МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ экспрессии генов семейства Vegf
реклама
Патология кровообращения и кардиохирургия • № 1 • 2010 70 УДК 611.018.46:616.127-005 МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ экспрессии генов семейства Vegf в мононуклеарных клетках костного мозга человека после плеттинга Д.С. Сергеевичев, П.М. Ларионов, Д.В. Субботин, Р.Б. Новрузов, Е.Н. Кливер, А.М. Караськов Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкина cpsc@nricp.ru Ключевые слова: ангиогенез, VEGF, мононуклеарные клетки костного мозга, полимеразная цепная реакция. По характеру и выраженности последствий, наносимых обществу (общей утрате трудоспособного населения), ишемическая болезнь сердца (ИБС) занимает первое место в России, поскольку является наиболее частой причиной смерти в молодом возрасте. В связи с этим разработка альтернативных методов улучшения кровоснабжения ишемизированного миокарда остается актуальной. Терапевтический ангиоваскулогенез, который иногда называют биологическим шунтированием, представляет собой новую тактику улучшения перфузии ишемизированных тканей с помощью усиления естественных, но недостаточных процессов неоваскуляризации. Разработке этой лечебной тактики способствовало развитие современных представлений о молекулярных и клеточных механизмах регуляции роста и ремоделирования кровеносных сосудов. За последнее десятилетие было проведено огромное количество исследований, посвященных репаративной регенерации миокарда с использованием имплантации в миокард различных клеточных популяций мононуклеарной фракции костного мозга (МНФ КМ). Большие надежды, вызванные многообещающими данными экспериментальных исследований и, в основном, неконтролируемых клинических исследований, сменились разочарованием после получения результатов масштабных двойных слепых рандомизированных плацебо-контролируемых клинических испытаний, не подтвердивших однозначно эффективность такой тактики [8]. Более того, в экспериментальном исследовании имплантации несепарированных клеток МНФ КМ в зоны ишемического поражения миокарда собак выявлен рост костных балок в рубцовой зоне [1]. После первой публикации [6] об использовании эндотелиальных предшественников многие исследователи сосредоточили свое внимание на применении различных сепарированных клеток МНФ КМ с целью регуляции ангиоваскулогенеза. Появилось множество экспериментальных данных, свидетельствующих об ангиогенной эффективности различных фракций МНК, их сочетаний, генетических модификациях, а также о методах доставки клеток в ишемизированную область. Одним из самых многообещающих методов доставки клеток МНФ в очаг по- ражения на сегодняшний день является их имплантация в слепые лазерные трансмиокардиальные каналы [1, 4, 9, 12]. Важным этапом в обосновании возможности терапевтического использования клеток МНФ КМ с целью коррекции последствий ишемических состояний является изучение молекулярных механизмов активации и ускорения неадекватного васкулогенеза, способов оптимизации получения эндотелиальных клетокпредшественников с необходимыми свойствами. Вазоэндотелиальные факторы роста: разновидности и рецепторы Основную роль в ремоделировании сосудистого русла играет вазоэндотелиальный фактор роста (VEGF). Он изначально был выявлен, охарактеризован и получен в чистом виде для исследования его способности изменять сосудистую проницаемость и запускать пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов. В настоящее время известны семь членов семейства VEGF, обозначаемых буквами от A до F. Однако наиболее изученными из них являются первые четыре. Различные члены этого семейства проявляют перекрывающиеся способности