На правах рукописи ЛИСИЦКИЙ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

На правах рукописи
ЛИСИЦКИЙ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ПОСЛЕДСТВИЙ
НЕЙРОТОКСИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЙ ПРИ ТЯЖЁЛЫХ ФОРМАХ
ОСТРЫХ ОТРАВЛЕНИЙ ЭТАНОЛОМ
(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
14.03.04  токсикология
14.03.06  фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Санкт–Петербург – 2013
Диссертационная работа выполнена в лаборатории психофармакологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства» (ФГБУН ИТ ФМБА
России).
Научные
руководители:
Петров Александр Николаевич
доктор медицинских наук, профессор
Шевчук Майя Константиновна
кандидат медицинских наук, доцент
Официальные
оппоненты:
Александров Михаил Всеволодович
доктор медицинских наук, профессор
Государственное бюджетное учреждение «СанктПетербургский научно-исследовательский институт скорой
помощи имени И.И. Джанелидзе», руководитель отделения
функциональной диагностики
Оковитый Сергей Владимирович
доктор медицинских наук, профессор
Государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования «СанктПетербургская государственная химико-фармацевтическая
академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой фармакологии и клинической фармакологии
Ведущая организация:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакологии (г. Санкт-Петербург).
Защита состоится «____» ___________ 20___ г. в __.__ часов на заседании диссертационного совета Д 208.030.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт токсикологии Федерального медикобиологического агентства» (192019, Санкт-Петербург, ул. Бехтерева, 1).
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства»
Автореферат разослан «____» __________ 2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук,
профессор
Луковникова Любовь Владимировна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования
Высокий уровень алкоголизации населения в России является причиной
большого количества острых отравлений алкоголем и его суррогатами, регистрируемых в последнее десятилетие [Заиграев Г.Г., 2009; Бонитенко Е.Ю., Бонитенко Ю.Ю., 2010]. Особенно важным является изменение структуры алкогольных отравлений в сторону преобладания у лиц среднего и молодого возраста, а
также увеличение числа подобных отравлений у детей [Альбицкий В.Ю. и др.,
2010; Барачевский Ю.Е. и др., 2011]. По данным детского токсикологического
центра г. Москвы, на долю острых отравлений алкоголем у детей приходится
21 % от общего количества госпитализаций [Лужников Е.А., Суходолова Г.Н.,
2013]. В результате применения комплекса эффективных лечебных мероприятий летальность больных с острой алкогольной интоксикацией в специализированных центрах по лечению острых отравлений, как правило, не превышает 12% [Лужников Е.А. и др., 2008, 2012], в то же время по числу смертельных исходов на догоспитальном этапе алкогольные отравления в течение многих лет
занимают ведущее место среди бытовых отравлений в нашей стране [Бонитенко Ю.Ю., 2003, 2005; Остапенко Ю.Н. и др., 2008; Шилов В.В. и др., 2008; Шабанов П.Д., 2012].
Наряду со значительной смертностью при невозможности оказания своевременной медицинской помощи серьёзным последствием перенесённого острого тяжёлого отравления алкоголем являются нарушения функций различных
тканей и органов, проявляющиеся на поздней, соматогенной стадии интоксикации [Лужников Е.А., Остапенко Ю.Н., Суходолова Г.Н., 2001]. Следует отметить, что нейротоксические поражения, как последствия тяжёлой формы острого отравления алкоголем, существенно влияющие на социальный статус и качество жизни этой категории больных, в том числе, являющиеся причиной их инвалидизации, изучены явно недостаточно. Поэтому исследование динамики
развития различных проявлений нейротоксического действия этанола в эксперименте определяет актуальность настоящего исследования с учётом последующего использования полученных данных в токсикологической клинике.
Этанол является политропным ядом, поскольку его токсическое действие
на нервные ткани обусловлено комплексом факторов, включая изменение физико-химических свойств липидов мембран нервных клеток и внутриклеточных
образований и связанное с этим изменение активности регуляторных белков и
ионных каналов – компонентов ряда медиаторных систем головного мозга. В
частности, в последние годы внимание исследователей привлечено к участию
глутаматергической системы мозга в формировании патологических процессов
при острой и хронической алкогольной интоксикации [Беспалов А.Ю., Звартау
Э.Э., 2000; Долго-Сабуров В.Б. и др., 2011]. В связи с этим представляет интерес изучения влияния лекарственных препаратов, связанных с глутаматергической медиацией, в частности антагониста NMDA-рецепторов мемантина, на
выраженность нейротоксических поражений, как последствий острого отравления этанолом в условиях хронической алкогольной интоксикации [Гладких
3
В.Д. и др., 2007; Руденко А.А. и др., 2009]. Учитывая, что одним из проявлений
нейротоксичности этанола является нарушение когнитивных функций, следует
считать перспективным использование в качестве нейропротекторов препаратов ноотропного действия с целью фармакологической коррекции последствий
острой алкогольной интоксикации [Васильев С.А., 2008; Башарин В.А., Иванов
М.Б., 2008]. По современным представлениям, к ноотропам относится большое
количество препаратов, представляющих различные группы химических веществ. Среди них следует выделить соединения – производные γаминомасляной кислоты (ГАМК), для одного из которых (пикамилон) установлена лечебная эффективность в комплексной терапии острой алкогольной интоксикации [Ковлер М.А. и др., 1997; Белова Е.И., 2006; Анцыперов В.В., 2008].
Препарат из группы регуляторных пептидов – ноопепт, наряду с ноотропным,
обладает нейропротективным и нейромодулирующим действием, а также высокой биодоступностью для тканей мозга [Островская Р.У., 2002, 2009; Стуров
Н.В., 2012], что обосновывает его изучение, как средства фармакологической
коррекции нейротоксических последствий алкогольных отравлений.
Исследование влияния препаратов из перечисленных фармакологических
групп на скорость восстановления нарушенных функций ЦНС в соматогенной
стадии острой алкогольной интоксикации и интоксикации на фоне предшествующей алкоголизации является актуальным, поскольку позволит сформулировать рекомендации для их последующего использования в комплексной терапии острых алкогольных отравлений и их отдалённых последствий.
Степень разработанности темы диссертационного исследования
В доступной нам отечественной и зарубежной литературе исследования
по экспериментальному моделированию последствий нейротоксических поражений, наблюдающихся в соматогенной стадии тяжёлой формы острого отравления, встречаются в единичном количестве. Практически отсутствуют экспериментальные работы по изучению поражений функций центральной и периферической нервной системы у животных с острым отравлением этанолом на
фоне предшествующей хронической алкоголизации. Весьма ограничены данные по доклиническим исследованиям лекарственных препаратов, как средств
фармакологической коррекции и восстановления нарушенных функций в отдалённом периоде острого отравления этанолом. Всё указанное позволило сформулировать цель и задачи настоящей работы.
Цели и задачи исследования
Изучить характер и выраженность нейротоксических поражений у крыс
после тяжёлой формы острого отравления этанолом и обосновать возможность
фармакологической коррекции выявленных нарушений.
Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:
1. Обосновать алгоритм экспериментального моделирования тяжёлой
формы острого отравления этанолом у крыс с целью последующей оценки неврологических нарушений, наблюдающихся в соматогенной стадии алкогольной
интоксикации.
2. Провести сравнительное изучение последствий острого тяжёлого отравления этанолом и острого отравления на фоне предварительной алкоголиза4
ции (ежедневное внутрижелудочное введение этанола в течение месяца) на
структуру поведения, состояние нейромоторной функции, память и обучение, а
также болевую чувствительность белых крыс.
3. Осуществить патоморфологическое исследование головного мозга
крыс, перенёсших тяжёлую форму острого отравления этанолом и острого отравления этанолом на фоне предварительной алкоголизации.
4. Изучить влияние фармакологических препаратов: пикамилона, ноопепта и мемантина на динамику восстановления нарушенных функций нервной
системы, как последствий токсического действия этанола.
Научная новизна исследования
В работе с помощью использованной батареи тестов осуществлена комплексная оценка поведения, двигательной активности, состояния координации
движений, мышечной силы, когнитивных функций и процессов болеощущения
у крыс, перенёсших тяжёлую форму острого отравления этанолом. В результате
проведённых исследований охарактеризована и сопоставлена выраженность и
продолжительность нейротоксических нарушений, проявлявшихся после острого периода алкогольной интоксикации у экспериментальных животных с однократным воздействием токсической дозы этанола, и у крыс, подвергнутых
предварительной алкоголизации.
