создание аналитической установки для исследований

СОЗДАНИЕ АНАЛИТИЧЕСКОЙ УСТАНОВКИ ДЛЯ
ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ НА ОСНОВЕ
МИКРОФЛЮИДНЫХ ЧИПОВ И ОПТИЧЕСКОГО МИКРОСКОПА
AXIO OBSERVER D1
А.С. Букатин 1,2, И.В. Кухтевич 3, А.А. Евстрапов 1,2,3, И.С. Мухин 1,3
Санкт-Петербургский Академический университет - научно-образовательный центр
нанотехнологий РАН
2
Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург
3
Санкт-Петербургский Государственный Университет Информационных Технологий,
Механики и Оптики
1
Проведен расчет топологии микрофлюидного чипа для диэлектрофореза.
Изготовлены экспериментальные образцы микрочипов с квадрупольными планарными
электродами. На основе инвертированного оптического микроскопа и микрофлюидных
чипов создана экспериментальная установка, продемонстрировавшая возможность
управления движением частиц в рабочей области микрочипа.
Введение
Исследование биологических объектов в нативном состоянии с помощью
методов высокоразрешающей микроскопии (атомно-силовой, ближнепольной,
сканирующей лазерной конфокальной) позволяет получить новую информацию об их
строении и взаимодействии с окружающей средой. Полученная информация может
быть востребована при диагностике заболеваний на ранних стадиях, а также при
разработке новых высокоэффективных лекарственных препаратов. Специфика методик
высокоразрешающей микроскопии требует создания специальной установки, которая
позволит поддерживать исследуемые объекты в биологически активном состоянии,
фиксировать их в заданной области пространства на время измерения и обеспечивать
свободный доступ зонда микроскопа к объекту исследования. Среди разнообразных
методов управления движением микрочастиц в жидкости (ультразвуковые методы [1],
электрофорез [2], диэлектрофорез [3,4]), наиболее перспективным и хорошо
разработанным является метод диэлектрофореза (ДЭ). ДЭ позволяет эффективно
управлять биологическими объектами (клетками, бактериями и т.д.) в жидкости и
сортировать их по различным физико-химическим характеристикам и биологическим
признакам (живые – мертвые, здоровые – раковые и т.д.), оказывая при этом
минимальное воздействие на процессы их жизнедеятельности по сравнению с другими
методами. Реализация ДЭ с помощью системы внутренних электродов,
интегрированных в микрофлюидный чип, позволяет не только эффективно управлять
микрочастицами, но и поддерживать биологические объекты в активном состоянии.
В данной работе представлены результаты исследований по созданию
экспериментальной установки на основе оптического микроскопа и микрофлюидных
чипов для исследований диэлектрофоретических методов управления движением
микрочастиц размерами 1 – 10 мкм в жидких средах.
Моделирование распределения электрических полей в микрофлюидном
чипе для диэлектрофореза.
Диэлектрофорез – это явление перемещения микрочастицы в неоднородном
электрическом поле, вызванное взаимодействием вынужденного (индуцированного)
диполя микрочастицы с внешним электрическим полем [5]. Для создания
166
электрических полей в микрофлюидных чипах используется система внутренних
электродов. Для определения топологии микрочипа, вычисления жесткости ДЭ
ловушки, а также характеристик потенциалов, подаваемых на электроды, было
проведено численное моделирование распределения электрических полей в
микрофлюидном чипе. В качестве базовой конфигурации электродов была выбрана
планарная квадрупольная конфигурация, т.к. она является наиболее простой в
изготовлении методом магнетронного напыления токопроводящего покрытия с
последующей фотолитографией и травлением.
Потенциальная энергия частицы в электрическом поле имеет следующий вид
[2]:
2
2
⎡
⎛ ∂ϕ ⎞ ⎤
3 ⎛ ∂ϕ ⎞
⎟⎟ ⎥ ,
W = −4πε1 K (ε1 , ε 2 )a ⎢⎜
⎟ + ⎜⎜
⎢⎣⎝ ∂x ⎠ ⎝ ∂y ⎠ ⎥⎦
где
– диэлектрические проницаемости среды и частицы; a – ее радиус;
фактор Клаузиуса-Мосотти; φ – потенциал электрического поля, подчиняющийся
уравнению Лапласа
с соответствующими граничными условиями:
∂ 2ϕ ∂ 2ϕ
+
=0,
∂x 2 ∂y 2
ϕ ∂Ω = u (t ) ,
– потенциал электродов в зависимости от времени, ∂Ω – граница области.
Моделирование электрических полей и распределения потенциальной энергии
осуществлялось с использованием программы COMSOL Multiphysics. Усредненное по
периоду распределение потенциальной энергии частицы в ДЭ ловушке приведено на
рис. 1.
167
Рис. 1. Средняя потенциальная энергия частицы в ДЭ ловушке. u1(t) = Acos(wt),
u2(t) = Acos(wt+π/2), u3(t) = Acos(wt+π), u4(t) = Acos(wt+3π/2). (ε1 = 78ε0,
ε2 = 2.75, a = 1 мкм, А=7В, w = 105с-1)
При использовании переменных электрических сигналов с одинаковой
амплитудой и сдвинутых по фазе в центре между электродами наблюдается минимум
потенциальной энергии, в котором возможна фиксация микрочастиц. Кроме того при
использовании сигналов с частотой больше 10 кГц происходит подавление
электрохимических реакций на электродах, протекание которых может приводить к
образованию пузырьков газа и разрушению электродов.
