«Спектрофотометрические методы в анализе биологически
реклама
ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ – филиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра фармацевтической и токсикологической химии Д.С. Лазарян, А.Ю. Айрапетова, Л.Б. Губанова, Х.Н. Гюльбякова УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ ПО ОСВОЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ Спектрофотометрические методы в анализе биологически активных веществ растительного и синтетического происхождения» « ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ПРОГРАММА «ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, ФАРМАКОГНОЗИЯ» (подготовка научно-педагогических кадров) НАПРАВЛЕНИЕ ПОДГОТОВКИ 33.06.01 ФАРМАЦИЯ ПЯТИГОРСК 2015 УДК 543.422.3:615.2/.3(076) ББК 52.82я35.66 М 54 Рецензент: доцент кафедры органической химии, доктор фармацевтических наук И.П. Кодониди Д.С. Лазарян, А.Ю. Айрапетова, Л.Б. Губанова, Х.Н. Гюльбякова М 54 Учебно-методическое пособие по освоению дисциплины «Спектрофотометрические методы в анализе биологически активных веществ растительного и синтетического происхождения». Образовательная программа «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Направление подготовки 33.06.01 Фармация. Для аспирантов / Д.С. Лазарян, А.Ю. Айрапетова, Л.Б. Губанова, Х.Н. Гюльбякова. – Пятигорск: ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ, 2015. – 132 с. Учебно-методическое пособие разработано в соответствии с рабочей программой дисциплины «Спектрофотометрические методы в анализе биологически активных веществ растительного и синтетического происхождения» учебного плана 140402_78-123(4)-3486 Фармацевтическая химия, фармакогнозия и предназначены для обучающихся по образовательной программе подготовки научно-педагогических кадров «Фармацевтическая химия, фармакогнозия» очной и/или заочной формы обучения. УДК 543.422.3:615.2/.3(076) ББК 52.82я35.66 Печатается по решению ЦМК ПМФИ - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ, 2015 Оглавление ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................................................ 5 БЛОК ИНФОРМАЦИИ ..................................................................................................................... 6 Характеристика спектроскопических методов анализа ................................................................. 6 РАЗДЕЛ 1. Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой ................................................ 8 областях спектра ................................................................................................................................ 8 1.1 Теоретические основы спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Основные термины и определения, используемые в спектрофотометрии ............ 8 1.2 Характеристика спектрофотометров ................................................................................ 11 1.3 Спектр поглощения – как отражение электронного строения вещества ...................... 13 1.4 Применение УФ-спектрофотометрии в анализе .............................................................. 17 лекарственных средств ............................................................................................................. 17 1.5 Использование спектрофотометрии в количественном анализе лекарственных средств. Способы расчета концентрации ............................................................................... 24 1.6 Выбор оптимальных условий анализа .............................................................................. 26 1.7 Виды спектрофотометрического анализа ......................................................................... 29 Непосредственная спектрофотометрия ....................................................................... 29 Метод дифференциальной спектрофотометрии ......................................................... 30 Метод высокого поглощения ............................................................................................ 30 Метод низкого поглощения............................................................................................... 31 Метод двухстороннего дифференцирования (метод предельной точности) сочетает в себе оба метода с прямым и обратным порядком измерения оптической плотности растворов. ...................................................................................................... 32 Производная спектрофотометрия ................................................................................. 33 Определение смеси светопоглощающих веществ. Метод Фирордта .............................. 35 РАЗДЕЛ 2. Спектрофотометрия в ИК-области спектра .............................................................. 37 2.1 Общие теоретические положения метода ИК-спектроскопии...................................... 39 2.1.1 Подготовка проб ....................................................................................................... 54 2.1.2 Интерпретация спектров ........................................................................................ 56 2.1.3 Качественный и количественный анализ по ИК-спектрам. Характеристичность частот в колебательном спектре молекул .............................. 59 2.2 Применение ИК-спектроскопии в анализе лекарственных средств ............................ 61 2.3 Приборы для регистрации ИК-спектров ........................................................................ 62 ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ ..................................................................................................... 69 Занятие 1 .................................................................................................................................. 69 Занятие 2 .................................................................................................................................. 71 Занятие 3 .................................................................................................................................. 77 Занятие 4 .................................................................................................................................. 86 Занятие 5 .................................................................................................................................. 89 Занятие 6 .................................................................................................................................. 92 Занятие 7 .................................................................................................................................. 95 Занятие 8 ................................................................................................................................ 106 Занятие 9 ................................................................................................................................ 112 ТЕМЫ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ ............................................................................ 122 Термины и определения, используемые в спектрофотометрии. ............................................... 122 Для заметок ..................................................................................................................................... 129 ЛИТЕРАТУРА ................................................................................................................................ 130 4 ВВЕДЕНИЕ Дисциплина биологически «Спектрофотометрические активных веществ методы растительного и в анализе синтетического происхождения», изучается на первом и втором курсах обучения в аспирантуре и относится к вариативной части учебного плана дисциплин по выбору (Б1.В.ДВ.1). Основной целью изучения дисциплины «Спектрофотометрические методы в анализе биологически активных веществ растительного и синтетического происхождения» является формирование у аспирантов профессиональных компетенций в области спектрофотометрических методов анализа. Основными объектами изучения данной дисциплины являются лекарственные средства и лекарственные вещества на стадиях доклинических, клинических испытаний и государственной регистрации; а также объекты диссертационных исследований аспирантов, обучающихся по образовательной программе Фармацевтическая химия, фармакогнозия. Задачами дисциплины являются: 1. Формирование профессиональных компетенций по проведению экспериментальных исследований и обработке полученных результатов. 2. Обучение самостоятельно интерпретировать результаты УФ- и ИКспектрометрии для идентификации биологически активных веществ. 3. Освоение приемов разработки новых методик стандартизации биологически активных веществ и лекарственных средств 4. Изучение разновидностей спектрофотометрического метода анализа и формирование профессиональных навыков владения ими в экспериментальной работе. Основными дисциплины видами учебной работы аспирантов при освоении «Спектрофотометрические методы в анализе биологически активных веществ растительного и синтетического происхождения» являются лекции, практические занятия и самостоятельная работа. БЛОК ИНФОРМАЦИИ Характеристика спектроскопических методов анализа К спектроскопическим методам анализа относят физические методы, основанные на избирательном поглощении электромагнитного излучения молекулами (или атомами) анализируемого вещества. Электромагнитное излучение имеет двойственную природу: волновую и корпускулярную, поэтому оно может быть охарактеризовано волновыми и энергетическими параметрами. К волновым параметрам относятся: длина волны - расстояние, проходимое волной за время одного полного колебания. Длину волны обычно выражают в нанометрах 1нм 1 109 м или в микрометрах 1мкм 1 106 м ; частота - число раз в секунду, когда электромагнитное поле достигает своего максимального значения. Для измерения частоты используют герц; волновое число - число длин волн, укладывающихся в единицу длины: 1 . Волновое число измеряют в обратных сантиметрах см 1 . Корпускулярная природа света характеризуется энергией квантов электромагнитного излучения. В системе СИ энергию измеряют в джоулях. Связь между волновой и корпускулярной природой света описывается уравнением Планка: Е h hc hc Е (1), где - изменение энергии элементарной системы в результате поглощения фотона с энергией h ; h - постоянная Планка (6,6·10 -27 эрг с ); c - скорость света (3·1010 см×с-1). При поглощении квантов света происходит увеличение внутренней энергии частицы, которая складывается из энергии движения электронов ЕE, колебательной энергии атомов молекулы EV и энергии вращения молекул ЕR: E = ЕE + EV + ЕR 6 Величина этих энергий убывает в порядке: ЕE ≥ EV ≥ ЕR , а их числовые значения относятся как: 103: 102: 1. Как видно из представленного соотношения, в зависимости от величины энергии электромагнитного излучения в молекуле возможны различные энергетические переходы. Если в соответствии с уравнением (1) учесть, что длина волны и энергия излучения связаны обратной пропорциональной зависимостью, то в электромагнитном спектре можно выделить определенные участки (таблица 1). Таблица 1 - Области электромагнитного излучения и соответствующие им процессы энергетических переходов Интервал длин Область спектра Процесс Рентгеновская Изменение состояний волн, нм 10 2 - 10 внутренних электронов 10 – 400 УФ-излучение Изменение состояний 400 – 760 Видимое излучение валентных электронов ИК-излучение Изменение колебательных 760 – 10 6 состояний молекулы 6 10 - 10 Микроволновая 8 Изменение вращательных состояний молекулы Взаимодействие электромагнитного излучения с веществом в оптической (ультрафиолетовой, видимой, спектрофотометрического инфракрасной) метода, который области широко лежит в основе используется в фармацевтическом анализе. В зависимости от используемой аппаратуры в фотометрическом методе различают спектрофотометрию (анализ по поглощению монохроматического излучения); колориметрию и фотоколориметрию (анализ по поглощению немонохроматического излучения). 7 Раздел 1. Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях спектра 1.1 Теоретические основы спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Основные термины и определения, используемые в спектрофотометрии В основе большинства фотометрических методов анализа лежит закон Бугера-Ламберта-Бера, который выражает зависимость интенсивности монохроматического светового потока, прошедшего через слой поглощающего вещества (I), от интенсивности светового потока, падающего на него (I концентрации поглощающего вещества (с), толщины поглощающего слоя (L) и от молярного показателя поглощения (), характеризующего поглощающее вещество: I = I×10-C L (2) Графически закон Бугера-Ламберта-Бера выражается прямой линией (рисунок 1), проходящей через начало координат при отсутствии светопоглощения растворителем и систематических ошибок. Графическая зависимость позволяет выявить пределы подчинения светопоглощения исследуемых растворов закону Бугера-Ламберта-Бера. При несоблюдении этого закона прямолинейность нарушается на каком-либо участке или на всей прямой. A 1 2 3 C Рисунок 1 - Зависимость оптической плотности от концентрации раствора: при соблюдении закона Бугера-Ламберта-Бера (1), положительных (2) и отрицательных (3) отклонениях от него 8 Отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера могут быть вызваны следующими факторами: - нелинейной зависимостью показаний прибора от интенсивности светового потока; - немонохроматичностью падающего на анализируемый образец светового потока; - непостоянством температуры в процессе измерений; - кислотно-основным взаимодействием, диссоциацией, ассоциацией, полимеризацией, изменением рН среды с изменением концентрации определяемого лекарственного вещества и другими процессами, происходящими в анализируемой системе. Для измерения степени поглощения электромагнитного излучения сконструированы приборы, позволяющие определять не интенсивность электромагнитного потока, а его ослабление, обусловленное поглощением анализируемого вещества. А для характеристики степени поглощения электромагнитного излучения введены такие фотометрические величины как пропускание и оптическая плотность. Пропускание (Т) – это отношение интенсивности светового потока, прошедшего через слой поглощающего вещества, к интенсивности падающего светового потока: T I IO (3) Исходя из формул (2) и (3) можно записать: T I O 10 E c l 10 E c l IO (4) Пропускание изменяется в пределах от 0 до 1 и обычно выражается в процентах (%) от 0 до 100. Неудобство исчислений привело к тому, что ввели другую фотометрическую величину - оптическую плотность (А) как десятичный логарифм величины, обратной пропусканию: 9 А lg 1 c l T (5) где: А – оптическая плотность раствора; l – толщина поглощающего слоя, см; χ –показатель поглощения; С – концентрация раствора, % или моль/л. Оптическая плотность является величиной безразмерной и практически измеряется в пределах от 0 до 2. Из формулы (5) видно, что поглощение электромагнитного излучения веществом зависит от природы вещества и прямо пропорционально концентрации вещества и толщине поглощающего слоя. Показатель поглощения является специфической физической константой для каждого вещества при строго определенных условиях и используется для идентификации, оценки степени чистоты и количественного определения веществ. На основании измеренной оптической плотности можно вычислить показатель поглощения по формуле: А C l (6) Если концентрация (С) раствора выражена в молях на 1 литр вычисляют молярный показатель поглощения: А C l – молярный показатель поглощения представляет собой оптическую плотность одномолярного раствора вещества при толщине поглощающего слоя 1см. Если концентрация (С) раствора выражена в процентах вычисляют удельный показатель поглощения: E11%см А C l – удельный показатель поглощения представляет собой оптическую плотность 1% раствора при толщине поглощающего слоя 1 см. 10 Коэффициент поглощения в УФ-областиможет достигать больших значений (до 105 л×см-1×моль-1). В ИК-области имеет величина незначительные значения и обычно не определяется. 