Показано, что у крыс, перенёсших тяжёлую форму острого отравления
этанолом, наряду с угнетением двигательной активности и сложных форм поведения (исследовательская активность, уровень мотивации, пространственная
ориентация) отмечалось ухудшение способности животных к приобретению и
сохранению навыка активного и пассивного избегания аверсивного стимула,
свидетельствующее о нарушении процессов памяти и обучения. Выявленные
изменения функций головного мозга под влиянием этанола, в конечном итоге,
могут лежать в основе когнитивных нарушений и снижения психической работоспособности в отдалённом периоде интоксикации.
Проведена оценка эффективности и обоснована возможность использования фармакологических препаратов, обладающих нейропротективной: ноотропной и нейромодулирующей активностью (пикамилон, ноопепт) и влияющих на глутаматергическую медиацию (мемантин) в качестве средств фармакологической коррекции нейротоксических поражений как последствий острого
отравления этанолом.
Практическая и теоретическая значимость работы
Предложены методические подходы, позволяющие осуществить объективную количественную оценку состояния поведения, двигательной, когнитивной и сенсорной функций экспериментальных животных, которые могут быть
использованы при доклинической оценке лекарственных средств, предназначенных для фармакологической коррекции нейротоксических поражений и восстановления нарушенных функций ЦНС у лиц, перенёсших тяжёлые отравления алкоголем.
Обосновано применение препаратов, обладающих нейропротективным
действием: производного никотиновой и γ-аминомасляной кислоты пикамилона
5
и дипептидного препарата ноопепта и их сочетания для коррекции нейротоксических поражений в соматогенной стадии острого отравления этанолом.
Проанализирована эффективность курсового введения пикамилона, ноопепта и блокатора NMDA-рецепторов мемантина при экспериментальной терапии последствий острого отравления этанолом на фоне предварительной алкоголизации.
Полученные в работе данные об эффективности исследованных лекарственных препаратов, выпускаемых фармацевтическими предприятиями Российской Федерации и разрешённых к медицинскому применению в стране, являются обоснованием для их включения в схемы лечебных и реабилитационных
мероприятий после алкогольных отравлений.
Методология и методы исследования
Методология исследования состояла в моделировании последствий острой алкогольной интоксикации у крыс (на интактных животных и на фоне
предварительной алкоголизации), оценённых в батарее тестов («открытое поле», крестообразный лабиринт, вращающийся стержень, сила хватки, условная
реакция пассивного избегания, условная реакция активного избегания плавания, болевые тесты – Tail Flick и механического отдёргивания лапы), с последующей оценкой сроков и степени восстановления нарушенных функций. Также с помощью данной батареи тестов была определена степень и выраженность
фармакологической коррекции выбранными препаратами (пикамилон, ноопепт,
мемантин). Исследования выполнены в соответствии с соблюдением всех правил доказательной медицины.
Положения, выносимые на защиту
1. Последствием тяжёлой формы отравления этанолом белых крыс являются нейротоксические поражения, приводящие к нарушениям поведения, двигательной функции, процессов памяти, обучения и ноцицепции, регистрируемые в течение нескольких суток после исчезновения у экспериментальных животных признаков острой интоксикации.
2. Ежедневное внутрижелудочное введение крысам субтоксических доз
этанола в течение месяца приводит к развитию поведенческих, неврологических и когнитивных нарушений, выраженность которых существенно увеличивается в результате острого отравления этанолом предварительно алкоголизированных животных. При этом в особенности страдают процессы приобретения
и сохранения выработанного навыка.
3. Перспективным подходом к коррекции нейротоксических поражений
после тяжёлой формы острого отравления этанолом является использование
фармакологических препаратов, обладающих нейропротективным – ноотропным, нейромодулирующим и нейромедиаторным действием и их сочетаний.
Степень достоверности и апробация результатов
Степень достоверности определяется достаточным количеством экспериментальных животных использованных в исследовании, рандомизацией и формированием групп сравнения и контроля, адекватными поведенческими, токсикологическими и фармакологическими моделями и методами исследования,
6
длительными сроками наблюдения и корректными методами статистической
обработки.
Результаты проведённых исследований были доложены и обсуждены на
Российской научной конференции с международным участием «Актуальные
проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской молодёжной конференции-школы «Нейробиология интегративных
функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийском симпозиуме, посвящённом 50-летию со дня основания ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России «Медико-биологические аспекты обеспечения химической безопасности Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 2012); VII Международной Пироговской
научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва,
2012); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы радиационной
медицины и промышленной токсикологии» (Красноярск, 2012); IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); II
Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); Научнопрактической конференции, посвящённой 20-летию ФГУП НПЦ «Фармзащита»
ФМБА России «Состояние и перспективы развития средств медицинской защиты от экстремальных факторов» (Москва, 2012); Всероссийской научной конференции молодых ученых «Медико-биологические аспекты химической безопасности» (Санкт-Петербург, 2013); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации» (Республика
Узбекистан, Ташкент, 2013); IV съезде токсикологов России с международным
участием (Москва, 2013); Всероссийской конференции молодых ученых «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2013); I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации» (Санкт-Петербург, 2013). Материалы, вошедшие в
диссертацию, также были доложены на Санкт-Петербургском обществе токсикологов (Санкт-Петербург, 2012).
Связь темы диссертации с плановой тематикой научноисследовательской работы учреждения
Работа выполнена в соответствии с задачами научно-исследовательской
работы «Поиск» (тема «Разработка и обоснование методологии клинической,
химико-токсикологической, судебно-медицинской диагностики и лечения отравлений
веществами
депримирующего
действия»
(клиникоэкспериментальное исследование)) входящей в Федеральную целевую программу «Национальная система химической и биологической безопасности
Российской Федерации (2009-2013 гг.)».
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 2 – в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, включает 21 таблицу, 30 рисунков. Состоит из введения, четырёх глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследова7
ний, заключение), выводов, научно-практических рекомендаций и библиографического списка литературы, включающего 219 источников (123 – на русском
языке и 96 – на иностранных языках).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Первая глава диссертации посвящена обзору литературы, в котором рассмотрены нейротоксические последствия, как результат острой и хронической
алкогольной интоксикации. Также рассмотрен вопрос моделирования нейротоксических процессов в эксперименте, патоморфологические изменения, которые могут наблюдаться в результате воздействия этанола, а также лекарственные препараты – потенциальные средства фармакологической коррекции
нейротоксических эффектов.
1. Материалы и методы исследования
Эксперименты выполнены на 1500 половозрелых беспородных белых
крысах-самцах массой 180-220 г. Острое отравление этанолом у интактных и
предварительно алкоголизированных животных вызывали внутрибрюшинным
введением 33% раствора этилового спирта (этанола) в дозе равной 0,8 ЛД50.
Предварительную алкоголизацию животных проводили в течение 1 месяца путём ежедневного внутрижелудочного введения 40% раствора спирта этилового
(этанола) в дозе 5 г/кг (2 недели) и 7 г/кг (2 недели) [Петров А.Н. и др., 2013].
Выраженность острого отравления этанолом без предварительной алкоголизации животных и на фоне неё оценивали по «балльной системе». Для
оценки степени угнетения функционирования ЦНС при действии этанола рассчитывали индекс тяжести неврологических нарушений (ИТНН). Расчет данного показателя позволяет с достаточно высокой точностью описать состояние
животных: от физиологической нормы до выраженного угнетения ЦНС − аналога терминальной комы у человека [Башарин В.А., 2011].
Формула расчета ИТНН:
ИТНН = 5×ПЖ + 4×ГР+ 3×БР + 2×РС + 2×ЗР + КР,
где следующие показатели, были выражены в баллах от 1 (наибольшая
степень угнетения) до 4 (отсутствие угнетения): ПЖ – поведение животных
(визуальная оценка состояния животного при нахождении крысы в клетке и в
руках исследователя); ГР – глоточный рефлекс (при надавливании на корень
языка зондом вызывались глотательные движения); БР – оценка тактильноболевой чувствительности (болевой раздражитель наносили сжатием хвоста
пинцетом); РС – рефлекс сгибания задних конечностей (путём сжатия задней
конечности пинцетом наблюдалось её сгибание или сокращением брюшной
стенки); ЗР – зрачковый рефлекс (после освещения глаза животного можно наблюдать его сужение (миоз), а затем расширение до нормы); КР – корнеальный
рефлекс (при осторожном прикасании волоском к роговице глаза крысы наблюдается закрытие век).