Материалы и оборудование
Для исследования процессов управления микрочастицами с помощью ДЭ была
собрана экспериментальная установка, состоящая из инвертированного оптического
микроскопа Axio Observer D1 (Carl Zeiss, Германия), микрофлюидного чипа с
квадрупольной ДЭ “ловушкой”, генератора сигналов GFG-8250A (GW-insTEK,
Тайвань) и специально разработанной схемой управляющей электроники. Общий вид
установки представлен на рис. 2а.
б) а) Рис. 2. а) Экспериментальная установка на базе оптического микроскопа Axio
Observer D1, б) микрофлюидный чип для ДЭ.
Микрофлюидный чип для ДЭ был изготовлен из стекла марки К8. Методом
магнетронного напыления на его поверхности была осаждена пленка хрома толщиной
140 нм, из которой затем были сформированы четыре электрода методом
фотолитографии и травления. После этого на чип помещалась защитная
полидиметилсилоксановая (ПДМС) пленка толщиной ~ 1 мм, в которой было
сформировано отверстие для нанесения пробы (рис. 2 б). Во время экспериментов на
ПДМС накладывалось покровное стекло для предотвращения испарения пробы и
защиты от попадания пыли.
Для управления микрочастицами с помощью ДЭ необходимо подавать на
электроды микрочипа сигналы, имеющие разные амплитуды и фазы. Реализация
условий захвата клетки требует подачи потенциалов с равными амплитудами и
сдвинутыми по фазе на π/2 друг относительно друга в диапазоне частот 100кГц – 1МГц.
В качестве источника сигнала использовался генератор GFG-8250A, способный
выдавать гармонический сигнал в диапазоне 0 – 10В, 0 – 10МГц. Электронная схема,
168
построенная на операционных усилителях, обеспечивала разделение сигнала от
генератора на четыре независимых канала с возможностью регулирования амплитуды и
фазы в каждом из них.
Результаты экспериментов по фиксированию частиц в
диэлектрофоретической ловушке.
В экспериментах по захвату частиц с помощью ДЭ использовались модельные
объекты – полистирольные шарики диаметром 6 мкм и концентрацией ~500 шт/мкл в
0.5% растворе KOН. Результаты экспериментов представлены на рис. 3.
а)
б)
в)
г)
Рис. 3
Микрофотографии полистирольных шариков диаметром 6 мкм и
концентрацией ~500 шт/мкл в 0.5% растворе КОН. а) вдали от электродов,
б) вокруг ловушки при включенном переменном электрическом поле. в,г) в
рабочей области микрофлюидного чипа. (Оптический микроскоп Axio
Observer D1, Carl Zeiss)
В свободном состоянии полистирольные шарики представляют собой
неупорядоченную взвесь частиц в жидкости, двигающуюся под действием броуновских
сил (см. рис. 3а). При подаче переменного напряжения на электроды и после
достижения напряженности электрического поля ~103 В/см происходит упорядочение
микрочастиц вокруг активной области чипа (см. рис. 3б). Если сдвиг фаз напряжений
между электродами равен π/2, то происходит захват одной или нескольких частиц в
центральной области микрочипа (см. рис. 3 в, г), т.к. при такой конфигурации
электрического поля в центре чипа находится минимум потенциальной энергии (см.
рис. 1).
169
Заключение
В работе проведено моделирование распределения электрических полей в
микрофлюидном чипе для ДЭ. На основе микрофлюидных чипов и оптического
микроскопа Axio Observer D1 создана экспериментальная установка для изучения
возможности управления микрочастицами в жидкости. Разработана и изготовлена
электроника,
обеспечивающая
функционирование
микрочипа
с
системой
квадрупольных
электродов.
Изготовлены
экспериментальные
образцы
микрофлюидных чипов для ДЭ. Проведены эксперименты по управлению движением и
фиксации полистирольных шариков диаметром 6 мкм методом ДЭ на микрочипе.
Полученные результаты могут быть использованы для изучения биологических
объектов в естественных условиях методами высокоразрешающей микроскопии.
Исследования проведены в рамках аналитической ведомственной целевой
программы «Развитие научного потенциала высшей школы», проект «Исследования и
диагностика клеточных структур: новые методические подходы и инструментальные
решения на основе сканирующей зондовой микроскопии и микрочиповых технологий»
(N 4247), федеральный целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России» на 2009 - 2013 годы (ГК П557), программы Carl Zeiss
поддержки научно-исследовательской работы молодых ученых ВУЗов России (договор
СПБГУ ИТМО 1/11 КЦ), Комитета по науке и высшей школе Правительства
Санкт-Петербурга.
Список литературы
1. Manneberg O., Vanherberghen B., Önfelt B., Wiklund M. Flow-free transport of cells
in microchannels by frequency-modulated ultrasound// Lab Chip. 2009. 9. P. 833 –
837
2. Jones T.B. Electromechanics of particles. Cambridge University Press, Cambridge,
UK, 1996. 285 p.
3. Voldman J. Electrical Forces For Microscale Cell Manipulation//Annu. Rev. Biomed.
Eng. 2006. 8. 425-454
4. Iliescu C., Tresset G., Xu G. Dielectrophoretic field-flow method for separating
particle populations in a chip with asymmetric electrodes// Biomicrofluidics. 2009. 3.
044104
5. Abgrall P., Gu A.M. Lab-on-chip technologies: making a microfluidic network and
coupling it into a complete microsystem—a review//J. Micromech. Microeng. 17
(2007) R15–R49
170