по взаимодействию с набором поверхностных клеточных рецепторов, которые вызывают ответ на эти факторы. Хотя большинство исследований было сосредоточено на изучении способности VEGF-A активизировать рост сосудов, недавние работы еще раз выявили его способность повышать проницаемости сосудов. VEGF-В экспрессируется во многих тканях, включая скелетные мышцы, миокард и бурый жир. Физиологическая роль этого фактора in vivo со всей очевидностью не выявлена. В качестве примера следует упомянуть, что VEGF-В – дефицитные мыши фертильны и выглядят совершенно обычными, но сердце у них уменьшено в размере, что подтверждает роль VEGF-B в развитии коронарной васкуляризации. В пути сигнальной трансдуции VEGF-C находится лимфатикоспецифичный VEGFR-3, который имеет важное значение для развития лимфатической системы: трансгенная гиперэкспрессия VEGF-С приводит к гиперплазии лимфатической системы. VEGF-D – секреторный гликопротеин, его структура на 48% идентична структуре VEGF-C. Этот фактор экспрессируется во мно- Новые научные разработки и технологии гих тканях у взрослых особей, включая эндотелий сосудов, сердце, скелетные мышцы, легкие. У человека VEGF-D подвергается протеолитическому процессингу и его зрелая форма связывается с рецепторами VEGFR-2 и VEGFR-3. Подобно VEGF-C данный фактор обладает лимфангиогенным потенциалом и способен индуцировать рост лимфатических сосудов, в том числе и при развитии новообразований. Регуляция VEGF В сравнении с его позже открытыми родственными формами, VEGF изучен в большей степени. Сейчас совершенно ясно, VEGF настолько сильный и критичный сосудистый регулятор, что для того, чтобы избежать сосудистых происшествий, необходимо тонко регулировать дозу воздействия в пространственных, временных и количественных рамках. Разрушение обоих аллелей гена VEGF у мышей мимикрирует VEGFR-2–нокаут, выражающийся в полном отсутствии васкуляризации. Разрушение только одного аллеля у мышей (например, с помощью простого эффекта полудозы) приводит к смерти эмбриона вследствие отдельных сосудистых аномалий [7]. Значение VEGF продолжает быть критическим и в период постнатального развития и роста. Это наглядно показано в исследованиях постнатальной инактивации VEGF с использованием Cre-loxP-делеции гена VEGF или с применением растворимого белка-рецептора VEGF, успешно блокирующего его действие. Поскольку инактивация VEGF приводит к летальному исходу в течение первых нескольких недель после рождения, то у более взрослых животных эта инактивация гораздо менее травматична. По-видимому, воздействие происходит только в тех органах и тканях, в которых продолжается ремоделирование сосудов, как это происходит в костных пластинках роста или в желтом теле яичника. Таким образом, VEGF у взрослых не имеет длительного функционального воздействия на большую часть сосудистого русла. Самый изящный пример необходимости исключительно тонкой регуляции VEGF – васкуляризация сетчатки, которая происходит в постнатальный период у мелких млекопитающих. Первоначально сетчатка находится в условиях гипоксии, и в ней отсутствует сосудистое русло, и прорастание в ней артерий зависит от экспрессии VEGF [5]. Любые нарушения нормальной экспрессии VEGF разрушают участки васкуляризации и приводят к драматическим последствиям для сетчатки. Последующее восстановление экспрессии гена не способно ни исправить проблему, ни существенно обострить ее. Простой путь нарушить экспрессию VEGF – на короткий период подвергнуть новорожденную крысу гипоксическому воздействию, которое транзиентно подавляет VEGF сетчатки [5]. В результате рост сосудов останавливается и даже происходит их регрессия. Когда животное возвращается к