Влияние хлоргексидина на упругие свойства эндотелиальных
реклама
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г УДК 577.352 ВЛИЯНИЕ ХЛОРГЕКСИДИНА НА УПРУГИЕ СВОЙСТВА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК* Дружинина О.С., Лебедев Д.В., Бухараев А.А., Скоринкин А.И. Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111, Казань, ул. Лобачевского, 2/31 Казанский физико-технический институт им. Е.К. Завойского КазНЦ РАН, 420029, Казань, ул. Сибирский тракт, д. 10/7 Казанский государственный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 16 E-mail: ask@ksu.ru Метод атомно-силовой микроскопии был применен для изучения изменения упругих свойств клеток внутренней поверхности кровеносного сосуда лабораторной крысы под действием лекарственного препарата хлоргексидина. Обнаружено, что это лекарственное вещество в концентрации 56 мкМ увеличивает модуль Юнга эндотелиальных клеток до 232±13 % от исходного значения, т.е. существенно повышает их жесткость. Атомно-силовая микроскопия, хлоргексидин, жесткость клеток брюшной аорты Действие биологически активных веществ на живые клетки оценивается, как правило, биохимическими либо электрофизиологическими методиками. При этом вне зоны внимания исследователей остается вопрос о влиянии этих веществ на физические свойства клеток, что также может быть весьма важным показателем их действия. Известно, что возникновение некоторых заболеваний сопровождается изменением жесткости тканей [1, 2]. Иногда причиной этого является изменение упругости внеклеточного матрикса [3], в других случаях жесткость тканей меняется из-за изменения твердости клеток [4, 5]. Известно, что жесткость клеточных мембран весьма чувствительна к структурным изменениям в них [6-8] и, например, изменение насыщенности мембраны холестерином, который обеспечивает внутримембранные взаимодействия, может изменять жесткость клеток [9]. В качестве исследуемого лекарственного вещества был выбран хлоргексидин, который широко применяется в клинической практике как средство с антисептическими свойствами [10]. Хлоргексидин обладает также ингибирующим воздействием на синаптическую передачу в нервно-мышечном соединении и имеет механизм действия, состоящий из двух компонент – аллостерической модуляции рецепторно-канального комплекса и блокирования открытого канала [11]. Известно, что хлоргексидин способен изменять структуру липидной мембраны [12, 13]. Проведенное нами ранее изучение методом ИКспектроскопи мембранотропного действия хлоргексидина показало, что хлоргексидин способен проникать в искусственную лецитиновую бислойную мембрану и существенно повышать плотность ее упаковки; максимум этого эффекта приходится на концентрации хлоргексидина 10÷100 мкМ [14]. Можно пред* Работа поддержана грантом «Ведущая научная школа РФ» и грантами РФФИ. 26 Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г положить, что слабая обратимость эффектов хлоргексидина связана с его способностью растворяться в мембранных липидах, поскольку в этом случае обратный выход из липида в водную фазу будет затруднен. В случае справедливости этой гипотезы есть основание говорить о существовании малоисследованного пока класса веществ, способных оказывать на клетки пролонгированное воздействие – липид-растворимых модуляторах. Влияние лекарственных препаратов на жесткость клеток изучалось методом атомно-силовой микроскопии, который неоднократно применялся для измерения жесткости клеток [15-17]. Для получения информации об упругости клеток на сканирующем зондовом микроскопе Solver Bio (фирмы NT-MDT) со сканером SMENA с жидкостной ячейкой регистрировали так называемые кривые подвода, которые отражают силу, отклоняющую гибкую балку при взаимодействии вершины зонда с поверхностью. Для получения более точных количественных данных и предотвращения повреждения поверхности клеток использовался специально созданный зонд, на вершине которого был закреплен шарик диаметром 5 мкм. Для расчета модуля Юнга по кривым подвода была использована модель Герца [18], в которой рассматривается взаимодействие жесткой полусферы (зонд) и плоскости (мембрана); подробно метод расчета описан в [19]. Особенности метода требуют возможности подвода зонда непосредственно к поверхности исследуемых клеток. Но большинство органов покрыто соединительной тканью, которую практически невозможно полностью удалить, что сделало невозможным и использование этих органов в данном исследовании. Клетки организма, не образующие тканей и ничем не покрытые – например, эритроциты – не удалось закрепить так, чтобы они не отталкивались зондом. В итоге, для исследования жесткости был использован слой эндотелиальных клеток, выстилающий изнутри кровеносные сосуды, поскольку это слой устойчивых к деформациям, плотно прилегающих