49 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ОСТРЫЙ

▪ медицинские науки ▪
49
УДК 616. 611‑002‑092. 9
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ОСТРЫЙ
ПОСТСТРЕПТОКОККОВЫЙ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТ
Н. Ю. Коломеец, Н. И. Аверьянова,
Н. Ю. Зарницына, П. В. Кос арева
ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия
им. ак. Е. А. Вагнера», г. Пермь, pr_averyanova@rambler.ru
Целью работы явилось создание модели острого постстрептококкового гломерулонефрита путем иммунизации белых беспородных (нелинейных) крыс бактериальной
суспензией эталонного штамма Streptococcus pyogenes в концентрации 109 КОЕ / мл,
в разведении 1:9. Эксперимент выполнен на 26 животных, содержащихся в стандартных условиях вивария. Иммунизацию проводили внутрибрюшинно 1 раз в день
по следующей схеме: 3 цикла, каждый из которых состоял из 1, 3, 5 дней иммунизации
и 2 дней перерыва между циклами. При последующем гистологическом исследовании
препаратов почек иммунизированных животных наблюдалась морфологическая картина, соответствующая патоморфологическим изменениям, характерным для острого гломерулонефрита. Воспроизводимость эксперимента составила 100 %.
Ключевые слова: экспериментальная модель, острый постстрептококковый гломерулонефрит, белые беспородные (нелинейные) крысы.
EXPERIMENTAL ACUTE POSTSTREPTOCOCCAL
GLOMERULONEPHRITIS
N. Yu. Kolomeets, N. I. Averyanova, N. Yu. Zarnitsina, P. V. Kosareva
Perm State Academy of Medicine named after Academician E. A. Wagner,Russia
pr_averyanova@rambler.ru
The aim of work was to create the model of acute poststreptococcal glomerulonephritis
by means of immunization of white outbred (nonlinear) rats with bacterial suspension of
Streptococcus pyogenes reference strain in the concentration of 109 KOE / ml, diluted 1:9.
The experiment was performed on 26 animals kept in standard conditions of vivarium.
Immunization was carried out intraperitoneally once a day by the following scheme: 3
cycles, each consisting of 1, 3, 5 immunization days with two-day intervals between the
cycles. Subsequent histological investigation of renal preparations of immunized animals
demonstrated morphological picture corresponding to pathomorphological changes, typical
for acute glomerulonephritis. Reproducibility of experiment was 100 %.
Keywords: experimental model, acute poststreptococcal glomerulonephritis, white
outbred (nonlinear) rats.
фундаментальные исследования №6, 2010
50
▪ медицинские науки ▪
Острый гломерулонефрит — тяжелое по‑
нии мышей в качестве экспериментальных
ражение структуры почечных клубочков,
животных воспроизведение заболевания
развивающееся вследствие перенесенной
осуществлялось посредством инокуляции
стрептококковой
вызванной
живой культуры стрептококка и создания
в основном, штаммами М серотипов 1, 2, 4,
локального очага инфекции, откуда экс‑
12, 18, 25, 49, 55, 57, 60 и некоторых дру‑
трацеллюлярные продукты распределялись
гих М-типов стрептококка группы А. Об‑
по организму хозяина. В модели на кроли‑
щепринятым является мнение об остроте
ках использовалась многократно вводимая
процесса, однако заболевание может иметь
парентерально и убитая прогреванием куль‑
хроническое течение, нередко приводить
тура Streptococcus pyogenes, сохранившая
к дисфункции почек (альбуминурия и сни‑
поверхностно локализованные факторы па‑
жение скорости клубочковой фильтрации
тогенности микроба и подвергающаяся ге‑
могут сохраняться у перенесших острый
нерализации в его организме [1].
инфекции,
гломерулонефрит пожизненно), что позво‑
Создание экспериментальных моделей
ляет рассматривать его в ряду причинных
острого
гломерулонефрита
необходимо
факторов хронической болезни почек [4].
