/мл [20,5-83,3] (Wilcoxon test, р=0,035). Учитывая ключевую роль Th17-популяции лимфоцитов в патогенезе аутоиммунных заболеваний и ХАК, можно предположить, что препарат «Габриглобин-IgG» снижает показатели ИЛ-17 у больных после проведения терапии. Однако, несмотря на положительную тенденцию в результатах после терапии, уровни спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-17 клетками иммунной системы у больных ХАК после лечения оставались достоверно более высокими по сравнению с показателями контрольной группы (Mann-Whitney test, р=0,037; р=0,0068 соответственно). Исследование уровня спонтанной продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы у больных ХАК до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» не показало достоверно значимых изменений после терапии. Однако при проведении сравнительного анализа по уровню данного показателя между больными ХАК после лечения и группой контроля были получены следующие результаты. Так, было выявлено, что уровень спонтанной продукции ИЛ-18 у больных ХАК после лечения, который составил 34,0 пг/мл [24,3-41,6] был достоверно более низким по сравнению с контрольной группой, в которой уровень данного показателя составил 80,4 пг/мл [54,0-123,0] (Mann-Whitney test, р=0,000007). Также, было проведено сравнительное исследование и показателей ФГА-индуцированной продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы между изучаемыми группами. При этом не было выявлено статистически значимых различий по уровню данного показателя между больными ХАК до и после лечения препаратом 69 «Габриглобин-IgG». Однако, было отмечено, что уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы у больных ХАК после лечения, который составил 29,3 пг/мл [22,4-40,9] был достоверно более низким по сравнению с контрольной группой, в которой данный показатель составил 72,5 пг/мл [52,0-97,0] (Mann-Whitney test, р=0,0021), что может свидетельствовать о снижении резервных возможностей клеток иммунной системы пациентов к продукции ИЛ-18. При изучении показателей спонтанной и ФГА-индуцированной продукции IFNγ у пациентов до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» были получены следующие результаты. Было выявлено, что уровень спонтанной продукции IFNγ клетками иммунной системы у больных ХАК после терапии имел тенденцию к снижению по сравнению с больными до начала терапии. Так, было отмечено, что уровень данного показателя у больных после лечения снижался в 5 раз с 29,9 пг/мл [0-33,6] до 6,05 пг/мл [1,1-22,65]. Однако, из-за большого разброса значений, данный показатель не имел достоверных различий между группами. При исследовании показателя спонтанной продукции IFNγ между больными ХАК после лечения и контрольной группой, был выявлен статистически значимый более высокий уровень данного показателя у больных после лечения (6,05 пг/мл [1,1-22,65]) по сравнению с контрольной группой, в которой данный показатель составил 0 пг/мл [0-0] (Mann-Whitney test, р=0,000026). При сравнительном анализе уровня ФГА-индуцированной продукции IFNγ между больными ХАК до и после лечения были выявлены следующие особенности. Как видно из данных таблицы 9, уровень данного показателя у больных после лечения составил 38,35 пг/мл [3,55-198,1], что было в 6 раз ниже по сравнению с уровнем данного показателя у больных до лечения, который составил 234,9 пг/мл [82,25-353,7] (Wilcoxon test, р=0,016). При изучении ФГА-индуцированной продукции IFNγ между больными после лечения и контрольной группой было отмечено, что уровень данного показателя у пациентов после лечения был достоверно снижен в 2 раза (38,35 пг/мл [3,55-198,1]) по сравнению с группой 70 контроля, в которой данный показатель составил 73,0 пг/мл [57,6-105,0] (WaldWolfowitz test, р=0,007). Известно, что высокие показатели IFNγ часто ассоциируются с активацией аутоиммунного процесса. Поэтому полученные в работе данные по снижению показателей IFNγ могут свидетельствовать о снижении активности аутоиммунного процесса в целом после проведения лечения препаратом «Габриглобин-IgG». Таким образом, у больных ХАК после лечения по сравнению с больными до лечения было выявлено достоверное снижение продукции ИЛ-17 (Th17) и IFNγ (Th1), а также повышение продукции ИЛ-10 (Tr1) клетками иммунной системы (рисунок 6). Полученные результаты могут свидетельствовать о регуляции препаратом «Габриглобин-IgG» Th-взаимодействия, что может способствовать положительному эффекту от лечения. 200 150 100 50 0 ИЛ-10 инд. ИЛ-17 сп. Больные до лечения ИЛ-17 инд. IFNγ инд. Больные после лечения Рисунок 6 – Достоверно значимые изменения показателей выработки ключевых цитокинов клетками иммунной системы у больных ХАК после лечения Используемые сокращения: сп. - спонтанная продукция цитокинов клетками иммунной системы; инд. – ФГА- индуцированная продукция цитокинов клетками иммунной системы 71 Изучение аналогичных показателей цитокинов у больных после лечения в сравнении с контрольной группой выявило повышение уровня спонтанной продукции ИЛ-4, ФГА-индуцированной продукции ИЛ-10, спонтанной и ФГАиндуцированной продукции ИЛ-17, спонтанной продукции IFNγ, а также снижение спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-18 и ФГАиндуцированной продукции IFNγ. 5.2. Характеристика цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы под действием препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей после лечения Для оценки влияния препарата «Габриглобин-IgG» на продукцию ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы у больных ХАК после проведения лечения, были проанализированы данные, полученные в тесте ex vivo с диагностически значимыми разведениями препарата «Габриглобин-IgG» как между группами больных ХАК до и после лечения, так и между группой больных после лечения и контрольной группой. В работу были взяты диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG» (глава 2.2.1), которые составили для выработки ИЛ-10, ИЛ-17, IFNγ клетками иммунной системы – 1:3, а для ИЛ-18 – 1:10. Полученные результаты исследования представлены в таблице 10. При сравнительном анализе уровня ИЛ-10 между больными ХАК до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» не было выявлено статистически значимых различий. Также данный показатель не имел достоверно значимого отличия и при сравнении группы пациентов после терапии с группой контроля. Однако, как видно данных таблицы 10, при исследовании уровня ИЛ-17 между группами больных ХАК до и после лечения препаратом «ГабриглобинIgG», было выявлено достоверно значимое снижение данного показателя у больных после лечения с уровня 57,85 пг/мл [50,5-72,0], который наблюдался у 72 больных до лечения до уровня 33,0 пг/мл [21,8-42,0] (Wilcoxon test, р=0,0018). В то же время, при сравнительном исследовании уровня ИЛ-17 между группой больных ХАК после лечения и группой контроля, было выявлено, что уровень данного показателя у больных после лечения оставался достоверно более высоким по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (9,95 пг/мл [5,7-28,6]) (Mann-Whitney test, р=0,0357). Полученные результаты согласуются с данными по спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-17 клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных ХАК после лечения и еще раз свидетельствуют о том, что препарат «Габриглобин-IgG» способен снижать повышенную продукцию Th17-популяции лимфоцитов. Таблица 10 – Показатели продукции цитокинов клетками иммунной системы под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo у больных ХАК до и после лечения Показатель «ГабриглобинIgG», используемые разведения ИЛ-10, пг/мл ИЛ-17, пг/мл ИЛ-18, пг/мл INFγ, пг/мл 1:3 1:3 1:10 1:3 Больные ХАК до лечения n=27 Mediana [LQ-UQ] 9,8 [1,2-16,5] 57,85 [50,5-72,0]* 37,5 [26,8-45,3] 22,75 [6,8-41,05] Больные ХАК после лечения n=27 Mediana [LQ-UQ] 10,5 [1,5-14,8] 33,0 [21,8-42,0]** 37,9 [21,3-41,3] 11,5 [5,9-42,5]** Контрольная группа n=30 Mediana [LQ-UQ] 18,3 [4,7-20,4] 9,95 [5,7-28,6] 42,6 [37,9-49,1] 44,05 [22,4-55,1] Примечание: * – статистически значимые различия больных ХАК до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG»; ** – статистически значимые различия больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» и контрольной группы При оценке уровня ИЛ-18 у больных ХАК до и после лечения не было получено достоверных изменений. Уровень данного показателя также не имел статистически значимых различий у больных после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» и по сравнению с контрольной группой. Уровень IFNγ в группах больных ХАК до и после лечения достоверно не различался. Однако в группе больных после лечения уровень данного показателя составил 11,5 пг/мл [5,9-42,5] и оказался достоверно более низким по сравнению с 73 группой контроля, в которой данный показатель составил 44,05 пг/мл [22,4-55,1] (Mann-Whitney test, р=0,01). Полученные данные по продукции IFNγ клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) согласуются с результатами о более низкой ФГА-стимулированной продукции IFNγ у больных ХАК после лечения по сравнению с контрольной группой (Wald-Wolfowitz test, р=0,007) (глава 5.1.). Таким образом, при изучении показателей продукции ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo у больных ХАК до и после лечения, а также у больных после лечения и контрольной группы, были выявлены следующие особенности (рисунок 7). * 60 50 ** 40 30 ** Здоровые 20 Больные после лечения 10 0 Больные до лечения ИЛ-17 IFN-γ Рисунок 7 – Статистически значимые показатели выработки ключевых цитокинов клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) в тесте ex vivo у больных ХАК после лечения Примечание: * – статистически значимые различия больных ХАК до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG»; ** – статистически значимые различия больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» и контрольной группы 74 Как видно на рисунке 7, у больных ХАК после проведения терапии наблюдалось статистически значимое снижение уровня ИЛ-17, однако уровень данного цитокина оставался более высоким по сравнению с контрольной группой. Уровень IFNγ у больных после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» достоверно не изменялся и оставался на более низком уровне по сравнению с группой контроля. Таким образом, полученные результаты о снижении показателей продукции ИЛ-17 клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) у больных ХАК после проведения лечения свидетельствует о его способности воздействовать на Th17-популяцию лимфоцитов. 5.3. Оценка иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» Для оценки влияния препарата «Габриглобин-IgG» на иммунологические показатели пациентов было проведено исследование основных показателей клеточного, гуморального звена иммунитета, системы комплемента, антител к нативной ДНК, а также уровней ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в сыворотке крови в группе больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» в сравнении с показателями больных до лечения и контрольной группы. Полученные в работе результаты представлены в таблице 11. Проведенное исследование основных показателей клеточного иммунитета по уровням CD4+ и CD8+ популяций лимфоцитов у больных ХАК после лечения позволило выявить следующие особенности. Как видно из данных таблицы 11, уровень CD4+ популяции лимфоцитов в группах больных ХАК до и после лечения достоверно не различался. При этом, уровень данного показателя в группе больных после лечения, который составил 47,0% [40,0-53,0] был достоверно выше по сравнению с показателем в контрольной группе (42,0% 75 [38,0-46,0] (Wald-Wolfowitz test, р=0,027). В то же время, уровень СD8+ популяции лимфоцитов у пациентов после проведения терапии достоверно повышался с 16,0 % [13,0-20,0] до 23,0% [20,0-26,0] (Wilcoxon test, р=0,002). При сравнении уровня СD8+ популяции лимфоцитов в группе пациентов после проведения терапии и группе контроля не было выявлено статистически значимых различий, что свидетельствует о нормализации данного показателя у больных после лечения. Также было установлено, что терапия больных ХАК препаратом «Габриглобин-IgG» привела к достоверному снижению ИРИ у пациентов после лечения с 2,7 [2,2-3,2] до 2,05 [1,6-2,55] (Wilcoxon test, р=0,016) и данный показатель достоверно не различался по сравнению с контрольной группой (1,8 [1,5-2,2]). При исследовании основных показателей гуморального иммунитета в группах больных ХАК до и после лечения были получены следующие результаты. Как видно из данных таблицы 11, уровни IgA, IgM, IgG не имели статистически значимых различий как между пациентами до и после лечения, так и между больными ХАК после лечения и контрольной группой. Исследование содержания общего IgE у больных ХАК после лечения по сравнению с больными до лечения не выявило статистически значимых различий. Уровень данного показателя у больных после лечения, который составил 108,0 МЕ/мл [37,0-221,0] был достоверно более высоким по сравнению с группой контроля, где данный показатель составил 21,5 МЕ/мл [12,5-34,5] (Mann-Whitney test, р=0,00017). Полученный результат свидетельствует о том, что препарат «Габриглобин-IgG» не оказывает влияние на уровень общего IgE. При сравнительной оценке уровня ЦИК у больных ХАК до и после лечения, а также между больными после лечения и контрольной группой не было выявлено статистически значимых различий. 76 Таблица 11 – Основные иммунологические показатели у больных ХАК до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» Показатель CD4+, % CD8+, % CD4/CD8 IgA, г/л IgM, г/л IgG, г/л IgE, МЕ/мл ЦИК 3%, у.