1.2 Характеристика спектрофотометров Независимо от области спектра приборы для измерения пропускания или поглощения состоят из 5 основных узлов (рисунок 2): Рисунок 2 – Схема спектрофотометра: 1 – источник излучения энергии; 2 – диспергирующее устройство, позволяющее выделить ограниченную область длин волн; 3 – кюветы для пробы и растворителя; 4 – детектор, превращающий энергию излучения в измеряемый сигнал; 5 – индикатор сигнала со шкалой Источник излучения в УФ-области – водородная или дейтериевая лампа. В водородной лампе происходит свечение водорода при разряде, причем возникает практически сплошное излучение в области 200 – 400 нм. ИК-излучение получают от инертного твердого тела, нагретого электрическим током до очень высокой температуры. Так, например, стержень из карбида кремния, называемый глобаро, при нагревании до 1500° С между двумя электродами излучает энергию в области 1 – 40 мкм. Монохроматор излучение на – это составляющие универсальными диспергирующее его монохроматорами волны в устройство, разной УФ-области разлагающее длины. являются Наиболее призмы, изготовленные из кварца или стекла. Для ИК-спектроскопии используют призмы из галогенидов щелочных или щелочноземельных металлов. С диспергирующим элементом связана система линз, зеркал и щелей, которая направляет излучение с требуемой длиной волны от монохроматора к детектору прибора. 11 Детекторы – в УФ-области обычно применяют фотоэлементы, позволяющие световую энергию преобразовать в электрическую. ИК-излучение обнаруживают по повышению температуры зачерненного материала, помещенного на пути потока. Измерительная шкала спектрофотометра проградуирована в процентах I пропускания Т ( I × 100 0 I ) и в величинах оптической плотности A ( lg I ), а 0 шкала длин волн или волновых чисел - в нанометрах или обратных сантиметрах соответственно. Спектрофотометры представляют собой комбинацию из основных узлов, рассмотренных выше, и различаются по сложности и рабочим характеристикам. Спектрофотометры бывают одно- и двулучевые. Наиболее часто применяются двулучевые приборы, в которых световой поток разделяется на два – основной и поток сравнения. При таком способе измерения большинство случайных помех от источника и детектора компенсируются, что обеспечивает меньшую погрешность определения. Принципиальное отличие УФ- и ИК-спектрометров заключается в различном расположении кювет: между диспергирующим устройством и фотоприемником в УФ-спектрофотометрах или между источником излучения и диспергирующим устройством в ИК-спектрометрах. Это объясняется тем, что в УФ-области поглощение может достигать больших величин, что позволяет достаточно точно измерить поглощение монохроматичного светового потока. В ИК-области поглощение принимает незначительные значения, что затрудняет его непосредственное измерение. Поэтому для регистрации ИК-спектров используют так называемую обращенную конструкцию приборов, в которых фиксируется весь спектр излучения, прошедший через вещество. Тогда ИК-спектр будет иметь высокие значения пропускания во всей области кроме участка, при регистрирующего котором произошло устройства в поглощение. ИК-спектрометрах 12 Поэтому шкала проградуирована на пропускание. УФ-спектрофотометры откалиброваны как на пропускание, так и на оптическую плотность. 1.3 Спектр поглощения – как отражение электронного строения вещества Электромагнитное излучение поглощается веществом избирательно. Важнейшей характеристикой электромагнитного излучения является его спектр. Спектром поглощения называют зависимость оптической плотности раствора или значений показателя поглощения (молярного или удельного) растворенного вещества от длины волны. Если органическая молекула взаимодействует с излучением в УФ-области спектра, то при определенной частоте произойдет поглощение кванта энергии, сопровождающееся переходом валентных электронов с основного на возбужденный уровень. Поэтому связывают с физическую природу электронными полос переходами: поглощения при в УФ-области поглощении молекулой электромагнитного излучения в УФ-области происходит переход между электронными уровнями молекулы, а спектр называют электронным. Спектр поглощения в УФ-области выражают в виде графической зависимости оптической плотности (А) или молярного коэффициента поглощения ( ) от длины волны ( ) падающего света. Вместо А или нередко используют их логарифмы. Длина волны может быть выражена в различных единицах – нм или мкм. Построение спектра в различных координатах отразится на его характере, поэтому требует регламентации в нормативных документах. УФ-спектр характеризуется как электронный, но при возбуждении электронов будет изменяться энергия колебательного движения атомов и энергия вращательного движения молекулы, поэтому в спектре появляется ряд линий, которые, сливаясь, образуют широкие полосы поглощения. Полосы поглощения в УФ-спектре, как правило, характеризуются расположением максимумов max и минимумов min поглощения и 1% интенсивностью, выраженной через удельный ( Е1см ) или молярный (ε) 13 показатель поглощения. Максимум поглощения max - длина волны, при которой на кривой поглощения появляется пик или интенсивность поглощения достигает максимума. Минимум поглощения min - длина волны, при которой поглощение минимально. Различные электронные переходы требуют неодинаковой энергии, поэтому полосы поглощения располагаются при разных длинах волн. Типы электронных переходов из основного состояния со связывающих и орбиталей и с несвязывающих n орбиталей в возбужденное состояние на разрыхляющие и орбитали представлены в таблице 2. Таблица 2 - Типы электронных переходов Тип электронных переходов Тип связи Энергия перехода Область (кДж/моль) поглощения (нм) 838 – 1077,5 100 – 150 связь Изолированная 586,6 -838 150 – 200 связь увеличение числа сопряженных связей приводит к снижению энергии Сопряженные связи n- n - Неподеленные электронные пары гетероатомов Неподеленные электронные пары гетероатомов 300 – 350 200 – 300 300 – 350 Наличие в структуре одинарных связей (–С–С–) и изолированных хромофорных групп (-СН=N; -N=N-; -N=O и др.) обусловливает поглощение в дальней УФ-области (100–200 нм). Однако поглощение в дальней УФ-области (до 200 нм) аналитического значения не имеет, поскольку современные спектрофотометры работают в области спектра, начиная со 180-200 нм. Сопряженные диены, как правило, имеют интенсивную полосу поглощения в области 220-250 нм. Для целей 14 спектрофотометрического анализа используются электронные переходы сопряженных связей. Сопряжение вызывает расщепление -орбиталей, что приводит к появлению подуровней, переходы электронов на которых требуют значительно меньшей энергии. При этом поглощение сдвигается в более длинноволновую область спектра и обладает высокой интенсивностью. Спектры поглощения бензола и его производных, так же как и их химические свойства, значительно отличаются от спектров соответствующих алифатических соединений. Бензол и другие ароматические системы, простейшим представителем которых он является, имеют три серии полос поглощения. Две из них характеризуются высокой интенсивностью: первая – в области 180 нм, а вторая – в области 193-204 нм. Интенсивность третьей группы полос в области 230-270 нм (центральный пик – 256 нм) значительно меньше, но ее часто называют «бензольной», поскольку она проявляется в спектрах производных бензола и других ароматических систем (например, пиридина). Эта полоса обусловлена перемещением электронов вдоль цепи сопряжения. На положение и интенсивность полос поглощения большое влияние оказывают электронодонорные (-NH2, -OH, -SH) и электроноакцепторные (N=O, -NO2, и др.) заместители, играющие роль ауксохромов. Они вступают в p, и , сопряжение с -электронной системой хромофора и вызывают смещение в ней электронной плотности, снижая тем самым энергию соответствующих переходов. Ауксохромные группы могут приводить как к батохромному (смещение полосы поглощения в сторону длинных волн) или гипсохромному (смещение полосы поглощения в коротковолновую часть спектра) сдвигу положения полос поглощения, так и к гиперхромному (смещение полосы поглощения в сторону длинных волн) или гипсохромному (смещение полосы поглощения в коротковолновую часть спектра) эффекту. В УФ-спектрах гомологов бензола наблюдается батохромное полос поглощения и увеличение их интенсивности. 15 смещение всех Например, введение в бензол гидроксильной или карбоксильной групп вызывает сдвиг «бензольной» полосы до 270 нм и увеличение интенсивности поглощения. Считается, что для ароматических соединений каждое дополнительное сопряженное ароматическое кольцо дает батохромный сдвиг, равный 50 нм. В электронных спектрах хинонов наиболее важная полоса имеет максимум при 400-500 нм. Таким образом, в УФ-области поглощают молекулы, имеющие в своей структуре хромофорные группы, сопряженные между собой. Чем длиннее система сопряжения, тем в более длинноволновой области спектра поглощает вещество. Полосы поглощения в УФ-области имеют тенденцию к уширению, поэтому УФ–спектры малоселективны. Однако они дают надежную информацию о наличии в структуре определяемого вещества системы сопряженных связей. Так, например, кислота аскорбиновая имеет в структуре хромофорную систему, включающую двойную связь –С=С–, сопряженную с карбонильной группой –С=О, а енольный гидроксил, расположенный на конце цепи сопряжения, играет роль ауксохрома. OH OH H O O HO CH CH2OH Поэтому УФ-спектр аскорбиновой кислоты (рисунок 3) имеет характерный максимум поглощения max = 243 нм и значение удельного 1% показателя поглощения Е1см = 543, которые используются для определения ее подлинности. 16 AD 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 210 220 230 235 243 250 255 260 270 Длина волны, нм Рисунок 3 – УФ-спектр 0,001 % раствора кислоты аскорбиновой в 0,001 моль/л растворе кислоты хлористоводородной 1.4 Применение УФ-спектрофотометрии в анализе лекарственных средств УФ-спектроскопия в фармацевтическом анализе применяется с различными целями. Поскольку характер поглощения вещества обусловлен его структурой, целесообразно применение УФ-спектрофотометрии в целях определения подлинности. При этом в качестве аналитических используются такие спектральные характеристики, как положение и интенсивность полос поглощения. Определение подлинности УФ-спектрофотометрическим методом может осуществляться различными способами. Первый способ основан на построении спектральной кривой и определении на ней характерных, так называемых аналитических длин волн, при которых наблюдается максимальное (мах), минимальное (min) поглощение и плечи. В фармакопейной статье, как правило, регламентируются не строго определенные значения мах и min, а их допустимые интервалы. Это обстоятельство объясняется допустимой ошибкой калибровки шкалы длин волн на различных приборах. 17 Поскольку УФ-спектр имеет одну, две, реже три широкие полосы поглощения, сравнение со стандартными образцами можно не использовать. Однако в ФС строго регламентируются условия определения (растворитель, концентрация рабочего раствора), а спектральная кривая должна строиться в координатах или A , регламентированных в ФС (таблицы 3-7). Второй способ заключается в сравнении спектров поглощения растворов испытуемого раствора и раствора стандартного образца. В указанной области спектра должно наблюдаться совпадение точек максимумов, минимумов, плеч и точек перегиба. Третий способ заключается в определении интенсивности поглощения при заданной аналитической длине волны, выраженной через удельный % показатель поглощения Е 11см . Сущность определения сводится к измерению % оптической плотности анализируемого образца при мах и вычислению Е 11см по формуле 1% EСМ A . C l Полученная величина сопоставляется с величиной удельного показателя поглощения, который, в свою очередь, определяется по стандартному образцу для анализируемого лекарственного вещества и приводится в ФС в виде допустимого интервала (таблицы 3-7). В современном фармакопейном анализе применение УФ- спектрофотометрии в целях определения подлинности веществ, имеющих в структуре систему сопряженных связей, является обязательным, но ввиду малой селективности рассматривается как дополнительный метод в блоке испытаний. 18 Таблица 3 - Фотометрические характеристики некоторых лекарственных веществ из класса витаминов и их аналогов Препарат Растворитель Викасол Вода Этанол Кислота аскорбиновая 0,001 моль/л раствор НСl Кислота никотиновая Вода 0,1 моль/л раствор НСl Кобамид Буферный раствор, рН 2,0 Никотинамид 0,1 моль/л раствор НСl Оксикобаламин Ацетатный буферный раствор, рН 4,0 Пиридоксальфосфат Фосфатный буферный раствор, рН 7,0 Пиридоксина г\хл Вода Ретинола ацетат Этанол Рибофлавин Вода Тиамина бромид Цианокобаламин Вода 0,1 моль/л раствор НСl Вода Этанол 0,1 моль/л раствор NaОН 5 моль/л раствор H 2 SO 4 Фосфатный буферный раствор, рН 7,0 Вода Эргокальциферол Этанол Тиамина хлорид Токоферола ацетат Фолиевая кислота Фосфотиамин 19 Длина волны (мах), нм 230 228 243 950,61 1000,31 542,5 262 260 309,7 246,9 459 55 261 438 351 190 388 201 292 326 223 267 370 445 234 262 260 274 285 365 320 312,93 1550 879,67 824,80 269,9 316,0 282,5 197,5 246,9 212,3 44,5 204,6 209,8 1% Е1см 268 361 278 265 207 115 480–485 Таблица 4 - Фотометрические характеристики стероидных гормонов и их аналогов Препараты Дезоксикортикостерона ацетат Кортизона ацетат Гидрокортизона ацетат Преднизолон Триамцинолон Дексаметазон Прогестерон Прегнин Норэтистерон Тестостерона пропионат Метилтестостерон Метандростенолон Эстрадиол Эстрон Этинилэстрадиол Растворитель Этанол Длина волны (мах), нм 241 % Е 11см 430–450 238 241 242 239 242 241 240 240 240 241 245 281 281 281 390 395 400–430 386 390 518–545 520 570 490 540 516 78 80 71 Этанол Этанол Метанол Этанол Этанол Этанол Этанол Этанол Этанол Этанол Этанол Этанол Этанол Этанол Таблица 5 - Фотометрические характеристики некоторых фениламинов Препараты Растворитель Адреналина гидротартрат Норадреналина гидротартрат Мезатон Фетанол Изадрин Орципреналина сульфат Фенотерол Сальбутамол Эфедрина гидрохлорид 0,01 моль/л раствор HCl 0,01 моль/л раствор HCl Анаприлин Спирт метиловый Дофамин 0,1 моль/л раствор HCl 0,1 моль/л раствор HCl Вода 0,01 моль/л раствор HCl 0,01 моль/л раствор HCl 0,01 моль/л раствор HCl Вода 20 Длина волны (мах), нм 280 279 272 272 280 276 276 276 251 257 263 290 306 319 280 % Е 11см 78–82 85 90 85 113 72 59 7,0 9,0 220 133 Таблица 6 - Фотометрические характеристики некоторых лекарственных веществ из класса алкалоидов и их аналогов Препараты Растворитель Атропина сульфат Вода Морфина гидрохлорид 0,1 моль/л раствор HCl Кодеин 0,1 моль/л раствор HCl Вода Вода 0,1 моль/л раствор HCl Этилморфина гидрохлорид Промедол Папаверина гидрохлорид Дротаверина гидрохлорид 0,1 моль/л раствор HCl Дибазол 0,01 моль/л раствор HCl Вода Вода Вода 0,1 моль/л раствор H 2 SO4 Спирт этиловый Кофеин Теобромин Теофиллин Эуфиллин Хинина сульфат Хинидина сульфат Спирт этиловый Эфедрина гидрохлорид Вода Пилокарпина гидрохлорид 0,01 моль/л раствор HCl 21 Длина волны (мах), нм 252 258 264 285 4,50 5,41 4,13 39,7 285 55,62 285 255 251 285 310 241 302 353 270 276 273 272 272 270 42,24 6,30 1830 164,9 211,1 236 278 332 236 278 332 251 257 263 215 1110 132 163 1110 132 163 7,33 9,37 % Е 11см 406,0 448,6 491,0 545,2 533,2 485,0 223,7 Таблица 7 - Фотометрические характеристики некоторых лекарственных веществ из класса антибиотиков % Длина Е 11см Препараты Растворитель волны и другие (мах , min), нм Бензилпенициллина натриевая соль Феноксиметилпенициллин Ампициллин Цефалексин Цефалотина натриевая соль Пенициллины мах = 280 Вода мах = 263 Раствор NaОН мах = 268 мах = 274 min = 272 Вода мах = 256 261 267 Цефалоспорины мах = 260 Вода мах = 260 Вода мах = 237 