не только для дальнейшего изучения меха‑
В настоящее время диагноз острый пост‑
низмов пато- и морфогенеза заболевания,
стрептококковый гломерулонефрит реже
но и для доклинической апробации новых
ставится в специализированных нефроло‑
лекарственных препаратов, предлагаемых
гических отделениях, хотя по‑прежнему на‑
фармацевтической промышленностью и об‑
блюдаются и спорадические случаи, и эпи‑
ладающих нефропротективным действием.
демические вспышки данного заболевания
Материалы и методы исследования:
[2,6,7].
Эксперимент выполнен на 26 живот‑
Накопленный клинический и экспери‑
ных — самцах и самках беспородных белых
ментальный опыт позволяет проследить
крыс четырехмесячного возраста, содержа‑
основные моменты в патогенезе заболева‑
щихся в стандартных условиях вивария. Все
ния, которые сводятся к активности «нефри‑
эксперименты проведены в соответствии
тогенных» продуктов, нарастанию титров
с «Правилами проведения работ с исполь‑
антител к ряду экстрацеллюлярных про‑
зованием экспериментальных животных»
дуктов и энзимов стрептококка, снижению
(Приложение к приказу Министерства здра‑
уровня комплемента, дисбалансу содержа‑
воохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755)
ния иммуноглобулинов и повреждающему
и «Европейской конвенцией о защите позво‑
действию циркулирующих специфических
ночных животных, используемых для экс‑
иммунных комплексов [3,5]. Существен‑
периментов или в иных научных целях»
ный вклад в патогенетическое обоснование
от 18 марта 1986 г.
острого постстрептококкового поврежде‑
Животные были разделены на 2 экспери‑
ния гломерулярных структур внесли работы
ментальные группы: I группа — контроль‑
по созданию экспериментальных моделей
ная (интактные животные), n=10; II группа
на мышах и кроликах. При использова‑
(опытная) — животные, иммунизирован‑
фундаментальные исследования №6, 2010
▪ медицинские науки ▪
51
ные бактериальной суспензией эталонно‑
каждого цикла иммунизации у животных
го штамма Streptococcus pyogenes (ГНИИ
контрольной и опытной групп также ис‑
стандартизации и контроля им. Л. А. Та‑
следовали разовую порцию мочи на белок
расевича), n=16. С целью подтверждения
и проводили микроскопию осадка. По окон‑
воспроизводимости эксперимента II группа
чании опыта животных выводили из экспе‑
была подразделена на 2 подгруппы, различа‑
римента путем перерезки спинного мозга
ющиеся сроком забора мочи для лаборатор‑
под эфирным наркозом с соблюдением пра‑
ного исследования и органов для аутопсии
вил эвтаназии. Внутренние органы забирали
и гистологического анализа (21 и 31 день
для проведения аутопсии и гистологическо‑
иммунизации).
го исследования, почки животных фиксиро‑
Антигенную суспензию для иммуниза‑
вали в 10 %-ной нейтральном формалине,
ции животных получали путем культиви‑
подвергали обезвоживанию в спиртах воз‑
рования штамма на мясопептонном бульо‑
растающей крепости, заливали в парафин.
не в аэробных условиях при температуре
Срезы получали на ротационном микрото‑
+370С, последующем центрифугировании
ме (толщина 3‑4 мкм), окрашивали гематок‑
суточной бульонной культуры Streptococcus
силином и эозином, пикрофуксином по ван
pyogenes в течение 10‑15 минут при скоро‑
Гизону, нитратом серебра по Футу. Микро‑
сти 3000 оборотов в минуту и последующем
скопию препаратов в проходящем свете
удаления супернатанта. Полученную взвесь
проводили с использованием светового ми‑
концентрацией 109 КОЕ / мл, определяемой
кроскопа Micros (Австрия) при увеличении
на КФК-3 (оптическая плотность 0,028,
микроскопа ×60, ×150, ×600, ×1500; захват
длина волны 540 нм, кювета — 1,060 мм),
гистологических объектов осуществляли
инактивировали при +56 ºС в течение 30
при помощи цифровой камеры для микро‑
минут. Из расчета 50 мкл взвеси на 1 жи‑
скопа CAM V200 Micros «Handelsgesellschaft
вотное готовили разведение: 9 мл стериль‑
m. b. H.» (Австрия).