состоянию нормоксии, то в плохо васкуляризованной сетчатке происходит скачкообразный рост экспрессии 71 VEGF, который заново запускает ангиогенез. Однако дефектные и слабые сосуды растут неправильными участками, что приводит к повреждению сетчатки. Эта модель отражает способность оксигенотерапии у недоношенных детей вызывать ретинопатию и показывает необходимость аккуратной регуляции VEGF. Эти данные показывают, что неконтролируемая индукция VEGF в отсутствие прицельной ангиогенной программы приводит к формированию слабых и незрелых сосудов, что вызывает развитие болезни. Эти данные также свидетельствуют о том, что тканевая гипоксия не способна поневоле индуцировать «полезный» ангиогенный ответ. В ходе ремоделирования сосудов эффект воздействия вазоэндотелиальных ростовых факторов (VEGF), ангиопоэтинов (Ang), а также их рецепторов суммируется. Однако направленное потенцирование одного из вышеперечисленных хемокинов не приводит к запуску всего каскада реакций ремоделирования [15]. Исследование уровня активности Ang1 и Ang2, выражающееся в изменении уровня экспрессии мРНК этих генов миокарде, при ишемическом поражении миокарда нами уже проводилось ранее [3]. К концу четвертой недели после имплантации сепарированных клеток МНФ КМ в лазерные каналы перифокально рубцовой области было показано значимое увеличение уровня мРНК: в 2,5 раза для Ang1 и почти в 4 раза для Ang2. Однако в контексте применения эндотелиальных клеток костномозгового происхождения при лечении ишемического поражения миокарда необходимо изучить экспрессию генов VEGF непосредственно в эндотелиальных клетках. Материал и методы Материалом исследования послужили мононуклеарные клетки КМ больных ИБС, получаемые при операции аортокоронарного шунтирования совместно с непрямой реваскуляризацией миокарда. Получение мононуклеарной фракции аутологичных клеток костного мозга и разделение ее плеттингом Забор КМ производили в условиях хирургической операционной под местной анестезией. При помощи костномозговой иглы BLE1510 (Biomedica Spa, Италия) пунктировали заднюю верхнюю ость подвздошной кости. Аспират КМ в объеме 5–8 мл помещали в стерильную пробирку с двумя объемами физиологического раствора (ФР) и гепарином, из расчета 20 ед. гепарина на 1 мл аспирата. В условиях асептического бокса разведенный физиологическим раствором КМ аккуратно наслаивали на предварительно разлитый в стерильные пробирки раствор фиколл-урографина с плотностью 1,077 г/мл и центрифугировали при 400 g в течение 30 мин при температуре 22 °С. Интерфазное кольцо переносили в новую пробирку, дважды от- 72 Патология кровообращения и кардиохирургия • № 1 • 2010 мывали в RPMI-1640, определяли жизнеспособность клеток полученной МНФ. При окрашивании пропидиум иодид+акридиновый оранжевый жизнеспособность клеток превышала 96%. Для разделения прилипающей и неприлипающей фракций клеток использовалось физиологическое свойство клеток адгезии. Для этого полученную суспензию клеток МНФ КМ ресуспендировали в питательной среде RPMI-1640 без добавок и высаживали в культуральные флаконы площадью 25 см2 из расчета 105 клеток на 1 см2. Далее следовала 30-минутная инкубация в СО2-инкубаторе в атмосфере 5% углекислоты при 37 °С. Затем жидкую фазу переносили в новые пробирки и оставшиеся в суспензии клетки отмывали от питательной среды ФР. Прилипшие клетки снимали с пластика после трехминутной инкубации в растворе Версена с 0,05% трипсина с последующей отмывкой в ФР. Выделение суммарной РНК Для выделения РНК из клеточных фракций использовался модифицированный метод ChomczynskiSacchi. Образец, объемом 150–200 мкл и содержащий порядка 4–8 × 106 клеток, гомогенизировали пипетированием в 