характеристики D280 D263 0,72 D268 1,21 1,24 D274 D = 0,65 – 0,72 Производные нитрофенилалкиламинов % мах = 278 Хлорамфеникол Вода Е 11см = 290 – 305 min = 237 Тетрациклин Окситетрациклин Доксициклина гидрохлорид Метациклина гидрохлорид УФ-спектрофотометрия Тетрациклины мах = 380 0,1 моль/л раствор HCl % Е 11см = 380 – 419 0,1 моль/л раствор HCl 1 моль/л раствор HCl мах = 353 D = 0,54 – 0,58 мах = 349 % Е 11см = 280 – 310 1 моль/л раствор HCl мах = 345 применяется также для определения специфических примесей в лекарственных веществах. Известно, чем больше значение молярного коэффициента поглощения (), тем меньшее количество вещества можно определить. Применение метода для определения примеси обосновано только в том случае, если эта примесь имеет 22 высокое значение молярного коэффициента поглощения. Такая примесь называется светопоглощающей. Определение примесей спектрофотометрическим методом сводится к двум случаям. Если примесь поглощает в области спектра, отличной от области поглощения лекарственного вещества, то о наличии примеси судят по появлению дополнительной полосы поглощения в спектре. Примером может служить обнаружение примеси адренолона в адреналина гидротартрате: OH OH H N HO CH3 H N O O CH3 -2H HO O Адреналин Сопряжение Адренолон ароматического расположенными в кольца орто–положении по с двумя –ОН группами, отношению друг к другу, обусловливает поглощение адреналина в УФ-области при длине волны 279 нм. Адренолон, являясь продуктом окисления адреналина, имеет хиноидную структуру, которая обусловливает поглощение в более длинноволновой области спектра при 310 нм. Примесь может поглощать в области спектра, характерной для лекарственного вещества. В таком случае о наличии примеси судят по увеличению оптической плотности при аналитической длине волны. Использование этого приема возможно при условии соблюдения закона аддитивности, согласно которому оптическая плотность суммы веществ равна сумме оптических плотностей отдельных веществ при условии независимого поглощения этих веществ: Поскольку АA АB АA B абсолютные значения оптической плотности плохо воспроизводятся, определяют относительное значение – отношение оптических плотностей при различных аналитических длинах волн: 23 А1 А2 . Так, например, поглощающих данный примесей в прием используется цианокобаламине. при определении Определяют оптическую плотность раствора лекарственного вещества при 278 нм, 361 нм и 548 нм. Затем вычисляют отношения оптических плотностей, которые должны входить в интервалы, приведенные в ФС: А при 361 нм А при 548 нм А при 361 нм А при 278 нм = 3,0 – 3,4 = 1,7 – 1,88 1.5 Использование спектрофотометрии в количественном анализе лекарственных средств. Способы расчета концентрации Спектрофотометрия в УФ-области используется достаточно широко в количественном анализе. Применение метода основано на существовании прямо-пропорциональной зависимости величины поглощения от концентрации вещества в анализируемом растворе: А c l . Различают несколько способов количественного анализа спектрофотометрическим методом: - графический по калибровочному графику; - сравнительный относительно стандартного образца; - расчетный по удельному показателю поглощения (Е1%1см). Первый способ наиболее рационален при проведении серийных анализов. Сущность его сводится к следующему: готовится серия разведений стандартного образца в интервале концентраций, при которых наблюдается подчинение закону Бугера–Ламберта–Бера. Измеряется оптическая плотность растворов стандартного образца и строится калибровочный график. Затем готовится раствор анализируемого образца в концентрации, примерно соответствующей середине калибровочного графика, и измеряется его оптическая плотность (Ax) на том же приборе при аналогичных условиях ( max , l ). По калибровочному графику определяется значение Сх , г/мл (рисунок 4). 24 A Рисунок 4 - Калибровочный график В дальнейших расчетах учитывается значение навески анализируемого образца и способ ее разведения: X,г C X VМ .К . VЛ .Ф. а. Достоинствами способа расчета по калибровочному графику являются: - простота и удобство при многократном фотометрировании однотипных по химическому составу растворов (серийные фотометрические анализы); - возможность проводить количественное определение анализируемого вещества при несоблюдении закона Бугера-Ламберта-Бера. В этом случае строят калибровочный график для узкого интервала концентраций, в пределах которого зависимость оптической плотности наиболее линейна. Недостатки: - появление погрешностей, связанных с субъективностью построения калибровочного графика, несоответствием графических (масштабных) погрешностей, и погрешностей измерений оптических плотностей, связанных с изменением условий (например, температуры) и невоспроизводимостью установки длины волны. Второй способ количественного определения сводится к следующему: параллельно готовятся растворы анализируемого и стандартного образцов примерно одинаковой концентрации (Сх и Сст) и измеряется их оптическая плотность (Ах и Аст.) при равных условиях ( max , l .) В соответствии с основным законом светопоглощения можно записать: 25 АX l C X ; Аст l C ст . Учитывая, что χи l одинаковы, объединяя оба уравнения, получают: АX C X Аст Cст CX АX Cст , г/мл. Аст Далее в расчетной формуле учитывают величину навесок стандартного и анализируемого образцов и способ их разведения: X АX аст Wх PЛФ , г. Аст а х W ст Данный способ является более точным, так как позволяет исключить влияние многочисленных факторов (погрешности разведения, установки длины волны, влияние температуры и т.д.) и широко применяется при выполнении единичных анализов. Третий способ расчета основан на использовании приведенного в НД или предварительно вычисленного значения удельного или молярного показателя поглощения. В фармацевтическом анализе чаще используется значение удельного показателя поглощения. Исходя из математического выражения закона Бугера-Ламберта-Бера, находят содержание действующего вещества в испытуемом растворе: Cx , % A x 1% 1см E l Для расчета содержания действующего вещества в исходном образце, необходимо учесть все выполненные операции по обработке исходного образца (приготовление исходного раствора, отбор аликвоты и последующие разведения). Однако этот способ анализа наименее предпочтителен, поскольку в данном случае возрастает роль ошибок, обусловленных индивидуальными характеристиками приборов. 1.6 Выбор оптимальных условий анализа Для обеспечения требуемой точности анализа необходимо научно обосновать условия количественного определения. 26 Выбор аналитической длины волны. Для этой цели строят спектральную кривую зависимости оптической плотности от длины волны по раствору стандартного образца. На спектральной кривой определяют аналитические длины волн, соответствующие длинам волн максимального поглощения. Из всех имеющихся в спектре полос поглощения для целей количественного анализа выбирают такую, которая характеризуется наибольшей интенсивностью, т. к. работа в области максимума светопоглощения обеспечивает наиболее высокую чувствительность определения. С другой стороны, более предпочтительными являются пологие максимумы, т. к. при этом меньше сказывается погрешность в установлении длины волны. Выбор интервала концентраций, при которых наблюдается подчинение закону Бугера–Ламберта–Бера. Для этого готовят серию разведений стандартного образца и при выбранной аналитической длине волны измеряют значения их оптических плотностей. По полученным данным строят калибровочный график – графическую зависимость оптической плотности от концентрации. Поглощение электромагнитного излучения веществом подчиняется основному закону светопоглощения в том интервале концентраций, при котором график представляет собой прямую линию, выходящую из начала координат (рисунок 5). A Рисунок 5 - Калибровочный график Cn - Cm – область концентраций, в которой наблюдается подчинение закону Бугера–Ламберта–Бера 27 Погрешность определения сильно возрастает при отсутствии прямопропорциональной зависимости величины поглощения от концентраций. Это наглядно можно продемонстрировать с помощью рисунок 6. A ΔA1 ΔA2 Рисунок 6 - Калибровочный график: 1 – при соблюдении закон Бугера–Ламберта–Бера, 2 – при несоблюдении закон Бугера–Ламберта–Бера На рисунке 6 видно, что при одной и той же погрешности определения оптической плотности ΔA1 =ΔA2 , погрешность определения концентраций ∆С2 в случае невыполнения закона Бугера–Ламберта–Бера превышает погрешность ∆С1, когда закон выполняется. Выбор рабочего диапазона оптической плотности (A). Установлено, что относительная погрешность измерения оптической плотности принимает минимальные значения при A = 0,434. Поэтому стараются работать в области значений оптических плотностей от 0,3 до 0,8, в которой прибор откалиброван с наибольшей точностью. Поскольку оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации вещества в анализируемой пробе и толщине поглощающего слоя, именно этими параметрами стоит варьировать для выбора оптимальных значений оптической плотности. В то же время концентрацию выбирают таким образом, чтобы ее значение укладывалось в интервале, при котором наблюдается подчинение закону Бугера–Ламберта–Бера. 28 Выбор стандартного образца (СО). Спектрофотометрия является относительным методом и, следовательно, требует использования стандартных образцов, в качестве которых могут использоваться государственные стандартные образцы (ГСО) или рабочие стандартные образцы (РСО). Подготовка анализируемого образца. Измерение поглощения в УФобласти осуществляется в растворах. Ввиду высокой чувствительности спектрофотометрического метода рабочая концентрация раствора Сх имеет низкие значения. Поэтому в методике спектрофотометрического определения должна быть регламентирована научно обоснованная величина навески и мерная посуда, используемая для ее разведения. Выбор раствора сравнения. Фотометрические определения в любой области спектра предполагают использование растворов сравнения – это растворители или растворы, содержащие все компоненты анализируемой пробы, кроме определяемого вещества. Фотометрические приборы сконструированы таким образом, что использование кювет с раствором сравнения позволяет шкалу оптических плотностей вывести на ноль и тем самым нивелировать поглощение, обусловленное стенками кюветы, растворителем и другими реактивами, используемыми для подготовки анализируемого образца. 1.7 Виды спектрофотометрического анализа Основной задачей спектрофотометрии является получение зависимости интенсивности поглощения от длины волны. Это дает возможность идентифицировать вещества по характеристикам полос поглощения спектра, а также проводить количественный анализ по зависимости интенсивности поглощения от концентрации. Основные виды спектрофотометрии представлены ниже. Непосредственная спектрофотометрия Для идентификации активных веществ и количественного растительного и определения биологически синтетического происхождения, обладающих способностью к избирательному светопоглощению в УФ-области, 29 наиболее часто используется метод непосредственной (прямой) спектрофотометрии. При использовании метода непосредственной спектрофотометрии оптические плотности исследуемого и стандартных растворов измеряют по отношению к растворителю или раствору сравнения с нулевым поглощением. Метод непосредственной спектрофотометрии наиболее простой, быстрый, достаточно специфичный. Он дает надежные результаты при определении индивидуальных веществ, не содержащих примесей, обладающих поглощением в той же области спектра. Метод дифференциальной спектрофотометрии В этом методе оптические плотности исследуемого и стандартных растворов измеряют не по отношению к растворителю или раствору сравнения с нулевым поглощением, а по отношению к раствору с известной концентрацией определяемого вещества Со. В зависимости от способов измерения относительной оптической плотности различают несколько вариантов метода. Метод высокого поглощения – концентрация раствора сравнения меньше концентрации исследуемого раствора (Со Сх). Готовят серию стандартных растворов с концентрациями С1, С2 Сn и фотометрируют стандартные и исследуемый растворы по отношению к раствору сравнения с концентрацией Со. Значения относительной оптической плотности А представляют собой разность оптических плотностей исследуемого (стандартных) раствора и раствора сравнения: Ax Ax Ao (Cx Co ) A Аст Ао (Сст Со ) Концентрацию исследуемого раствора определяют расчетным способом или по градуировочному графику. Отличие градуировочного графика от обычного в том, что за начало отсчета принимают концентрацию раствора сравнения Со. 30 При расчетном способе учитывают, что отношение оптических плотностей исследуемого и стандартных растворов соответствует отношению разности между концентрациями этих растворов и раствора сравнения: Ах Сх Со Аст Сст Со Отсюда: Сх Со Ах Сст Со Аст или Сх Со FАх где: F Сст Со Аст F называют фактором пересчета. В одной серии измерений F является постоянной величиной. Метод рекомендуется использовать в тех случаях, когда оптическая плотность растворов больше единицы. Метод низкого поглощения. Концентрация раствора сравнения больше концентрации исследуемого раствора (Со Сх). В этом случае применяют обратный порядок измерения: анализируемый и стандартные растворы условно принимают за растворы сравнения и по отношению к ним измеряют оптическую плотность изначального раствора сравнения. При обратном порядке измерения относительная оптическая плотность А равна разности оптических плотностей исследуемого раствора (стандартного) и раствора сравнения: Ах Ао Ах Аст Ао Аст Концентрацию Сх рассчитывают по формуле: Сх Со FАх 31 где F Со Сст Аст Метод низкого поглощения применяют чаще всего к растворам с оптической плотностью 0,1. Метод двухстороннего дифференцирования (метод предельной точности) сочетает в себе оба метода с прямым и обратным порядком измерения оптической плотности растворов. При работе этим методом готовят несколько стандартных растворов с концентрациями, меньшими, чем в растворе сравнения, и столько же стандартных растворов с концентрациями, большими, чем в растворе сравнения. Рисунок 7 - Градуировочный график в методе двухсторонней дифференциальной фотометрии Если С Со, используют прямой порядок измерения, если С Со, применяют обратный порядок измерения, и значения относительных оптических плотностей берут со знаком минус (для фотометрических приборов стрелочного типа со шкалой). Современные фотоэлектроколориметры позволяют фиксировать отрицательные значения оптической плотности, поэтому используют прямой порядок измерений. Градуировочный график при этом не проходит через начало координат, а пересекает ось абсцисс в точке, соответствующей концентрации раствора сравнения Со (рисунок 7). 