е ЦИК 4%, у.е С3, мг/дл С4, мг/дл АТ к ДНК, МЕ/мл ИЛ-4, пг/мл ИЛ-10, пг/мл ИЛ-17, пг/мл ИЛ-18, пг/мл IFNγ, пг/мл Больные ХАК до лечения n=27 Mediana [LQ-UQ] 49,0 [42,0-55,0] 16,0 [13,0-20,0]* 2,7 [2,2-3,2]* 2,2 [1,3-2,6] 1,6 [1,2-2,5] 12,0 [9,0-16,0] 112,0 [65,0-249,0] 12,0 [7,0-25,0] 24,0 [18,0-43,0] 158,0 [130,0-247,0] 23,0 [22,0-31,0]* 11,2 [9,0-39,7] 0,5 [0-0,81] 0,9 [0,5-3,0] 0 [0-0,5] 79,9 [69,3-187,6] 0 [0-7,6] Больные ХАК после лечения n=27 Mediana [LQ-UQ] 47,0 [40,0-53,0]** 23,0 [20,0-26,0] 2,05 [1,6-2,55] 2,0 [1,6-2,2] 1,7 [1,25-2,3] 13,0 [9,5-16,0] 108,0 [37,0-221,0]** 16,0 [9,0-24,0] 31,0 [20,0-40,0] 173,0 [140,0-233,0]** 31,0 [22,0-43,0]** 8,15 [6,15-30,8] 0 [0-0,85]** 0 [0-4,2] 0 [0-4,2] 98,7 [77,2-118,5] 0 [0-0,9] Контрольная группа n=30 Mediana [LQ-UQ] 42,0 [38,0-46,0] 22,0 [18,0-29,0] 1,8 [1,5-2,2] 2,4 [1,5-3,1] 1,5 [0,95-1,8] 15,0 [10,6-17,0] 21,5 [12,5-34,5] 11,0 [8,0-14,0] 26,0 [21,0-33,0] 141,0 [106,0-164,0] 22,0 [18,0-29,0] 5,95 [3,7-8,5] 4,6 [0,21-5,0] 1,0 [0-3,4] 0 [0-1,0] 111,0 [60,0-121,3] 0 [0-7,0] Примечание: * – статистически значимые различия больных ХАК до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG»; ** – статистически значимые различия больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» и контрольной группы Исследование системы комплемента у больных после лечения показало, что уровни С3-компонента комплемента между больными ХАК до и после лечения достоверно не различались. Однако при сравнительном анализе данного показателя между группой больных ХАК после лечения и группой контроля, было выявлено, что у больных после лечения уровень С3-компонента комплемента составил 173,0 мг/мл [140,0-233,0], что было достоверно более высоким по сравнению с контрольной группой (141,0 мг/мл [106,0-164,0]) (MannWhitney test, р=0,0227). При анализе уровня С4-компонента комплемента, было отмечено, что данный показатель у больных ХАК до лечения – 23,0 мг/дл [22,0-31,0] достоверно повышался до 31,0 мг/дл [22,0-43,0] у больных после лечения (Wilcoxon test, р=0,04). Также, при сравнительном анализе уровня 77 С4-компонента комплемента между больными после лечения и группой контроля было выявлено, что уровень данного показателя у больных после лечения был достоверно более высоким по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы, который составил 22,0 мг/дл [18,0-29,0] (Mann-Whitney test, р=0,029). Полученные данные о более высоких уровнях С3- и С4-компонентах комплемента у больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG», можно объяснить активацией комплемента по альтернативному и классическому пути. При изучении уровня антител к нативной ДНК между больными ХАК до и после лечения не было выявлено статистически значимых различий. Однако наблюдалась тенденция к снижению данного показателя у больных после проведения лечения препаратом «Габриглобин-IgG» (8,15 МЕ/мл [6,15-30,8]) по сравнению с больными до лечения (11,2 МЕ/мл [9,0-39,7]). При анализе изучаемого показателя между группой больных ХАК после лечения и контрольной группой (5,95 МЕ/мл [3,7-8,5]) также не было выявлено достоверно значимых различий. Полученные данные свидетельствуют о том, что показатель антител к нативной ДНК у больных после проведения терапии соответствовал уровню здоровых лиц, что объясняется данными литературы о способности препарата «Габриглобин-IgG» к нейтрализации и выведению патологических аутоантител [4]. Исследование уровней ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в сыворотке крови между группами больных ХАК до и после лечения не показало статистически значимых различий. Однако, при сравнении аналогичных показателей между больными ХАК после лечения и контрольной группой было отмечено, что уровень ИЛ-4 в группе больных после лечения составил 0 пг/мл [0-0,85], что было достоверно более низким по сравнению с группой контроля, где уровень данного показателя составил 4,6 пг/мл [0,21-5,0] (Mann-Whitney test, р=0,00014). Вместе с тем, уровни ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в сыворотке крови 78 между больными после лечения и контрольной группой достоверно не различались. Таким образом, при изучении основных иммунологических показателей у больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» в сравнении с больными до лечения было выявлено повышение уровня CD8+ популяции лимфоцитов и снижение показателя ИРИ, что говорит об активации цитотоксического потенциала Т-лимфоцитов у больных ХАК после терапии. Кроме этого, было выявлено повышение С4-компонента комплемента у больных после лечения, что свидетельствует об активации комплемента по классическому пути (рисунок 8). Исследование иммунологических показателей у больных после лечения в сравнении с контрольной группой выявило повышение уровня CD4+ популяции лимфоцитов, а также показателей IgE, С3- и С4-компонентов комплемента, и снижение уровня ИЛ-4 в сыворотке крови. 79 40% * * 30% 20% 10% -40% * -50% Рисунок 8 – Динамика иммунологических показателей у больных ХАК после проведения лечения препаратом «Габриглобин-IgG» Примечание: * – достоверность различий показателей больных после лечения по сравнению с больными до лечения; по оси ординат – % отклонений от цифр группы больных до лечения IFNγ, пг/мл ИЛ-18, пг/мл ИЛ-17, пг/мл ИЛ-10, пг/мл ИЛ-4, пг/мл С4, мг/дл С3, мг/дл ЦИК 4%, у.е ЦИК 3%, у.е IgG, г/л IgM, г/л АТ к ДНК, МЕ/мл -30% IgE, МЕ/мл -20% IgA, г/л CD4/CD8 CD8+, % -10% CD4+, % 0% 80 5.4. Критерии отбора больных хронической аутоиммунной крапивницей на лечение препаратом «Габриглобин-IgG» Известно, что применение внутривенного иммуноглобулина «Габриглобин-IgG» является наиболее безопасным и эффективным методом лечения аутоиммунной крапивницы [41]. Однако критерии отбора больных ХАК на лечение данным препаратом на сегодняшний день отсутствуют. В соответствии с целью и задачами исследования, нами была проведена разработка критериев отбора больных ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG», используя данные полученные в тесте ex vivo. В работе из 27 пациентов с ХАК, которые получали лечение препаратом «Габриглобин-IgG», у 20 человек наблюдался хороший эффект от лечения, у 2 человек – удовлетворительный эффект и у 5 человек – неудовлетворительный эффект от терапии (таблица 12). Таблица 12 – Распределение больных в зависимости от эффективности лечения Показатель Эффект от лечения: Хороший Удовлетворительный Неудовлетворительный Абсолютное число % 20 2 5 74 7 19 В целом, как видно из данных таблицы 12, эффективность лечения данным препаратом, с учетом хороших (74%) и удовлетворительных результатов (7%) у больных ХАК составила 81%. Для дальнейшего исследования, нами были сформированы две группы больных ХАК. В 1 группу были включены пациенты с хорошим эффектом от лечения (20 человек), а 2 группу составили больные с неудовлетворительным эффектом от лечения (5 человек). Пациенты с удовлетворительным результатом от терапии не были включены в исследование. Далее с целью прогноза эффективности лечения в работе была проведена оценка связи эффективности терапии с полученными методом ex vivo 81 показателями спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ, а также продукции ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG у больных ХАК. Сравнительный анализ 1 и 2 групп пациентов по изучаемым показателям позволил выявить следующие особенности (таблица 13). Таблица 13 – Характеристика цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы в тесте ex vivo у больных ХАК до лечения в зависимости от эффективности терапии Показатель 1 группа n=20 ИЛ-4 сп., пг/мл ИЛ-4 инд., пг/мл ИЛ-10 сп., пг/мл ИЛ-10 инд., пг/мл ИЛ-10 (Г.1:3), пг/мл ИЛ-17 сп., пг/мл ИЛ-17 инд., пг/мл ИЛ-17 (Г.1:3), пг/мл ИЛ-18 сп., пг/мл ИЛ-18 инд., пг/мл ИЛ-18 (Г. 1:10), пг/мл IFNγ сп., пг/мл IFNγ инд., пг/мл IFNγ (Г.1:3), пг/мл 2 группа n=5 Mediana [LQ-UQ] 0,2 [0,1-0,2] 0,5 [0,2-0,5] 8,0 [0-11,1] 13,2 [7,6-17,0] 9,8 [0-16,0] 58,3 [53,0-98,1] 83,8 [62,6-107,3] 69,9[50,5-231,6] 30,9 [18,1-48,2] 31,3[16,7-45,6] 31,3 [20,0-45,3] 0 [0-2,6] 177,3 [56,1-187] 1,5 [0-10,8] Mediana [LQ-UQ] 2,4 [2,0-3,7] 3,3 [1,6-5,1]* 10,8 [8,2-30,4] 24,8 [10,0-47,9] 17,95 [12,5-37,65] 36,3 [0,75-90,05] 101,1 [20,8-102,7] 55,7 [0,65-72,0] 37,5 [19,6-64,85] 43,7[24,9-63,3] 42,7 [26,8-60,9] 32,1 [29,1-54,4]* 198,6 [85,6-537,4] 27,2 [19,6-75,3]* Примечание: * – статистически значимые различия между 1 и 2 группами больных ХАК; Используемые сокращения: сп. – спонтанная продукция; инд. – индуцированная продукция; Г. – продукция под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» Как видно из данных таблицы 13, уровень спонтанной продукции ИЛ-4 между сравниваемыми группами пациентов не имел статистически значимых различий. Однако, уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 у больных 1 группы, который составил 3,3 пг/мл [1,6-5,1] был достоверно выше по сравнению с больными 2 группы, в которой данный показатель составил 0,5 пг/мл [0,2-0,5] (Mann-Whitney test, р=0,025). Полученный результат может 82 указывать на то, что резервные возможности клеток иммунной системы к продукции ИЛ-4 у больных с хорошим эффектом от лечения выше, по сравнению с больными у которых отмечался неудовлетворительный эффект. Изучение спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-10, ИЛ-17 и ИЛ-18 клетками иммунной системы у больных 1 и 2 групп не показало достоверно значимых различий. Также не было выявлено статистически значимых различий между изучаемыми группами больных и по показателю продукции ИЛ-10, ИЛ-17 и ИЛ-18 клетками иммунной системы под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG». Однако при изучении показателей IFNγ в сравниваемых группах были выявлены следующие особенности. Как видно из данных таблицы 13, у больных 1 группы был выявлен достоверно более высокий уровень спонтанной продукции IFNγ, который составил 32,1 пг/мл [29,1-54,4] по сравнению с больными 2 группы, в которой данный показатель составил 0 пг/мл [0-2,6] (Mann-Whitney test, р=0,033). При этом уровень ФГА-индуцированной продукции IFNγ клетками иммунной системы между сравниваемыми группами пациентов достоверно не отличался. При изучении продукции IFNγ клетками под действием диагностически значимого разведения препарата «ГабриглобинIgG» (1:3) было выявлено, что у больных 1 группы уровень данного показателя, который составил 27,2 пг/мл [19,6-75,3] был достоверно более высоким по сравнению с показателем во 2 группе больных (1,5 пг/мл [0-10,8]) (MannWhitney test, р=0,042). Таким образом, сравнительный анализ показателей спонтанной и ФГАиндуцированной продукции изучаемых цитокинов клетками иммунной системы, а также их продукции под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» между 1 и 2 группами больных выявил следующие различия. В 1 группе больных отмечались достоверно более высокие уровни ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, спонтанной продукции IFNγ, а также продукции IFNγ клетками иммунной системы под 83 действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) (рисунок 9). Далее для изучаемых параметров был проведен корреляционный анализ (Spearman test) и установлена статистически значимая, прямая и сильная корреляционная связь между критерием эффективности и показателями ФГАиндуцированной продукции ИЛ-4 (R=0,7166, p=0,013), спонтанной продукции IFNγ (R=0,6456, p=0,023), а также продукции IFNγ клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «ГабриглобинIgG» (1:3) (R=0,6143, p=0,034). 35 30 25 20 15 10 5 0 ИЛ-4 инд. Хороший эффект IFNγ сп. IFNγ Г.1:3 Неудовлетворительный эффект Рисунок 9 – Достоверно значимые показатели цитокинов в тесте ex vivo между больными 1 и 2 групп Используемые сокращения: сп. – спонтанная продукция цитокинов; инд. – индуцированная продукция цитокинов; Г. – продукция цитокинов под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» Следующим этапом исследования было проведение ROC-анализа для показателей ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, спонтанной продукции IFNγ, а также продукции IFNγ под действием диагностически значимого 84 разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) с целью определения их пороговых значений. Первым шагом ROC-анализа было определение порогового значения для переменной ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4. На рисунке 10 изображены кривые распределения данного параметра для групп пациентов с хорошим и неудовлетворительным эффектом от терапии. Как видно на рисунке 10, кривая распределения пациентов по параметру ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 у больных с неудовлетворительным эффектом от лечения полностью включена в распределение пациентов с хорошим эффектом от терапии, причем у пациентов, имеющих хороший эффект от лечения, данный показатель выше. Поэтому было принято решение определить пороговое значение, выше которого располагаются значения параметра ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, характерные только для пациентов, имеющих хороший эффект от лечения. 