800 мкл раствора TRIzol (Invitrogen, США), затем добавляли 200 мкл хлороформа и перемешивали. После инкубации на льду в течение 10 мин образец центрифугировали 15 мин при 13200 об/мин (5415D, Eppendorf, Германия). Далее около 400 мкл водной фазы переносили в новую пробирку с 10 мкл линейного полиакриламида в качестве соосадителя. Добавляли 1 объем холодного изопропанола, после интенсивного перемешивания раствор инкубировали 60 мин при -20 °С. Затем пробирки снова встряхивали и центрифугировали 10 мин при 13200 об/мин. Полученный осадок 2 раза промывали 80% этанолом, подсушивали до исчезновения запаха спирта в течение 15–20 мин в термостате и растворяли в 30 мкл деионизированной воды MillyQ Academic (Millipore, США). Качество и количество РНК определяли после электрофореза в 0,8% агарозном геле на ТАЕбуфере с визуализацией нуклеиновых кислот бромистым этидием в УФ-свете (GelDoc XR, Bio-Rad, США) относительно маркера весов РНК (Fermentas, Литва) с помощью программного обеспечения Quantity One (Bio-Rad, США). Обратная транскрипция Для обратной транскрипции (ОТ) использовали около 1 мкг полученной РНК. В качестве затравки использовали 50 мкМ статистического праймера, состава N9-randome. После отжига затравки 5 мин при 70 °С и охлаждения смеси на льду к ней добавляли реакционный буфер с таким расчетом, чтобы в итоге в нем содержалось 50 ед. обратной транскриптазы MoMLV, 10мМ DTT, 1мМ Tris-HCl pH=7.0, 5мM KAc, 5 мМ MgCl2, 200 мкМ dNTP. Далее смесь инкубировали в термостате при 42 °С в течение 1 ч и инактиви- ровали реакцию прогревом в течение 5 мин при 90 °С. Для удаления остатков геномной ДНК из раствора был применен несложный способ очистки с помощью разделения фрагментов реакции в 1% агарозном геле с последующей эвакуацией и очисткой мелкоразмерных фрагментов на спин-колонке Montage (Millipоre, США). После этого объем смеси доводили до 100 мкл деионизированной водой. Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали 5 мкл кДНК. Полимеразная цепная реакция Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет следить за кинетикой накопления продуктов амплификации. В нашем случае это достигалось введением в реакционную смесь зондов Taq-Man. При этом использовалась экзонуклеазная активность Taqполимеразы, гидролизующая комплементарно связанный с кДНК зонд и высвобождающая таким образом флюорофор. Для того чтобы увеличить чувствительность и специфичность ПЦР, использовали «hot-start» Taq-полимеразу – это рекомбинантная Taq-ДНК-полимераза, инактивированная полипептидом, денатурирующим при температуре выше 90 °С, позволяющим избежать начала реакции до того момента, когда в пробирке устанавливались условия, необходимые для специфического отжига праймеров. Оптимальные концентрации праймеров и зондов для ПЦР были определены опытным путем из диапазона 100–500 пМ. ПЦР проводили в финальном объеме 25 мкл, в 96-луночных ПЦР-планшетах (Axygen, США), закрытых оптической пленкой (Bio-Rad, США). В реакционной смеси содержалось по 300 пМ каждого праймера, 150 пМ зонда Taq-Man, 0,2 мкM dNTP, 67 мМ Tris-HCl pH=8,9, 16 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgCl2, 0,01% Twin-20, 2 е.