ного физиологического раствора и 1 мл
Результаты исследования
взвеси (на 1 животное приходится 500 мкл
У животных контрольной группы не было
(0,5 мл) полученной вновь взвеси антиген‑
выявлено лабораторных и гистологических
ной суспензии). Иммунизацию животных
признаков развития острого гломерулонеф‑
проводили внутрибрюшинно 1 раз в день
рита. В течение всего эксперимента в моче
по схеме: 3 цикла, каждый из которых со‑
животных этой группы белок не выявлялся,
стоял из 1, 3, 5 дней иммунизации и 2 дней
в микроскопии мочевого осадка патологии
перерыва между циклами.
не обнаружено.
Перед началом эксперимента у животных
При проведении аутопсии почки живот‑
контрольной (интактной) и опытной группы
ных контрольной группы имели бобовидную
проводили микроскопию мочевого осадка
форму, капсула легко снималась, обнажая
и анализ разовой порции мочи на белок, ис‑
блестящую, гладкую поверхность светло-
пользуя качественную реакцию с 20 %-ной
коричневого цвета. На разрезе корковое
сульфосалициловой кислотой. В конце
вещество почек было светло-коричневого
фундаментальные исследования №6, 2010
52
▪ медицинские науки ▪
цвета, мозговое вещество — темно-красное.
гистологических препаратов в ткани почек
Лоханка не расширена, ее слизистая обо‑
выявлялось полнокровие сосудов коркового
лочка блестящая, гладкая. При проведении
и мозгового вещества, в корковом веществе
гистологического исследования строение
визуализировалось
ткани почек соответствовало нормально‑
увеличенных гиперцеллюлярных клубоч‑
му: четко выявлялась капсула, корковое ве‑
ков с резко уменьшенным мочевым про‑
щество с почечными тельцами и извитыми
странством, инфильтрированных нейтро‑
канальцами, мозговое вещество, визуали‑
фильными гранулоцитами, эозинофилами
зировались сосочки и почечная лоханка,
и лимфоцитами, с аккумуляцией большого
выстланная переходным эпителием. Со‑
числа моноцитов в просветах капилляров.
судистые клубочки нефрона не изменены.
Выявленные изменения характеризовали
Проксимальные и дистальные почечные ка‑
в этом сроке экссудативную фазу воспале‑
нальцы с типичной структурой.
ния и были выражены не менее чем в 60 %
большое
количество
У иммунизированных животных II груп‑
клубочков, выявляемых в гистологическом
пы к 21 дню иммунизации визуально отме‑
срезе. Отмечалось сужение просветов ка‑
чалось снижение аппетита и двигательной
пилляров клубочков вследствие пролифе‑
активности. У 90 % животных при проведе‑
рации эндотелиальных и мезангиальных
нии микроскопии мочевого осадка выявили
клеток, появление клубочков с лобулярной
гематурию — от незначительной до средней
структурой. В проксимальных и дисталь‑
степени выраженности, исследование мочи
ных канальцах нефронов изменения каналь‑
на содержание белка показало положитель‑
цевого эпителия были выражены умеренно
ный результат у 80 % животных.
(выявлялись участки белковой дистрофии
На секции отмечались макроскопические
эпителия, в интерстициальной ткани по‑
признаки застойной сердечной недостаточ‑
чек — участки воспалительной инфильтра‑
ности: общее венозное полнокровие; уве‑
ции лимфоцитами, нейтрофилами и макро‑
личение печени (печень плотная, тёмная);
фагами) и имели очаговый характер.
инъецированность сосудов брыжейки, име‑
лись небольшие кровоизлияния.
У всех животных II группы к 31 дню им‑
мунизации при свободном доступе к пище
С целью подтверждения воспроизводимо‑
и воде отмечалось значительное снижение
сти модели острого гломерулонефрита забор
аппетита и потребности в жидкости, а также
материала у 8 животных II группы осущест‑
резкое снижение суточного диуреза по срав‑
вляли на 21 день эксперимента. При про‑
нению с контрольной группой. При проведе‑
ведении аутопсии почки иммунизирован‑
нии микроскопии мочевого осадка выявляли
ных животных имели бобовидную форму,
гематурию средней степени выраженности,
были увеличены в размерах, выглядели
содержание белка показало положительный
набухшими. На разрезе корковое вещество
результат у 100 % животных.