32 Концентрацию исследуемого раствора можно определить и расчетным путем: Сх Со FАх Как видно, при концентрации раствора сравнения Со=0 дифференциальный метод превращается в метод прямой фотометрии. Дифференциальные методы анализа применяют для определения больших количеств веществ, для устранения мешающего влияния посторонних примесей и исключения поглощения реактивов. Этот метод применяют еще и в тех случаях, когда из-за большой концентрации нарушается закон Бугера – Ламберта – Бера, или когда значение оптической плотности выходит за границы шкалы прибора, а дальнейшее разбавление раствора нежелательно. Точность определения при использовании дифференциального метода повышается. Производная спектрофотометрия Часто в практике фармацевтического анализа приходится иметь дело не с индивидуальными веществами, а с различными смесями. Вследствие наложения полос поглощения спектрофотометрические методики могут давать погрешности, величина которых использования спектрофотометрии. является Одним из основным способов, ограничением позволяющих увеличить разрешающую способность спектральных измерений, является производная спектрофотометрия. Метод производной спектрофотометрии заключается в непосредственном измерении разности в поглощении при двух длинах волн разделенных узким интервалом: Δλ = λ2 - λ1 Разность в оптической плотности для двух длин волн, отнесенная к величине интервала между ними в пределе представляет собой математическую производную спектра поглощения: 33 Величина производной прямо пропорциональна крутизне наклона исходной кривой спектра поглощения, точки пересечения производной с осью длин волн соответствует положению максимумов и минимумов в спектре поглощения, а максимумы и минимумы на производной – точкам перегиба кривой поглощения. Недостатком первой производной является то, что одной полосе поглощения соответствует положительный и отрицательный максимумы, что значительно усложняет форму кривой и может затруднить интерпретацию полученных данных. Вторая производная по общей форме значительно ближе к исходному спектру: максимуму поглощения соответствует минимум на второй производной. В отличие от исходной полосы поглощения наблюдается заметное сужение пика второй производной, с обеих сторон наблюдаются дополнительные пики, которые называют сателлитами. Четвертая производная также по виду близка полосе поглощения исходного спектра, но значительно уже ее. Использование производных от спектров поглощения позволяет увеличить разрешение при идентификации полос поглощения, а следовательно, расширить возможности спектрофотометрического метода для идентификации лекарственных веществ в различных смесях. Производная спектрофотометрия может быть использована количественном анализе. При соблюдении закона Бугера-Ламберта-Бера: А=E1см1%×С×l Тогда: где: С –концентрация раствора, %; l –толщина кюветы, см; А – оптическая плотность; Е – коэффициент светопоглощения. 34 и в С помощью производной спектрофотометрии возможно определение одних веществ в присутствии других, у которых поглощение изменяется медленнее по сравнению с определяемым веществом. Определение смеси светопоглощающих веществ. Метод Фирордта Спектрофотометрический метод, в принципе, позволяет определить несколько светопоглощающих веществ в одном растворе без предварительного разделения. В простейшем случае вещества поглощают при разных длинах волн, и анализ смеси сводится к определению каждого компонента в отдельности – метод изолированной абсорбции. В случае, когда спектры поглощения компонентов смеси частично накладываются друг на друга, выбирают длину волны, при которой наблюдается максимальное поглощение одного компонента, а поглощение другого компонента пренебрежимо мало. Если же спектры веществ перекрываются, то для анализа используют один из методов, основанных на законе аддитивности. Например, для смеси веществ А и В можно записать систему уравнений Фирордта: А1 ( А,1СА В,1СВ ) А2 ( А,2 СА В,2 СВ ) Решение этой системы уравнений при l = 1 см дает: СА СВ А1 В,1 А2 В,1 А,1 В,2 А,2 В,1 А2 А,1 А1 А,2 А,1 В,2 А,2 В,1 Длины волн, при которых следует проводить измерения оптической плотности, выбирают по спектрам поглощения веществ А и В. Хорошие результаты дает, например, метод максимальных разностей. Для этого сначала снимают спектры поглощения веществ А и В (рисунок 8, а), а затем строят график зависимости А – В или В – А от длины волны и находят области максимума и минимума (рисунок 8, б). 35 Рисунок 8 - Спектры поглощения веществ А и В (а) и зависимость А – В от длины волны (б) Молярные коэффициенты светопоглощения определяют заранее, поэтому анализ сводится к измерению оптической плотности при двух длинах волн. Этот анализ при помощи фотоколориметров осуществить практически невозможно, поэтому количественное определение компонентов производят при помощи спектрофотометров. Точность определения тем выше, чем больше различие в значениях А и В при одной и той же длине волны. Точность результатов анализа зависит от соотношения концентраций компонентов. Погрешность определения резко увеличивается при уменьшении относительного содержания компонента и при большом числе определяемых компонентов. Если число компонентов в смеси больше, чем два, число слагаемых в уравнениях увеличивается пропорционально числу компонентов и соответственно возрастает число уравнений. Необходимое требование – подчинение компонентов системы законам Бера и аддитивности. Так, для n компонентов будет записана система из n уравнений, значения оптических плотностей должны быть измерены при n длинах волн. Такие системы уравнений решают с использованием вычислительной техники. 36 Раздел 2. Спектрофотометрия в ИК-области спектра Явление взаимодействия веществ с ИК-излучением было открыто У. Эбни и И.Фестингом в 1861 г. В России впервые ИК-спектры адсорбированных молекул были получены в 1938 г. А.Н. Терениным и его аспирантом К.Я. Каспаровым. Теренин Александр Николаевич (1896 - 1967) В 1948 г., за шесть лет до появления первой подобной публикации за рубежом, Н.Г. Ярославским были обобщены результаты первых исследований поверхности пористого стекла с помощью ИК-спектроскопии. В дальнейшем этот метод, весьма чувствительный к межмолекулярным взаимодействиям, оказался незаменимым средством изучения веществ и их превращений в адсорбированном состоянии. Достоинством методов колебательной спектроскопии является то, что они допускают исследование практически любого неорганического или органического вещества в любом агрегатном состоянии - газе, жидкости, растворах, кристаллах или аморфной фазе. Т.о., в настоящие время ИКспектрофотометрия стала одним из основных методов исследования веществ различной химической природы, в том число и лекарственных соединений. Впервые метод стал фармакопейным с 1968 г (ГФ X), где он рекомендовался для контроля качества трех лекарственных веществ: фторотана, оксациллина и метициллина натриевых солей, а в разделе «Общие методы физико-химического, химического и биологического исследования» фармакопеи помещен материал, касающийся 37 некоторых практических вопросов ИК-спектрофотометрии. Со времени выхода 10-го издания фармакопеи число препаратов, при исследовании которых рекомендуется метод, значительно выросло, что можно проследить на примере дополнений к фармакопее, издаваемых ежегодно, и отдельно выпускаемых фармакопейных статьях. Наряду с ультрафиолетовой ИКспектроскопия включена во все современные фармакопеи. Так, Международная фармакопея (Женева, 1990 г) рекомендует этот метод практически в анализе половины описанных в ней лекарственных веществ. Получать ИК-спектры можно не только для субстанций, но и в ряде случаев для готовых препаратов. Для этого необходимо, чтобы вспомогательные вещества, входящие в состав препарата (например, таблеток), не подавляли спектр действующего вещества. Это условие обычно выполняется, если процентное содержание вспомогательных веществ не слишком велико - обычно менее 60—70%. ИК-спектроскопия является обязательным методом контроля веществ - стандартных образцов, кроме того, она в настоящее время включается в ФС на многие лекарственные вещества. Метод используется в фармакопейном анализе для доказательства отличия лекарственных веществ близкого химического строения (одного ряда). Например, в ФС на эстоцин - препарат из группы эфиров арилалифатических кислот - требуется, чтобы в ИК-спектре, снятом в вазелиновом масле, отсутствовала характеристическая полоса поглощения свободной гидроксильной группы в области 3300-3500 см-1 (отличие от амизила и метацина). Метод ИК-спектроскопии обычно не очень чувствителен к примесям, если они не превышают 1 %. Примеси проявляются в появлении «лишних» полос, изменение формы, интенсивности и резкости отдельных полос. В настоящее время широкое применение находит ИК-спектроскопия с Фурье-преобразованием или ИК-Фурье спектроскопия. Это метод оптической спектроскопии, в котором спектр получают в результате Фурье38 преобразования так называемой интерферограммы исследуемого излучения. Интерферограмма зависит от оптической разности хода двух лучей и представляет собой Фурье-образ спектра, т.е. функции распределения энергии излучения по частотам. Фурье-преобразование – это универсальный метод выделения частотных характеристик из периодической функции любого вида. Метод ИК-Фурье спектроскопии был разработан с целью устранения ограничений, встречающиеся при работе с дисперсионным оборудованием, главным недостатком которых является медленный процесс сканирования. Требовался метод, в котором все инфракрасные частоты измерялись бы одновременно, а не по отдельности. К достоинствам ИК-Фурье спектроскопии относится и то, что данный метод является неразрушающим. 2.1 Общие теоретические положения метода ИК-спектроскопии ИК-спектроскопия - метод исследования веществ, основанный на поглощении ИК-излучения, в результате чего происходит усиление колебательных и вращательных движений молекул. Энергия ИК-излучения недостаточна для осуществления электронных переходов; под действием ИК-излучения возможны только колебательные и вращательные переходы. Большее проявление имеют колебательные движения, поэтому ИК-спектры, называются колебательными (или молекулярными). Эти спектры связаны с периодическим изменением относительного расположения атомных ядер, т.е. с колебательным движением молекулы или иона. Атомы в молекулах никогда не находятся в состоянии покоя, а колеблются относительно каких-то средних положений, отчего расположение их относительно друг друга периодически изменяется. ИКизлучение усиливает эти колебания, при этом часть энергии излучения теряется. Фиксируется ослабление прошедшего ИК-излучения. (J)=J0-Jпотери как функция длины волны (так же, как в электронных спектрах). 39 Энергия, необходимая для возбуждения колебаний атомов в молекуле, соответствует энергии квантов света с длиной волны 1 - 15 мкм или волновым числом 400-4000 см-1, т.е. электромагнитному излучению средней инфракрасной области. ИК-область обычно рассматривают, начиная с красного края видимого спектра, примерно с 14000 см-1, где глаз перестает воспринимать диспергированное излучение («инфра», значит «ниже красного»). Области, примыкающие к ней, называются ближней инфракрасной и дальней инфракрасной. Слова ближний и дальний характеризуют близость к области видимого света. «Ближняя» расположена между 14000 и 3600 см-1. «Дальнюю» приближенно считают от 300 до 20 см-1. Так называемая фундаментальная ИК-область начинается примерно с 3600 см-1 и распространяется до 300 см-1. Это средняя ИК-область, которая широко используется для анализа органических молекул, т.к. в ней проявляется большое число полос поглощения функциональных групп. Полосы, наблюдаемые в интервале от 700 см-1 и менее, обусловлены деформационными колебаниями тяжелых атомов или циклических группировок. Этот интервал приобретает аналитическую значимость при исследовании неорганических веществ. Ранее областью «отпечатков пальцев» считали только спектральный интервал от 1500 см-1 до 700 см-1; в настоящее время в связи с прогрессом метода этот подход устарел. К области «отпечатков пальцев» относят всю фундаментальную область ИК-спектра. Колебательные уровни молекул квантованы, энергия переходов между ними и, следовательно, частоты колебаний могут иметь только строго определенные значения. Поглощая квант света, молекула может переходить на более высокий колебательный уровень, обычно из основного колебательного состояния в возбужденное. Поглощение инфракрасного излучения вызывают колебания связанные с изменением либо длин связи, либо углов между связями. Это означает, что 40 в зависимости от частоты поглощенного излучения начинает периодически растягиваться определенная связь или искажаться определенный угол между связями. Таким образом, основными типами колебаний являются так называемые валентные и деформационные колебания. Колебания, заключающиеся в изменении длины связи между связанными атомами и не сопровождающиеся отклонением от межъядерной оси, называются валентными, т.о. валентными колебаниями называются колебания ядер атомов вдоль линии связи, они обозначаются буквой ν (ν С=С, ν С=О). Валентные колебания располагаются в области больших частот 40001400 см-1, деформационные - в области низких < 1400 см-1. В зависимости от природы колебания подразделяются на скелетные (800-1500 см-1) и колебания групп (>1500 см-1). Наряду с указанными основными в спектре наблюдаются обертоны, полосы резонансного взаимодействия, составные полосы, возникающие в результате взаимодействия полос поглощения отдельных атомов. Колебательными спектрами обладают не все молекулы, а только те, у которых при колебании происходит изменение ее дипольного момента. Например, HCI, H2O, но не Cl2, N2, O2, и т.д. Приближенной механической моделью валентных колебаний может служить система из двух шаров, связанных пружиной (шары изображают атомы, а пружина - химическую связь). При растяжении или сжатии пружины шары начнут колебаться вокруг положения равновесия, т.е. будет осуществляться гармоническое колебание, описываемое уравнением: 1 2 F m r , где ν- частота колебания; F - силовая постоянная; характеризующая прочность связи, или силу, возвращающую шары в положение равновесия; 41 mr - приведенная масса атомов, вычисляемая по формулам: mr m1 m 2 m1 m 2 , где m1 и m2 – массы атомов. валентные колебания могут быть симметричными (νs), если обе связи одновременно удлиняются или укорачиваются и пары атомов одновременно приближаются и отделяются; m1 m2 Частота m1 m2 антисимметричного колебания всегда выше, чем симметричного. Следующим типом колебаний являются деформационные, которые связаны с изменением валентного угла, образованного связями у общего атома, т.е. колебания, при которых атомы смещаются с межъядерной оси, они обозначаются буквой δ. Для возбуждения деформационных колебаний требуется меньшая энергия, чем в случае валентных колебаний и, следовательно, они имеют меньшую частоту. С увеличением числа атомов в молекуле число возможных колебаний быстро растет. В реальной молекуле колебания атомов тесно связаны друг с другом и взаимодействуют между собой. Рассмотрим двухатомную молекулу. Ядра ее совершают малые колебания около положения равновесия. Этим колебаниям отвечает дискретный набор состояний и соответствующих им энергетических уровней. Чтобы колебание проявилось в инфракрасной области, необходимо изменение дипольного момента при колебании вдоль оси симметрии или перпендикулярно ей, т.