ИТНН в баллах отражал состояние экспериментальных животных, соответствующее степени острой алкогольной интоксикации у человека: более 55
баллов – уровень физиологической нормы; от 46 до 55 баллов – оглушение; от
8
36 до 45 баллов – сопор; от 26 до 35 баллов – кома умеренная; от 18 до 25 баллов – кома глубокая, терминальная кома − 17 баллов и меньше.
Поведение, двигательная и исследовательская активность исследовались
с помощью методов «открытое поле» – оценивались количество горизонтальных и вертикальных перемещений, заглядываний и груминга; крестообразный
лабиринт – оценивались латентный период начала исследования лабиринта в
секундах; количество посещенных тупиков за 4 минуты; время полного обхода
лабиринта в секундах; количество вертикальных стоек, состояние координации
движений и мышечного тонуса – по способности животных удерживаться на
вращающемся стержне и изменению силы хватки. Состояние процессов памяти
и обучения исследовались с помощью методов условной реакции активного избегания плавания (УРАИ) – регистрировали латентный период избегания плавания (время от помещения животного в воду до обнаружения оплетённого
стержня и выхода из воды) и условной реакции пассивного избегания электроболевого воздействия (УРПИ) – регистрировали латентный период первого захода через 12 и 24 часа после обучения (ЛП12 и ЛП24). При дальнейших расчётах использовали разницу между латентными периодами ЛП12 – ЛП0 и ЛП24 –
ЛП0 (ЛП0 – латентный период первого захода при отборе). Состояние болевой
чувствительности инструментально исследовалось с помощью методов регулируемого термического и механического раздражения [Хабриев Р.У. и др., 2005;
Миронов А.Н. и др., 2012].
Острое отравление этанолом экспериментальных животных осуществлялась в двух вариантах: без предварительной алкоголизации и после предварительной алкоголизации крыс.
В опытах без предварительной алкоголизации крыс разделяли на группы
по 12 особей. Группе интактных животных в/б вводили воду для инъекций,
группе крыс с острым отравлением без лечения – 0,8 ЛД50 этанола. Через 12 часов после введения этанола и далее ежедневно в течение 3-9 суток в обеих
группах осуществляли регистрацию оцениваемых показателей. В группах
крыс, получавших лечение, фармакологические препараты вводились однократно в/б (пикамилон в дозе 300 мг/кг, ноопепт в дозе 30 мг/кг, сочетание пикамилона и ноопепта в дозах 300 мг/кг и 30 мг/кг соответственно) через 12 часов после введения 0,8 ЛД50 этанола. Регистрацию оцениваемых показателей
осуществляли через 30 минут после инъекции препаратов и далее ежедневно на
протяжении 3-9 суток.
Выбор доз исследованных препаратов был осуществлён на основании сопоставления данных по их лечебной эффективности и безопасному применению у человека и в экспериментах на лабораторных животных [Ливанов Г.А.,
Бонитенко Е.Ю. и др., 2000; Островская Р.У., 2002; Руденко А.А., 2009].
В опытах с предварительной алкоголизацией выделялись следующие
группы животных (по 12 особей): группа интактных крыс, получавших воду
для инъекций, группа крыс с предварительной в течение месяца алкоголизацией, группа крыс, получивших 0,8 ЛД50 этанола после предварительной алкоголизации. Регистрацию параметров оцениваемых показателей в группах осуществляли через 12 после введения 0,8 ЛД 50 этанола и далее ежедневно в течение
9
9 суток. В группах крыс, получавших лечение, фармакологические препараты
(пикамилон в дозе 300 мг/кг, ноопепт в дозе 30 мг/кг, мемантин в дозе 10 мг/кг)
вводились через 12 часов после введения 0,8 ЛД50 этанола и затем ежедневно на
протяжении 7 суток. Регистрацию оцениваемых показателей осуществляли через 30 минут после инъекции препаратов.
У животных также проводили макроскопическую оценку с определением
массы органов и гистологическое исследование. После декапитации крыс головной мозг извлекали и через 3 минуты фиксировали в 9% растворе нейтрального формалина, проводили через спирты и заливали в парафин по стандартной
методике приготовления гистологических препаратов. Производили ленточные
срезы головного мозга в сагиттальной и горизонтальной плоскостях. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Изготовленные препараты изучали в светооптическом микроскопе Leica (Германия) при 100×, 200× и 400× кратном
увеличении. Животных разделяли на группы по 5 особей: интактные крысы,
которым вводили воду для инъекций; крысы, подвергшиеся острой алкогольной интоксикации (забор материала через 12 часов и через 7 дней после введения 0,8 ЛД50 этанола); крысы, предварительно алкоголизированные в течение 1
месяца; крысы, предварительно алкоголизированные в течение 1 месяца и подвергшиеся острой алкогольной интоксикации (забор материала через 12 часов и
через 7 дней после введения 0,8 ЛД50 этанола). Гистологическое исследование
проводилось в лаборатории патоморфологии ФГБУН ИТ ФМБА России совместно с ведущим научным сотрудником, д.м.н., профессором О.Н. Гайковой и
научным сотрудником К.Л. Авагяном.
Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с использованием программ: BIOSTAT, version 4.03 и Excel
2003 for Windows. Обработка проводилась параметрическим методом с помощью t-критерия Стьюдента. Числовые данные приведены как среднее значение±ошибка среднего. Вывод о статистической достоверности различий между
группами принимали при р < 0,05 и ниже.
2. Результаты исследований и их обсуждение
В качестве токсикометрического параметра этанола в работе была избрана среднесмертельная доза (ЛД50), поскольку она представляет собой наиболее
точную количественную характеристику токсичности вещества с минимальным
значением 95% доверительного интервала и несомненным оцениваемым эффектом (гибель животного) [Куценко С.А., 2004]. Признаки интоксикации этанолом носили дозозависимый характер и проявлялись в прогрессирующем угнетении функций ЦНС с нарастающими расстройствами витальных функций
(дыхания, кровообращения). Токсичность этанола (ЛД50) определяли «табличным экспресс-методом» по В.Б. Прозоровскому. Среднесмертельные дозы
(ЛД50) оценивались в каждой партии полученных для исследования крыс, рассчитанные на 1 сутки после введения этанола они составили: 6,68±0,72;
6,84±1,5; 6,37±0,8 г/кг. Значение ЛД50 при введении этанола предварительно
алкоголизированным животным не отличалось от такового у интактных животных. Для моделирования острого отравления этанолом был выбран внутрибрюшинный путь введения этанола в дозе 0,8 ЛД50, составившей в каждой пар10
тии использованных в работе животных 5,3 г/кг; 5,4 г/кг; 5,1 г/кг. Это позволило стандартизировать схему введения и уменьшить разброс клинических проявлений интоксикации [Башарин В.А., 2011].
Осуществляя наблюдение за крысами, получившими 0,8 ЛД50 этанола, в
различные временные промежутки после внутрибрюшинного введения, нам
удалось проследить в динамике изменение поведенческих и неврологических
показателей от физиологической нормы до глубоко угнетения ЦНС и последующего, визуально оцениваемого, восстановления состояния животных. Значения ИТНН определяли на протяжении 12 часов наблюдения после внутрибрюшинного введения этанола в дозе 0,8 ЛД50 у каждого животного взятого в
эксперимент.
В дальнейшем в экспериментальные группы крыс, подвергшихся острому
отравлению этанолом и последующей фармакологической коррекции без предварительной алкоголизации, а также на фоне предварительной алкоголизации,
отбирались животные, перенёсшие состояние, эквивалентное глубокой коме у
человека (ИТНН = 18-25 баллов через 2 часа после введения 0,8 ЛД50 этанола) и
достигшие уровня физиологической нормы (ИТНН = 55 баллов) через 12 часов
после отравления этанолом. У животных, достигших подобного значения
ИТНН в данном временном интервале, предполагалась 100% выживаемость,
что и подтвердилось на протяжении последующего наблюдения за ними в течение эксперимента (9 суток).
Таким образом, осуществляя наблюдение за крысами, получившими 0,8
ЛД50 этанола, в различные временные промежутки после внутрибрюшинного
введения, с помощью использования ИТНН нам удалось проследить в динамике изменение поведенческих и неврологических показателей от физиологической нормы до глубокого угнетения ЦНС и последующего, визуально оцениваемого, восстановления состояния животных.