8 неудовлетворительный эффект хороший эффект 7 Наблюдения 6 5 4 3 2 1 0 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Рисунок 10 – Распределение значений ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 в 1 (хороший эффект) и 2 (неудовлетворительный эффект) группах больных ХАК 85 На рисунке 11 изображена ROC-кривая для параметра ФГА- индуцированной продукции ИЛ-4. Полученная ROC-кривая не проходит через верхний левый угол, но находится очень близко к идеальной форме, что позволяет построить достаточно качественный классификатор диагноза по уровню параметра ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 с высокой чувствительностью и специфичностью. ИЛ-4 ФГА-инд. диагональная (базисная) линия Рисунок 11 – ROC-кривая для параметра ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 Как видно из таблицы 14 площадь под кривой для переменной ФГАиндуцированной продукции ИЛ-4 равна 0,958, что высокозначимо отличается от 0,5 (р=0,025) и свидетельствует о высокоточной классификации на основании данной переменной. Координаты кривой приведены в таблице 15. Таблица 14 – Площадь под ROC-кривой для параметра ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 95% доверительный интервал Площадь 0,958 Станд. ошибка* 0,060 нижняя граница p** 0,025 * – Непараметрические тесты ** – Нулевая гипотеза: истинная площадь под кривой = 0,5 0,000 верхняя граница 1,000 86 Таблица 15 – Координаты ROC-кривой для прогноза эффекта от лечения на основании переменной ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 Параметр ФГАиндуцированной продукции ИЛ-4 Sensitivity -0,80 0,35 1,05 1,97 2,82 4,05 4,95 6,50 8,10 9,30 1 - Specificity 1,000 1,000 0,875 0,750 0,625 0,500 0,375 0,250 0,125 0,000 1,000 0,667 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Specificity 0,000 0,333 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Sensitivity+ Specificity |SensitivitySpecificity| 1,000 1,333 1,875 1,750 1,625 1,500 1,375 1,250 1,125 1,000 1,000 0,667 0,125 0,250 0,375 0,500 0,625 0,750 0,875 1,000 Примечание: Sensitivity – чувствительность, Specificity – специфичность Как видно из таблицы 15, случай максимальной чувствительности и специфичности чувствительности теста и (max|Sensitivity+Specificity|=1,875) специфичности и баланс (min|Sensitivity-Specificity|=0,125) совпадают и поэтому пороговым значением параметра ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 следует признать 1,05 пг/мл с чувствительностью теста 87,5% и специфичностью – 100%. Следующим шагом было проведение ROC-анализа для переменной спонтанной продукции IFNγ. На рисунке 12 изображены кривые распределения данного параметра для групп пациентов с хорошим и неудовлетворительным эффектом от лечения препаратом «Габриглобин-IgG». Как видно на рисунке 12, кривая распределения пациентов по параметру спонтанной продукции IFNγ с неудовлетворительным эффектом от лечения полностью включена в распределение пациентов с положительным эффектом и область пересечения данных кривых достаточно узкая. Это свидетельствует о возможности построения удачного классификатора с высоким уровнем чувствительности и специфичности. 87 40 неудовлетворительный эффект хороший эффект 35 Наблюдения 30 25 20 15 10 5 0 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Рисунок 12 – Распределение значений спонтанной продукции IFNγ в 1 (хороший эффект) и 2 (неудовлетворительный эффект) группах больных ХАК Как следует из рисунка 13, полученная ROC-кривая не проходит через верхний левый угол, но находится очень близко к идеальной форме, что позволяет построить достаточно качественный классификатор диагноза по уровню параметра спонтанной продукции IFNγ с высокой чувствительностью и специфичностью. IFNγ спонт. диагональная (базисная) линия Рисунок 13 – ROC-кривая для параметра спонтанной продукции IFNγ 88 Как видно из таблицы 16, площадь под кривой для переменной спонтанной продукции IFNγ равна 0,926, что значимо отличается от 0,5 (р = 0,033) и свидетельствует о достаточно точной классификации на основании данной переменной. Координаты кривой приведены в таблице 21. Таблица 16 – Площадь под ROC-кривой для параметра спонтанной продукции IFNγ 95% доверительный интервал Площадь Станд. ошибка* 0,926 нижняя граница p** 0,081 0,033 верхняя граница 0,000 1,000 * – Непараметрические тесты ** – Нулевая гипотеза: истинная площадь под кривой = 0,5 Как видно из таблицы 17, случай максимальной чувствительности и специфичности теста чувствительности и (max|Sensitivity+Specificity|=1,889) специфичности и баланс (min|Sensitivity-Specificity|=0,111) совпадают. Поэтому нами было определено, что пороговым значением параметра спонтанной продукции IFNγ будет являться 15,85 пг/мл с чувствительностью теста 88,9% и специфичностью – 100%. Таблица 17 – Координаты ROC-кривой для прогноза эффекта от лечения на основании переменной спонтанной продукции IFNγ Параметр спонтанной продукции IFNγ -1,00 1,30 15,85 29,50 30,90 32,10 32,95 44,00 56,30 235,55 413,90 Sensitivity 1,000 0,889 0,889 0,778 0,667 0,556 0,444 0,333 0,222 0,111 0,000 1 - Specificity 1,000 0,333 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Specificity 0,000 0,667 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Sensitivity+ Specificity 1,000 1,556 1,889 1,778 1,667 1,556 1,444 1,333 1,222 1,111 1,000 Примечание: Sensitivity – чувствительность, Specificity – специфичность |SensitivitySpecificity| 1,000 0,222 0,111 0,222 0,333 0,444 0,556 0,667 0,778 0,889 1,000 89 В заключении был проведен ROC-анализ для переменной продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3). На рисунке 14 изображены кривые распределения данного параметра для групп пациентов с хорошим и неудовлетворительным эффектом от терапии. 5 неудовлетворительный эффект хороший эффект Наблюдения 4 3 2 1 0 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Рисунок 14 – Распределение значений продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) в 1 (хороший эффект) и 2 (неудовлетворительный эффект) группах больных ХАК Как следует из рисунка 14, кривая распределения пациентов по данному параметру у больных с неудовлетворительным эффектом от лечения препаратом «Габриглобин-IgG» полностью включена в распределение пациентов с положительным эффектом от терапии. Также нами было отмечено, что у пациентов, имеющих хороший эффект от терапии, данный показатель выше. Поэтому было проведено определение порогового значения для показателя продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3), выше которого располагаются значения характерные для пациентов, имеющих хороший эффект от лечения. Как следует из рисунка 15, полученная ROC-кривая не проходит через верхний левый угол, но находится очень близко к идеальной форме, что 90 позволяет построить достаточно качественный классификатор диагноза по уровню параметра продукции IFNγ с диагностически значимым разведением препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) с высокой чувствительностью и специфичностью. IFNγ Г.1:3 диагональная (базисная) линия Рисунок 15 – ROC-кривая для параметра продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) Как видно из таблицы 18 площадь под кривой для данной переменной равна 0,907, что значимо отличается от 0,5 (р=0,042) и свидетельствует о достаточно точной классификации на основании данной переменной. Таблица 18 – Площадь под ROC-кривой для параметра IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) 95% доверительный интервал Площадь 0,907 Станд. ошибка * 0,093 нижняя граница ** p 0,042 * – Непараметрические тесты ** – Нулевая гипотеза: истинная площадь под кривой = 0,5 0,000 верхняя граница 1,000 91 Как видно из таблицы 19, случай максимальной чувствительности и специфичности теста чувствительности и (max|Sensitivity+Specificity|=1,889) специфичности и баланс (min|Sensitivity-Specificity|=0,111), аналогично для показателя спонтанной продукции IFNγ совпадают, поэтому пороговым значением параметра продукции IFNγ с диагностически значимым разведением препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) следует признать 15,20 пг/мл с чувствительностью теста 88,9% и специфичностью – 100%. Таблица 19 – Координаты ROC-кривой для прогноза эффекта от лечения на основании переменной IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) Параметр IFNγ Г. 1:3 -1,00 0,75 6,15 15,20 21,00 22,75 27,20 33,20 55,20 101,35 154,00 181,60 Sensitivity 1,000 0,889 0,889 0,889 0,778 0,667 0,556 0,444 0,333 0,222 0,111 0,000 1 - Specificity 1,000 0,667 0,333 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Specificity 0,000 0,333 0,667 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Sensitivity+ Specificity |SensitivitySpecificity| 1,000 1,222 1,556 1,889 1,778 1,667 1,556 1,444 1,333 1,222 1,111 1,000 1,000 0,556 0,222 0,111 0,222 0,333 0,444 0,556 0,667 0,778 0,889 1,000 Примечание: Г. – продукция под действием препарата «Габриглобин-IgG»; Sensitivity – чувствительность, Specificity – специфичность. Таким образом, нами были выявлены критерии отбора пациентов с ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG». Данными критериями явились: 1. Уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 более 1,05 пг/мл; 2. Уровень спонтанной продукции IFNγ более 15,85 пг/мл; 3. Уровень продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) не менее 15,20 пг/мл. 92 Подводя итог главы, следует отметить, что для назначения пациентам с ХАК терапии препаратом «Габриглобин-IgG» необходимо проводить постановку теста ех vivo, с определением уровня ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, спонтанной продукции IFNγ, а также продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3). Хорошую эффективность лечения можно прогнозировать в 77,8% случаев при специфичности совокупности тестов 100,0%, если у пациента уровень ФГА-индуцированной ИЛ-4 будет больше 1,05 пг/мл, уровень спонтанной продукции IFNγ больше 15,85 пг/мл, а уровень продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) составит не менее 15,20 пг/мл. 93 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проблема хронической крапивницы (ХК) до настоящего времени остается одной из сложнейших в клинической аллергологии. По данным литературы распространенность ХК колеблется от 0,1 до 5 % в популяции [6,23]. Среди всех форм ХК наиболее сложной является аутоиммунная форма, которая составляет в ее структуре 30-50% и характеризуется длительным и упорным течением, а также малой эффективностью традиционными методами лечения [24,74]. Патогенетические механизмы хронической аутоиммунной крапивницы (ХАК) являются сложными и изучены недостаточно. Известно, что в основе патогенеза заболевания лежит образование аутоантител, которые способны активировать тучные клетки и базофилы и вызывать их дегрануляцию [15,155]. Также при формировании аутоиммунного процесса развиваются различные дефекты иммунной системы, которые могут выражаться в гиперактивации Т- и В-систем иммунитета, активации систем свертывания крови, компонентов комплемента, дисбалансе системы цитокинов. Однако до настоящего времени, иммунологические механизмы патогенеза ХАК с участием цитокинов остаются малоизученными. Имеются единичные публикации по изучению ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN-γ в сыворотке крови у больных ХАК, которые являются противоречивыми и не дают полного представления о цитокиновой регуляции при данном заболевании [7,164,165]. В последнее время одним из перспективных методов изучения цитокинов является исследование их продукции клетками иммунной системы в тестах ex vivo. Данные тесты позволяют дать оценку цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы, а также использовать их для изучения влияния фармакологических препаратов, с целью назначения терапии больным. В нашей стране и за рубежом, актуальным является персонализированный подход в лечении больных с той или иной патологией, который позволяет подобрать терапию каждому пациенту индивидуально. И для этой цели с 94 успехом используются тесты ex vivo, которые позволяют создать лабораторную модель, соответствующую условиям in vivo, для оценки эффективности лечения фармакологическими препаратами. В настоящее время одним из безопасных и эффективных методов терапии больных ХАК является лечение ВВИГ, которое направлено на патогенетические механизмы данного заболевания. Одним из таких препаратов является отечественный препарат «Габриглобин-IgG», высокая эффективность которого была доказана в ряде исследований [13,41]. В связи с вышесказанным целью настоящего исследования явилась оценка цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы у больных с аутоиммунной формой хронической крапивницы и определение ее роли в оптимизации лечения препаратом «Габриглобин-IgG». В работе было проведено комплексное аллерго-иммунологическое обследование 120 пациентов с ХК в возрасте от 18 до 60 лет, из которых пациенты с ХАК составили 100 человек (основная группа) и пациенты с ХИК – 20 человек (группа сравнения). В качестве контрольной группы было обследовано 30 практически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой. Из 100 пациентов с диагнохом ХАК, 27 пациентам было проведено лечение препаратом ««Габриглобин-IgG» в дозе 2,5 грамма в сутки (0,03-0,04 г/кг веса) в течение 4 дней дополнительно к базисному лечению. Клиническую эффективность терапии оценивали по разработанной 4-х бальной шкале [13]. Аллергологическое обследование пациентов включало постановку кожных проб с аутосывороткой и определение общего IgЕ. Внутрикожные пробы с аутосывороткой выполнялись по методу М.Hide [119]. Пациентам с диаметром пробы 7 мм и более ставили диагноз ХАК. Пациентов, которые давали отрицательную пробу с аутосывороткой, относили в группу с ХИК [13]. Определение уровня общего IgE в сыворотке крови проводилось методом ИФА. 95 Иммунологическое обследование больных включало исследование показателей клеточного иммунитета – CD4+ и CD8+ популяций лимфоцитов – методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител. Для оценки гуморального иммунитета было проведено исследование уровней сывороточных иммуноглобулинов классов А, M, G с помощью метода Mancini [143] и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) методом осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) по методу V. Haskova [116]. Система комплемента оценивалась по уровню С3- и С4компонентов в сыворотке крови имунотурбидиметрическим методом. Оценка уровня антител к нативной ДНК проводилась в сыворотке крови методом ИФА. Изучение цитокинового профиля осуществлялось по трём направлениям. Первое направление включало изучение методом ex vivo спонтанной и ФГАиндуцированной продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы [31]. Второе направление заключалось в количественной оценке продукции ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы под действием диагностически значимых разведений препарата «ГабриглобинIgG» в тесте ex vivo. Диагностически значимые разведения препарата отрабатывались на клетках иммунной системы контрольной группы в тесте ex vivo c использованием разведений препарата 1:1, 1:3, 1:10. Третье направление заключалось в количественной оценке показателей ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в сыворотке крови в изучаемых группах. Определение концентрации цитокинов осуществлялось методом ИФА. Статистический анализ полученных результатов проводился с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0», а также с применением программы SPSS для ROC-анализа. Важным индуцированной разделом работы было изучение спонтанной и ФГА- продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN-γ клетками иммунной системы у больных ХАК по сравнению с контрольной группой. При этом было отмечено, что у пациентов с ХАК наблюдалось достоверно значимое 96 повышение спонтанной продукции ИЛ-4 клетками иммунной системы, что объясняется активацией Th2- популяции лимфоцитов при аутоиммунных заболеваниях и согласуется с данными ряда авторов [61,169]. Кроме того, полученные результаты согласуются с данными литературы о повышенном содержании ИЛ-4 у больных ХАК [104]. Однако имеется работа, в которой авторами не было найдено повышения уровня ИЛ-4 у данных больных [165]. Самые значительные изменения у пациентов касались показателей ИЛ-17. Так, у больных ХАК было выявлено повышение спонтанной и ФГАиндуцированной продукции ИЛ-17 по сравнению с контрольной группой, что свидетельствовало о повышенной продукции данного цитокина клетками иммунной системы. Полученные в работе результаты по показателям ИЛ-17 согласуются с данными литературы, в которых авторы указывают на ключевую роль ИЛ-17 в патогенезе аутоиммунных заболеваний, а также о повышении его уровня у больных ХАК по сравнению со здоровыми людьми [79]. Учитывая участие ИЛ-18 в патогенезе ХАК, нас интересовал вопрос изучения его показателей у пациентов по сравнению с контрольной группой. В результате было выявлено, что уровни спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-18 у больных ХАК были значительно снижены по сравнению с контрольной группой. Имеющиеся в литературе данные по уровню ИЛ-18 у больных ХАК немногочисленны и касаются его содержания в сыворотке крови. Авторами отмечается, что уровень ИЛ-18 в сыворотке крови в группе больных ХАК и контрольной группе не различался и зависел только от тяжести заболевания [164]. Кроме перечисленных цитокинов ключевую роль в механизмах патогенеза ХАК играет IFNγ, так как известно, что его повышенный уровень может вызывать запуск аутоиммунных процессов в организме [169]. Поэтому было важно провести изучение показателей продукции IFNγ клетками иммунной системы у больных ХАК. В результате было получено значительное повышение его спонтанной и ФГА-индуцированной продукции у пациентов по 97 сравнению с контрольной группой. Данные результаты свидетельствуют об активации аутоиммунного процесса у больных ХАК. Подобных исследований по определению спонтанной и ФГА-индуцированной продукции IFNγ клетками иммунной системы у больных ХАК проведено не было, однако в литературе имеются работы, где авторы также указывают на повышение его уровня в сыворотке крови у пациентов с ХАК по сравнению со здоровыми людьми [33,182]. По данным других исследований уровень IFNγ у больных ХК не отличался от показателей здоровых лиц [106]. Таким образом, полученные в работе методом ex vivo результаты по спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ключевых цитокинов констатируют одновременную активацию Th1 (IFNγ), Th2 (ИЛ-4) и Th17 (ИЛ-17) – популяций Т-лимфоцитов при ХАК, что свидетельствует о разбалансировке хелперных клонов Т-лимфоцитов [66]. Аналогичные результаты были получены в ряде работ, в которых авторы также отмечали одновременную активацию Th1- и Th2- популяций лимфоцитов при аутоиммунных заболеваниях [61,169]. Для оптимизации терапии препаратом «Габриглобин-IgG» нас также интересовал вопрос о влиянии данного препарата на продукцию ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы у больных ХАК в тесте vivo. С этой целью нами были подобраны диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG», которые в дальнейшем использовались при постановке теста ex vivo с клетками больных ХАК. Данные разведения препарата «Габриглобин-IgG» подбирались опытным путем на клетках иммунной системы контрольной группы. Критерием для выбора диагностически значимых разведений препарата служил максимальный процент здоровых людей, у которых наблюдалась высокая выработка изучаемых цитокинов. По результатам проведенной работы, диагностически значимыми разведениями препарата «Габриглобин-IgG» для выработки ИЛ-10, ИЛ-17, IFNγ оказалось разведение 1:3 и для выработки ИЛ-18 – 1:10. 98 Данные разведения 1:3 и 1:10 были взяты в работу по изучению влияния препарата «Габриглобин-IgG» на продукцию ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы у больных ХАК в тесте vivo. По результатам изучаемого теста нами было выявлено, что у больных ХАК под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) происходило повышение продукции ИЛ-17 клетками иммунной системы и снижение продукции IFNγ по сравнению с контрольной группой. Полученные данные указывают на целенаправленное действие препарата «ГабриглобинIgG» на Th17- и Th1-популяции лимфоцитов больных ХАК в тесте ex vivo. Также в соответствии с задачами настоящего исследования для выявления иммунных нарушений у пациентов были изучены основные показатели клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента, а также показатели цитокинов в сыворотке крови в сравнении с контрольной группой. Кроме того, нас интересовал вопрос отличия иммунологических параметров у пациентов с ХАК, имеющих положительную пробу с аутосывороткой от больных ХИК, имеющих отрицательную пробу. С этой целью нами было проведено исследование перечисленных основных показателей иммунитета между больными ХАК и ХИК, а также между больными ХИК и контрольной группой. Исследование клеточного иммунитета показало, что у пациентов с ХАК наблюдался повышенный уровень CD4+ популяции лимфоцитов по сравнению с контрольной группой и сниженный уровень CD8+ популяций лимфоцитов по сравнению с контрольной группой и больными ХИК. Полученные данные согласуются с данными литературы и свидетельствуют о том, что только при аутоиммунной форме ХК происходит дисбаланс в основных популяциях клеточного иммунитета [121,176]. При изучении показателей гуморального иммунитета у больных ХАК было выявлено достоверное повышение уровня общего IgE по сравнению с контрольной группой. Данные результаты согласуются с данными Сигбатуллиной Н.А. и соавторов, которые отмечали повышенный уровень IgE у 99 68% больных ХАК [53]. Однако другие авторы отмечали более низкий уровень IgE у больных с данной патологией [73,121]. По-видимому, противоречивые результаты по данному показателю могут быть связаны с наличием атопического механизма у ряда больных ХАК, который не учитывался большинством исследователей. В тоже время при сравнении больных ХАК и ХИК по данному показателю не было выявлено достоверно значимых различий. Повышенный уровень IgE у больных ХИК по сравнению с контрольной группой также был получен рядом авторов [153,183]. Исследование системы комплемента позволило выявить достоверное повышение уровня С3-компонента комплемента у больных ХАК по сравнению с контрольной группой и больными ХИК, что объясняется активацией комплемента по альтернативному пути под действием иммунных комплексов, содержащих IgE [66]. Аналогичные результаты были отмечены в работе Орловой Е.А. [46]. Однако другие авторы наоборот выявили снижение уровня C3-компонента комплемента у больных с данной патологией [184]. Такие разнонаправленные результаты по данному показателю у больных ХАК можно объяснить различиями в тяжести процесса и периодом обследования больных. В настоящее время доказана роль антител к нативной ДНК в качестве специфического маркера аутоиммунного процесса, вследствие чего вопрос изучения данного показателя у больных ХАК в сравнении с группой контроля представлялся интересным. При этом было выявлено, что у больных ХАК данный показатель был достоверно более высоким по сравнению с контрольной группой. Полученные результаты согласуются с данными литературы о повышенном уровне антител к нативной ДНК у больных ХАК, что служит доказательством наличия аутоиммунного процесса при данном заболевании [12]. При изучении цитокинов в оценке иммунного статуса, было проведено определение уровней ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в сыворотке крови у больных ХАК по сравнению с контрольной группой и больными ХИК. В ходе работы у больных ХАК был выявлен более низкий уровень ИЛ-4 по сравнению 100 с показателями контрольной группы. Однако достоверного отличия по данному показателю между больными ХАК и ХИК выявлено не было. Снижение данного показателя у больных ХАК было показано в работе Santos J.C. и соавторов [165]. Однако другие авторы отмечали повышение уровня ИЛ-4 у больных с данной патологией [104]. При изучении уровня ИЛ-10 в сыворотке крови у больных ХАК в сравнении с группой контроля не было получено достоверных различий. Однако существенные различия были получены при сравнении данного показателя между больными ХАК и ХИК. При этом был выявлен достоверно более низкий уровень данного показателя у больных ХАК. Однако в имеющейся литературе авторы указывают на его повышение у больных ХАК [7]. Также имеется работа, в которой авторы показывают более высокий уровень ИЛ-10 у больных ХАК по сравнению с больными ХИК [165]. Данное расхождение результатов можно объяснить тем, что в работах не учитывалась длительность заболевания. Так как на начальных этапах развития ХАК происходит снижение уровня ИЛ-10, это способствует прогрессированию аутоиммунного процесса. При изучении показателя ИЛ-10 у больных ХИК по сравнению с контрольной группой был выявлен значительно более высокий уровень данного показателя у больных, что может свидетельствовать о возможном его участии в патогенетических механизмах ХИК и согласуется с данными литературы [109]. При изучении уровня ИЛ-18 в сыворотке крови у больных ХАК в сравнении с контрольной группой не было выявлено достоверных различий. В некоторых источниках литературы также было показано, что его уровень не различался со здоровыми людьми и коррелировал только с тяжестью заболевания [134,173]. Другие авторы указывали на более низкий уровень данного цитокина в сыворотке крови у больных ХАК [137]. В то же время, при проведении анализа по данному показателю у больных ХАК в сравнении с больными ХИК, было выявлено, что уровень ИЛ-18 у больных ХАК оказался 101 достоверно более низким. Аналогичные результаты по данному показателю были получены в работе Puxeddu I. и соавторов [162]. Известно, что ИЛ-18 является непосредственным фактором высвобождающим гистамин. Кроме того, доказана его роль не только в аутоиммунном, но и в противоинфекционном иммунитете. Поэтому полученный результат о более высоком уровне ИЛ-18 у больных ХИК по сравнению с больными ХАК может свидетельствовать о возможном участии инфекционных агентов в патогенезе ХИК. Обобщая результаты изучения цитокинов в сыворотке крови у больных ХАК по сравнению с контрольной группой можно констатировать, что изменения были выявлены только по показателю ИЛ-4, что не отражает аутоиммунный механизм заболевания. Поэтому на наш взгляд, определение уровня цитокинов в сыворотке крови у больных ХАК, не является достаточно информативным по сравнению с методом ex vivo. Таким образом, выявленные в работе нарушения в иммунологических параметрах у больных ХАК по сравнению с контрольной группой характеризовались повышением уровня CD4+ популяции лимфоцитов, с одновременным снижением уровня CD8+ популяции лимфоцитов, а также повышением уровней IgE, С3-компонента комплемента, антител к нативной ДНК, снижением показателя ИЛ-4 в сыворотке крови, что указывает на ведущий аутоиммунный механизм у больных ХАК. В то же время у больных ХИК отмечались другие иммунные нарушения, которые характеризовались повышенным уровнем IgE, сниженным уровнем ИЛ-4 и повышенным уровнем ИЛ-10. Полученные результаты доказывает, что иммунные нарушения у больных ХАК и ХИК носят различный характер (схема 1). 