е. 42 любое изменение значения или направления диполя приводит к возникновению осциллирующего диполя, который может поглощать энергию, взаимодействуя с электрической компонентой инфракрасного излучения. Рисунок 9 - Основные типы колебаний: а – валентное симметричное; б –деформационное симметричное; в – валентное асимметричное Для реально колеблющихся молекул картина движения очень сложная, каждый атом не движется точно по одному из путей, представленному на рисунке 9, их движение является суперпозицией всех возможных колебаний. Однако такая суперпозиция может быть разложена на составляющие, если, например, наблюдать молекулу строскопически, освещая ее импульсно частотами, совпадающими с частотами каждого из основных колебаний по очереди. В этом и состоит существо инфракрасной спектроскопии, только роль подсветки играет частота поглощаемого излучения, а наблюдение ведется за изменением дипольного момента. Спектры молекул представляют собой сложный набор различных колебаний, каждое из которых проявляется в узком интервале частот. Общее число линий (полос поглощения) в спектре, связанных с колебаниями атомов, определяется для нелинейной молекулы формулой 3N 6 основных колебаний и 3N - 5 для линейной молекулы, где N - число атомов в молекуле. Фактически число полос в спектре не всегда равно этому числу. Оно может уменьшаться вследствие того, что часть полос не проявляется в ИК-спектре, что связано со степенью симметрии молекулы. Уменьшение числа полос происходит из-за того, что для достаточно симметричных молекул различные колебания могут иметь одинаковые частоты и в 43 результате этого в спектре проявляется вместо 2-3 лишь одна полоса. Интенсивность поглощения в ИК-спектроскопии обычно выражают как поглощение (А) или чаще как пропускание (Т) светового потока в процентах: T ,% J 100 J0 Полосы также оцениваются ориентировочно как сильные (с), средние (ср) и слабые (сл). При изучении взаимодействия с ИК-излучением веществ различного химического строения (модельные соединения) было установлено, что многие атомные группы такие как -ОН, -NH2, -NO, >СО, а также определенные связи, такие как С-Н, С-С, С=С, С=О, характеризуются определенными частотами, мало отличающимися в различных соединениях. Такие частоты получили название характеристических или групповых частот. Они обозначаются греческой буквой ν и для основных классов органических соединений приведены в таблицах 8-9. Таблица 8 - Характеристические частоты поглощения различных групп атомов в ИК-области АЛКАНЫ Валентные колебания С–Н () –СН3 2962 и 2872 см-1 ± 10 см-1 (с.) –СН2– 2926 и 2853 см-1 ± 10 см-1 (с.) 2890 ± 10 см-1 (сл.) СН (третичный) Деформационные колебания С–Н () 1450 ± 10 см-1 (ср.) С– СН3 (асимметричные) – СН2– 1465 ± 20 см-1 (ср.) 1380 – 1370 ± 20 см-1 (с.) С– СН3 (симметричные) 1385 – 1380 и 1370 – 1365 см-1 (с.) С–(СН3)2 –С–(СН3)3 1395 – 1385 см-1 (ср.) и 1365 см-1 (с.) –СН– около 1340 см-1 (сл.) Колебания –С–С– скелета R–С–(СН3)3 1250 ± 5 см-1 (с.), 1250 – 1200 (с.), около 415 см-1 –С–(СН3)2 1170± 5 см-1 (с.), 1170 –1140 см-1 (с.), 44 – (СН2)4– – (СН2)4–О– Циклопропан Циклобутан около 800 см-1 750 –720 см-1 (с.) 742 –734 см-1 (с.) (неприменимо к углеводородам) Циклические системы 1020 – 1000 см-1 (ср.) 920 – 866 см-1 или 1000 – 960 см-1 (ср.) АЛКЕНЫ Валентные колебания СС 1680 – 1620 см-1 Несопряженная связь Связь, около 1625 см-1 (с.) сопряженная с фенилом Связь, около 1625 см-1 (с.) сопряженная с С=О и С=С Валентные и деформационные колебания С–Н –СН=СН– (транс) 3040 – 3010 см-1 (ср.) () 970 – 960 см-1 (с.) () 1310 – 1295 см-1 (с.- сл.) () –СН=СН– (цис) 3040 – 3010 см-1 (ср.) () около 690 см-1 (с.) () АЛКИНЫ СН 3300 см-1 (с.) () СС 2140 – 2100 см-1 (с.) () монозамещенные СС 2260 – 2190 см-1 () дизамещенные Дополнительные 1750, 1250 и 650 см-1 полосы АРОМАТИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ =С–Н вблизи 3030 см-1 (с.) () С=С-скелет плоскостные колебания: 1600 см-1 , 1500 см-1, 1580 см-1 (сопряженные кольца) (с.), 1450 (ср.) 45 С6Н5 – (в бензоле расположены по соседству пять незамещенных атомов Н) С6Н4 –(четыре незамещенных атома Н в бензоле) С6Н3 –(три незамещенных атома Н в бензоле) С6Н2 –(два незамещенных атома Н в бензоле) С6Н1 –(один незамещенный атом Н) В бензоле 1,2-; 1,4-; 1,2,4замещение Моно-; 1,3-; 1,2,3–; 1,3,5–замещение 1,2-; 1,2,3-; 1,2,4-замещение Свободная –ОН Межмолекулярная водородная связь Внутримолекулярная водородная связь Хелаты 770 –730 см-1 (оч. с.) и 710 –690 см-1 (с.) () 770 – 735 см-1 (оч. С.) () 810 –750 см-1 (оч. С.) () 860 – 800 см-1 (оч. С.) () 900 – 860 см-1 (ср.) () 1225 –1175 см-1 (сл.); 1125 – 1090 см-1 (сл.) 1070 – 1000 см-1 (сл) (две полосы) 1175 – 1125 см-1(сл.); 1110 – 1070 см-1 (кроме 1,3,5-замещения) (сл.); 1070 – 1000 см-1 (одна полоса) (сл.) 1000 – 960 см-1(сл.) СПИРТЫ И ФЕНОЛЫ Валентные колебания –ОН 3650 – 3590 см-1 (перем.) 3550 – 3450 см-1 (один водородный мостик) 3400 – 3200 см-1 (полимеры) 3570 – 3450 см-1 (один водородный мостик) 3200 – 2500 см-1 (сильные внутримолекулярные связи) Деформационные колебания –ОН; валентные колебания С–О Первичные спирты Около 1050 см-1 (с.); 1350 – 1260 см-1 (с.) Вторичные спирты Около 1100 см-1 (с.); 1350 – 1260 см-1 (с.) Третичные спирты Около 1150 см-1 (с.);1410– 1310 см-1 (с.) Фенолы Около 1200 см-1 (с.); 1410 – 1310 см-1 (с.) ПРОСТЫЕ ЭФИРЫ –СН2–О–СН2– (алкильные 1150 – 1060 см-1 (оч. с.) простые эфиры) Ароматические и др. эфиры с 1270 – 1230 см-1 (оч. с.) группой =С–О– Циклические эфиры: 46 Эпоксидные соединения Соединения с бóльшими циклами около 1250 см-1 (с.); около 890 см-1 (транс) (с.); около 830 см-1 (цис) (ср.) 1140 – 1070 см-1 (оч. с.) КЕТОНЫ 1725 – 1705 см-1 –СН2–СО––СН2– Замещенные кетоны с открытой цепью Кетоны с шести- и семичленным кольцом Кетоны с пятичленным кольцом Кетоны с четырехчленным кольцом Хиноны: - две группы –СО в одном кольце; - две группы –СО в двух кольцах 1725 – 1705 см-1 1750 – 1740 см-1 около 1775 см-1 1690 – 1660 см-1 1655 – 1635 см-1 АЛЬДЕГИДЫ 1740 – 1720 см-1 Колебания СО (насыщенные алифатические) Колебания С–Н (для все типов) Другие колебания: Алифатические альдегиды 2900 – 2700 см-1 (сл.) () 975 – 780 см-1 (ср.) () 1440 – 1325 см-1 (с.) 1415 – 1350 см-1 (с.) Ароматические альдегиды 1320 – 1260 см-1 (с.) 1230 – 1160 см-1 (с.) КАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ –ОН свободная (карбон. к-т) 2700 – 2500 см-1 (сл.) () –ОН связанная (карбон.к-т) 3560 – 3500 (ср.) С=О(карбоновых кислот) 1725 – 1700 см-1 (сл.) (насыщенные алифатические) 1700 – 1680 см-1 (сл.) (ароматические) 1670 – 1650 см-1 (сл.) (имеющие внутреннюю водородную связь) 1440 – 1395 см-1 (сл.); Колебания С–О () , –ОН (); 1320 – 1211 см-1 (с.) –ОН (, неплоскостные) 950 – 900 см-1 (переем.) Карбоксильная группа 1610 – 1550 см-1 (с.) (); 1420 – 1300 см-1 (с.) () СЛОЖНЫЕ ЭФИРЫ И ЛАКТОНЫ Валентные колебания С=О 47 Нормальные насыщенные сложные эфиры Сложные кетоэфиры Сложные -кетоэфиры (енольные) -лактоны (насыщенные) -лактоны (,-ненасыщенные) -лактоны (,-ненасыщенные) -лактоны Сложные тиоэфиры все типов Формиаты Ацетаты Фенолацетаты Пропионаты и высшие гомологи Бензоаты 1750 – 1735 см-1 1755 – 1740 см-1 1755 – 1740 см-1 1780 – 1760 см-1 1760 – 1740 см-1 около 1800 см-1 около 1820 см-1 около 1675 см-1 Валентные колебания С–О 1200 – 1180 см-1 1250 – 1230 см-1 около 1205 см-1 1200 – 1150 см-1 1310 – 1250 см-1 1150 – 1100 см-1 АМИДЫ, ПРОТЕИНЫ Валентные колебания NH Первичные амиды: NH (свободная) NH (связанная) Вторичные амиды: NH (свободная) NH (связанная): трансцисцис и транс- около 3500 – 3400 см-1 (ср.) около 3350 – 3180 см-1(ср.) около 3440 – 3400 см-1(ср.) 3320 – 3270 см-1(ср.) 3180 – 3140 см-1(ср.) 3100 – 3070 см-1 (ср.) Полоса поглощения СО (амидная полоса I) 48 около 1650 см-1 (тв.) (с.) около 1690 см-1 (разб. Р-ры.) (с.) Вторичные амиды 1680 – 1630 см-1 (тв.) (с.) 1700 – 1670 см-1 (разб. Р-ры.) (с.) Третичные амиды 1670 – 1630 см-1 (тв. и разб. р-ры.) (с.) Циклические амиды около 1700 см-1 (моноциклические -лактамы) (с.) около 1760 – 1730 см-1 (моноциклические -лактамы в р-ре) (с.) Деформационные колебания NН2 (амидная полоса II) Только первичные 1650 – 1620 см-1 (тв.) (с.) амиды 1620 – 1590 см-1 (р-р.) (с.) Деформационные колебания NН (амидная полоса II) Только вторичные 1570 – 1515 см-1 (тв.) (с.) нециклические амиды 1550 – 1510 см-1 (р-р.) (с.) Полоса С–N 1420 – 1400 см-1 (оч. низкая интенсивность) (только первичные) АМИНЫ Полосы поглощения валентных колебаний NH Первичные амины. Две 3500 – 3300 см-1 полосы Вторичные амины. Одна 3500 – 3300 см-1 полоса Частоты деформационных колебаний NH Первичные амины 1650 – 1590 см-1 Вторичные амины 1650 – 1550 см-1 Колебания С–N Ароматические амины: первичные 1340 – 1250 см-1 вторичные 1350 – 1280 см-1 третичные 1360 – 1310 см-1 Алифатические 1220 – 1020 см-1 (ср. –сл.) вблизи 1410 см-1(сл.) амины АМИНОКИСЛОТЫ + NH3 3130 – 3030 см-1 (ср.) () 1660 – 1610 см-1 (сл.) у г/хл. около 1590 см-1 () (полоса I) 1550 – 1485 см-1 (ср.) () (полоса II) Первичные амиды 49 3390 – 3260 см-1 (ср.) (амидоксилоты) 1600 – 1560 см-1 (с.) (все типы аминокислот и солей, кроме г/хл.) 1754 – 1720 см-1 (с.) (-аминокислоты) 1724 – 1695 см-1 (с.) (-амидокислоты) 1730 – 1700 см-1 (с.) (,-аминокислоты) СО (амидная полоса I) 1620 – 1600 см-1 (с.) (-амидокислоты) 1650 – 1620 см-1 (с.) др. амидокислоты) СО (амидная полоса I I) 1570 – 1500 см-1 (с.) АРОМАТИЧЕСКИЕ ГЕТЕРОЦИКЛЫ Пиридины и хинолины СН, С=С, С=N около 3020 см-1 (с.) () 1660 – 1590 см-1 (ср.) () около 1500 см-1 (с.) () около 1200 см-1 (с.) () 1100 – 1000 см-1 (с.) () 900 – 650 см-1 (с.) () около 710 см-1 (с.) () Пиримидины СН 3060 – 3010 см-1 (с.) () С=С, С=N 1580 – 1520 см-1 (ср.) () Колебания кольца 1000 – 960 см-1 (ср.) 825 – 775 см-1 (ср.) и СН () НИТРО-, НИРОЗОСОЕДИНЕНИЯ, НИТРАТЫ, НИТРИТЫ R–NO2 800 – 500 см-1 –С– NO2 1560 – 1500 см-1 (для аром. соед.) () –О– NO2 1650 – 1600 см-1 () 1300 – 1250 см-1 () –N– NO2 1630 – 1550 см-1 () 1300 – 1250 см-1 () R –О–N=О 1681 – 1610 см-1 () С– N=О, N– N=О 1410 – 1310 см-1 () NO31410 – 1340– см-1 ; 860 – 800 см-1 NH Карбоксил СООН (ионизированный) Карбоксил СООН (неионизированный) 50 Таблица 9 – Характеристика ИК-спектров, используемых при идентификации некоторых лекарственных веществ в фармакопейном анализе Лекарственное вещество Область ИК-излучения, см-1 Условия получения спектра Анальгин Анестезин Ацетилсалициловая кислота Бензилпенициллина натриевая соль Викасол Глютаминовая кислота Дибазол Димедрол Метилурацил Метронидазол Натрия салицилат Никотиновая кислота Новокаин Папаверина гидрохлорид Пирацетам Тиамина хлорид Фенилсалицилат Фенкарол Фуразолидон Хинозол Гидрокортизона ацетат 4000-400 -//-//- диск KBr -//-//- -//- -//- 2000-400 4000-400 -//-//4000-500 4000-1600 4000-400 -//4000-600 4000-400 -//4000-700 4000-400 3300-550 1900-700 4000-400 3700-400 -//-//- -//–/-//-//-//-//-//-//-//-//-//-//-//-//-//-//-//суспензия в вазелиновом масле -//-//- -//4200-1200 4000-400 4200-400 4000-400 -//-//-//-//-//- 4200-400 -//- Дексаметазон Дротаверина гидрохлорид Изониазид Кальция глюконат Кальция пангамат Кофеин Натрия цитрат для инъекций Парацетамол 51 Частота валентных колебаний определяется массой атомов и прочностью (энергией) связи. Чем больше масса, тем меньше частота, например: νС-С ~ 1000 см-1 νС-Н ~ 3000 см-1 Чем прочнее связь, тем выше частота колебаний: νС-С ~ 1000 см-1 νС=С ~ 1600 см-1 Существование таких частот обусловлено тем, что хотя зависимость между колебаниями разных частей молекулы существует всегда, взаимодействие связей в пределах функциональной группы характеризуется строгим постоянством и только в небольшой степени зависит от природы углеродного скелета, несущего эту функциональную группу. Поэтому оказывается возможным установить соответствие между различными функциональными группами и свойственными им групповыми частотами. Именно по этой причине ИК-спектроскопия используется главным образом для определения функциональных групп молекулы. Метод ИК- спектроскопии не является разделяющим методом, то есть при исследовании какого-либо вещества может оказаться, что исследовалась на самом деле смесь нескольких веществ, что конечно сильно исказит результаты расшифровки спектра. Говорить об однозначной идентификации вещества с помощью метода ИК-спектроскопии не вполне правильно, так как метод скорее позволяет выявить определённые функциональные группы, а не их количество в соединении и их способ связи друг с другом. Колебательная спектроскопия является: - молекулярно-специфичной, что позволяет получать информацию о функциональных группах в молекуле – их типе, взаимодействиях и ориентациях; - селективной по отношению к изомерам, благодаря области «отпечатков пальцев»; 52 - методом количественного и недеструктивного анализа, даже по отношению к неустойчивым соединениям; - методом, работающим в области концентраций от 0,1% до 100%, но также пригодным и для определения микроколичеств после соответствующего концентрирования. В основе получения ИК-спектра лежит облучение исследуемого образца ИК-светом с постепенно изменяющейся частотой с помощью прибора - ИК-спектрофотометра. Схема ИК-спектрофотометра (рисунок 10) сходна со схемой УФспектрофотометра, однако конструкция приборов более сложна. ИКизлучение является тепловым; его источником обычно служит керамический стержень (SiС- карборунд), раскаляемый проходящим электрическим током. С помощью системы зеркал световой поток разделяется на два одинаковых луча, один из которых пропускается через кювету с веществом, другой - через кювету сравнения. Прошедшие через кюветы излучение поступает в монохроматор, состоящий из вращающейся призмы, зеркала и щели, позволяющий выделять излучение со строго определенной частотой и плавно изменять эту частоту. Учитывая, что в ИКобласти большинство веществ непрозрачно, призмы изготовляются из монокристаллов солей. В приборах высокого класса применяют три призмы: из LiF (2000-3800 см-1), NaCl (700-2000 см-1) и KBr (400-700 см-1). Каждая из призм в другом интервале волновых чисел дает значительно меньшее разрежение. Самописец Рисунок 10 - Схема ИК-спектрофотометра Интенсивности двух световых потоков (основного и луча сравнения), прошедших через монохроматор, автоматически вычитаются одна из 53 другой. Электрический результирующего импульс, светового образующийся потока на детектор при попадании типа термопары, усиливается и регистрируется самопищущим потенциометром. Запись представляет собой ИК-спектр в виде зависимости поглощения или пропускания (в %) от частоты (в см-1) или длины волны (в мкм). Для правильной работы прибор должен находиться на прочной устойчивой поверхности, исключающей его колебания, что особенно важно в момент снятия спектров. Располагать прибор необходимо вдали от нагревательных приборов и источников воды (влаги). Последнее особенно важно, поскольку вода затрудняет получение ИК-спектров, так как поглощает ИК-излучение. ИК-спектроскопия включает следующие стадии: 1. Подготовка исследуемого образца; 2. Регистрация (снятие) спектра с помощью прибора; 3. Интерпретация (анализ спектра, отнесение полос поглощения к определенным ФГ, связям, фрагментам структур); 4. Решение аналитической задачи. 2.1.1 Подготовка проб Существуют различные способы подготовки исследуемого образца в ИК-спектрофотометрии: 1. Растворы веществ наиболее удобны для получения спектров, так как в этом случае отсутствуют межмолекулярные взаимодействия. В связи с тем, что в ИК-области поглощает любое вещество, в качестве растворителей используют соединения простейшей структуры, спектры которых состоят из минимального числа полос, и наиболее часто – CCl4 и CS2. Для растворов применяют цилиндрические кюветы толщиной 0,1-1 мм с окнами из солевых пластин. Необходимый для заполнения кюветы объем раствора 0,11,0 мл при концентрации 0,05-10%. 2. Тонкие пленки (< 0,01 мм) жидкого вещества, помещенные 54 между солевыми пластинами, удерживаемыми капиллярными силами. 3. Пасты, приготовляемые тщательным растиранием твердого образца с вазелиновым маслом и помещаемые в виде тонкого слоя между солевыми пластинами. Само вазелиновое масло поглощает в области 2900 и 1400 см-1 Методика получения пасты с вазелиновым маслом более проста и экспрессна. 4. Твердые вещества в виде тонкого порошка 0,5-1 г тщательно перемешанные с порошком бромида калия ≈100 мг и затем спрессованные в специальном устройстве под давлением в тонкую пластину. Важным условием получения ИК-спектров является отсутствие влаги в анализируемом образце. Испытуемое вещество или препарат тщательно измельчают в агатовой ступке. Обычную ступку нельзя использовать, поскольку в ней имеются поры, в которых содержится вода. Затем полученный порошок необходимо поместить в среду, хорошо пропускающую ИК-излучение. Если анализируется лекарственная субстанция, для анализа берут испытуемую навеску массой около 15 мг (0,015 г). При анализе таблеток содержание действующего вещества в пробе должно быть около 5 мг (0,005 г). Остальная часть - это вспомогательные вещества. При таком соотношении на спектре прослеживаются полосы лекарственного вещества, а полосы вспомогательных веществ либо отсутствуют, либо немногочисленны и имеют небольшую интенсивность. Небольшое количество полученной пасты помещают стеклянной палочкой между двумя стеклами из калия бромида, которые, в свою очередь, зажимают в специальном устройстве (кювете). Кювету помещают в измерительный отсек прибора и получают ИК-спектр. Для получения надежных результатов рекомендуется измерять фоновый спектр (спектр воздуха) непосредственно перед каждым измерением. Это, во-первых, связано с колебаниями влажности, во55 вторых, с изменением газового состава в измерительном отсеке (двухатомные молекулы N2, О2 не имеют ИК-спектров, однако СО2 поглощает ИК-изучение) и, в третьих, с постепенным «прогревом» прибора после его включения. 