Оценка поведенческих, неврологических и морфологических нарушений
у крыс после тяжёлой формы острого отравления этанолом
Оценка состояния поведения и двигательной активности крыс с использованием метода открытое поле, позволила установить снижение двигательной
активности крыс за счёт уменьшения горизонтальных перемещений на протяжении 3 суток после отравления (Таблица 1). Острая интоксикация этанолом
вызывала нарушение регистрируемых в крестообразном лабиринте более сложных форм поведения: исследовательской активности, пространственной ориентации и уровня мотивации. Следует отметить, что при использовании обоих
методов у интактных животных при повторных тестированиях проявлялся феномен «неассоциативного обучения», выражавшийся последовательным снижением показателей двигательной, ориентировочной и исследовательской активности при помещении крыс в уже знакомую обстановку. У крыс, перенёсших острое тяжёлое отравление этанолом, характер динамики изменения двигательной активности не соответствовал критериям «неассоциативного обучения», что говорит об искажении под его влиянием естественных процессов сохранения и угасания навыка.
11
Таблица 1 – Состояние общей двигательной активности и пространственной ориентации крыс после острого отравления этанолом
Группы животных
Время наблюдения после введения этанола (0,8 ЛД50)
(n=12)
12 часов
1 сутки
3 сутки
5 сутки
7 сутки
9 сутки
Уровень общей двигательной активности в «открытом поле» (М±m, кол-во актов)
Интактные
48,8±6,1
25,3±3,9
17,8±2,2
10,3±1,0
4,3±0,9
2,9±0,6
0,8 ЛД50 этанола
9,5±1,8*
9,4±2,3*
9,8±2,9*
9,8±2,0
7,7±0,5*
4,1±1,3
Время полного обхода лабиринта у крыс в крестообразном лабиринте (М±m, сек.)
1 сутки
5 сутки
9 сутки
Интактные
74,2±10,5
39,4±5,2
18,9±1,1
0,8 ЛД50 этанола
284,3±10,1*
283,0±12,7*
289,7±7,3*
Примечание –*– по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05)
Данные полученные в тестах «вращающийся стержень» и «сила хватки»
могут рассматриваться как проявление нейромоторных нарушений у крыс, перенёсших тяжёлое отравление этанолом, приводящих к расстройствам двигательной координации, равновесия и развитию мышечной слабости (Таблица 2).
Таблица 2 – Состояние нейромоторных функций крыс после острого отравления этанолом
Группы животных (n=12)
Время наблюдения после введения этанола (0,8 ЛД50)
12 часов
1 сутки
3 сутки
Продолжительность удерживания крыс на вращающемся стержне (М±m, сек.)
Интактные
597,4±1,9
595,9±3,1
595,2±3,3
0,8 ЛД50 этанола
176,1±36,6*
255,6±44,2*
562,1±14,0*
Динамика изменения силы хватки (М±m, Н)
Интактные
15,0±0,9
15,8±1,1
14,3±0,9
0,8 ЛД50 этанола
9,5±0,3*
10,1±0,3*
11,8±0,4*
Примечание –*– по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05)
Полученные результаты при изучении состояния выработки и сохранения
УРАИ плавания у крыс позволили заключить, что одним из последствий тяжёлого острого отравления этанолом являются когнитивные нарушения, выражающиеся у экспериментальных животных расстройствами процессов памяти и
обучения. После введения этанола в дозе 0,8 ЛД50 у предварительно обученных
крыс в течение первых суток наблюдалось достоверное увеличение времени
плавания (латентного периода УРАИ) по сравнению с интактной группой животных, что свидетельствовало о нарушении процесса сохранения приобретённого навыка и его воспроизведения. Острое отравление этанолом приводило к
нарушению процесса приобретения навыка, о чём свидетельствовало достоверное увеличение времени плавания у животных в течение 9 суток тестирования
УРАИ. Причём данное нарушение носило волнообразный характер – мнимое,
недостоверное улучшение с последующим более сильным ухудшением на 3 и 7
сутки тестирования (Таблица 3).
12
Таблица 3 – Состояние когнитивных функций у крыс после острого отравления этанолом (М±m, сек.)
Группы животных
(n=12)
Время наблюдения после введения этанола (0,8 ЛД50)
12 часов
1 сутки
Латентный период УРАИ плавания у предварительно обученных крыс
Интактные
14,6±3,0
13,6±2,2
0,8 ЛД50 этанола
33,1±7,7*
26,4±4,9*
Латентный период УРАИ плавания у предварительно не обученных крыс
12 часов
1 сутки
3 сутки
5 сутки
7 сутки
9 сутки
Интактные
28,7±3,8 13,6±2,7 8,7±0,6
4,7±0,6
5,1±0,5
4,9±0,5
0,8 ЛД50 этанола
72,4±10,8* 5,2±2,8* 42,8±4,8* 29,9±7,0* 57,7±11,0* 26,6±4,2*
Примечание –*– по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05)
Показанное нами снижение болевой чувствительности крыс, перенёсших
тяжёлую острую интоксикацию этанолом, является проявлением нейротоксического поражения, приводящего к нарушениям сенсорной функции (Таблица 4).
Таблица 4 – Состояние болевой чувствительности у крыс после острого
отравления этанолом
Время наблюдения после введения этанола (0,8 ЛД50)
12 часов
1 сутки
2 сутки
3 сутки
Время отдёргивания хвоста при предъявлении термического стимула (M±m, сек.)
Интактные
7,8±0,4
7,5±0,7
5,8±0,3
4,9±1,1
0,8 ЛД50 этанола
37,1±3,0*
28,3±4,4*
12,1±0,6*
10,1±0,9*
Сила сдавления лапы, приводящая к защитной реакции (M±m, г)
Интактные
245,0±12,4
244,2±22,7
251,7±17,4
202,1±5,5
0,8 ЛД50 этанола
607,5±49,2*
583,3±42,1*
394,2±23,7*
234,2±10,2*
Примечание –*– по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05)
Группы животных (n=12)
Проведённые морфологические исследования структур головного мозга
крыс (кора головного мозга, мозжечок, подкорковые ядра и гиппокамп), перенёсших тяжёлую форму острого отравления этанолом показали наличие патологических нарушений, в основном проявлявшиеся в виде набухания и сморщивания нейронов. Хотя морфологическая картина не отличалась у животных
через 12 часов и 7 суток после отравления, в ряде структур мозга отмечали диапедезные кровоизлияния и мелкие очаги некроза, свидетельствующие о проявлениях нейропатологических процессов, несмотря на прекращение действия
токсиканта.
Оценка поведенческих, неврологических и морфологических нарушений
у крыс, перенёсших тяжёлую форму острого отравления этанолом на фоне
предварительной алкоголизации
Установлено, что сама по себе хроническая алкоголизация в течение месяца приводит к изменениям двигательной активности и различных форм поведения экспериментальных животных. Острое отравление этанолом на фоне
предварительной алкоголизации увеличивает выраженность поведенческих нарушений и угнетения двигательной активности. В этих сериях опытов, как и в
предыдущей главе, у интактных животных по ряду показателей поведения проявился феномен «неассоциативного» обучения. У крыс с хронической алкого13
лизацией отмечалась тенденция к сохранению этого феномена. В то же время у
животных, перенёсших тяжёлое острое отравление на фоне предварительного
внутрижелудочного введения этанола в течение одного месяца, отсутствовали
признаки естественного угасания двигательной и исследовательской активности в ходе повторных тестирований этих показателей (Таблица 5).
Таблица 5 – Состояние общей двигательной активности крыс в «открытом поле» после предварительной алкоголизации и введения 0,8 ЛД50 этанола
(М±m, кол-во актов)
Группы животных
(n=12)
Время наблюдения после прекращения предварительной алкоголизации и введения этанола (0,8 ЛД50)
12 часов
1 сутки
3 сутки
5 сутки
7 сутки
9 сутки
Интактные
48,8±5,2
25,3±2,7 17,8±2,2 10,3±0,8
4,3±0,3
2,9±0,8
Предварительная
15,3±2,7* 13,7±3,5* 14,7±2,8 14,3±2,6 11,8±1,6*
7,5±1,5*
алкоголизация (ПА)
ПА + 0,8 ЛД50 эта9,0±1,5*• 3,7±1,9*• 3,7±1,5• 11,7±5,4 16,5±1,5*• 16,0±2,2*•
нола
Примечания
* – по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05);
• – по сравнению с группой предварительно алкоголизированных животных (р < 0,05).
При использовании крестообразного лабиринта установлено, что хроническая алкоголизация снижает способность животных к пространственной ориентации и ухудшает их мотивационную активность, на что указывало увеличение латентного периода выхода с центральной площадки и времени полного
обхода лабиринта по сравнению с интактными крысами. Острое отравление
этанолом приводило к ещё большему увеличению латентного периода выхода с
центральной площадки и выраженному достоверному снижению исследовательской активности крыс (кол-во посещённых тупиков) по сравнению с группой интактных животных и группой крыс с хронической алкоголизацией (Таблица 6).