102 Схема 1 – Различия в иммунологических показателях у больных ХАК и ХИК N – показатели в пределах значений контрольной группы; ↓ – снижение показателей; ↑ – повышение показателей 103 С целью оценки влияния препарата «Габриглобин-IgG» на цитокинпродуцирующую способность клеток иммунной системы больных ХАК после терапии было проведено изучение спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в тесте ex vivo у больных ХАК до и после лечения, в сравнении с контрольной группой. В результате было выявлено, что у больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» происходило повышение ФГА-индуцированной продукции ИЛ-10. Аналогичное изменение было получено у больных ХАК по сравнению с группой контроля. Однако в ряде работ, авторами было показано снижение уровня ИЛ-10 в сыворотке крови у больных ХК после проведения иммунотерапии, в связи с чем, делается вывод, что снижение уровня данного цитокина у больных ХК после лечения является хорошим прогностическим признаком эффективности терапии [137,180]. Такая несопоставимость результатов может объясняться определением уровня ИЛ-10 в различных биологических жидкостях и различием в проводимой иммунотерапии. Первоначально в работе было доказано участие ИЛ-17 в патогенезе ХАК, следовательно, нас интересовал вопрос возможного влияния препарата «Габриглобин-IgG» на показатели ИЛ-17 у больных ХАК после терапии. Так, в ходе работы было получено снижение спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-17, которые были значительно повышены у больных до лечения. Данные показатели у больных после проведенной терапии, тем не менее, превышали уровень показателей у здоровых людей. Следовательно, лечение препаратом «Габриглобин-IgG» способствует снижению уровня ИЛ-17, не решая вопрос его нормализации у больных ХАК. В то же время при изучении показателей IFNγ в тесте ex vivo было выявлено, что у пациентов после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» происходило значительное снижение ФГА-индуцированной продукции данного цитокина, которая была повышена у больных до лечения. В результате, уровень IFNγ у больных после терапии становился в 2 раза ниже по сравнению с 104 контрольной группой. При этом показатель спонтанной продукции IFNγ у больных ХАК после лечения имел тенденцию к снижению. В связи с этим, полученные в работе данные по снижению показателей IFNγ могут свидетельствовать о снижении активности аутоиммунного процесса в целом после проведения лечения препаратом «Габриглобин-IgG». На основании полученных результатов можно судить о достаточно сильном воздействии препарата «Габриглобин-IgG» на показатели ИЛ-10, IFNγ и ИЛ-17, в результате которого происходит регуляция Th-взаимодействия у больных ХАК. С целью оптимизации терапии препаратом «Габриглобин-IgG» был проведен сравнительный анализ продукции ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы в тесте ex vivo c диагностически значимыми разведениями препарата «Габриглобин-IgG» у больных ХАК до и после лечения, а также у больных после лечения и контрольной группы. При этом отмечалась интересная закономерность. Уровень ИЛ-17 у больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» достоверно снижался, но оставался более высоким по сравнению с контрольной группой. Однако показатель IFNγ у пациентов достоверно не изменялся после терапии и оставался на более низком уровне по сравнению с группой контроля. Полученные данные можно объяснить тем, что препарат «Габриглобин-IgG» оказывал воздействие на Th1популяцию лимфоцитов у больных ХАК, значительно снижая повышенные показатели IFNγ после терапии, в связи с чем, нами не было выявлено достоверных изменений продукции данного цитокина под действием диагностически значимого разведения данного препарата в тесте ex vivo. Однако, несмотря на то, что продукция ИЛ-17 клетками иммунной системы у больных после лечения не снижалась до значений контрольной группы, тем не менее, дополнительная нагрузка на клетки данным препаратом в тесте ex vivo приводила к снижению показателей ИЛ-17. 105 С целью определения точек воздействия препарата «Габриглобин-IgG» было проведено изучение основных иммунологических показателей у больных ХАК после лечения в сравнении с больными до лечения, а также с контрольной группой. В результате, у больных после терапии было выявлено достоверное повышение уровня CD8+ популяции лимфоцитов, который был снижен у больных ХАК до лечения. Данный показатель у больных после лечения соответствовал показателю контрольной группы, что свидетельствовало о его нормализации. Полученные результаты указывают на активацию цитотоксического потенциала Т-лимфоцитов у больных ХАК после терапии препаратом «Габриглобин-IgG» и согласуются с данными литературы [4]. Также было отмечено, что показатели С4-компонента комплемента у больных ХАК до лечения, становились повышенными у больных после терапии. Полученный результат свидетельствует об активации комплемента по классическому пути, однако объяснения данного феномена в литературе не было найдено, в связи с чем, данный вопрос требует дальнейшего изучения. Кроме того, было выявлено, что достоверно более высокий уровень антител к нативной ДНК у больных ХАК до лечения снижался до значений контрольной группы после проведения терапии, что может указывать на уменьшение аутоиммунного воспаления у пациентов, и объясняется данными литературы о способности препарата «Габриглобин-IgG» к нейтрализации и выведению патологических аутоантител [3]. Анализ показателей гуморального иммунитета и ключевых цитокинов в сыворотке крови не выявил статистически значимых изменений у больных после проведения терапии. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что наибольшее влияние препарат «Габриглобин-IgG» оказывал на клеточное звено иммунитета, регулируя соотношение CD4+/CD8+ популяций лимфоцитов, а также показатели антител к нативной ДНК, тем самым снижая уровни маркеров аутоиммунного процесса. Однако данный препарат вызывал повышение уровня С4-компонента комплемента у больных ХАК. 106 Заключительным разделом работы было выявление критериев отбора больных ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG». С этой целью нами была проведена оценка эффективности терапии у 27 пациентов с ХАК. Было выявлено, что у 20 человек (74%) наблюдался хороший эффект от лечения, у 2 человек (7%) – удовлетворительный эффект и у 5 человек (19%) – неудовлетворительный эффект от терапии. В целом, эффективность лечения данным препаратом с учетом хороших и удовлетворительных результатов у больных ХАК составила 81%. Для дальнейшего исследования, нами были сформированы две группы больных ХАК. В 1 группу нами были включены пациенты с хорошим эффектом от лечения (20 человек), а 2 группу составили больные с неудовлетворительным эффектом (5 человек). Далее с целью прогноза эффективности лечения в работе была проведена оценка связи эффективности терапии с полученными методом ex vivo показателями спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ, а также продукции ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG у больных ХАК. При сравнительном анализе больных ХАК 1 и 2 групп, было выявлено, что в 1 группе больных наблюдалось повышение ФГА- индуцированной продукции ИЛ-4, спонтанной продукции IFNγ и продукции IFNγ клетками имунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3). Далее для параметров ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, спонтанной продукции IFNγ и продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) был проведен ROCанализ и определены их пороговые значения, на основании которых можно будет сделать прогноз, хороший или неудовлетворительный эффект от лечения окажет применяемая терапия. 107 Таким образом, нами были выявлены критерии отбора пациентов с ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG». Данными критериями явились: 1. Уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 более 1,05 пг/мл; 2. Уровень спонтанной продукции IFNγ более 15,85 пг/мл; 3. Уровень продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) не менее 15,20 пг/мл. Исходя из полученных результатов, мы можем рекомендовать для назначения пациентам с ХАК терапии препаратом «Габриглобин-IgG» проводить постановку теста ех vivo, с определением уровня ФГА- индуцированной продукции ИЛ-4, спонтанной продукции IFNγ, а также продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3). Хорошую эффективность лечения можно прогнозировать в 77,8% случаев при специфичности совокупности тестов 100,0%, если у пациента уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 будет больше 1,05 пг/мл, уровень спонтанной продукции IFNγ больше 15,85 пг/мл, а уровень продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) составит не менее 15,20 пг/мл. ВЫВОДЫ 1. С помощью теста ex vivo выявлено повышение спонтанной продукции ИЛ-4, спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-17 и IFNγ, а также снижение спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы у больных ХАК. 2. Диагностически значимое разведение препарата «Габриглобин-IgG» для выработки ИЛ-10, ИЛ-17, IFNγ клетками иммунной системы составило 1:3 и для выработки ИЛ-18 – 1:10. 108 3. Показано повышение продукции ИЛ-17 и снижение продукции IFNγ клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) в тесте ex vivo у больных ХАК. 4. Сравнительный анализ иммунологических показателей у больных ХАК и ХИК по сравнению с показателями контрольной группы показал повышение уровней CD4+ популяции лимфоцитов, показателей общего IgE, С3-компонента комплемента, антител к нативной ДНК, а также снижение уровней CD8+ популяции лимфоцитов и ИЛ-4 в сыворотке крови у больных ХАК. У больных ХИК изменения иммунологических показателей характеризовались повышением общего IgE и ИЛ-10, а также снижением ИЛ-4. 5. Лечение препаратом «Габриглобин-IgG» способствовало повышению индуцированной продукции ИЛ-10, снижению спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-17 и индуцированной продукции IFNγ клетками иммунной системы, повышению уровня CD8+ популяции лимфоцитов, а также нормализации соотношения CD4+/CD8+ популяций лимфоцитов и показателей антител к нативной ДНК у больных ХАК. 6. Диагностически значимыми критериями отбора больных ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG», полученными в тесте ex vivo, являются: уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 более 1,05 пг/мл, уровень спонтанной продукции IFNγ более 15,85 пг/мл, уровень продукции IFNγ под действием диагностически значимого «Габриглобин-IgG» (1:3) не менее 15,20 пг/мл. разведения препарата 109 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для выявления нарушений в системе цитокинов у больных ХАК предпочтительней является определение их уровня в спонтанном и индуцированном супернатанте клеток иммунной системы в тесте ex vivo, а не в сыворотке крови. 2. Для назначения терапии препаратом «Габриглобин-IgG» больным ХАК рекомендуется проводить постановку теста ех vivo с определением уровня ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, спонтанной продукции IFNγ, а также продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3), и руководствоваться разработанными критериями отбора больных. ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ Существует несколько актуальных направлений дальнейшей разработки темы. Во-первых, доказанная применения теста ex vivo в настоящем для изучения исследовании цитокинов и значимость выявления иммунологических критериев отбора больных ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG» служит перспективой для дальнейшей работы в указанном направлении, включая широкое внедрение данного метода в лабораторную и медицинскую практику и для назначения других фармакологических препаратов пациентам. Во-вторых, актуальным является изучение Т-регуляторных клеток при ХАК, а именно, исследование транскрипционного фактора FOXP3 и связанного с ним генетического полиморфизма значимых цитокинов. Данное направление может открыть новые возможности в понимании патогенетических механизмов аутоиммунной формы хронической крапивницы. 110 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АКТГ адренокортикотропный гормон ВВИГ внутривенный иммуноглобулин ГКС глюкокортикостероиды ЖКТ желудочно-кишечный тракт ИКК иммунокомпетентные клетки ИЛ интерлейкин ИРИ иммунорегуляторный индекс ИФА иммуноферментный анализ ЛПС липополисахарид ОРВИ острая респираторная вирусная инфекция ПЭГ полиэтиленгликоль ТПО тиреоидная пероксидаза ФГА фитогемагглютинин ФИТЦ флюоросцеинизотиацианат ФНО фактор некроза опухолей ХАК хроническая аутоиммунная крапивница ХИК хроническая идиопатическая крапивница ХК хроническая крапивница ЦИК циркулирующие иммунные комплексы CD кластер дифференцировки Ig иммуноглобулин INF интерферон SP-рецептор рецептор к субстанции Р Th 1 Т-хелперы первого типа Th 2 T-хелперы второго типа TNF тумор-некротизирующий фактор Tr1 Т-регуляторные клетки 111 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Агаева, Е.В. Ингибирующие эффекты мезенхимных стромальных клеток на хемилюминисценцию макрофагов при аллогенном и ксеногеном сокультивировании in vitro / Е.В. Агаева, В.Н. Петров, А.Г. Коноплянников, О.А. Коноплянникова, Е.В. Саяпина, Л.А. Лепехина, С.Ш. Кальсина, И.В. Семенкова // Аллергология и иммунология. – 2011. – Т. 12, №2. – С. 205206. 2. Алешина, Р.М. Паразитарная крапивница / Р.М. Алешина, В.В. Лейкина // Клиническая иммунология. Аллергология. Инфектология. – 2011. – №2. – С.11-19. 3. Алёшкин, В.А. Клиническое применение иммуноглобулина для внутривенного введения Габриглобин: пособие для врачей / В.А. Алёшкин, А.Г. Лютов – М.: Медицина, 2006. – 20 с. 4. Алёшкин, В.А. Иммуноглобулиновые препараты и их иммуно- модулирующее действие / В.А. Алёшкин, А.Г. Лютов, Л.И. Новикова, И.В. Борисова, О.