2.1.2 Интерпретация спектров Инфракрасный спектр испытуемого образца должен иметь полное совпадение полос поглощения с полосами поглощения прилагаемого спектра сравнения по положению и относительным интенсивностям. Однако необходимо в настоящее учитывать спектрофотометры имеют время при ряд факторов. достаточно интерпретации ИК-спектров Современные большую ИК- чувствительность и управляются серьезным программным обеспечением. Полученные спектры также анализируются с помощью этих компьютерных программ, а не рисуются относительно грубо с помощью самописца. Это позволяет видеть на рисунке полосы поглощения практически любой интенсивности — вплоть до 0,5 % по шкале пропускания (transmittance). Высокое разрешение современных приборов (в данном случае 1 см-1) дает возможность разделить находящиеся стороны, рядом полосы. С другой воспроизводимость физических методов анализа хотя и улучшилась, но порядок значений остался прежним. Для качественных аналитических приборов воспроизводимость (относительное стандартное отклонение) составляет обычно 2–5 % с учетом погрешностей пробоподготовки. Поэтому в случае ИК-спектроскопии (особенно при получении спектров таблеток, где имеется побочное действие вспомогательных веществ) добиться полного (100%) совпадения полос даже для подлинного (нефальсифицированного) препарата не всегда удается. Некоторые очень слабые полосы могут исчезать, а иногда появляться в виде артефактных полос поглощения очень небольшой интенсивности. При разрешении 1 см-1 воспроизводимость значений волновых чисел составляет обычно 56 ±4—8 см-1 в области 4000 — 2000 см-1 и ±1—3 см- 1 в области 2000—400 см-1. Последнее может приводить к слиянию (неразрешению) полос поглощения, находящихся друг от друга на расстоянии нескольких см-1. Поэтому при интерпретации спектров важно чтобы все полосы большой, средней и малой интенсивности имели полное совпадение с соответствующими полосами стандартного спектра. Исчезновение или появление полос очень малой интенсивности (1 2 % по шкале пропускания), а также слияние полос, находящихся друг от друга на расстоянии менее 6—8 см-1, не свидетельствует о факте подделки. При расшифровке спектров необходимо учитывать следующие моменты: а) отсутствие характеристической полосы поглощения является более надежным доказательством отсутствия структурной группы, чем доказательство ее наличия на основании появления полосы поглощения; б) не все полосы можно интерпретировать; в) выводы, получаемые из спектров, часто остаются более или менее обоснованными предположениями; точным доказательством спектры становятся тогда, когда имеются надежные данные для сравнения и спектр идентифицируемого вещества во всех деталях совпадают со спектром проанализированного соединения. Для структурного анализа часто рекомендуют следующую схему: - определение класса соединения (для алифатических соединений частота валентных колебаний группы ≡СН < 3000 см-1, для ненасыщенных и ароматических соединений частота валентных колебаний группы >СН > 3000 см-1); - обнаружение функциональных групп (-ОН, -NH2, >NH, -СN, >С=O) целесообразно начинать с области высоких частот; - установление типа заместителей в ароматических соединениях, положения и характера двойных связей, влияния стерических факторов. 57 Полученная таким образом информация в большинстве случаев достаточна для выбора некоторых возможных вариантов. В случае исследования новых химических соединений проводят анализ спектра (интерпретацию, расшифровку, объяснение нахождения в спектре определенных полос). Имеющиеся полосы поглощения относят к определенным функциональным группам, связям, фрагментам структур, используя руководствах таблицы по характеристических частот, имеющиеся в ИК-спектрофотометрии. На основании подобного анализа спектра делают выводы (заключение) о строении исследуемого вещества. Полученная таким образом информация в большинстве случаев достаточна для выбора некоторых возможных вариантов. При определении подлинности ИК-спектр лекарственного вещества 0 0 является такой же константой как t пл , tкип , [α] и др. В этом случае анализа спектра не требуется. Как же поступают на этой стадии контроля качества? а) рекомендуется получить ("снять") спектр анализируемого вещества и стандартного образца этого же соединения в одинаковых условиях (агрегатное состояние, растворитель, толщина слоя и др.) - при этом картина спектров должна совпадать (число полос, их частота, форма контура). Способ рекомендован для гормонов стероидной структуры, антибиотиков: ампициллин-стандарт, метациклин-стандарт; тестостерона пропионат-стандарт. б) если стандартный образец отсутствует, то рекомендуется сравнивать полученный спектр анализируемого вещества со спектром приведенным в фармакопейной статье: в этом случае в статье также приведены условия получения спектра анализируемого вещества (например, для рибоксина, фепромарона, рифампицина, эстрадиоладипропионата. в) в некоторых случаях рекомендуется измерять не весь спектр, а наиболее характерные его фрагменты. Например, для фуразолидона58 стандарта ФС рекомендует измерить спектр в области 1900-700 см-1 (область "отпечатков пальцев"). Условия получения ИК-спектров лекарственных веществ согласно действующей НД приведены в таблице 9. 2.1.3 Качественный и количественный анализ по ИК-спектрам. Характеристичность частот в колебательном спектре молекул ИК- спектры весьма индивидуальны для каждого химического соединения и могут быть использованы для качественного анализа с целью идентификации чистых веществ и обнаружения отдельных атомных группировок. Другая задача, решаемая с помощью ИК- спектроскопии - это количественный анализ вещества, который, как и качественный, может проводиться для газообразных, жидких и твердых веществ. Для решения задач количественного анализа следует знать эмпирические зависимости интенсивности полос в спектрах от концентрации веществ. В случае ИКспектров, также как и в случае ультрафиолетовых и видимых спектров поглощения, соотношение между пропусканием света системой и концентрацией поглощающих веществ выражается законом ЛамбертаБугера-Бера: D= lg I 0/I = K·c·l где: D — оптическая плотность; I 0 — интенсивность падающего света; I — интенсивность прошедшего света; с — молярная концентрация; l — толщина поглощающего слоя; K — молярный коэффициент поглощения для данного волнового числа и температуры. При качественном анализе колебательных спектров веществ важным моментом является использование характеристичности частот. Изучение природы колебательных спектров показало, что поглощение и испускание света в ИК области обусловлено колебаниями 59 с одинаковыми частотами (нормальные частоты) всех атомов молекулы; движение отдельных атомов отличается лишь направлением и амплитудой. Однако при экспериментальном исследовании колебательных спектров было установлено, что некоторые частоты можно привести в соответствие с колебаниями определенных атомов или групп атомов в молекуле. Такие частоты принято называть характеристическими. Так, оказалось, что спектры всех парафиновых углеводородов характеризуются наличием нескольких частот в области 2800—3000 см-1, которые относятся к валентным колебаниям C—Н-связи в группах СН, CH2, СН3; гомологический ряд моноолефинов — углеводородов, содержащих одну двойную связь между атомами углерода — характеризуется наличием частоты в области 1650 см– 1, связанной с валентными колебаниями связи С=С; ацетиленовые соединения, для которых характерна тройная связь между атомами углерода, имеют частоту в области 2100 см-1, относящуюся к валентным колебаниям связи C=C. Существование характеристических частот можно понять на основании следующих соображений. Колебания некоторой группы атомов или связей могут быть слабо связаны с колебаниями атомов остальной части молекулы. В этом случае частота колебаний данной группы или связи зависит только от строения этой группы и характера рассматриваемой связи и мало зависит от окружающих их атомов и связей. Вследствие этого ряд различных молекул, содержащих данную группу атомов или связей, в общем случае будет характеризоваться различными колебательными спектрами; однако в каждом из них будет присутствовать одна или несколько одинаковых или почти одинаковых частот, характеристичных для данной группы атомов или связей. Условия, при которых наблюдаемая частота колебаний будет характеристической, следующие: - Частоту можно считать характеристической, если ее значение намного отличается от значений всех других частот. Так, характеристическими по этому признаку являются колебания C=C, 60 С=O, N=N, N=O и др., лежащие в интервале 1600—1700 см-1; частоты тройных связей С≡С, N≡N в области 2100 см-1; C—Cl соответствует частота ≈700 см-1, C—Br — ≈600 см-1. Наличие всех этих частот в исследуемом спектре является достаточно надежным свидетельством существования в молекуле соответствующих им связей. - Характеристическими изменением можно расстояния считать между частоты, двумя связанные атомами, различающимися по своим массам, например С—Н, O—Н с сильно (≈3650 см-1), N—H (3300— 3400 см-1), Si—H (2100—2300 см-1), P—H (2350—2440 см-1), S—H(2500—2600 см-1) и др. Установление характеристичности частот позволяет, не производя никаких расчетов, определять по спектру присутствие в молекуле различных групп и связей и тем самым устанавливать строение молекулы. 2.2 Применение ИК-спектроскопии в анализе лекарственных средств ИК-спектроскопия используется: - при установлении структуры новых БАВ получаемых путем химического синтеза или выделяемых из природных объектов (животное или растительное сырье, продукты жизнедеятельности микроорганизмов); изучении строения метаболитов; - при испытании на подлинность лекарственных веществ; определении доброкачественности лекарственных соединений; - количественном анализе; - контроле технологического процесса в промышленном производстве фармпрепаратов (полнота протекания). ИК-спектроскопия в фармацевтическом анализе наиболее широко применяется с целью определения подлинности. Это объясняется большой специфичностью колебательного спектра. Идентификация лекарственного вещества может быть проведена путем сопоставления ИК-спектра исследуемого вещества с аналогичным спектром 61 его стандартного образца или с рисунком стандартного спектра, приведенного в фармакопейной статье. На практике при интерпретации спектров определяют положение полос поглощения и их интенсивность (сильная, средняя, слабая). Сопоставление ИК-спектров рекомендуется начинать с анализа характеристических полос, которые обычно хорошо проявляются на спектрах, и лишь при их совпадении сопоставляют низкочастотную область. Совпадение спектральной кривой исследуемого вещества с рисунком стандартного спектра свидетельствует об идентичности двух веществ. Отсутствие в спектре исследуемого вещества полос, наблюдаемых в спектре стандартного образца, однозначно указывает на то, что эти вещества различны. Присутствие в спектре исследуемого вещества большего числа полос, по сравнению со спектром стандарта, может быть объяснено как загрязнением исследуемого вещества, так и различием обоих веществ. Таким образом, ИК-спектр испытуемого образца должен иметь полное совпадение полос поглощения с полосами поглощения стандартного спектра по положению и относительной интенсивности. В фармацевтическом анализе для целей количественного определения метод ИК-спектроскопии не нашел широкого применения из-за трудностей, не позволяющих добиться сопоставимой точности. К ним относятся необходимость измерения в очень узкой кювете, длину которой трудно воспроизвести; высокая вероятность перекрывания полос поглощения; небольшая ширина полосы поглощения в максимуме, что приводит к отклонениям от основного закона светопоглощения. 2.3 Приборы для регистрации ИК-спектров Для регистрации ИК-спектров используют ИК-спектрофотометры, которые по принципу устройства можно разделить на диспергирующие и недиспергирующие. Спектры веществ, полученные на недиспергирующих спектрофотометрах, не отличаются от спектров, полученных на диспергирующих ИК-спектрофотометрах, и характеризуют только данное 62 вещество. К диспергирующим приборам относятся сканирующие спектрометры, построенные на базе монохроматора. Схема (рисунок 11) ИК-спектрофотометра во многом сходна со схемой спектрофотометра видимой и ультрафиолетовой области. Здесь также с помощью системы зеркал (М1 и М2) световой поток разделяется на два одинаковых луча, один из них пропускается через кювету с исследуемым веществом, другой – через кювету сравнению. Прошедшее через кюветы излучение поступает в монохроматор, состоящий из вращающейся призмы, зеркала и щели и позволяющий выделять излучение со строго определенной частотой, а также плавно менять частоту. Оба луча встречаются в зеркальном секторе М3. При вращении зеркала в монохроматор попеременно попадают либо отраженный опорный луч, либо прошедший через прорезь луч от образца. Возникающий за счет разности энергий на детектор, электрический лучей, попадающих импульс усиливается и регистрируется самопишущим потенциометром. ИК-спектр представляет собой зависимость поглощения или пропускания (%) от частоты (см–1). Рисунок 11 - Оптическая схема двулучевого ИК-спектрофотометра Кюветы и окна для защиты детектора, как и призма монохроматора, выполняются из отполированных кристаллов минеральных 63 солей, пропускающих инфракрасный свет. В современных приборах призма заменяется дифракционной решеткой, позволяющей значительно увеличить разрешающую способность спектрофотометров. К недиспергирующим спектрофотометры, в приборам которых вместо относят ИК-Фурье монохроматора применяются интерферометры. Принципиальная блок-схема Фурье-спектрофотометра, построенного на базе интерферометра Майкельсона (изобретен А. Майкельсоном в 1880 г.), приведена на рисунке 1 2 . Интерферометр содержит два взаимно перпендикулярных зеркала – неподвижное (1) и подвижное (2) и полупрозрачную светоделительную пластину (3), расположенную в месте пересечения падающих пучков излучения и пучков, отраженных от обоих зеркал. Интерферометр производит единственный тип сигнала, в котором «закодированы» все ИК частоты. Сигнал можно измерить очень быстро, за время порядка 1 с. Поток инфракрасного излучения от источника 4, попадая на пластину 3, разделяется на два пучка. Один из них направляется на неподвижное зеркало 1, второй – на подвижное зеркало 2, которое может перемещаться с постоянной скоростью в направлении, перпендикулярном его фронтальной плоскости. Оба пучка, отразившись от зеркал, выходят через светоделитель из интерферометра в одном и том же направлении. Далее излучение фокусируется на образце 5 и поступает на детектор излучения 6. Два пучка отличаются друг от друга оптической разностью хода, величина которой меняется в зависимости от положения подвижного зеркала. В результате интерференции пучков интенсивность результирующего потока периодически меняется (модулируется). Частота модуляции зависит от частоты падающего излучения v и смещения подвижного зеркала х. В результирующей интерферограмме выделяется так называемая точка нулевой разности хода, или точка белого света. В этой точке для всех частот наблюдается максимум; от нее ведут отсчет 64 смещения подвижного зеркала. Для градуировки перемещений последнего часто используют интерферограмму монохроматического излучения от лазера (обычно на основе Не - Ne), введенного в Фурье-спектрофотометр. Регистрируемая детектором интерферограмма, возникающая при перемещении зеркала, содержит информацию об изменении каждой частоты в спектре источника, которое вызвано поглощением образца. Компьютер по заданной программе обрабатывает интерферограмму и преобразует ее в обычный ИК-спектр (Фурье-преобразование). Рисунок 12 - Оптическая схема Фурье-спектрофотометра: 1 – неподвижное зеркало интерферометра; 2 – подвижное зеркало; 3 – светоделительная пластина; 4 – источник излучения; 5 – исследуемый образец; 6 – детектор излучения К достоинствам Фурье-спектрофотометров следует отнести прежде всего быстродействие – любая точка интерферограммы содержит информацию о всей исследуемой спектральной области. На детектор в каждый момент поступают сигналы, соответствующие всем частотам. За одно сканирование (за время t1) регистрируется спектр с таким же отношением сигнал/шум, как и для дисперсионного спектрофотометра (но за время t2 на несколько порядков большее, чем t1), т.