а. Hot-Start Taq-ДНК-полимеразы («СибЭнзим», Новосибирск) и 5 мкл кДНК. Для каждого образца реакция проводилась в триплетах. Дизайн праймеров осуществлен с помощь программного обеспечения Vector NTI 8 (InforMax Inc., США). С помощью GenBank получены нуклеотидные последовательности мРНК генов вазоэндотелиальных факторов роста – A, -B, -C, -D (таблица). Комбинации праймеров и зондов были проверены на специфичность с помощью интернет-сервиса BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), и ни в одной из них не было показано значимой гомологии с другими последовательностями. Программа амплификации состояла из 40 циклов, каждый цикл включал следующие этапы: 95 °С – 10 с, 61 °С – 20 с, 72 °С – 20 с, с предварительным прогревом планшета 2 мин при 95 °С и финальной элонгацией 5 мин при 72 °С. Съем флюоресцентного сигнала производился после этапа отжига. Уровень экспрессии оценивался автоматически, с помощью встроенного сервиса Gene Expression программного обеспечения iQ5 (Bio-Rad, США) и нормировался по уровню экспрессии мРНК гена β-актина. Статистическая обработка данных исследования проводилась средствами статистической систе- Новые научные разработки и технологии 73 Номера последовательностей исследуемых генов из базы данных GenBank и разработанные для них пары праймеров и зондов Ген GenBank № Последовательность праймеров, 5`-3` Зонд прямая обратная CTTGCCTTG CTGCTCTACC CACACAGGA TGGCTTGAAG FAM- AGTTCATGGATG TCTATCAGCGCAGCT –TAMRA NM001025370 NM001025369 NM001025368 VEGF-A NM001033756 NM001025367 NM003376 NM001025366 NM003377 AGCACCAA GTCCGGATG GTCTGGCTTCA CAGCACTG FAM- AGATCCTCATGATC CGGTACCCG –TAMRA VEGF-C NM005429.2 TGCCGATGC ATGTCTAAACT TGAACAGGTCT CTTCATCCAGC FAM- CAGCAACACTA CCACATGTCAGGCA –TAMRA VEGF-D NM004469.2 GTATGGACTC TCGCTCAGCAT AGGCTCTCTT CATTGCAACAG FAM- AAGAACTAGTGCA GCCCTAGAGAAACG –TAMRA мы Origin 7.5 for Windows. Для статистической обработки результатов использовали альтернативный анализ, методы вариационной статистики, вычисление средней арифметической (М) и ее ошибки (m). Достоверность различий между группами оценивали по критерию Стьюдента и критерию ANOVA. При р<0,05 различия рассматривались как статистически достоверные. Результаты Оценка уровня экспрессии генов вазоэндотелиальных факторов роста в сепарированных мононуклеарных клетках костного мозга Для исследования уровня экспрессии мРНК генов интереса был разработан и оптимизирован метод количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени. На основании анализа гомологии нуклеотидных последовательностей выбранных экспрессирующихся генов, а также секвенированных фрагментов генома были идентифицированы соответствующие гены и мРНК. Для этих последовательностей были спроектированы пары праймеров, позволяющие специфично амплифицировать фрагменты кДНК генов семейства VEGF. Для нормализации начального количества мРНК в образце и эффективности обратной транскрипции измерялось количество кДНК гена β-актина, в относительно равной степени экспрессирующегося во всех клетках. В клетках неприлипающей фракции была обнаружена повышенная экспрессия генов VEGF-D и -B, в меньшей степени – VEGF-A, характерных в основном для артериального русла [11]. В клетках прилипающей фракции был значительно повышен уровень экспрессии генов VEGF-С и -B, характеризующих в большей мере лимфангиогенез (рисунок). Та- Уровень экспрессии мРНК, арбитражные ед. VEGF-B Относительный уровень экспрессии мРНК генов VEGFA, -B, -C, -D в клетках неприлипающей и прилипающей фракций МНК КМ (p<0,05). ким образом, целесообразность процедуры плеттинга, позволяющая имплантировать только лишь неприлипающую фракцию клеток МНФ КМ, определяется в том числе и увеличением ангиогенного потенциала. Обсуждение Миокардиальная ишемия и периферические сосудистые заболевания – две главные причины заболеваемости и летальности у людей. Прогресс в лечении этих состояний реализовывается, потому что есть продвижение в нашем понимании ангиогенеза и, в особенности, развития коллатеральных сосудов коронарного русла. Действительно, ряд заболеваний, которые не так давно рассматривались как резистентные к лечению, в настоящее время становятся потенциальными целями для