Таблица 6 – Состояние показателей, регистрируемых в крестообразном
лабиринте у крыс после введения этанола в дозе 0,8 ЛД50 на фоне предварительной алкоголизации
Группы животных
(n=12)
Время наблюдения после прекращения предварительной
алкоголизации и введения этанола (0,8 ЛД50)
12 часов (1 сутки)
5 сутки
9 сутки
Латентный период выхода с центральной площадки (М±m, сек.)
Интактные
3,6±0,6
10,2±0,9
15,9±3,7
Предварительная алко11,3±2,4*
13,2±1,1*
18,7±3,7
голизация (ПА)
ПА + 0,8 ЛД50 этанола
29,3±5,3*•
24,2±3,1*•
32,6±4,5*•
Время полного обхода лабиринта (М±m, сек.)
Интактные
86,7±9,8
51,3±4,5
18,7±1,9
ПА
300,0±0,0*
300,0±0,0*
300,0±0,0*
ПА + 0,8 ЛД50 этанола
300,0±0,0*•
300,0±0,0*•
300,0±0,0*•
14
Группы животных
(n=12)
Время наблюдения после прекращения предварительной
алкоголизации и введения этанола (0,8 ЛД50)
12 часов (1 сутки)
5 сутки
9 сутки
Количество посещенных тупиков за 4 минуты (М±m, кол-во движений)
Интактные
12,3±0,9
7,6±0,7
6,9±0,9
ПА
10,3±1,1
5,8±0,9
3,9±0,9
ПА + 0,8 ЛД50 этанола
1,2±0,3*•
1,1±0,2*•
1,8±0,6*•
Примечания
* – по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05);
• – по сравнению с группой предварительно алкоголизированных животных (р < 0,05).
Проведённые в этом разделе исследования также позволили установить,
что ежедневное в течение одного месяца внутрижелудочное введение этанола
вызывает неврологические нарушения у экспериментальных животных, приводящие к нарушению координации движений, равновесия и мышечной слабости.
Острое тяжёлое отравление этанолом крыс на фоне предварительной алкоголизации не привело к усилению нарушения координации движений, однако достоверно увеличило снижение силы хватки (Таблица 7).
Таблица 7 – Состояние нейромоторных функций после введения этанола
в дозе 0,8 ЛД50 на фоне предварительной алкоголизации
Время наблюдения после прекращения предварительной алкоголизации и введения 0,8 ЛД50 этанола
12 часов (1 су3 сутки
5 сутки
7 сутки
тки)
Продолжительность удерживания крыс на вращающемся стержне (М±m, сек.)
Интактные
594,7±3,2
594,8±3,2
593,3±4,1
592,2±4,2
Предварительная алко194,8±35,1*
211,7±41,9*
195,2±26,1*
350,8±26,0*
голизация (ПА)
ПА + 0,8 ЛД50 этанола
134,8±10,9*
188,2±17,5*
193,8±21,2*
358,4±24,0*
Динамика изменения силы хватки (M±m, Н)
Интактные
14,3±0,6
15,8±1,1
16,3±0,8
16,1±0,7
ПА
9,5±0,7*
10,7±0,4*
10,3±0,6*
10,2±0,4*
ПА + 0,8 ЛД50 этанола
5,8±0,3*•
6,0±0,4*•
7,8±0,4*•
7,8±0,7*•
Примечания
* – по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05);
• – по сравнению с группой предварительно алкоголизированных животных (р < 0,05).
Группы животных
(n=12)
В результате проведённых в данном разделе исследований нами показано,
что хроническая алкоголизация крыс по использованной нами схеме сама по
себе приводит к нарушению когнитивных функций экспериментальных животных, выражающихся в ухудшении процесса обучения (по тесту УРАИ) и нарушении памяти (по тесту УРПИ). Острое отравление этанолом предварительно
алкоголизированных крыс с выработанным навыком избегания показало их неспособность воспроизвести навык в течение первых суток после интоксикации
и ухудшение его воспроизведения на протяжении всего периода последующего
наблюдения. При этом наряду с нарушением обучения страдают и процессы
сохранения навыка, что было подтверждено при использовании теста УРПИ по
15
уменьшению латентного периода реакции при её повторных тестированиях через 12 и 24 часа после обучения (Таблицы 8, 9).
Таблица 8 – Влияние введения этанола в дозе 0,8 ЛД50 на продолжительность плавания в тесте УРАИ у предварительно алкоголизированных животных
(M±m, сек.)
Группы животных (n=12)
Время наблюдения после введения 0,8ЛД50 этанола
12 часов
1 сутки
3 сутки
5 сутки
7 сутки
4,1±0,3
4,4±0,2
5,1±1,0
4,9±0,9
4,2±0,4
Интактные
Предварительная алкоголизация
7,1±0,9*
7,3±1,3*
7,8±0,7*
7,9±1,1* 6,9±1,2*
(ПА)
ПА + 0,8 ЛД50 этанола
63,4±4,4*• 55,8±3,4*• 40,7±1,3*• 27,9±3,1* 17,5±0,9*
Примечания
* – по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05);
• – по сравнению с группой предварительно алкоголизированных животных (р < 0,05).
Таблица 9 – Изменение латентного периода (ЛП) УРПИ после введения
этанола в дозе 0,8 ЛД50 на фоне предварительной алкоголизации (M±m, сек.)
Группы животных (n=12)
ЛП0
ЛП12 – ЛП0
ЛП24 – ЛП0
Интактные
20,5±2,9
99,5±3,4
99,5±3,4
Предварительная алкоголизация (ПА)
19,3±2,7
52,4±3,1*
25,9±2,6*
ПА + 0,8 ЛД50 этанола
18,0±1,6
31,2±2,3*•
11,2±1,4*•
Примечания
* – по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05);
• – по сравнению с группой предварительно алкоголизированных животных (р < 0,05).
Показано, что одним из последствий хронической алкоголизации является нарушение процессов ноцицепции, выражающихся уменьшением болевой
чувствительности экспериментальных животных. В ещё большей степени уровень болевого восприятия страдает после острого отравления этанолом хронически алкоголизированных крыс (Таблица 10).
Таблица 10 – Влияние этанола в дозе 0,8 ЛД50 на болевую чувствительность крыс на фоне предварительной алкоголизации
Время наблюдения после прекращения предварительной алкоголизации и
введения этанола (0,8 ЛД50)
12 часов
1 сутки
3 сутки
5 сутки
7 сутки
Время отдёргивания хвоста при предъявлении термического стимула (M±m, сек.)
Интактные
7,7±0,5
7,3±1,0
6,0±1,0
6,1±1,0
6,2±0,9
Предв. алкого25,8±3,8*
15,6±2,3*
15,0±1,5*
13,8±1,4*
12,7±0,8*
лизация (ПА)
ПА + 0,8 ЛД50
36,0±2,6*•
25,0±1,8*•
20,0±1,8*•
19,5±2,1*•
18,7±1,5*•
этанола
Сила сдавления лапы, приводящая к защитной реакции (M±m, г)
Интактные
234,2±11,9
240,0±13,0
241,7±13,6
244,6±11,2
235,0±14,2
ПА
410,0±41,8*
402,5±40,9*
382,5±25,4*
375,8±29,6* 360,0±23,7*
ПА + 0,8 ЛД50 540,8±24,1•
527,5±31,6*•
430,8±31,8*
385,0±28,4* 358,3±26,8*
этанола
Примечания
* – по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05);
• – по сравнению с группой предварительно алкоголизированных животных (р < 0,05).
Группы животных (n=12)
16
Проведение морфологического анализа структур головного мозга крыс
(кора головного мозга, мозжечок, мягкая мозговая оболочка), перенёсших хроническую алкоголизацию показало наличие различных сосудистых нарушений
в оболочках мозга и паренхиме, сморщивание и гибель отдельных нейронов коры головного мозга и мозжечка. Острое отравление этанолом на фоне предварительной алкоголизации усилило данные явления и привело к развитию дистрофических изменений сосудистой стенки микроциркуляторного русла, увеличению количества клеток нейроглии, образованию микрополостей заполненных экссудатом и выраженному снижению количества отростков нейронов, что
говорит о возможном развитии алкогольной энцефалопатии.
Фармакологическая коррекция нейротоксических поражений у крыс
после тяжёлой формы острого отравления этанолом
С целью фармакологической коррекции последствий нейротоксического
действия этанола крысам вводили однократно пикамилон (300 мг/кг, в/б), ноопепт (30 мг/кг, в/б) и сочетание пикамилона и ноопепта (соответственно 300
мг/кг и 30 мг/кг, в/б) через 12 часов после введения этанола в дозе 0,8 ЛД50.