е. интерферограмма записывается в запоминающее устройство вычислительной машины в течение времени сканирования (≈1 с), в то время как для записи спектра сканирующими ИК-спектрофотометрами требуется несколько минут. Это преимущество Фурье-спектрофотометра называется выигрышем Фелжетта. Другое важное преимущество Фурье-спектрофотометра 65 – выигрыш Жакино, или геометрический фактор, определяется отсутствием в нем щелей (задерживающих в дисперсионных спектрофотометрах до 99,9% излучения), что дает значительный выигрыш в светосиле (~ в 100–200 раз). Это позволяет уменьшить время регистрации спектров и отношение сигнал/шум, повысить разрешение и уменьшить габариты прибора. В Фурье-спектрофотометре используют параллельные пучки, нет необходимости в фокусировке света и не требуются щели, т.к. вся энергия источника проходит через прибор. По сравнению со сканирующими ИКспектрофотометрами ИК-Фурье спектрофотометры обладают большей разделяющей способностью, определяющейся длиной хода зеркала и емкостью памяти интерферометр вычислительной модулирует системы. каждую Вследствие частоту того, излучения что различным образом, отсутствует влияние рассеянного излучения, это обеспечивает высокую точность измерений даже высокой оптической плотности. Любое излучение, исходящее из образца, не детектируется, так что в спектре модулируется отсутствуют и не ложные сигналы. Использование ЭВМ автоматизировать многие интерферограммы с позволяет кроме операции, целью вычисления многократно улучшения отношения спектра суммировать сигнал/шум, осуществлять управление и контроль за работой самого прибора. Быстрое развитие и широкое применение ИК-Фурье спектроскопии обусловлены перечисленными выше преимуществами ИК-Фурье спектрометров по сравнению с дисперсионными приборами. Следует также отметить, что в настоящее время Фурье-спектрофотометры вытеснили сканирующие ИК-спектрофотометры при регистрации спектров в далекой инфракрасной области: 400–10 см-1. Источники излучения В качестве источников излучения 66 в ИК-области используют раскаленные твердые тела. Для таких источников распределение интенсивности излучения по длинам волн зависит от температуры и описывается законом излучения Планка. Это распределение неравномерно и имеет четко выраженный максимум. Для ИК-спектроскопии необходимо отсечь интенсивное коротковолновое излучение в видимой области и оставить более длинноволновое и относительно менее интенсивное – как правило, в области 4000–400 см-1 (иногда до 200 см-1). Наиболее распространенные источники ИК-излучения – штифты Нернста, изготовленные из оксидов иттрия и циркония, и глобары из карбида кремния. Их нагревают до высоких температур электрическим током. Для штифтов Нернста рабочие температуры составляют около 1900°С, для глобаров – порядка 1350°С. Менее интенсивные, но более продолжительные в эксплуатации источники изготавливают из тугоплавких сплавов (например, хрома и никеля). Их нагревают до температуры порядка 800°С. Для дальней ИК-области (от 200 до 10см-1 или, соответственно, от 50 до 1000 мкм) необходимо использовать специальные источники излучения. Чаще всего применяют ртутные разрядные лампы высокого давления. В ближней ИК-области (4000–12800 см-1, 2500–780 нм) можно использовать обыкновенные вольфрамовые лампы накаливания. Детекторы В качестве детекторов (приемников) инфракрасного используют термические Термопара (термоэлемент) детекторы – преобразует термопары энергию и излучения болометры. ИК-излучения в тепловую, а затем в электрическую. Возникающую в результате этого процесса разность потенциалов регистрируют обычным способом. Болометр работает по принципу термометра сопротивления. Рабочим материалом барометра является металл или сплав (платина, никель, а также полупроводниковые материалы), электрическое которых сильно изменяется с изменением температуры. 67 сопротивление Общей проблемой измерения интенсивности ИК-излучения является наличие значительного теплового шума окружающей среды при относительно небольшом полезном сигнале. Детекторы ИК-излучения следует как можно лучше изолировать от окружающей среды. Кроме того, используют модуляцию полезного сигнала с помощью прерывателя, чтобы выделить его из 68 теплового шума. ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ Занятие 1 1.ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Теоретические основы метода спектрофотометрии (основной закон светопоглощения, его графическое и математическое выражение, удельный и молярный показатели светопоглощения, их взаимосвязь и использование в анализе). 2. ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЗАНЯТИЯ: 2 часа. 3. ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: спектрофотометрического Изучить метода анализа. теоретические Изучить основы возможность использования удельного и молярного показателей светопоглощения в анализе лекарственных средств. 4. ПЛАН ЗАНЯТИЯ: 4.1. Объяснение преподавателя по теме и разбор заданий для самостоятельной работы. 4.2. Выполнение самостоятельной работы и оформление протокола. 4.3. Проверка выполнения заданий. 4.4. Текущий контроль Задание 1. Рассчитайте удельный показатель поглощения для гидрокортизона ацетата, если 0,2000 г вещества внесли в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворили и довели до метки спиртом этиловым. 10 мл полученного разведения внесли в мерную колбу вместимостью 100 мл, довели спиртом этиловым до метки. В такую же колбу внесли 5 мл второго разведения и довели до метки тем же растворителем. Оптическая плотность анализируемого раствора (242 нм) в кювете с толщиной рабочего слоя 1,0 см равна 0,400. Задание 2. Рассчитайте молярный показатель поглощения для бензокаина (анестезина), если 0,3000 г вещества внесли в мерную колбу вместимостью 500 мл, растворили и довели до метки спиртом этиловым. 10 мл полученного разведения внесли в мерную колбу вместимостью 100 мл, довели спиртом этиловым до метки. В такую же колбу внесли 5 мл второго разведения и довели до метки тем же растворителем. Оптическая плотность 69 анализируемого раствора (292 нм) в кювете с толщиной рабочего слоя 1,0 см равна 0,369.Установить растворимость в воде неизвестной фармацевтической субстанции. Задание 3. Рассчитайте молярный показатель поглощения для сульфаниламида (стрептоцида) (Mr 172,2), если его удельный показатель поглощения равен 915. Задание 4. Рассчитайте удельный показатель поглощения для хлорамфеникола (левомицетина) (Mr 323,10), если его молярный показатель поглощения равен 9693. Задание 5. Определение удельного показателя левомицетина. Методика анализа: точную массу препарата (около 0,1 г) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 5 мл этанола и встряхивают, затем добавляют 20-30 мл воды при нагревании и доводят до метки водой (раствор А). 1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл объем раствора доводят до метки водой очищенной, перемешивают (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряют при длине волны 278 нм, раствор сравнения – вода. По полученным данным рассчитывают значение удельного показателя поглощения, величина которого должна находиться в пределах от 290 до 305. Задания для текущего контроля: Тестовые задания 001.В основе спектрофотометрического метода лежит избирательное поглощение электромагнитного излучения анализируемым веществом 2) испускание электромагнитного излучения возбужденными атомами или молекулами 3) отражение электромагнитного излучения анализируемым веществом 002. Поглощение электромагнитного излучения веществом зависит от 1) 1) интенсивности светового потока 2) природы вещества 3) толщины поглощающего слоя 4) содержания вещества в анализируемом растворе 70 003. Спектр поглощения в УФ – области представляет собой 1) графическую зависимость оптической плотности (D) или молярного коэффициента поглощения ( ) от длины волны ( ) падающего света 2) графическую зависимость пропускания (Т) от частоты ( ), выраженной в обратных сантиметрах 004. Спектр поглощения в ИК – области представляет собой 1) графическую зависимость оптической плотности (D) или молярного коэффициента поглощения ( ) от длины волны ( ) падающего света 2) графическую зависимость пропускания (Т) от частоты ( ), выраженной в обратных сантиметрах Занятие 2 1.ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Спектр поглощения электронного строения вещества (понятие как отражение об «ауксохромах» и «хромофорах», характеристика основных типов электронных переходов, их энергоемкость, соотнесение к областям поглощения спектра). 2. ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЗАНЯТИЯ: 2 часа. 3.ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить общие закономерности способности веществ поглощать структурные избирательное электромагнитное элементы в поглощение молекуле света, излучение, уметь вещества, обусловливающие идентифицировать находить лекарственные вещества с помощью спектров электромагнитного поглощения. 4. ПЛАН ЗАНЯТИЯ: 4.1. Объяснение преподавателя по теме и разбор заданий для самостоятельной работы. 4.2. Выполнение самостоятельной работы и оформление протокола. 4.3. Проверка выполнения заданий. 4.4. Текущий контроль. 71 Задание 1. Укажите основные структурные фрагменты молекулы сульфацетамида, являющиеся хромофорами или ауксохромами. Задание 2. Укажите основные структурные фрагменты молекулы индометацина, являющиеся хромофорами или ауксохромами. Задание 3. Укажите, какому препарату соответствует УФ-спектр – 3. а) бензокаин 1) б) бензилпенициллина натриевая соль 72 2) в) прокаин 3) Задание 4. Укажите, какому препарату соответствует УФ-спектр – 3. а) ставудин 1) б) хинин 2) 73 в) теобромин 3) Задание 5. Определение максимума светопоглощения дибазола. Для испытания используют 0,001% раствор препарата в 0,01 моль/л растворе кислоты хлористоводородной (растворитель является и раствором сравнения), который должен иметь максимумы светопоглощения при длинах волн 270±2 нм и 276 ±2 нм. Методика анализа: точную массу препарата (около 0,1 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 0,01 М растворе кислоты хлористоводородной, перемешивают и доводят объем раствора до метки тем же растворителем, перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А пипеткой переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, объем раствора доводят до метки 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной, перемешивают и измеряют оптическую плотность при длинах волн от 264 до 280 нм с интервалом 1 нм. По полученным данным строят кривую, отмечая положения максимумов. Задания для текущего контроля: Тестовые задания 005. Установите соответствие Область электромагнитного излучения Характер спектра 1) УФ-область а) колебательный 2) ИК-область б) электронный 74 006. Картина спектр в УФ-области зависит от 1) массы атомов и действующих между ними сил 2) числа атомов и числа образованных между ними связей 3) наличия в структуре системы сопряженных связей 007. Картина спектр в ИК-области зависит от 1) массы атомов и действующих между ними сил 2) числа атомов и числа образованных между ними связей 3) наличия в структуре системы сопряженных связей 008. Полосы поглощения в спектре в УФ-области характеризуются 1) расположением аналитических длин волн max , min 2) положением в аналитической области спектра всего набора полос поглощения 3) интенсивностью поглощения, выраженной через 1% удельный показатель поглощения ( Е1см ) 4) относительной интенсивностью, характеризуемой как малой, средней и высокой степени 009. Полосы поглощения в спектре в ИК-области характеризуются 1) расположением аналитических длин волн max , min 2) положением в аналитической области спектра всего набора полос поглощения 3) интенсивностью поглощения, выраженной через 1% удельный показатель поглощения ( Е1см ) 4) относительной интенсивностью, характеризуемой как малой, средней и высокой степени 010. Установите соответствие Область ИК-спектра Аналитическая информация 1) область 1300 - 400 см 1 2) область 4000 - 1300 см 1 а) характеристика ядерного скелета молекулы в целом область «отпечатка пальцев» б) характеристика входящих в состав молекулы функциональных групп «характеристическая область» 011. Более селективным и информативным для целей определения подлинности лекарственных средств является а) спектрофотометрия в УФ-области б) спектрофотометрия в ИК-области 75 012. Идентификация лекарственного вещества по ИК-спектрам может быть проведена 1) по совпадению полос поглощения и относительной интенсивности со спектром стандартного образца 2) по совпадению полос поглощения и относительной интенсивности с рисунком спектра, приведенным в ФС 3) по положению и интенсивности аналитических длин волн, регламентированных в ФС 013. При испытании на подлинность лекарственных веществ УФспектрофотометрический метод рассматривается как 014. 1) основной 2) дополнительный Определение подлинности лекарственных веществ УФ- спектрофотометрическим методом может быть осуществлено 1 по спектральной кривой 2) по калибровочному графику 3) по величине удельного показателя поглощения при аналитической длине волны 015. Чувствительность определения выше, а погрешность измерения величины поглощения меньше 1) в УФ-области 2) в ИК-области 016. В количественном анализе лекарственных веществ используется 017. 1) спектрофотометрия в УФ-области 2) спектрофотометрия в ИК-области Подготовка образца для количественного УФ- спектрофотометрического определения предполагает взятие макронавески лекарственного вещества с последующим ее растворением и разбавлением соответствующим растворителем с использованием мерных колб 2) растирание лекарственного вещества с вазелиновым маслом или другой жидкостью и помещение полученной суспензии между двумя пластинками из калия бромида 3) растирание лекарственного вещества с калия бромидом и последующее прессование 1) 76 018. Выбор концентрации раствора анализируемого вещества в УФспектрофотометрических определениях осуществляют 1) по спектральной кривой 2) по калибровочному графику 3) исходя из концентрации стандартного раствора 019. В методике количественного определения лекарственных веществ УФспектрофотометрическим методом должны быть регламентированы 1) величина макронавески 2) мерная посуда для разведения навески 3) концентрация раствора анализируемого вещества 4)концентрация стандартного раствора или способ его приготовления 5) аналитическая длина волны 6) раствор сравнения Занятие 3 1.ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Непосредственная спектрофотометрия. 2. ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЗАНЯТИЯ: 2 часа. 3.ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить способы анализа лекарственных средств методом непосредственной спектрофотометрии. 4. ПЛАН ЗАНЯТИЯ: 4.1. Объяснение преподавателя по теме и разбор заданий для лабораторной работы. 4.2. Выполнение лабораторной работы и оформление протокола. 4.3. Проверка выполнения заданий. 4.4. Текущий контроль Задание 1. Провести идентификацию субстанции папаверина гидрохлорида методом непосредственной УФ-спектрофотометрии: 1. Измерить УФ-спектр 0,0005% раствора субстанции в 0,01 М растворе кислоты хлороводородной в области от 230 нм до 270 нм. УФспектр 0,0005% раствора субстанции в 0,01 77 М растворе кислоты хлороводородной в области от 230 нм до 270 нм должен иметь максимум поглощения при 251 ± 2нм . 