М. Кострова, О.М. Волков // Современные представления об иммунокоррекции: материалы Всероссийской научно-практической конференции – Пенза. – 2008. – С. 11-15. 5. Андриеш, Л.П. Перспективы лечения ассоциированных форм хронической рецидивирующей крапивницы и хронического гепатита с использованием иммуномодуляторов / Л.П. Андриеш, В.А. Думбрава, Д.В. Барба // Аллергология и иммунология. 2007. – Т. 8, №2. – С. 205-206. 6. Астафьева, Н.Г. Крапивница и ангиоотек: рекомендации для практических врачей. Российский национальный согласительный документ (часть 1) / Н.Г. Астафьева, Е.Ю. Борзова, Л.А. Горячкина, И.В. Данилычева, А.В. Емельянов, Н.Г. Кочергин, Л.В. Лусс, Р.Я. Мешков, К.Н. Монахов, А.Н. Пампура, В.А. Ревякина, И.В. Сидоренко, Г.И. Смирнова, Е.С. Феденко, Г.И. Цывкин // Российский аллергологический журнал. – 2008. – №3. – С. 36-42. 112 7. Баранова Н.И. Сравнительная характеристика цитокинового профиля у больных с аутоиммунной и инфекционной формами крапивницы / Н.И. Баранова, Е.А. Орлова, Л.А. Ащина, С.В. Коженкова // Аллергология и иммунология. – 2012. – Т. 13, №1. – С. 34. 8. Барба, Д.В. Особенности клинико-иммунологического течения хронической рецидивирующей крапивницы, ассоциированной с хроническим гепатитом / Д.В. Барба, Ю.А. Лупашко, Л.П. Андриеш, Е.С. Березовская // Аллергология и иммунология. – 2011. – Т. 12, №3. – С. 245-246. 9. Барейчева, О.А. Оценка эффективности различных методов диагностики инфекции Helicobacter pylory у больных с хронической крапивницей / О.А. Барейчева, О.В. Скороходкина, Л.Г. Морозова // Российский аллергологический журнал. – 2011. – №4. – С. 41-42. 10. Барышников, А.Ю. Сравнительное исследование иммуногенности противоопухолевых вакцин на основе дендритных клеток и дендритом in vitro / А.Ю. Барышников, К.Д. Никитин, А.Н. Никифорова, М.В. Рубцова // Аллергология и иммунология. – 2009. – Т. 10, №3. – С. 361-363. 11. Батуро, А.П. Микробиоценоз носоглотки больных, страдающих крапивницей / А.П. Батуро, Э.Е. Романенко, М.А. Мокроносова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2006. – № 1. – С. 8285. 12. Бездетко, Т.В. Хроническая крапивница как проявление аутоиммунного синдрома / Т.В. Бездетко, Т.Ю. Химич // Клиническая иммунология. Аллергология. Инфектология. – 2012. – №2. – С. 38-41. 13. Больц, Е.А. Методы диагностики аутоиммунной крапивницы и эффективность лечения с использованием отечественного препарата «Габриглобин IgG»: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.03.09 / Больц Елена Александровна. – М., 2012. – 27 с. 14. Борзова, Е.Ю. Лечение крапивницы: сегодня и завтра / Е.Ю. Борзова, К. Граттан // Российский аллергологический журнал. – 2010. – №5. – С.3-16. 113 15. Борзова, Е. Ю. Новые аспекты патогенеза хронической крапивницы / Е.Ю. Борзова // Российский аллергологический журнал. – 2012. – № 5. – С. 3-9. 16. Бурнашева, Р.Х. Крапивница и хронические очаги инфекции / Р.Х. Бурнашева, Н.М. Рахматуллина, А.М. Гумерова // Казанский медицинский журнал. – 1995 – Т. 76, №1. – С. 50-52. 17. Вараксин, Н.А. Острая ВИЧ-инфекция in vitro и продукция цитокинов лимфоцитоарными клетками человека / Н.А. Вараксин, Т.Г. Рябичева, Н.В. Тимофеева, Н.Г. Перминова, И.В. Тимофеев // Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4, №3. – С. 130-131. 18. Гервазиева, В.Б. Патогенетические механизмы хронической крапивнице / В.Б. Гервазиева, В.В. Сверановская, Н.А. Сибгатуллина // Вестник РАМН. – 2003. – №4. – С. 49-53. 19. Гервазиева, В.Б. Взаимоотношение атопии и инфекционной аллергии при хронической рецидивирующей крапивнице (ХРК) / В.Б. Гервазиева, Н.А Сигбатуллина, С.П. Чернуцкая // Российский аллергологический журнал. – 2007. – №3. – С. 153. 20. Гинда, С. Влияние препарата BIORZN на функциональную активность Тлимфоцитов / С. Гинда, В. Рудик, В. Кирошка, Е. Могорян, Е. Привалова, М. Попа, В. Отгон // Аллергология и иммунология. – 2008. – Т. 9, №4. – С. 63. 21. Гирина, О.Н. Влияние инфламафертина на иммунный и цитокиновый статус больных бронхиальной астмой, хронической и острой крапивницей в процессе лечения / О.Н. Гирина, Л.В. Кузнецова, А.М. Пилецкий, Л.И. Романюк, С.В. Плахотник, А.П. Гришило // Провизор. – 2004. – №7. – С. 10-11. 22. Голубчикова, Р.Н. Этиология хронической крапивницей / Р.Н. Голубчикова, И.В. Данилычева // Российский аллергологический журнал. – 2006. – №6. – С.12-17. 114 23. Горячкина, Л.А. Роль хеликобактерной инфекции в патогенезе хронической крапивницы / Л.А. Горячкина, Е.Ю. Борзова // Аллергология. – 2004. – №1. – С. 31-39. 24. Горячкина, Л.А. Перспективные направления в терапии хронической спонтанной крапивницы / Л.А. Горячкина, О.С. Дробик, М.Ю. Передельская // Российский аллергологический журнал. – 2011. – №4. – С. 91-92. 25. Данилычева, И.В. Аутоиммунные нарушения при хронической крапивнице. Обоснование новых терапевтических подходов / И.В. Данилычева, О.А. Купавцева, С.М. Иванова, А.И. Сперанский // Российский аллергологический журнал. – 2005. – №1. – С. 19-25. 26. Демьянов, А.В. Диагностическая ценность исследования цитокинов в клинической практике / А.В. Демьянов, А.Ю. Котов, А.С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. – 2003. – № 3. – С. 20-35. 27. Добротина, Н.А. Влияние полиоксидония и нативных иммуномодуляторов на иммунологические реакции in vitro / Н.А. Добротина, М.В. Прохорова, Ж.А. Казацкая // Иммунология. – 2005. – №3. – С. 152-155. 28. Зурочка, В.А. Влияние иммуномодулятора Бестима in vitro на спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов INFγ, IL-1β, IL-4, IL-8, IL-10 иммунокомпетентными клетками крови условно здоровых лиц / В.А. Зурочка, И.И. Долгушин, А.С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. – 2007. – Т. 6, №1. – С. 31-35. 29. Иваненко, Т.В. Иммунологические аспекты лабораторно диагностики хронической крапивницы / Т.В. Иваненко, О.В. Москалец, С.В. Сучков, О.М. Дурова, О.А. Гусева // Клиническая лабораторная диагностика. – 2001. – №4. – С. 38-40. 30. Ильичев, А.В. Секреция гранул нейтрофилов человека под действием формилпептида и препарата стимфорте / А.В. Ильичев, А.П. Бельков, Д.Г. Мальдов, Е.И. Асташкин // Иммунология. – 2009. – №3.- С. 159-161. 115 31. Исаченко, Е.Г. Способ прогнозирования развития аллергопатологии на доклиническом этапе / Е.Г. Исаченко, Т.И. Виткина, Е.В. Бердышев // ПАТ. №2192008 (РФ). Бюл. – 2002. – №30. – 10 с. 32. Исаченко, Е.Г. Способ оценки резервных возможностей иммунокомпетентных клеток/ Е.Г. Исаченко // Аллергология. – 2006. – №2. – С. 44-47. 33. Калимолдаева, С.Б. Хроническая крапивница: этиопатогенетическая роль инфекции Helicobacter pylori и разработка методов лечебно- профилактической коррекции: автореф. дис. … д-ра мед. наук: 14.00.36 / Калимолдаева Салтанат Булатовна. – Алматы, 2008. – 52 с. 34. Калимолдаева, С.Б. Иммунологические аспекты хронической крапивницы, индуцированной инфекцией Helicobacter pylori / С.Б. Калимолдаева // Экспериментальная и клиническая аллергология. – 2009. – №6. – С. 355-358. 35. Карельская, И.А. Инфекция Helicobacter pylori у больных с хронической крапивницей и бронхиальной астмой / И.А. Карельская, В.К. Игнатьев // Клиническая медицина. – 2005. – №3. – С. 58-61. 36. Колхир, П. В. Крапивница и ангиоотек / П.В. Колхир. – М.: Практическая медицина, 2012. – 364 с. 37. Лютов, А.Г. О безопасности и клинической эффективности Габриглобина – отечественного иммуноглобулина для внутривенного введения / А.Г. Лютов, А.К. Денисов, Е.В. Мостовская, С.С. Бочкарева, Ю.М. Тюриков // Педиатрия. – 2008. – №3. – С. 73-79. 38. Маслова, Л.В. Крапивница, отеки Квинке. – М.: БелМАПО, 2006. – 39 с. 39. Мищенко, Н. Хроническая крапивница: новый взгляд на патогенез, современные подходы к лечению / Н. Мищенко // Здоровье Украины. – 2007. – №8. – С. 64-65. 40. Мокроносова, М.А. Хроническая рецидивирующая крапивница и стрептококковая инфекция / М.А. Мокроносова, А.В. Сергеев, А.П. Батуро, 116 Э.Е. Романенко, И.Н. Улиско // Иммунология. – 2002. – Т. 23, №4. – С. 215217. 41. Молотилов, Б.А. Анализ эффективности различных методов лечения хронической аутоиммунной крапивницы / Б.А. Молотилов, В.А. Алешкин, Е.А. Орлова, Л.И. Новикова, А.Г. Лютов // Медицинские науки. Клиническая медицина. – 2013. – №2. – С. 83-93. 42. Незговоров, Д.В. Цитокин-независимая активация клеточных рецепторов иммунокомпетентных клеток / Д.В. Незговоров // Иммунология Урала. – 2007. – №1. – С. 20-21. 43. Нестерова, И.В. Бестим в коррекции дисфункций нейтрофильных гранулоцитов пациентов с хроническим осложненным панкреатитом в эксперименте in vitro / И.В. Нестерова, И.Н. Швыдченко, И.В. Фесенко // Цитокины и воспаление. – 2006. – Т. 5, № 2. – С. 42-45. 44. Орлова, E.A. Изучение нейрогенного воспаления у больных с хронической крапивницей и оценка эффективности лечения при использовании препарата атаракс / Е.А. Орлова, Б.А. Молотилов, О.А. Левашова // Российский аллергологический журнал. Труды национальной конференции. – 2010. – №1. – С. 139-140. 45. Орлова, Е.А. Нейроиммунные показатели у больных хронической крапивницей / Е.А. Орлова, О.А. Левашова, Л.А. Ащина // Сборник трудов 1 международной интернет-конференции «Медицина в 21 веке». – Казань, 2012. – С. 188-190. 46. Орлова, Е.А. Клинико-иммунологическая характеристика различных форм хронической крапивницы (диагностика, патогенетические аспекты, лечение): автореф. дис. … д-ра мед. наук: 14.03.09 / Орлова Екатерина Александровна. – М., 2013. – 56 с. 47. Петров, В.И. Клиническая эффективность циклоспорина при хронической идиопатической крапивнице у взрослых / В.И. Петров, А.В. Разваляева, 117 С.А. Гребнев, Н.В. Маможинская // Саратовский научно-медицинский журнал. – 2010. – Т. 6, №2. – С. 248-252. 48. Плескановская, С.А. О повышении «узнаваемости» эхинококкового антигена лейкоцитами крови in vivo и in vitro в присутствии фитопрепаратов / С.А. Плескановская, Т.П. Кичикулова // Аллергология и иммунология. – 2007. – Т. 8, №1. – С. 262. 49. Подшивалина, Е.Ю. Изучение антител к ДНК и их гидролизующих свойств при аутоиммунном тиреоидите с использованием нанотехнологий: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.03 / Подшивалина Елена Юрьевна. – Самара, 2008. – 24 с. 50. Попов, Т.А. Сравнение результатов действия препаратов левоцетиризина и дезлоратадина на гситамин-индуцированную кожную реакцию в виде аллергической папулы и гиперемии в условиях in vivo / Т.А. Попов, Д. Думитреску, А. Бачварова, С. Боскан, В. Димитров, М.К. Черч // Российский аллергологический журнал. – 2008. – №2. – С. 73-77. 51. Разумная, Ф.Г. Влияние афобазола на функциональную активность моноцитов в системе in vitro / Ф.Г. Разумная, С.В Сибиряк // Цитокины и воспаление. – 2011. – Т. 10, №1. – С. 70-74. 52. Рыжикова, С.Л. Стандартизация методики определения продукции цитокинов клетками крови ex vivo / С.Л. Рыжикова, Ю.Г. Дружинина, Т.Г. Рябичева, Н.А. Вараксин // Клиническая лабораторная диагностика. – 2011. – №11. – С. 49-53. 53. Сигбатуллина, Н.А. Аутоиммунный вариант хронической рецидивирующей крапивницы и методы его диагностики / Н.А. Сигбатуллина, Н.М. Рахматуллина, В.Б. Гервазиева // Казанский медицинский журнал. – 2002. – Т. 83, № 6. – С. 409-410. 54. Сибгатуллина, Н.А. Клинико-иммунологические особенности хронической рецидивирующей крапивницы и методы ее диагностики: дис. … канд. мед. наук: 14.00.36 / Сигбатуллина Наиля Асхатовна. – М., 2003. – 98 с. 118 55. Соболев, А.В. Профилактика обострений хронической крапивницы / А.В. Соболев, М.А. Шевяков, А.В. Богданов, В.В. Кирьянова //Аллергология. – 2005. – №1. – С. 31-34. 56. Суетина, И.А. Уровни интерферонзависимых ферментов у больных крапивницей, связанной с частыми вирусными инфекциями / И.А. Суетина, Т.М. Соколова, О.И. Белостоцкая // Вопросы медицинской химии. – 1990. – Т. 36, №6. – С. 56-59. 57. Талгатбекова, Д.Ж. Состояние клеточного иммунитета и особенности цитокинового статуса у больных хронической рецидивирующей крапивницей, ассоциированной с хроническими инфекциями / Д.Ж. Талгатбекова, А.А. Шортанбаев, А.С. Тарабаева, А.Б. Жубантурлиева, Э.Ж. Битанова // International Journal on Immunorehabilitation. Материалы конференции. – 2010. – Т. 12, №2. – С. 110а. 58. Таха, Т.В. Новые возможности в терапии крапивницы / Т.В. Таха // Российский медицинский журнал. – 2011. – №11. – С. 678-682. 59. Титова, Н.Д. Иммуномодулирующие эффекты пищевых красителей: стимуляция лимфоцитов и индукция секреции цитокинов / Н.Д. Титова // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2011. – №2. – С. 81-90. 60. Тузлукова, Е.Б. Применение Н1-антигистаминных препаратов для лечения хронической крапивницы / Е.Б. Тузлукова // Справочник поликлинического врача. – 2008. – №14. – С. 9-13. 61. Тыртышная, Г.В. Взаимосвязь нарушений иммунной и эндокринной систем при аутоиммунной патологии / Г.В. Тыртышная, А.П. Парохонский // Современные наукоемкие технологии. – 2007. – №2. – С. 80-81. 62. Феденко, Е.С. Крапивница – актуальная проблема клинической аллергологии / Е.С. Феденко // Аллергология. – 2002. – №4. – С. 31-35. 63. Феденко, Е.С. Кожные проявления аллергии: клинические аспекты и принципы лечения / Е.С. Феденко // Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4. – №3. – С. 100-106. 119 64. Федоров, Е.С. Крапивница в практике детского ревматолога / Е.С. Федоров, С.О. Салугина, Н.Н. Кузьмина // Педиатрия. – 2008. – №3. – С. 68-72. 65. Хагаманова, И.В. Роль стрессовых факторов в развитии хронической крапивницы / И.В. Хамаганова, О.В. Павлова // Вестник последипломного медицинского образования. – 2001. – №2. – С. 52-53. 66. Хаитов, Р.М. Руководство по клинической иммунологии / Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин, А.