Оценивалось состояние поведения, моторных, когнитивных и сенсорных функций у крыс непосредственно через 30 минут после введения препаратов, а также динамика их восстановления на протяжении последующего наблюдения за
животными в течение нескольких суток.
Проведённые в данном разделе исследования позволили установить возможность фармакологической коррекции поведенческих, двигательных, мнестических и ноцицептивных нарушений у крыс, перенёсших острое тяжёлое отравление этанолом.
Наряду с улучшением показателей общей двигательной активности, пространственной ориентации и исследовательской активности непосредственно
после введения всех исследованных препаратов, под влиянием однократного
введения пикамилона, ноопепта и их сочетания, динамика изменения нарушенных функций продемонстрировала восстановление у этих животных естественных процессов неассоциативного обучения. С помощью метода «открытое поле» установлено достоверное увеличение уровня общей двигательной активности, существенно сниженное у крыс через 12 часов после введения 0,8 ЛД50
этанола, хотя этот показатель не достигал соответствующего значения у интактных животных.
Использование крестообразного лабиринта позволило продемонстрировать, что под влиянием средств фармакологической коррекции улучшаются такие формы поведения животных, отравленных этанолом, как способность к
пространственной ориентации и уровень исследовательской активности. Если у
крыс, получивших этанол в дозе 0,8 ЛД50, на протяжении 9 суток наблюдения
время полного обхода лабиринта приближалось к максимальному сроку наблюдения (300 секунд), то в случае однократного введения исследованных препаратов за 30 минут до тестирования наблюдалось значительное уменьшение
этого показателя. Наиболее выраженное улучшение по этому тесту было отмечено при совместном введении пикамилона и ноопепта (Рисунок 1, А). Через 12
часов после введения 0,8 ЛД50 этанола нами показано, что крысы не смогли по17
сетить ни один из тупиков лабиринта в течение 4 минут наблюдения, что свидетельствовало о резком снижении у этих животных уровня исследовательской
активности. В это же время под влиянием использованных фармакологических
препаратов произошло достоверное улучшение этого показателя, причём совместное введение пикамилона и ноопепта практически позволило достичь
среднего значения, наблюдавшегося у интактных животных (Рисунок 1, Б).
14
350
Время, с
250
200
*
*º
*
*
*º
*º
150
12
10
*º *º
Кол-во тупиков, число актов
300
*º
*º *º *º
100
50
0
5 сутки
9 сутки
º
º º º
4
*
2
*
*
12 часов (1 сутки)
Время наблюдения после введения этанола (0,8 ЛД50)
Интактные
Этанол
Этанол + Пикамилон
Этанол + Ноопепт
Этанол + Пикамилон + Ноопепт
º º
6
0
12 часов (1 сутки)
º
*º *º
8
5 сутки
9 сутки
Время наблюдения после введения этанола (0,8 ЛД50)
Примечания: * - достоверно, по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05);
º - достоверно, по сравнению с группой 0,8 ЛД50 этанола (р < 0,05).
А
Б
Рисунок 1 – Время полного обхода лабиринта (А) и уровень исследовательской активности
(Б) в крестообразном лабиринте у крыс после фармакологической коррекции острого отравления этанолом (0,8 ЛД50), n в группе = 12
Такие показатели моторики как координация движений и сила хватки при
использовании пикамилона, ноопепта и в особенности их сочетания восстанавливались уже на раннем этапе после острой интоксикации этанолом. Однократное введение пикамилона, ноопепта и их сочетания достоверно увеличивало
время удерживания крыс на вращающемся стержне, начиная с 12 часов после
интоксикации. На 3 сутки наблюдения время удерживания крыс во всех опытных группах нормализовалось (Рисунок 2, А). Только в случае совместного
введения пикамилона и ноопепта наблюдалась нормализация силы хватки животных через 12 часов после отравления этанолом. На 3 сутки наблюдения во
всех группах с использованием средств фармакологической коррекции среднее
значение силы хватки достоверно не отличалось от данного показателя у интактных животных, в то время как в группе крыс без лечения сохранялся дефицит мышечной силы (Рисунок 2, Б).
18
700
18
*º
600
*
16
*º
400
12
*
*
300
*
200
º
14
Сила, Н
Время, с
500
º *º
º
*
10
*
*º*º
º
*
*
*
8
6
4
100
2
0
0
12 часов
1 сутки
12 часов
3 сутки
3 сутки
Время наблюдения после введения этанола 0,8 ЛД50
Время наблюдения после введения этанола 0,8 ЛД50
Интактные
Этанол + Пикамилон
Этанол + Пикамилон + Ноопепт
1 сутки
Этанол
Этанол + Ноопепт
Примечания: * - достоверно, по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05);
º - достоверно, по сравнению с группой 0,8 ЛД50 этанола (р < 0,05).
А
Б
Рисунок 2 – Продолжительность удерживания крыс на вращающемся стержне (А) и динамика изменения силы хватки крыс после фармакологической коррекции острого отравления
этанолом (0,8 ЛД50), n в группе = 12
Установлено, что однократное введение пикамилона и пикамилона совместно с ноопептом уже через 12 часов после отравления этанолом способствовало нормализации процессов памяти и обучения. Использование ноопепта
на раннем этапе после острой алкогольной интоксикации способствовало
улучшению процессов сохранения выработанного навыка (Рисунок 3, А).
Оценка состояния УРАИ плавания у крыс без предварительного обучения показала, что острое отравление этанолом приводило к нарушению выработки навыка на протяжении 9 суток обучения. Однократное введение исследованных
препаратов предотвращало подобное действие этанола на динамику выработки
УРАИ – у животных регистрировалось последовательное укорочение латентного периода реакции при её последующих тестированиях, что соответствует естественным процессам формирования следа памяти. При этом введение пикамилона достоверно снижало время плавания, начиная уже с первых суток после
интоксикации этанолом, а достоверное нормализующее действие ноопепта начинало проявляться с 3 суток (Рисунок 3, Б).
45
35
80
*
Время, с
30
15
Этанол
*
60
Этанол + Ноопепт
50
25
20
*
70
*
º
º
Время, с
40
º
40
º
10
º
º
30
Этанол + Пикамилон
º
Этанол + Пикамилон +
Ноопепт
*
Интактные
ºº
º
º
10
0
12 часов
*
*
20
5
*
º
º
º
º
0
1 сутки
12 часов
Время наблюдения после введения этанола 0,8 ЛД50
1 сутки
3 сутки
5 сутки
7 сутки
º
º
9 сутки
Время наблюдения после введения этанола 0,8 ЛД50
Интактные
Этанол + Пикамилон
Этанол + Пикамилон + Ноопепт
Этанол
Этанол + Ноопепт
Примечания: * - достоверно, по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05);
º - достоверно, по сравнению с группой 0,8 ЛД50 этанола (р < 0,05).
А
Б
Рисунок 3 – Латентный период УРАИ плавания у предварительно обученных крыс (А) и у
предварительно не обученных крыс в ходе их обучения в течение 9 суток (Б) после фармакологической коррекции острого отравления этанолом (0,8 ЛД50), n в группе = 12
19
Под влиянием средств фармакологической коррекции: пикамилона и ноопепта происходила нормализация процессов ноцицепции, нарушенных вследствие токсического действия этанола. В наиболее выраженной степени этот
эффект проявлялся при сочетанном использовании пикамилона и ноопепта.
Фармакологическая коррекция нарушений когнитивных функций у
крыс после тяжёлой формы острого отравления этанолом на фоне
предварительной алкоголизации
Одним из последствий острого отравления этанолом крыс на фоне их
предварительной алкоголизации явилось выраженное нарушение процессов
памяти и обучения. В силу этих обстоятельств было изучено влияние повторного ежедневного введения фармакологических препаратов: пикамилона, ноопепта и мемантина (соответственно в дозах 300 мг/кг, 30 мг/кг и 10 мг/кг в/б на
введение) на состояние УРАИ плавания. С целью выяснения влияния фармакологических препаратов на процессы памяти исследовано состояние сохранения
навыка по избеганию электроболевого раздражения с использованием метода
УРПИ.