антиангиогенной терапии, в том числе диабетическая ретинопатия, эндоме- 74 Патология кровообращения и кардиохирургия • № 1 • 2010 триоз, или проангиогенной терапии – ИБС. Клеточноопосредованные стратегии в лечении ИБС основаны на имплантации непосредственно в ишемизированный миокард или в коронарное русло костномозговых клеток. При этом преследуется две цели: реваскуляризация миокарда и устранение дефицита функциональных клеточных элементов миокарда. К сегодняшнему дню для индуцирования процессов сосудообразования в миокарде в эксперименте и в клинике используются различные фракции клеток КМ. Наиболее распространенным вариантом при проведении пилотных клинических исследований за рубежом и в России является имплантация нефракционированных клеток МНФ КМ. П.М. Ларионов и соавт. [2004] первыми в эксперименте, после имплантации суммарной фракции МНК костного мозга в перирубцовую зону миокарда на модели ХИБС собаки получили формирование диффузных костных балок и распространенных очагов кальцификации и хондрогенеза. Вероятно, это объясняется тем фактом, что мезенхимальные прогениторные клетки, присутствующие в суспензии клеток, при отсутствии в микроокружении дополнительных васкуло- и ангиогенных сигналов могут дифференцироваться в типичном для стромы КМ направлении, формируя кластеры остеобластных клеток. Для решения проблемы снижения хондро-остеогенного потенциала имплантируемых МНК был использован простой и, как оказалось, эффективный способ инкубации клеток в питательной среде в культуральных флаконах в течение около 30 мин. Полученные таким образом популяции клеток не имели значимого различия по большинству маркеров CDдифференцировки, определяемых иммунофенотипически. Однако исследование уровня экспрессии мРНК генов, являющих маркерами хондро- и остеогенеза, показало выраженные различия между этими популяциями МНК [2]. В продолжение изучения свойств фракционированных МНК костного мозга мы провели исследование экспрессии мРНК генов семейства VEGF, а именно их подтипов -А, -B, -C и -D. В неприлипающей фракции клеток мы в результате обнаружили выраженное увеличение уровней экспрессии мРНК генов VEGF-D и VEGF-B и в незначительной степени VEGF-A. Подобное поведение мы объясняем следующими причинами. Уровень экспрессии VEGF-A зависит от многих факторов, таких как наличие ростовых факторов и цитокинов, стадии трансформации клетки, мутаций гена р53, уровня эстрогена и тиреоидного гормона, опухолевых промотеров и уровня оксида азота и, самое главное, гипоксического состояния ткани и организма, ключевым медиатором которого служит HIF-1. Если в условиях нормоксемии его уровень постоянно снижен, то при возникновении гипоксического состояния высвобождение HIF-1 приводит к опосредованному увеличению экспрессии VEGF-A [10]. Повышение на эмбриональном этапе уровня экспрессии мРНК гена VEGF-B, необходимого для нормального развития сердечно-сосудистой системы, а во взрослом организме отвечающего за ремоделирование сосудистого русла при различных патологических и физиологических состояниях [11], в клетках неприлипающей фракции отражает наличие в ней большего количества сосудистых клеток-предшественников в сравнении с клетками прилипающей фракции. Из двух последних исследуемых членов семейства VEGF известна четкая роль только VEGF-C. Он отвечает за формирование лимфатической сосудистой сети, особенно на начальных этапах, в период эмбриогенеза. И хотя структурно по аминокислотному составу он на 30% гомологичен VEGF-A165, на С- и N-концах он вместе с VEGF-D несет пропептидные последовательности, не характерные больше ни для каких белков семейства VEGF. В свою очередь, VEGF-D, по данным различных авторов, с