А. Ярилин – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 345 с. 67. Халафян А.А. STATISTICA 6. Статистический анализ данных / А.А. Халафян. – М.: Бином, 2009. – 528 с. 68. Хараева, З.Ф. Изучение механизма активирующего действия препарата «суперлимф» на нейтрофилы больных инфекционными заболеваниями, вызванными Staphylococcus aureus / З.Ф. Хараева, Л.В. Ковальчук, Л.В. Ганковская // Иммунология. – 2003. – Т. 24, №2. – С. 86-89. 69. Чернуцкая, С.П. Роль Helicobacter pylori в развитии аллергических заболеваний / С.П. Чернуцкая, В.Б. Гервазиева, Г.В. Сухарева // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2008. – Т.4, №4. – С. 17-20. 70. Ширинский, И.В. Влияние гормона эпифиза мелатонина на пролиферацию мононуклеаров периферической крови и продукцию IL-4 и INFγ в модели стресса in vitro / И.В. Ширинский, В.С. Ширинский // Цитокины и воспаление. – 2005. – Т.4, №2, 2005. – С. 126. 71. Шортанбаева, А.А. Роль урогенитальной инфекции в возникновении хронической рецидивирующей крапивницы / А.А. Шортанбаева, Д.Ж. Талгатбекова, Ж.А. Шортанбаева // Аллергология и иммунология. – 2011. – Т. 12, №3. – С. 246-248. 72. Щегловитова, О.Н. Влияние полидезоксирибонуклеотида на продукцию цитокинов и пролиферацию культур клеток человаека in vitro / О.Н. Щегловитова, Е.В. Миронченкова, Ю.А. Романов, Е.Ф. Колмакова, Ф.И. Ершов // Иммунология. – 2005. – №2. – С. 87-90. 120 73. Abd El-Azim, М. Chronic Autoimmune Urticaria: frequency and association with immunological markers / М. Abd El-Azim, S. Abd El-Azim // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. – 2011. – Vol. 21, №7. – Р. 546-550. 74. Altrich M.L. Comparison of the in vivo autologous skin test with in vitro diagnostic tests for diagnosis of chronic autoimmune urticaria / M.L. Altrich, J.F. Halsey, L.C. Altman // Allergy Asthma Proc. – 2009. – Vol. 30, № l. – Р. 28-34. 75. Altrichter S. IgE Mediated autoallergy against thyroid peroxidase – a novel pathomechanism of chronic spontaneous urticaria? [Электронный ресурс] / S. Altrichter, H. Peter, D. Pisarevskaja, M. Metz, P. Martus, M. Maurer // PLoS ONE. – 2011. – Vol. 6, №4. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3075251/. 76. Asero, R. Autoimmune chronic urticaria associated with type 1 diabetes and Graves' disease / R. Asero, А. Orsatti, А. Tedeschi, М. Lorini // J. Allergy Clin. Immunol. – 2005. – Vol. 115, №5. – Р. 1088-1089. 77. Asero, R. Chronic urticaria: a disease at a crossroad between autoimmunity and coagulation / R. Asero, P. Riboldi, A. Tedeschi, M. Cugno, P. Meroni // Autoimmun Rev. – 2007. – Vol. 7, №1. – Р. 71-6. 78. Asero, R. Eosinophils in chronic urticaria: supporting or leading actors? / R. Asero, M. Cugno, A. Tedeschi // Journal World Allergy Organization. – 2009. – Vol. 2, № 9. – P. 213-217. 79. Atwa, M.A. Serum concentration of IL-17, IL-23, TNF-α among patients with chronic spontaneous urticaria: association with disease activity and autologous serum skin test [Электронный ресурс] / M.A. Atwa, A.S. Emara, N. Youssef, N.M. Bayoumy Venerology. // Journal of European Academy of Dermatology and – 2013. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23451767. 80. Bagnasco, M. Urticaria and thyroid autoimmunity / M. Bagnasco, P.L. Minciullo, G.S. Saraceno, S. Gangemi, S. Benvenga // Thyroid. – 2011. – Vol. 2, №4. – Р. 401-410. 121 81. Bakos N. Comparison of chronic autoimmune urticaria with chronic idiopathic urticaria / N. Bakos, M. Hillander // International Journal of Dermatology. –2003. – Vol. 42, №8. – Р. 613-615. 82. Bеrard, F. Immunological and non immunological mechanisms in urticaria / F. Berard, P. Saint-Mezard, F. Cousin, S. Mecheri, J.F. Nicolas [Электронный ресурс] // Ann. Dermatol. Venerol. – 2003. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12843804. 83. Bessler, H. In vitro effect of statins on cytokine production and mitogen response of human peripheral blood mononuclear cells / H. Bessler, H. Salman, M. Bergman, R. Straussberg, M. Djaldetti // Clin. Immunol. – 2005. – Vol. 117, №1. – Р. 73-77. 84. Boguniewicz, M. The autoimmune nature of chronic urticaria / М. Boguniewicz // Allergy and Asthma proceedings. – 2008. – Vol. 29, №5. – Р. 433-438. 85. Brodell, L.A. Pathophisiology of chronic urticaria / L.A. Brodell, L.A. Beck, S.S. Saini // Ann Allergy Asthma Immunollogy. – 2008. – Vol. 100, №4. – Р. 291-297. 86. Caproni, M. Infiltrating cells and related cytokines in lesional skin of patients with chronic idiophatic urticaria and positive autologous serum skin test / M. Caproni, W. Volpi, D. Macchia, В. Giomi, M. Manfredi, P. Campi // Exp. Dermatol. – 2003. – Vol. 12, №5. – Р. 621-628. 87. Caproni, M. Chronic idiopathic and chronic autoimmune urticaria: clinical and immunopathological features of 68 subjects / M. Caproni, W. Volpi, B. Giomi, C. Cardinali, E. Antiga, L. Melani, A. Dagata, P. Fabbri // Acta. Derm. Venerol. – 2004. – Vol. 84, №4. – Р. 288-290. 88. Caproni, M. Chronic idiopathic urticaria: infiltrating cells and related cytokines in autologous serum-induced wheals / M. Carponi, B. Giomi, W. Volpi, L. Melani, E. Schincaglia, D. Macchia, M. Manfredi, A. D'Agata, P. Fabbri // Clin. Immunol. – 2005. – Vol. 114, №3. – Р. 284-292. 122 89. Caproni, M. Cellular infiltrate and related cytokines, chemokines, chemokine receptors and adhesion molecules in chronic autoimmune urticaria: comparison between spontaneous and autologus serum skin test induced wheal / M. Carponi, B. Giomi, L. Melani, W. Volpi, E. Antiga, D. Torchia, P. Fabbri // Int. J. Immunopathol. – 2006. – Vol. 19, №3. – Р. 507-515. 90. Castellani, M.L. Impact of RANTES, MCP-1 and IL-8 in mast cells / M.L. Castellani, M.A. De Lutiis, E. Toniato, F. Conti, P. Felaco, M. Fulcheri, T.C. Theoharides, A. Caraffa, P. Antinolfi, P. Conti, C. Cuccurullo, C. Ciampoli, M. Felaco, C. Orso, V. Salini, G. Cerulli, D. Kempuraj, S. Tetè, B. Shaik // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. – 2010. – Vol. 24, №1. – P. 1–6. 91. Chodirker, W.B. Immunological parameters and alpha 1-antitrypsinin chronic urticaria / W.M. Chodirker, W. Bauman, R.R. Komar // Clin. Allergy. –1979. – Vol. 9, №2. – Р. 201-210. 92. Chomiciene, A. Chronic urticaria and thyroid autoimmunity markers / A. Chomiciene, L. Jurgauskiene, A. Blaziene // Central European Journal of Medicine. – 2012. – Vol. 7. – P. 736-741. 93. Conlon, KC. Exacerbation of symptoms of autoimmune disease in patients receiving alfa-interferon therapy / K.S. Conlon, W.J. Ubra, J.W. Smith, R.G. Steis, D.L. Longo, J.W. Clark // Cancer. – 1990. – Vol. 65, №10. – P. 22372242. 94. Coondoo, A. The role of cytokines in the pathomechanism of cutaneous disorders / A. Coondoo // Indian J. Dermatol. – 2012. – Vol. 57, №2. – Р. 90-96. 95. Cugno, M. Activation of blood coagulation in autoimmune skin disorders / M. Cugno, A. Tedeschi, C. Crosti, A.V. Marzano // Expert Rev. Clin. Immunol. – 2009. – Vol. 5, №5 – P. 605-613. 96. Cugno, M. Skin аutoimmunity and blood coagulation / M. Cugno, A. Tedeschi, R. Asero, P.L. Meroni, A.V. Marzano // Autoimmunity. – 2010. – Vol. 43, №2. – P. 189-194. 123 97. Cugno, M. Inflammation and сoagulation in urticaria and angioedema / M. Cugno, R. Asero, A. Tedeschi, R. Lazzari, A.V. Marzano // Current Vascular Pharmacology. – 2012. – Vol.10, №5. – Р. 653-658. 98. Davidson, A. Autoimmune disease / A. Davidson, B. Diamond // New Engl. Med. – 2001. – Vol. 345. – P. 340-350. 99. Deacock, S.J. An approach to the patient with urticaria / S.J. Deacock // Br. Society for Immunollogy, Clinical and Experimental Immunology. – 2008. – Vol. 153. – P. 151-161. 100. Delgato, A.V. Production of tumor necrosis factor-alfa, interleukin 1-beta, interleukin 2, and interleukin 6 by rat leucocyte subpopulations after exposure to substance P / A.V. Delgato, A.T. McManus, J.P. Chambers // Neuropeptides. – 2003. – Vol. 37, №6. – Р. 355-361. 101. Dezfoulian, B. Urticaria and sistemic diseases / B. Dezfoulian, Z. Khalil, M. de la Brasinne // Rev. Med. Liege. – 2003. –Vol. 58, №12. – P. 751-756. 102. Dreskin, S.C. The thyroid and urticaria / S.C. Dreskin, K.Y. Andrews // Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. – 2005. – Vol. 5, №5. – P. 408-412. 103. Erel, F. Impact of Helicobacter pyroli and Giardia lambdia infections on chronic urticaria / F. Erel, O. Sener, A. Erdil, M. Karaayvaz, G. Gür, Z. Caliskaner, N. Ozangüç // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. – 2000. – Vol. 10, №2. – Р. 94–97. 104. Ferrer, M. Secretion of cytokines, histamine and leukotrienes in chronic urticaria / M. Ferrer, E. Luquin, A. Sanchez-Ibarrola, C. Moreno, M.L. Sanz, A.P. Kaplan // Int. Arch. Allergy Immunol. – 2002 – Vol. 129, №3. – P. 254-260. 105. Ferrer, M. IL3 effect on basophils histamine release upon stimulation with chronic urticaria sera / M. Ferrer, E. Luquin, A.P. Kaplan // Allergy. – 2003. – Vol. 58, №8. – P. 802-807. 106. Ferrer, M. Progress and challenges in the understanding of chronic urticaria / M. Ferrer, A. Kaplan // Allergy, Astma & Clinical Immumology. – 2007. – Vol. 3. – P. 31-35 124 107. Futata, E. Impaired IFN-α secretion by plasmacytoid dendritic cells induced by TLR9 activation in chronic idiopathic urticaria / E. Futata, M. Azor, J. Dos Santos, C. Maruta, M. Sotto, F. Guedes // Br. J. Dermatol. – 2011. – Vol. 164, №6. – P. 1271-1279. 108. Galli, S.J. Mast cells and basophiles / S.J. Galli // Curr. Opin. Hematol. – 2000. – Vol. 7. – P. 32-39. 109. Gao, J. mRNA profiles of cytokine receptor in unstimulated peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic idiopathic urticaria / J. Gao, A. Yang, M. Chen, A. Li, X. Yao, Y. Li, S. Xie, X. Yang, L. Zhong, Z. Chen // Journal of Biomedical Research. – 2011. – Vol. 25. – Issue 2. – P. 141-147. 110. Godse, K. Chronic urticaria and treatment / K. Godse // Ind. J. Dermatol. – 2009. – Vol. 54, №4. – P. 310-312. 111. Goh, C.L. Chronic autoimmune urticaria: where we stand? / C.L. Goh, K.T. Tan // Indian J. Dermatol. – 2009. – Vol. 54, №3. – Р. 269-274. 112. Grattan, C.E.H. Autoimmune urticaria / C.E.H. Grattan // Immunol. Allergy. Clin. North Am. – 2004. P. 163-181. 113. Greaves, M.W. Chronic idiopatic urticaria / M.W. Greaves // Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol. – 2003. – Vol. 3. – P. 363-368. 114. Greaves, M.W. Chronic urticaria: recent advances / M.W. Greaves, K.T. Tan // Clin. Rev. Allergy Immunol. – 2007. – Vol. 33. – P. 134-143. 115. Gulec, M. Chronic urticaria in patients with autoimmune thyroiditis: significance of severity of thyroid gland inflammation / M. Gulec, O. Kartal, A.Z. Caliskaner, M. Yazici, H. Yaman, S. Ozturk, O. Sener // Indian Journal of Dermatology, Venerology and Leprology. – 2011. – Vol. 77. – P. 477-482. 116. Haskova, V. Simple method of circulating immune complex detection in human sera by polyethylene glycol precipitation / V. Haskova, J. Kaslik, I. Riha, I. Matl, J. Rovensky // Z. Immunitatsforsch. Immunobiol. – 1978. – Vol. 154, №4.1. – P. 399-406. 125 117. Hellming, S. Role of Helicobacter pylori infection in the treatment and outcome of chronic urticaria / S. Hellmig, K. Troch, S.J. Ott, T. Schwarz, U.R. Fölsch // Helicobacter. – 2008. – Vol. 13. – P. 341-345. 118. Hennino, A. Pathophysiology of urticaria / A. Hennino, F. Berard, I. Guillot, N. Saad, A. Rozieres, J.F. Nicolas // Clin. Rev. Allergy Immunol. – 2006. – Vol. 30, №1. – P. 3-11. 119. Hide, M. Autoantibodies against the high affinity IgE receptor as a cause for histamine release in chronic urticaria / M. Hide, D.M. Francis, C.E. Grattan, J. Hakimi, J.P. Kochan, M.W. Greaves // N. Engl. J. Med. – 1993. – Vol. 328. – P. 1599–1604. 120. Hoffman, H.M. Prevention of cold-assotiated acute inflammation in familian cold autoinflammatory syndrome by interleukin-1 receptor antagonist / H.M. Hoffman, S. Rosengren, D.L. Boyle, J.Y. Cho, J. Nayar, J.L. Mueller, J.P. Anderson, A.A. Wanderer, G.S. Firestein // Lancet. – 2004. – Vol. 364, №9447. – Р. 1779-1785. 121. Huilan, Z. Role of the subgroups of T, B, natural killer lymphocyte and serum levels of interleukin-15, interleukin-21 and immunoglobulin E in the pathogenesis of urticaria / Z. Huilan, L. Runxiang, L. Bihua, G. Qing // J. Dermatol. – 2010. – Vol. 37. – P. 441-447. 122. Jin, C.Y. Effect of integrative Chinese and western medicine in treating chronic urticaria and its impact on interleukin – 10 and interleukin – 8 in peripheral blood / C.Y Jin, D.L. Wang, Z.D. Fang // Zhongguo Zhong Xi Yi Jie HeZaZhi. – 2008. – Vol. 28, №4. – P. 358-360. 123. Kandeel, A.A. Evaluation of chronic urticaria in patients with Hashimoto thyroiditis / A.A. Kandeel, M. Zeid, T. Helm, M.A. Lillie, E. Donahue, J.L. Ambrus // J. Clin. Immunol. 2001. – Vol. 21. – P. 335-347. 124. Kaplan, A.P. Pathogenesis of chronic urticaria / A.P. Kaplan, M. Greaves // Clin. Exp. Allergy. – 2009. – Vol. 39, №6. – P. 777-787. 126 125. Kasperska-Zajac, A. Plasma concentration of interleukin 6 (IL-6), and its relationship with circulating concentration of dehydroepiandrosterone sulfate (DHEA-S) in patients with chronic idiopathic urticaria / A. Kasperska-Zajac, Z. Brzoza, B. Rogala // Cytokine. – 2007. – Vol. 39, №2. – P. 142-146. 126. Kasperska-Zajac, A. Dehydroepiandrosterone and dehydroepiandrosterone sulphate in atopic allergy and chronic urticaria / A. Kasperska-Zajac, Z. Brzoza, B. Rogala // Inflammation. – 2008. – Vol. 31. – P. 141–145. 