В результате проведённых исследований установлено, что ежедневное
введение исследованных фармакологических препаратов в течение 7-и суток
после острого отравления этанолом способствовало улучшению оцениваемого
показателя УРАИ – латентного периода избегания плавания. Однако время
проявления и степень выраженности корригирующего влияния препаратов отличались. Если эффект пикамилона достигал своего максимума, начиная с 3-х
суток тестирования УРАИ, то под влиянием ноопепта значительное укорочение
времени плавания наблюдалось уже в первый день его введения. Эффект мемантина проявился только с 3-го дня после его введения (Рисунок 4, А). Достоверное улучшение выработанного навыка по методу УРПИ, нарушенного
вследствие острого отравления этанолом, наблюдалось при использовании пикамилона, ноопепта и мемантина. Важно отметить, что в группе у предварительно алкоголизированных крыс и в группе животных, перенёсших после этого острое отравление этанолом, амнезический эффект через 24 часа проявлялся
ещё в большей степени, чем через 12 часов после введения 0,8 ЛД50 этанола. В
то же время под влиянием средств фармакологической коррекции воспроизведение выработанного навыка через 24 часа оказалось на более высоком уровне,
чем в ранний срок тестирования реакции, что может быть свидетельством их
нормализующего влияния на нарушенные процессы фиксации (консолидации)
условной связи (Рисунок 4, Б).
20
120
70
ПА + Этанол
*•
60
50
*•
80
*•
Время, с
40
ПА + Этанол + Ноопепт
30
*
*•▪
*•▪
20
10
Предварительная
алкоголизация (ПА)
*
0
*
*•▪
*•▪
*
1 сутки
3 сутки
40
*•▪
*•
*•▪
*▪
*
*▪
* *•▪
*
*
*
20
5 сутки
7 сутки
9 сутки
0
Интактные
12 часов
60
*
*•▪
*•▪ *•▪ *•▪
ПА + Этанол + Пикамилон
*•▪
В ремя, с
100
*•
ПА + Этанол + Мемантин
*•▪
*
*•
*
*•
ЛП2 – ЛП0
Время наблюдения после прекращения предварительной алкоголизации (ПА) и введения этанола 0,8 ЛД50
Примечания: * - достоверно, по сравнению с группой интактных животных (р < 0,05);
• - достоверно, по сравнению с группой ПА (р < 0,05);
▪ - достоверно, по сравнению с группой ПА + 0,8 ЛД50 этанол (р < 0,05).
ЛП24 – ЛП0
Интактные
ПА + Этанол
ПА + Этанол + Ноопепт
А
*•▪ *•▪
Предварительная алкоголизация (ПА)
ПА + Этанол + Пикамилон
ПА + Этанол + Мемантин
Б
Рисунок 4 – Изменение продолжительности плавания в тесте УРАИ (А) и изменение латентного периода (ЛП) в тесте УРПИ (Б) после фармакологической коррекции острого отравления этанолом (0,8 ЛД50) на фоне предварительной алкоголизации, n в группе = 12
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведённых экспериментов установлено, что у крыс, вышедших из острого периода отравления этанола в дозе 0,8 ЛД50 и достигших
уровня физиологической нормы (по значениям ИТНН), с помощью использованной батареи тестов объективно регистрировались изменения различных
форм поведения, двигательной активности, нейромоторной функции, процессов
обучения и памяти и болевой чувствительности. Выявленные нарушения могут
моделировать нейротоксические поражения, наблюдаемые у человека в соматогенной стадии тяжёлых форм алкогольных интоксикаций.
Острое отравление этанолом на фоне предварительной алкоголизации
увеличивало выраженность и продолжительность поведенческих и когнитивных нарушений у крыс (угнетение мотивации, снижение двигательной и исследовательской активности, нарушения обучения и памяти). Наряду с этим введение этанола (0,8 ЛД50) предварительно алкоголизированным животным приводило к ещё большему ослаблению у них силы хватки, свидетельствуя о потенцировании моторной нейротоксичности. Установлено, что одним из последствий хронической алкогольной интоксикации является уменьшение болевой
чувствительности крыс. Уровень болевого восприятия угнетался ещё в большей
степени в результате последующего острого отравления этих животных этанолом.
Проведённые исследования позволили установить эффективность пикамилона и ноопепта, а также их сочетания как средств фармакологической коррекции нейротоксических поражений в соматогенной стадии острого тяжёлого
отравления этанолом. Нормализующее влияние пикамилона и ноопепта, а также их сочетания на различные проявления нейротоксического действия этанола
с нашей точки зрения объясняется нейропротективными свойствами этих препаратов, их способностью обеспечивать неспецифическую адаптацию ЦНС к
повреждающим факторам различного генеза, в том числе к экзогенным химическим воздействиям.
21
Ноопепт и пикамилон, проявившие свои нейропротективные свойства после острой интоксикации этанолом, также оказались эффективными в отношении нормализации нарушенных процессов выработки и сохранения навыка избегания плавания у животных, подвергнутых предварительной алкоголизации.
Под влиянием мемантина, обладающего нейромедиаторным действием (блокирующего NMDA-рецепторы), в данной постановке эксперимента достоверный
нормализующий эффект по тесту УРАИ начинал проявляться только с третьего
дня его введения. Улучшение показателей УРПИ при тестировании реакции через 12 и 24 часа после обучения свидетельствует о нормализующем влиянии
исследованных препаратов на нарушенные под действием этанола процессы
фиксации и консолидации следа памяти.
В целом, полученные результаты позволяют заключить о перспективности использования фармакологических препаратов, обладающих нейропротективным (ноотропным, нейромодулирующем и нейромедиаторным действием) в
качестве средств коррекции последствий нейротоксического действия этанола.
Выводы:
1. Внутрибрюшинное введение белым крысам этанола в дозе 0,8 ЛД50
проявляется комплексом поведенческих и неврологических показателей, изменяющихся от физиологической нормы до глубокого угнетения ЦНС и последующего визуально оцениваемого восстановления состояния животных в соматогенной стадии отравления.
2. Последствием тяжёлой формы острого отравления этанолом (0,8 ЛД50),
наряду с депримирующим действием, является нарушение сложных форм поведения (уровень мотивации, пространственная ориентация, исследовательская
активность), когнитивных функций (память, способность к обучению), неврологических показателей (координация движений и сила хватки), болевой чувствительности, регистрируемой у крыс на протяжении от 7 до 9 суток после воздействия токсиканта.
3. Хроническая алкоголизация крыс, достигавшаяся путём ежедневного в
течение месяца внутрижелудочного введения субтоксических доз этанола, приводит к поведенческим и неврологическим расстройствам, которые проявляются в виде угнетения психомоторной активности, нарушения процессов обучения и памяти, повышения уровня ноцицепции.
4. В результате острого отравления этанолом предварительно алкоголизированных животных происходит усиление расстройств, выявленных при хронической алкоголизации. В особенности страдают процессы обучения и памяти: через 12 часов после ведения этанола в дозе 0,8 ЛД50 и прекращения предварительной алкоголизации крысы продемонстрировали неспособность к воспроизведению выработанного навыка избегания (по тесту УРАИ), у них также
отмечается нарушение фиксации и воспроизведения следа памяти (по тесту
УРПИ).
5. Патоморфологические исследования различных структур головного
мозга крыс подтверждают непосредственное нейротоксическое действие этанола. Острое отравление этанолом характеризуется морфологическими изменениями в виде набухания и сморщивания отдельных нейронов коры, мозжечка,
22
подкорковых ядер и гиппокампа. В результате хронической алкогольной интоксикации отмечаются нарушения сосудистой проницаемости в оболочках и паренхиме головного мозга. Острое отравление этанолом на фоне предшествующей алкоголизации приводит к усилению выявленных гистологических изменений, к развитию периваскулярного и перицеллюлярного отёка мозговой ткани в сочетании с нейродегенеративными проявлениями (гибель нейронов коры
и мозжечка, образование микрополостей).
6. Однократное введение пикамилона в дозе 300 мг/кг и ноопепта –
30 мг/кг в экспериментальной терапии последствий острого отравления, вызванного введением этанола в дозе 0,8 ЛД50, приводит к улучшению показателей общей двигательной активности, пространственной ориентации и исследовательской активности, способствует восстановлению моторики (координации
движений и силы хватки), нормализации процессов памяти и обучения, уровня
болевой чувствительности уже на раннем этапе соматогенной стадии отравления.
7. В наиболее выраженной степени в экспериментальной терапии острого
отравления, вызванного введением этанола в дозе 0,8 ЛД50, восстановление нарушенных показателей, наблюдается при сочетанном использовании пикамилона (300 мг/кг) и ноопепта (30 мг/кг).