одной стороны, способен индуцировать опухолевый лимфангиогенез и способствовать метастазированию [13], а, с другой стороны, действует подобно VEGF-B, индуцируя васкулогенез и ремоделирование сосудистого русла (миграцию и адгезию циркулирующих костно-мозговых клеток-предшественников, их пролиферацию, увеличение проницаемости сосудистой стенки и т. д.), однако использует для этого нисходящий путь сигнальной трансдукции через VEGF-R2 и VEGF-R3 [14], достигая тем самым более выраженного ангиогенного эффекта. В ходе проведенного исследования мы выявили выраженные различия в экспрессии мРНК генов вазоэндотелиальных факторов роста среди фракций мононуклеарных клеток КМ после плеттинга. В прилипающей фракции клеток резко повышен уровень экспрессии мРНК гена VEGF-C и слабо выражена экспрессия гена VEGF-B, характерных для клеток с лимфангиогенным потенциалом. Во фракции неприлипающих мононуклеаров резко выражен уровень экспрессии мРНК генов VEGF-D, VEGF-B и в меньшей степени мРНК гена VEGF-А, характерных для клеток артериального русла с ангиогенным потенциалом. Таким образом, наше исследование еще раз подтверждает обоснованность и необходимость плеттинга мононуклеарных клеток КМ перед их интрамиокардиальной имплантацией при лечении сердечной патологии ишемического генеза, что будет продемонстрировано в наших дальнейших исследованиях. Список литературы 1. Ларионов П.М., Чернявский А.М., Боярских У.А. и др. // Медицинская консультация. 2004. № 45. С. 2–6. 2. Ларионов П.М., Сергеевичев Д.С., Чернявский А.М. и др. // Бюл. эксперимент. биологии и медицины. 2009. № 5. С. 576–582. 3. Караськов А.М, Ларионов П.М., Чернявский А.М. и др. // Патол. кровообращ. и кардиохирургия. 2007. № 4. C. 75–81. Новые научные разработки и технологии 4. Чернявский А.М., Ларионов П.М., Фомичев А.В. и др. // Вестн. трансплант. и искусств. органов. 2007. № 6. C. 30–36. 5. Alon T., Hemo I., Itin A. et al. // Nature Med. 1995. V. 1. P. 1024–1028. 6. Asahara T. et al. // Science. 1997. V. 275. P. 964–967. 7. Carmeliet P., Ferreira V., Breier G. et al. // Nature. 1996. V. 380. P. 435–439. 8. Darwin J.P., Scott D.O. // Blood. 2007. V. 109 (8). P. 3147–3151. 9. Horvath K.A. // J. Cardiovasc. Surg. 2008. V. 23 (3). P. 266–276. 10. Lando D. et al. // Science. 2002. V. 295. P. 858–861. 11. Olofsson B., Jeltsch M., Eriksson U. et al. // Curr. Opinion Biotechnology. 1999. V. 10. P. 528–535. 12. Patel A.N., Spadaccio C., Kuzman M. et al. // Cell Transplant. 2007. V. 16 (9). P. 899–905. 13. Stacker S.A., Caesar C., Baldwin M.E. et al. // Nature Med. 2001. V. 7. P. 186–191. 14. Takahashi T., Shibuya M. // Nature. 2000. V. 407. P. 242–248. 15. Yancopoulos G., Davis S., Gale N. et al. // Nature. 2000. V. 407. P. 242–248. 75 MOLECULAR ANALISYS OF vegf fAMILY GENE EXPRESSION IN BONE MARROW MONONUCLEAR CELLS AFTER PLETTING D.S. Sergeevichev, P.M. Larionov, D.V. Subbotin, R.B. Novruzov, E.N. Kliver, A.M. Karaskov In the treatment of ischemic myocardial lesions are widely used mononuclear cells of autologous bone marrow. In the study of molecular-biological characteristics of human cells among the fractions of adherent and non-adherent bone marrow mononuclear cells, we have shown marked differences in the level of mRNA expression of genes vasoendotelial growth factor-A,-B,-C and-D. In adherent cells prevails expression of mRNA genes VEGF-C and VEGF-B. While in non-adherent mononuclearas it was increased mRNA expression of genes VEGF-D and-B, to a lesser extent - VEGF-A It describes the fundamental differences of biological properties of these fractions. Key words: angiogenesis, VEGF, bone marrow mononuclear cells, polymerase chain reaction.