127. Kasperska-Zayac, A. Sex hormones and urticaria / A. Kasperska-Zajac, Z. Brzoza, B. Rogala // J. Dermatology science. – 2008. – Vol. 52, №2. – P. 7886. 128. Kasperska-Zajac, A. Acute-phase response in chronic urticaria / А. KasperskaZajac // Journal of the European Academy of Dermatology and Venerology. – 2012. – Vol. 26, №6. – P. 665-672. 129. Kessel, A. Elevated serum total IgE-a potential marker for severe chronic urticaria / A. Kessel, W. Helou, E. Bamberger, E. Sabo, D. Nusem, J. Panassof, E. Toubi // Int. Arch. Allergy Immunol. 2010. – Vol. 153, №3. – P. 288-293. 130. Kikuchi, Y. Mechanisms of autoimmune activation of basohils in chronic urticaria / Y. Kikuchi, A.P. Kaplan // J. Allergy Clin. Immunol. – 2001. – Vol. 107, №6. – P. 1056-1062. 131. Klote, M. Autoimmune response in urticaria of treatment with high doses of intravenous immunoglobulin / M. Klote, M.P. Nelson, R.J. Engler // Ann. Allergy Asthma Immunol. – 2005. – Vol. 94. – P. 307-308. 132. Krauth, M.T. Effect of various statins on cytokines-dependent growth and IgE-dependent release of histamine in human mast cells / M.T. Krauth, Y. Majlesi, K. Sonneck, P. Samorapoompichit, M. Ghannadan, A.W. Hauswirth // Allergy. – 2006. – Vol. 61, №3. – P. 281-288. 133. Krishnaswamy, G. The human mast cell: function in physiology and disease / G. Krishnaswamy, J. Kelley, D. Johnson, G. Youngberg, W. Stone, S.K. Huang, J. Bieber, D.S. Chi // Frontiers in Bioscience 2001. – Vol. 6. – P. 1109-1127. 127 134. Kurt, E. Autologous serum skin test response in chronic spontaneous urticaria and respiratory diseases and its relationship with serum interleukin-18 level / E. Kurt, A. Aktas, K. Aksu, M. Keren, A. Dokumaciioglu, C.H. Goss, O. Atalas // Arch. Dermatol. Res. – 2011. – Vol. 303(9). – P. 643-649. 135. Lai, J.P. Substance P antagonist (CP-96,345) ingibits HIV-1 replication in human mononuclear phagocytes / J.P. Lai, W.Z. Ho, G.X. Zhan, Y. Yi, R.G. Collman // PNAS. – 2001. – Vol. 98, №7. – P. 3970-3975. 136. Lek Wood, G. A case of autoimmune progesterone dermatitis diagnosed by progesterone pessary / G. Lek Wood // Australas J. Dermatol. – 2011. – Vol. 52, №2. – Р. 139-141. 137. Li, L. Effect of specific immunotherapy on the serum levels of IL-18 and IL-10 in patients with chronic urticaria [Электронный ресурс] / L. Li, P. Dong, X. Liu et al. // China Journal of Leprosy and Skin Diseases. – 2006. – Режим доступа: http://en.cnki.com.cn/Article_en/CJFDTOTAL-MALA200611005.htm. 138. Liezman, C. Stress, atopy and allergy: A re-evalution from a psychoneiroimmunologic perspective / C. Liezman, B. Klapp, E.M. Peters // Dermatoendokrinol. – 2011. – Vol. 3, №1. – P. 37-40. 139. Lourenco, F.D. Activated status of basophils in chronic urticaria leads to interleukin-3 hyper- responsiveness and enhancement of histamine release induced by anti- IgE stimulus / F.D. Lourenco, M.N. Azor, J.C. Santos, E. Preato, C.W. Maruta, E.A. Rivitti, A.J. Duarte // Br. J. Dermatol. – 2008. – Vol. 158, №5. – P. 979-986. 140. Magen, E. Eradication of Helicobacter pylori infection equally improves chronic urticaria with positive and negative autologous serum skin test / E. Magen, J. Mishal, M. Schlesinger, S. Scharf // Helicobacter. – 2007. – Vol. 12, №5. – Р. 567-571. 141. Mahmoud, L.B. Helicobacter pylori associated with chronic urticaria / L.B. Mahmoud, H. Ghozzi, A. Hakim, Z. Sahnoun, K. Zeghal // J. Infect. Dev. Ctries. – 2011. – Vol. 5, №8. – P. 596-598. 128 142. Majlesi, Y. Dependent differentiation and IgE-mediated histamine basophils and downmodulate expression of the basophil-Activation antigen CD203c/ENPP3/ Y. Majlesi, P. Samorapoompichit, A.W. Hauswirth, G.H. Schernthaner, M. Ghannadan, M. Baghestanian et al. // J. Leukoc. Biol. – 2003. – Vol. 73, №1. – P. 107-117. 143. Mancini, C. / C. Mancini, A. Carbonaro, J. Heremans // Immunochemistry. – 1965. – Vol. 2, № 3. – P. 234-254. 144. Mitzel-Kaoukhov, H. Effect of high-dose intravenous immunoglobulin treatment in therapy-resistant chronic spontaneous urticaria / H. Mitzel-Kaoukhov, P. Staubach, T. Muller-Brenne // Ann. Allergy Asthma Immunol. – 2010. – Vol. 104, №3. – P. 253-258. 145. Mizota, K. Novel type of Gq/11 protein-coupled neurosteroid receptor sensitive to endocrine disrupting chemicals in mast cell line (RBL-2H3) / K. Mizota, A. Yoshida, H. Uchida, R. Fujita, H. Ueda // British Journal of Pharmacology. – 2005. – Vol. 145. – P. 545–550. 146. Moosbauer, C. Eosinophils are a major intravascular location for tissue factor storage and exposure / C. Moosbauer, E. Morgenstern, S.L. Cuvelier, D. Manukyan, K. Bidzhekov et al. // Blood. – 2007. – Vol. 109. – P. 995-1002. 147. Najib, U. The spectrum of chronic urticaria / U. Najib, J. Sheikh // Allergy Asthma Proc. – 2009. – Vol. 30, №1. – P. 1-10. 148. Nassif, A. Is chronic urticaria an atopic condition? / А. Nassif // Eur. J. Dermatol. – 2007. – Vol. 17. – Р. 545-546. 149. Nettis, E. The Employment of leukotriene antagonists in cutaneous diseases belonging to allergological field / E. Nettis, M. D'Erasmo, E. Di Leo, G. Gianfranco Calogiuri, V. Montinaro, A. Ferrannini A, A. Vacca // Mediators of Inflammation. – 2010. – P. 1-6. 150. Niimi, N. Dermal mast cell activation by autoantibodies against the high affinity IgE receptor in chronic urticaria / N. Niimi, D.M. Francis, F. Kermani, B.F. O’Donnell, M. Hide, A. Kobza-Black, R.K. Winkelmann, M.W. Greaves, R.M. Barr // J. Invest. Dermatol. 1996. – Vol. 106. – P. 1001-1006. 129 151. O’Donnell, B.F. Thyroid autoimmunity in chronic urticaria / B.F. O’Donnell, D.M. Francis, G.T. Swana, P.T. Seed, A. Kobza Black, M.W. Greaves // Br. J. Dermatol. – 2005. – Vol. 153, №2. – P. 331-335. 152. O'Garra, A. IL-10–producing and naturally occurring CD4+ Tregs: limiting collateral damage / A. O'Garra, P.L. Vieira, A.E. Goldfeld // Journal of Clinical Investigation. – 2004. – Vol. 114. – Issue 10. – Р. 1372-1378. 153. Omidian, M. Is there correlation between chronic idiopathic urticaria and elevated serum IgE? / M. Omidian, E. Omidian // Iranian Journal of Dermatology. – 2009. – Vol. 12, №3. – Р. 90-92. 154. Ortonne, J.P. Chronic idiopathic urticaria for the generalist / J.P. Ortonne // Eur. J. Intern. Med. – 2003. – Vol. 14, №3. – P. 148-157. 155. Ozdemir, O. Idiopathic (autoimmune) chronic urticaria / O. Ozdemir // Allergy Asthma Proc. – 2006. – Vol. 27, №5. – P. 431-434. 156. Pachlopnik, J.M. Natural anti-FcsRIa autoantobodies may interfere with diagnostic tests for autoimmune urticaria / J.M. Pachlopnik, M.P. Horn, M. Fux, M. Dahinden, M. Mandallaz, D. Schneeberger, L. Baldi, M. Vogel, B.M. Stadler, S.M. Miescher // Journal of Autoimmunity. – 2004. – Vol. 22. – P. 43-51. 157. Pawankar, R. Mast cells as orchestrators of the allergic reaction: the IgE-IgE receptor mast cell network / R. Pawankar // Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. – 2001. – Vol. 1, №1. – Р. 3-6. 158. Pereira, C. Low-dose intravenous gammaglobuline in the treatment of severe autoimmune urticaria / C. Pereira, B. Tavares, I. Carrapatoso, G. Loureiro, E. Faria, D. Machado, C. Chieira // European annals of allergy and clinical immunology. – 2007. – Vol. 39, №7. – P. 237-242. 159. Pezeshkpoor, F. Efficacy of Atorvastatin and antihistamines in comparison with antihistamines plus placebo in the treatment of chronic idiopathic urticaria: a controlled clinical trial / F. Pezeshkpoor, R. Farid Hosseini, H. Rafatpanah et al. // Iran J. Allergy Asthma Immunol. – 2012. – Vol. 11, №3. – P. 236-240. 130 160. Powell, J.M. The effects of dehydroepiandrosterone (DHEA) on in vitro spleen cell proliferation and cytokine production / J.M. Powell, G. Sonnenfeld // Journal of Interferon & Cytokine Research. – 2006. – Vol. 26, №1. – P. 34-39. 161. Powell, R. J. BSACI guidelines for the management of chronic urticaria and angio-oedema / R.J. Powell, G.L. Du Toit, N. Siddique, S. C. Leech, T.A. Dixon, A.T. Clark, R. Mirakian, S.M. Walker, P.A. J. Huber, S.M. Nasser // Clinical and Experimental Allergy. – 2007. – Vol. 37. – P. 631–650. 162. Puxeddu, I. Free IL-18 and IL-33 cytokines in chronic spontaneous urticaria / I. Puxeddu, P. Italiani, P. Giungato, F. Pratesi, F. Panza, D. Bartaloni, V. Rocchi, I. Del Corso, D. Boraschi, P. Migliorini // Cytokine. – 2013. – Vol. 61, №3. – P. 741-743. 163. Rubio, M. Follow-up of total and Anisakis simplex specific IgE levels in patients with anaphylaxis or acute or chronic urticaria / M. Rubio, J.M. Zubeldia, M.L. Baeza, M.P. Lopez //Allergol. Immunol. Clin. – 2000. – Vol. 15. – P. 247254. 164. Samia, A.I. Interleukin-18 correlates with disease severity in chronic autoimmune urticaria [Электронный ресурс] / A.I. Samia, A.K. Naglaa // Egyptian Dermatology Online Journal. – 2009. – Vol. 5, №1. – Режим доступа: http://www.edoj.org.eg/vol005/0501/001/01.htm. 165. Santos, J.C. Increased circulating pro-inflammatory cytokines and imbalanced regulatory T-cell cytokines production in chronic urticaria / J.C. Santos, M.H. Azor, Y.N. Viviane et al. // Int. Immunopharmacol. 2008. – Vol. 8, №10. – Р. 1433-1440. 166. Santos, J.C. Up-regulation of chemokine C–C ligand 2 (CCL2) and C-X-C chemokine 8 (CXCL8) expression by monocytes in chronic idiopathic urticaria / J.C. Santos, C.A. de Brito, E.A. Futata, M.H. Azor, N.M. Orii, C.W. Maruta, E.A. Rivitti, A.J.S. Duarte, M.N. Sato // Clinical & Experimental Immunology. – 2012. – Vol. 167. – P. 129-136. 131 167. Shincai, K. Cryopin-associated periodic syndrome and autoinflammation / K. Shincai, T. McCalmont, K. Leslie // Clin. Exp. Dermatol. 2007. - Vol. 33. – P. 1-9. 168. Silpa-Archa, N. Physical urticaria: prevalence, type and natural course in a tropical country / N. Silpa-Archa, K. Kulthanan, S. Pinkaew // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. – 2011. – Vol. 25, №10. – P. 1194-1199. 169. Skyrkovich, S.V. Anticytokine therapy – new approach to the treatment of autoimmune and cytokine – disturbance diseases / S.V. Skyrkovich, S.S. Skyrkovich, J.A. Kelly // Medical Hypotheses. – 2002. – Vol. 59, № 6. – P. 770780. 170. Soruri, A. Mast cell activation is characterized by upregulation of a functional anaphylatoxin C5a receptor / A. Soruri, J. Grigat, Z. Kiafard, J. Zwimer // BMC Immunol. – 2008. – Vol. 9. – P. 29. 171. Soundararajan, S. Functional assessment of pathogenic IgG subclasses in chronic autoimmune urticaria / S. Soundararajan, Y. Kikuchi, K. Joseph, A.P. Kaplan // J. Allergy Clin. Immunol. – 2005. – Vol. 115, №4. – P. 815-821. 172. Takeda, T. Increase of coagulation potential in chronic spontaneous urticaria / T. Takeda, Y. Sakurai, S. Takahagi, J. Kato, K. Yoshida, M. Hide, M. Shima // Allergy. – 2011. – Vol. 66, №3. – P. 428-433. 173. Tedeschi, A. Serum interleukin-18 in patients with chronic ordinary urticaria: association with disease activity / А. Tedeschi, М. Lorini, С. Suli, R. Asero // Clin. Exp. Dermatol. – 2007. – Vol. 32, №5. – P. 568-570. 174. Tharp, M.D. Mast cells and their mediators / M.D. Tharp // BMJ. – 2003. – Vol. 326, №4. – P. 41-45. 175. Torresani, C. Chronic urticaria is usually associated with fibromyalgia syndrome / C. Torresani, S. Bellafiore, G. De Panfilis // Acta Derm. Venereol. 2009. – Vol. 89, №4. – P. 389-392. 176. Toubi, E. Immune aberrations in B and T lymphocytes derived from chronic urticaria patients / E. Toubi, A. Adir-Shani, A. Kessel, Z. Shmuel, E. Sabo, H. Hacham // J. Clin. Immunol. – 2000. – Vol. 20. – P. 371-378. 132 177. Wai, Y.C. Evaluating chronic urticaria patients for allergies, infections, or autoimmune disorders / Y.C. Wai, G.L. Sussman // Clin. Rev. Allergy Immunol. – 2002. – Vol. 23, №2. – P. 185-193. 178. Wedi, B. Chronic urticaria and infections / B. Wedi, U. Rapp, A. Kapp // Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. – 2004. – Vol. 4. – P. 387-396. 179. Williams, C.M. The diverse potential effector and immunoregulatory roles of mast cells in allergic disease / C.M. Williams, S.J. Galli // J. Allergy Clin. Immunol. – 2000. – Vol. 105, №5. – P. 847-859. 180. Yang, X. Variation of immune function of chronic urticaria patients exposed to TDI [Электронный ресурс] / X. Yang, Q. Li // China Tropical Medicine. – 2010. – Режим доступа: http://en.cnki.com.cn/Article_en/CJFDTOTAL- RDYX201003041.htm 181. Ye, Y.M. Co-existence of chronic urticaria and metabolic syndrome: clinical implications / Y.M. Ye, H.J. Jin, E.K. Hwang, Y.H. Nam, J.H. Kim, Y.S. Shin, H.S. Park // J. Acta Derm. Venereol. – 2013. – Vol. 93, №2. – P. 156-160. 182. Ying, S. TH1/TH2 cytokines and inflammatory cells in skin biopsy specimens from patients with chronic idiopathic urticaria: comparison with the allergeninduced late-phase cutaneous reaction / S.Ying, Y. Kikuchi, Q. Meng, A.B. Kay, A.P. Kaplan // J. Allergy Clin. Immunol. 2002. – Vol. 109, №4. – Р. 694. 183. Zaky, А. Chronic idiopathic urticaria and atopy, is there any relation? / A. Zaky, S. Khalifa, A. El Mohsen A. // The Gulf Journal of Dermatology and Venereology. – 2010. – Vol. 17, №1. – Р. 32-35. 184. Zamiri, M. Reactivity to autologous serum skin test and relationship with complement levels in chronic idiopathic urticaria and angioedema / M. Zamiri, C.S. Jury, R.S. Dawe, S. O’Neill, W.S. Douglas // Clin. Exp. Dermatology. 2009. – Vol. 34, №5. P. 587- 590. 185. Zawar, V. Chronic urticaria associated with recurrent genital herpes simplex infection and success of antiviral therapy - a report of two cases / V. Zawar, K. Godse, S. Sankalecha // Int. J. Infect. Dis. – 2010. – Vol.14, №6. – P. 514-517.