8. Курсовое введение (в течение 7-и суток) нейропротекторов – пикамилона в дозе 300 мг/кг и ноопепта – 30 мг/кг в экспериментальной терапии последствий острого отравления, вызванного введением этанола (0,8 ЛД50) на фоне предварительной алкоголизации, приводит к нормализации когнитивных
функций у крыс, начиная с первого дня введения препаратов с последующим
усилением лечебного эффекта при повторных введениях (по тесту УРАИ). Достоверный лечебный эффект курсового введения (в течение 7 суток) блокатора
NMDA-рецепторов мемантина в дозе 10 мг/кг проявлялся только с 3-го дня после его введения.
9. Изучение антиамнезической активности пикамилона, ноопепта и мемантина по тесту УРПИ свидетельствует о нормализующем влиянии препаратов на нарушенные под действием этанола процессы фиксации (консолидации)
и воспроизведения следа памяти.
Научно-практические рекомендации и перспективы дальнейшей
разработки темы:
Результаты выполненных исследований рекомендуется использовать:
– для разработки методических рекомендаций по доклинической оценке
лекарственных средств, предлагаемых для фармакологической коррекции нейротоксических поражений у лиц, перенёсших тяжёлые отравления алкоголем;
– для обоснования включения лекарственных препаратов, разрешённых к
медицинскому применению в Российской Федерации в схемы лечебных и восстановительных мероприятий после алкогольных отравлений;
– для отбора и внесения предложений по использованию перспективных
лекарственных средств по новому назначению в качестве нейропротекторов
при острой и хронической алкогольной интоксикации и разработки соответствующих дополнений в инструкции по применению этих препаратов.
23
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
1. Долго-Сабуров, В.Б. Центральные нейрохимические эффекты острого и хронического воздействия этанола. Механизмы толерантности и зависимости (обзор литературы) / В.Б. Долго-Сабуров, А.Н. Петров, Д.С. Лисицкий, В.А. Беляев // Биомедицинский журнал Medline.ru. – 2011. – Т. 12. –
С. 1423-1436.
2. Лисицкий, Д.С. Фармакологическая коррекция нейротоксических
поражений у белых крыс после тяжёлой формы острой алкогольной интоксикации / Д.С. Лисицкий, А.Н. Петров, М.К. Шевчук // Токсикологический вестник. – 2013. – № 1. – С. 19-23.
3. Башарин, В.А. Сравнительная эффективность семакса при различных
путях введения на фоне отравления этанолом / В.А. Башарин, Н.Ф. Маркизова,
Д.С. Лисицкий // Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии: тезисы
Российской научной конференции с международным участием, СанктПетербург, 19-20 мая 2011 г. – СПб: ООО «Издательство Фолиант», 2011. –
С.193.
4. Макарова, Н.В. Математическое моделирование депримирующих эффектов в эксперименте / Н.В. Макарова, Е.Ю. Бонитенко, А.Н. Гребенюк, В.А.
Башарин, М.Б. Иванов, Д.С. Лисицкий // Актуальные проблемы токсикологии и
радиобиологии: тезисы Российской научной конференции с международным
участием, Санкт-Петербург, 19-20 мая 2011 г. – СПб: ООО «Издательство Фолиант», 2011. – С.109.
5. Лисицкий, Д.С. Экспериментальное исследование динамики восстановления функций центральной нервной системы после острой алкогольной интоксикации / Д.С. Лисицкий // Материалы всероссийской молодёжной конференции-школы «Нейробиология интегративных функций мозга», СанктПетербург, 21-25 ноября 2011 г. – СПб: Медицинский академический журнал,
2011. – Т. 11, спец. выпуск. – С.39.
6. Лисицкий, Д.С. Экспериментальная фармакотерапия нарушений когнитивных функций и поведения белых крыс при тяжёлой форме острой алкогольной интоксикации / Д.С. Лисицкий // Материалы Всероссийского симпозиума,
посвящённого 50-летию со дня основания ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России
«Медико-биологические аспекты обеспечения химической безопасности Российской Федерации», Санк-Петербург, 17 февраля 2012 г. – СПб: ЭЛБИ-СПб,
2012. – С.168-169.
7. Лисицкий, Д.С. Использование ноопепта для экспериментальной терапии нарушений когнитивных функций и поведения у белых крыс при тяжёлой
форме острой алкогольной интоксикации / Д.С. Лисицкий // VII Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых, Москва, 15 марта 2012 г. – М.: Вестник Российского государственного медицинского университета, 2012. – №1, спец. выпуск. – С.269.
8. Лисицкий, Д.С. Фармакологическая коррекция нейротоксических поражений у белых крыс при тяжёлой форме интоксикации этанолом / Д.С. Лисиц24
кий, А.Н. Петров, М.К. Шевчук // Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы радиационной медицины и промышленной токсикологии», 28-29 марта 2012 г. – Красноярск, 2012. – С.79.
9. Башарин, В.А. Оценка эффективности нейропептидов при острых отравлениях депримирующими веществами / В.А. Башарин, Е.Ю. Бонитенко, Д.С.
Лисицкий // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии», Казань, 18-21 сентября 2012 г. – М.: Фолиум, 2012. –
С.19.
10. Лисицкий, Д.С. Экспериментальная фармакотерапия нарушений когнитивных функций при тяжёлой форме острой алкогольной интоксикации на фоне хронической алкоголизации / Д.С. Лисицкий // Материалы II Всероссийской
научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки
третьего тысячелетия», ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН, 12-14 ноября 2012 г. –
СПб: Медицинский академический журнал, 2012. – С.122-124.
11. Лисицкий, Д.С. Применение мемантина при тяжёлой форме острой алкогольной интоксикации у интактных крыс и на фоне хронической алкоголизации / Д.С. Лисицкий // Научно-практическая конференция, посвящённая 20летию ФГУП НПЦ «Фармзащита» ФМБА России «Состояние и перспективы
развития средств медицинской защиты от экстремальных факторов», Москва,
22 ноября 2012. – М.: «IP-Print», 2012. – С.126-133.
12. Лисицкий, Д.С. Влияние нейротропных препаратов на течение острой
алкогольной интоксикации в эксперименте / Д.С. Лисицкий, А.С. Мелехова //
Сборник трудов Всероссийской научной конференции молодых ученых «Медико-биологические аспекты химической безопасности», Санкт-Петербург,
ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА, 18-20 сентября 2013 г. – СПб: Издательство ВВМ,
2013. – С.190-191.
13. Лисицкий, Д.С. Применение дипептида ноопепта в экспериментальной
терапии нарушений когнитивных функций у белых крыс при острой алкогольной интоксикации / Д.С. Лисицкий // Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы интеграции образования, науки и производства в
фармации», Республика Узбекистан, г. Ташкент, 4-5 ноября 2013г. – Ташкент,
2013. – С. 484-486.
14. Лисицкий, Д.С. Фармакологическая коррекция нарушений когнитивных функций у крыс после тяжёлой формы острого отравления этанолом на
фоне предварительной алкоголизации / Д.С. Лисицкий, А.С. Мелехова // Сборник трудов IV Съезда токсикологов России с международным участием, Москва, 6-8 ноября 2013 г. – М.: Издательство Capital Press, 2013. – С. 289-291.
15. Лисицкий, Д.С. Коррекция нарушений памяти у крыс после тяжёлой
формы острого отравления этанолом на фоне предварительной алкоголизации /
Д.С. Лисицкий, А.С. Мелехова // Сборник тезисов докладов Всероссийской молодёжной конференции «Нейробиология интегративных функций мозга»,
НИИЭМ СЗО РАМН, Санкт-Петербург, 12-14 ноября 2013 г. – СПб., 2013. – С.
44-45.
16. Лисицкий, Д.С. Коррекция нарушений двигательных функций у крыс
после тяжёлой формы острого отравления этанолом / Д.С. Лисицкий // Сборник
25
материалов I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации», СПХФА, Санкт-Петербург, 20
ноября 2013 г. – СПб.: Изд-во СПХФА, 2013. – С. 48-49.
17. Лисицкий, Д.С. Применение автоматизированных систем Laboras и
Open field для оценки поведения и двигательной активности животных после
острого алкогольного отравления / Д.С. Лисицкий, А.С. Мелехова // Сборник
материалов I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации», СПХФА, Санкт-Петербург, 20
ноября 2013 г. – СПб.: Изд-во СПХФА, 2013. – С. 49-50.
ГАМК
ИТНН
ЛД50
ЛП
УРАИ
УРПИ
ЦНС
NMDA
––
––
––
––
––
––
––
––
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Гаммааминомасляная кислота
Индекс тяжести неврологических нарушений
Среднелетальная доза
Латентный период
Условная реакция активного избегания
Условная реакция пассивного избегания
Центральная нервная система
N-метил-D-аспартат рецептор
26