имело серовато-коричневый цвет, мозговое
При проведении аутопсии у 8 иммунизи‑
вещество — вишнево-красный; лоханка
рованных животных II группы на 31 день
не изменена. При проведении микроскопии
эксперимента макроскопически имелись
фундаментальные исследования №6, 2010
53
▪ медицинские науки ▪
признаки отёка почечной ткани, изменения
иммунология. — 2006. — Т. 8, № 5‑6. —
в лоханках отсутствовали. Гистологическое
С. 623–630.
исследование ткани почек животных этой
2. Acute
post-streptococcal
группы выявило в большинстве клубочков
glomerulonephritis
in
children
of
(80 %) преобладание процессов пролифера‑
French Polynesia: a 3‑year retrospective
ции, что выражалось в появлении, наряду
study / O. Becquet, J. Pasche, H. Gatti, C. Chenel,
с мезангиальной и эндотелиальной пролифе‑
M. Abély, P. Morville, C. Pietrement// Pediatr.
рацией, отложений нитей фибрина и белко‑
Nephrol. — 2010. — Vol. 25, № 2. —
вых масс в капсуле Шумлянского-Боумена,
P. 275‑280.
сращении капилляров клубочка с капсу‑
3. Cunningham, M. W. Pathogenesis of group
лой и образовании полулуний в отдельных
A streptococcal infections / M. W. Cunningham//
клубочках. Отмечался также тромбоз ка‑
Clin. Microbiol. Rev. — 2000. — Vol. 13. —
пилляров почечных телец. Гломерулярная
P. 470‑511.
базальная мембрана визуально выглядела
4. Acute
postinfectious
crescentic
значительно утолщенной. В проксимальных
glomerulonephritis:
clinicopathologic
и дистальных извитых канальцах находили
presentation and risk factors /A
. A. El-Husseini,
белковую дистрофию эпителия, в межуточ‑
H. A. Sheashaa, A. A. Sabry, F. E. Moustafa,
ной ткани почек — воспалительную ин‑
M. A. Sobh // Int. Urol. Nephrol. — 2005.
фильтрацию нейтрофильными гранулоци‑
Vol. 37, № 3. — P. 603‑609.
5. Garnier, A, Postinfectious acute glom
тами и лимфоцитами.
Таким образом, в гистологических пре‑
erulonephritis /A
. Garnier, M. Peuchmaur,
паратах почек иммунизированных живот‑
G. Deschênes // Nephrol Ther. — 2009. Vol. 5,
ных наблюдалась морфологическая карти‑
№ 2. — P. 97‑101.
на, соответствующая патоморфологическим
6. Jankauskiene,
A. Postinfectious
для острого
glomerulonephritis in children in Lithuania
гломерулонефрита. Воспроизводимость экс‑
during 1995‑2004: prevalence and clinical
перимента составила 100 %.
features /A
. Jankauskiene,
изменениям,
характерным
B. Pundziene,
Список литературы
R. Vitkevic // Medicina (Kaunas). — 2007. Vol.
1. Бурова Л. А. Способность стрептокок‑
43, № l. — P. 16‑22.
ков группы А типа М12 связывать иммунные
7. Wong, W. Outcome of severe acute post-
комплексы и их роль в патогенезе постстреп‑
streptococcal
glomerulonephritis
in
New
тококкового гломерулонефрита / Л. А. Бу‑
Zealand children / W. Wong, M. C. Morris,
рова, Е. А. Гаврилова. П. В. Пигаревский,
J. Zwi // Pediatr. Nephrol. — 2009. Vol. 24,
В. Г. Селиверстова, В. А. Нагорнев, К. Ша‑
№ 5. — P. 1021‑26.
лен, Артем А. Тотолян // Медицинская
фундаментальные исследования №6, 2010