к друг к другу и ничем не покрытых клеток. Исследования проводили на крысах породы Wistar, подопытных животных декапитировали под эфирным наркозом, вскрывали и извлекали брюшную аорту, которую хранили затем в стандартном физиологическом растворе не более 24 часов. В чашку Петри с покрытым силгартом дном наливали физиологический раствор, помещали подложку из фторопласта выпуклой формы и на ней растягивали с помощью микроигл разрезанный вдоль кусок аорты внутренней стороной вверх. Хлоргексидин добавлялся в физиологический раствор до общей концентрации 56 мкМ, измерения проводились при комнатной температуре. Для контроля примененного метода мы использовали замену внеклеточного раствора на гипоосмотический, так как известно, что это приводит к постепенному увеличению внутриклеточного давления и, соответственно, жесткости клеток [20]. В наших экспериментах при замене 1/3 физиологического раствора дистиллятом модуль Юнга внутренней поверхности брюшной аорты за 30 минут увеличивался до 174±16 % от исходного значения, при замене половины 27 Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г физиологического раствора дистиллятом модуль Юнга за те же 30 минут увеличивался до 196±24 % от исходного значения. Эти данные подтверждают возможность применения метода зондовой микроскопии для контроля жесткости биологических тканей. Кроме того, данная проверка показала возможность контроля клеточного давления, так как при его повышении клетки увеличивали свой объем и при измерениях требовалось отводить зонд дальше от исследуемого эндотелиального слоя. На Рис. 1 представлены типичные кривые подвода для клеток внутренней поверхности брюшной аорты в контроле и после 6, 12, 25 и 40 минут действия хлоргексидина в концентрации 56 мкМ. На рисунке видно резкое изменение наклона кривых подвода вследствие воздействия вещества. Такие изменения наклона кривых подвода повторялись во всех экспериментах, но исходные значения модуля Юнга эндотелиальных клеток в контроле варьировали довольно сильно – от 20 до 75 КПа. По этой причине мы измеряли в экспериментах относительные изменения жесткости эндотелия при действии хлоргексидина. Рис. 1. Типичные кривые подвода для клеток внутренней поверхности брюшной аорты в контроле (1) и после 6 (2), 12 (3), 25 (4) и 40 (5) минут действия хлоргексидина в концентрации 56 мкМ. Для сравнения на графике приведена также типичная кривая подвода пьезосканера к стеклянной подложке (6). На Рис. 2 представлен график изменения модуля Юнга внутренней поверхности брюшной аорты в течение 40 минут воздействия хлоргексидина в концентрации 56 мкМ. Из графика видно, что хлоргексидин за это время увеличивает модуль Юнга эндотелиальных клеток внутренней поверхности сосуда до 232±13 % от исходного значения, т.е. делает клетки более чем в два раза твер28 Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г же. Клетки при этом не увеличивали свой объем, то есть увеличение жесткости не было связано с ростом внутриклеточного давления. Такие результаты могут быть обусловлены появлением дополнительных водородных связей между молекулами липидов мембран эндотелиальных клеток и молекулами хлоргексидина после проникновения последних внутрь мембраны. Рис. 2. График зависимости модуля Юнга внутренней поверхности брюшной аорты от времени под действием хлоргексидина в концентрации 56 мкМ (n = 7). За 0 на оси времени принят момент добавления препарата. Модуль Юнга выражен в % к начальному значению (до подачи препарата). Таким образом, можно считать установленным влияние хлоргексидина на жесткость исследованных клеток. Открытие новых аспектов действия применяемых в клинической практике лекарственных препаратов может позволить расширить спектр их применения и учесть все возможные последствия их использования в разных ситуациях. 29 Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г Литература 1. Bucala, R. Advanced glycosylation: chemistry, biology, and implications for diabetes and aging / R. Bucala, A. Cerami // Adv. Pharm.- 1992.- V. 23.- P. 1-34. 2. Castellani, R.J. Active glycation in neurofibrillary pathology of Alzheimer disease: N(epsilon)(carboxymethyl) lysine and hexitol-lysine / R.J. Castellani, P.L.R. Harris, L.M. Sayre et al. // Free Rad. Biol. Med.- 2001.- V. 31.- P. 175-180. 3. Dimri, G.P. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo / G.P. Dimri, X. Lee, G. Basile et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995.- V. 92.- P. 93639367. 4. Goldmann, W.H. Differences in elasticity of vinculin-deficient F9 cells measured by magnetometry and atomic force microscopy / W.H. Goldmann, R. Galneder, M. Ludwig et al. // Exp. Cell Res.- 1998.- V. 239.- P. 235-242. 5. Berdyyeva, T.K. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: Direct measurements / T.K. Berdyyeva, C.D. Woodworth, I. Sokolov // Phys. Med. Biol.- 2005.- V. 50.- P. 81-92. 6. Zeman, K. Bending undulations and elasticity of the erythrocyte membrane: Effects of cell shape and membrane organization / K. Zeman, H. Engelhardt, E. Sackmann // Eur. Biophys. J.1990.- V. 18.- P. 203-219. 7. Mohandas, N. Mechanical properties of the red cell membrane in relation to molecular structure and genetic defects / N. Mohandas, E. Evans // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.- 1994.- V. 23.- P. 787-818. 8. Rawicz, B. Elasticity, strength, and water permeability of bilayers that contain raft microdomain-forming lipids / W. Rawicz, B.A. Smith, T.J. McIntosh et al. // Biophys J.- 2008.V. 94.- P. 4725-4736. 9. Dianzani, M.U. Lipid peroxidation and cancer: A critical reconsideration / M.U. Dianzani // Tumori.- 1989.- V. 75.- P. 351-357. 10. Russel, D. Antiseptics and disinfectants: Activity, action, and resistance / D. Russel, G. McDonnell // Clin. Microbiol. Rev.- 1999.- V. 12.- P. 147-179. 11. Шайхутдинова, А.Р. Механизмы модуляции работы рецепторно-канального комплекса хлоргексидином / А.Р. Шайхутдинова, Е.Е. Никольский, Р.А. Гиниатуллин, А.И. Скоринкин // ДАН.- 2005.- T. 402.- С. 427-429. 12. Audus, K.L. Chlorhexidine effects on membrane lipid domains of human buccal epithelial cells / K.L. Audus, M.R. Tavakoli-Saberi, H. Zheng, E.N. Boyce // J. Dent. Res.- 1992.- V. 71.- P. 1298-1303. 13. Abu-Elteen, K.H. Effect of sub-inhibitory concentration of chlorhexidine on lipid and sterol composition of Candida albicans / K.H. Abu-Elteen, P.A. Whittaker // Mycopathology.- 1998.V. 140.- P. 69-76. 14. Стробыкина, О.С. Изучение методом ИК-спектроскопи мембранотропного действия хлоргексидина биглюконата / О.С. Стробыкина, Д.А. Файзуллин, А.И. Скоринкин // Структура и динамика молекулярных систем.- 2005.- Вып. XII, Ч. 2.- С. 229-232. 15. Radmacher, M. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope / M. Radmacher, M. Fritz, C.M. Kacher et al. // Biophys. J.- 1996.- V. 70.- P. 556567. 16. Scheffer, L. Atomic force pulling: Probing the local elasticity of the cell membrane / L. Scheffer, A. Bitler, E. Ben-Jacob, R. Korenstein // Eur. Biophys. J.- 2001.- V. 30.- P. 83-90. 17. Smith, B.A. Probing the viscoelastic behavior of cultured airway smooth muscle cells with atomic force microscopy: Stiffening induced by contractile agonist / B.A. Smith, B. Tolloczko, J.G. Martin, P. Grütter // Biophys. J.- 2005.- V. 88.- P. 2994-3007. 18. Cappella, B. Force-distance curves by atomic force microscopy / B. Cappella, G. Dietler // Surf. Sci. Rep.- 1999.- V. 34.- P. 1-104. 30 Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №7,А, 2009 г 19. Лебедев, Д.В. Измерение модуля Юнга биологических объектов в жидкой среде с помощью специального зонда атомно-силового микроскопа / Д.В. Лебедев, А.П. Чукланов, А.А. Бухараев, О.С. Дружинина // ПЖТФ.- 2009.- Т. 35, вып. 8.- С. 54-61. 20. Kelly, S.M. Direct measurement of intracellular pressure / S.M. Kelly, P.T. Macklem // Am. J. Physiol.- 1991.- V. 260.- P. C652-C657. CHLORHEXIDINE ACTION ON THE ELASTICITY OF ENDOTHELIOCYTES Druginina O.S., Lebedev D.V., Bukharaev A.A,. Skorinkin A.I Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics KSC RAS, 420111, Kazan, Lobachevskogo str., 2/31 Zavoisky Physical-Technical Institute KSC RAS, 420029, Kazan, Sibirsky trakt str., 10/7 Kazan State University, 420008, Kazan, Kremliovskaja str., 18 E-mail: ask@ksu.ru The method of atomic-force microscopy has been applied to studying the change of elastic properties of cells of an internal surface of a blood vessel of a laboratory rat under action of a drug chlorhexidine. It is revealed that this drug in concentration 56 μM increases Young modulus of endothelial cells up to 232±13 % of control values, i.e. it raises substantially their rigidity. Keywords: Atomic-force microscopy, chlorhexidine, rigidity of the cells of abdominal aorta Сведения об авторах №№ Ф.И.О. Должность и место работы Телефон рабочий E-mail 420111, Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, 2-319-032, solnyshek@list.ru 420029, Казань, ул. Сибирский тракт, д. 10/7, 2-319-107 1 Дружинина Ольга Сергеевна Аспирант, КИББ КазНЦ РАН 2. Лебедев Денис Владимирович Аспирант, КФТИ им. Е.К. Завойского КазНЦ РАН 3 Бухараев Анастас Ахметович д.ф.-м.н., зав. лаб., КФТИ им. Е.К. Завойского КазНЦ РАН 420029, Казань, ул. Сибирский тракт, д. 10/7, 2-319-107, a_bukharaev@kfti.knc.ru 4 Скоринкин Андрей Иванович д.ф.-м.н., доцент, КГУ им. В.И. Ульянова-Ленина; в.н.с., КИББ КазНЦ РАН 420008, Казань, ул. Кремлевская, д. 18, 420111, Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, (843) 2319032 (р), 5428075 (д), факс 2927347, e-mail: ask@ksu.ru. 31