2. Измерить УФ-спектр 0,0025% раствора субстанции в 0,01 М растворе кислоты хлороводородной в области от 270 нм до 350 нм. УФ- спектр 0,0025% раствора субстанции в 0,01 М растворе хлороводородной в кислоты области от 270 нм до 350 нм должен иметь максимумы поглощения при 285 ± 2 нм и 309 ± 2 нм. 3. Сделать заключение о соответствии субстанции папаверина гидрохлорида по показателю «Подлинность» требованиям ФС. Задание 2. Выполнить количественное определение субстанции папаверина гидрохлорида методом непосредственной спектрофотометрии: 1. Методика анализа: Около 0,1 г субстанции папаверина гидрохлорида (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 25 мл 0,1 М раствора кислоты хлороводородной, встряхивают, после растворения доводят объем раствора тем же растворителем до метки (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят объем раствора 0,1 М раствором кислоты хлороводородной до метки (раствор В). Измеряют оптическую раствора В на спектрофотометре при длине волны 309 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора рабочего стандартного образца (РСО) папаверина гидрохлорида. В качестве раствора сравнения используют 0,1 М раствор кислоты хлороводородной. Примечание. Приготовление раствора РСО папаверина гидрохлорида. Около 0,05 г (точная навеска) папаверина гидрохлорида растворяют в 0,1 М растворе кислоты хлороводородной в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора тем же растворителем до 78 метки. 2 мл раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят до метки объем раствора той же кислотой до метки. Расчет содержания папаверина гидрохлорида в процентах ведут по формуле: Aх 100 100 a0 2 100 Aх a0 100 100 100 a x A0 1100 50 a x A0 25 100 В , где X Ах – оптическая плотность испытуемого раствора; ах – навеска субстанции, взятая на анализ, г; А0 – оптическая плотность раствора РСО папаверина гидрохлорида; а0 – навеска РСО папаверина гидрохлорида, г; В – потеря в массе при высушивании, %. Содержание папаверина гидрохлорида должно быть не менее 99,0% в пересчете на сухое вещество. 2. Сделать заключение о соответствии субстанции папаверина гидрохлорида по показателю «Количественное определение» требованиям ФС. Задания для текущего контроля: Тестовые задания 020. В более длинноволновой части спектра расположены полосы поглощения COOH NH 2 N N OH OCH3 N O S NH OCH3 N N O O OCH 3 S NH N O OCH 3 1) сульфадиметоксин 2) салазопиридазин 79 021. Отличить лекарственные вещества CH3 CH3 CH3 CH3 NH NH . HCl N . HCl N O O CH3 CH3 CH3 CH3 Лидокаина гидрохлорид CH3 Тримекаина гидрохлорид возможно с применением метода 1) спектрофотометрия в УФ-области 2) спектрофотометрия в ИК-области 022. Для двух производных 5-нитрофурана полосы поглощения в УФ– области спектра O O N O2N O O2N N H N O NH2 N NH O Фурацилин Фурагин а) позволяют отличить лекарственные вещества б) не позволяют отличить лекарственные вещества 023. Использование УФ-спектрофотометрического метода в анализе глюкозы обосновано с целью H C O H C OH HO C H H C OH H C OH HOH 2C CH2OH Глюкоза O C H гидроксиметилфурфурол 1) определение подлинности глюкозы 2) определения примеси гидроксиметилфурфурола 3) количественного определения глюкозы 80 O 024. Для двух лекарственных веществ из класса антибиотиков более специфичной является NH 2 NH S CH3 O N CH3 O Ампициллин COOH NH 2 HO NH S CH3 O N O Амоксициллин CH3 COOH а) область «отпечатка пальцев» в ИК-спектре б) характеристические полосы поглощения ИК-спектра Задания для зачетного занятия (рубежный контроль) Ситуационные задачи 1. УФ–спектр 0,002 % раствора дибазола в спирте 95% в области от 225 нм до 300 нм имеет максимумы при длинах волн 244 ± 2 нм; 275 ± 1 нм; 281 ± 1 нм и минимумы при длинах волн 230 ± 2 нм; 253 ± 2 нм; 279 ± 1 нм. Как приготовить спиртовой раствор дибазола и получить его спектр? 1. Удельный показатель поглощения фурацилина в спиртовом растворе при λ = 365 нм составляет 850 – 875. Для определения удельного показателя аналитик приготовил 0,0005% раствор фурацилина. Оцените, правильно ли аналитик рассчитал концентрацию раствора. 2. Кислота аскорбиновая в 0,001 М растворе кислоты хлористоводородной при длине волны 243 нм имеет удельный показатель % поглощения E11см = 542,5. Для определения показателя аналитик приготовил 81 0,001 % раствор кислоты аскорбиновой по следующей методике: около 0,05 г (точная навеска) кислоты аскорбиновой поместил в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворил в 0,001 М растворе кислоты хлористоводородной, довел объем раствора до метки. 2 мл полученного раствора разбавил растворителем в мерной колбе вместимостью 100 мл, получил в итоге 0,001% раствор. Проверьте правильность расчета концентрации раствора и оцените методику приготовления раствора с позиции метрологии. 3. Аналитик приготовил 0,001% раствор папаверина гидрохлорида, используя в качестве хлористоводородной. растворителя Измерил на 0,1 приборе М раствор оптическую кислоты плотность приготовленного раствора при λ = 310 нм в кювете с толщиной слоя 1 см относительно растворителя. Оптическая плотность раствора составила D = 0,23. Затем по формуле рассчитал удельный показатель поглощения: % E11см D 0,23 230 C l 0,001 1 В соответствии с НД удельный показатель должен быть 211 – 220. На основании полученных данных аналитик сделал заключение о несоответствии лекарственного вещества требованиям НД по показателю % E11см . Оцените действия аналитика. 4. Подлинность субстанции димедрола устанавливают аналитическими химическими реакциями. С кислотой серной концентрированной получают оксониевую соль ярко–желтого цвета. Реакцией с раствором серебра нитрата в азотнокислой среде подтверждают наличие в структуре ионов хлора. Дополнительно подлинность лекарственного вещества подтверждают по температуре плавления. При подготовке нового проекта ФСП было принято решение о применении спектральных характеристик димедрола вместо аналитических реакций. В раздел «Испытание на подлинность» было внесено следующее изменение: УФ–спектр 0,05% раствора димедрола в спирте в области от 230 нм до 280 нм имеет максимумы при длинах волн 253 ± 2 нм; 82 258 ± 2 нм; 264 ± 2 нм и минимумы при длинах волн 244 ± 2 нм; 255 ± 2 нм и 263 ± 2 нм. Пояснения к ситуационным задачам 1. Для приготовления 0,002% спиртового раствора дибазола необходимо 0,2 г дибазола растворить в мерной колбе вместимостью 100 мл в спирте 95%, довести объем раствора до метки. Получится 0,2% раствор, который необходимо разбавить в 100 раз. Для этого 1 мл приготовленного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят спиртом до метки. Затем измеряют на спектрофотометре оптическую плотность 0,002% раствора дибазола в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно растворителя в области от 225 нм до 300 нм через 5 нм, а вблизи максимумов и минимумов через 1 нм. По полученным значениям строят спектральную кривую зависимости оптической плотности (D) от длины волны (λ). На спектральной кривой отмечают длины волн, соответствующие максимальному и минимальному поглощениям. Они должны соответствовать длинам волн, приведенным в НД. Задача значительно облегчается при работе на современных спектрофотометрах с автоматическим устройством для записи спектров. 2. Удельный показатель поглощения – это поглощение 1% раствора при толщине слоя 1 см. Данный показатель рассчитывают по формуле: % E11см D C l (1) % E11см фурацилина составляет 850 – 875. Это означает, что его 1% раствор имеет оптическую плотность D = 850 – 875. Такую плотность раствора практически невозможно измерить на спектрофотометре, так как его шкала градуирована от 0 до 2. Причем, наименьшая погрешность градуировки находится в области 0,3 – 0,8. А оптимальная для измерения оптическая плотность составляет D = 0,43. Поэтому готовят испытуемый 83 раствор такой концентрации, чтобы его оптическая плотность была близка к величине 0,43. Исходя из формулы (1) можно рассчитать требуемую концентрацию раствора: C D 1% 1см E l 0,43 0,0005 % 850 1 Таким образом, расчеты аналитика верны. 3. Концентрацию раствора кислоты аскорбиновой для определения % удельного показателя поглощения E11см рассчитывают по формуле: C D 1% 1см E l 0,43 0,0008 % 542,5 1 Аналитик приготовил 0,001% раствор вместо 0,0008%. Это вполне допустимо, так как приготовленный раствор будет иметь оптическую плотность: % D E11см c l 542,5 0,001 1 0,54 Такая плотность входит в рекомендуемый для измерения интервал оптических плотностей 0,3 – 0,8. Следовательно, аналитик правильно выбрал концентрацию испытуемого раствора. Однако с позиции метрологии приготовил раствор недостаточно точно, взяв навеску вещества, равную 0,05 г. Для обеспечения точности взвешивания лучше брать навеску вещества как можно больше, в крайнем случае, равную 0,1 г. Из нее следует приготовить вначале 0,1% раствор, используя мерную колбу на 100 мл, а затем разбавить его в 100 раз для получения раствора с требуемой концентрацией 0,001%. Для этого можно взять 2 мл 0,1% раствора и мерную колбу вместимостью 200 мл. 4. Аналитик сделал необоснованное заключение. Он приготовил раствор низкой концентрации (0,001%). При измерении оптической плотности (D) такого раствора была допущена значительная ошибка, так как D = 0,23 не соответствует оптимальному значению D = 0,43. Неточность 84 измерения оптической плотности отразилась на расчетах удельного показателя поглощения. Аналитик должен правильно рассчитать концентрацию раствора по формуле: C D 1% 1см E l 0,43 0,002% , 211 1 приготовить новый раствор с концентрацией 0,002%, измерить его оптическую плотность, рассчитать заново удельный показатель поглощения и только затем сделать заключение. 5. Решение об установлении подлинности димедрола только на основании его УФ-спектра является необоснованным. УФ-спектр димедрола характеризует в структуре вещества только хромофорные группы. Таковыми для димедрола являются два ароматических кольца: O CH CH2 CH2 CH3 N . HCl CH3 Подобные хромофорные группы встречаются в ряде лекарственных веществ (эфедрина г/хл, атропина сульфат и т.д.). Поэтому УФ-спектры вещества не позволяют получить надежную информацию о его подлинности. Испытание на подлинность необходимо дополнить аналитическими химическими реакциями, подтверждающими другие структурные фрагменты димедрола, в частности простую эфирную связь и ион хлора. Таким образом, только сочетание химического и УФ- спектрофотометрического методов является рациональным при оценке подлинности димедрола. 85 Занятие 4 1.ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Дифференциальная спектрофотометрия. 2. ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЗАНЯТИЯ: 2 часа. 3.ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить способы анализа лекарственного растительного сырья методом дифференциальной спектрофотометрии. 4. ПЛАН ЗАНЯТИЯ: 4.1. Объяснение преподавателя по теме и разбор заданий для лабораторной работы. 4.2. Выполнение лабораторной работы и оформление протокола. 4.3. Проверка выполнения заданий. 4.4. Текущий контроль. Задание 1. Провести количественное определение суммы флавоноидов в лекарственном растительном сырье «Трава зверобоя» методом дифференциальной спектрофотометрии: 1. Методика анализа: Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл 50% спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Горячее извлечение фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 100мл так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Вату помещают в колбу для экстрагирования и прибавляют 30 мл 50% спирта. Экстракцию повторяют еще дважды в описанных выше условиях, фильтруя извлечение в ту же мерную колбу. После охлаждения объем извлечения доводят 50% спиртом до метки и перемешивают (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, добавляют 1 каплю разведенной уксусной кислоты, 1 мл раствора алюминия 86 хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки. Через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл извлечения, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 95% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора ГСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору. Приготовление раствора ГСО рутина: около 0,05 г (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-1350 С в течение 3-х часов, растворяют в 85 мл 95% этаноле в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане. После охлаждения объем раствора доводят до метки тем же растворителем. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах вычисляют по формуле: , где: А – оптическая плотность испытуемого раствора; А0 - оптическая плотность раствора ГСО рутина; а – масса сырья в граммах; а0 - масса ГСО рутина в граммах; В – потеря в массе при высушивании сырья в процентах. Задание 2. Провести количественное определение суммы флавоноидов в "Пертуссине" методом ΔЕ-спектрофотометрии Методика определения: точную массу препарата (около 5 г) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки водой, хорошо перемешивают. 5 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл 96 % этанола,2 мл 2% раствора алюминия хлорида. Через 10 минут добавляют 0,1 мл разведенной уксусной кислоты и доводят объем раствора до метки 96% этанолом, фильтруют. 87 Через 30 минут измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 395 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный по указанной выше методике, но без добавления 2% раствора алюминия. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора ГСО лютеолина. Для этого в мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл 0,03% раствора ГСО лютеолина, 10 мл 96 % этанола, 2 мл 2% раствора алюминия хлорида и далее поступают как указано в методике определения препарата. Приготовление раствора ГСО лютеолина: точную массу ГСО лютеолина (около 0,03 г) предварительно высушенного при температуре 100105о С в течение 2-х часов, растворяют в 95% этаноле в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на кипящей водяной бане. После охлаждения объем раствора доводят до метки тем же растворителем. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин (Х.%) вычисляют по формуле: , А - оптическая плотность испытуемого раствора; А0 - оптическая плотность раствора ГСО лютеолина; а - масса препарата,г; а0 - масса ГСО лютеолина,г Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в препарате должно быть не менее 0,07%. Задания для текущего контроля: Ситуационные задачи 1.Примесь адренолона в лекарственном веществе адреналина гидротартрат определяют спектрофотометрическим методом. В соответствии с НД оптическая плотность 0,2% раствора адреналина гидротартрата в 0,01 М растворе кислоты хлороводородной при λ = 310 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм не должна превышать 0,2. 88 Аналитик приготовил 0,2% раствор лекарственного вещества и измерил его оптическую плотность, соблюдая условия, указанные в НД. Оптическая плотность анализируемого вещества составила 0,26. При повторении анализа были получены аналогичные результаты. На основании полученных данных аналитик сделал заключение о несоответствии лекарственного вещества требованиям НД по содержанию примеси адренолона. Оцените действия аналитика. 2.В проект ФСП на таблетки кислоты ацетилсалициловой 0,5 г в раздел «Испытание на подлинность», наряду с аналитическими реакциями, были включены спектральные характеристики лекарственного вещества, полученные УФ-спектрофотометрическим методом. Этот же метод рекомендован для определения теста «Растворение» и количественного анализа. Оцените обоснованность выбора метода для определения ряда показателей качества таблеток кислоты ацетилсалициловой. Занятие 5 1.ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Производная спектрофотометрия. 2. ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЗАНЯТИЯ: 2 часа. 3.ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить способы анализа лекарственных средств методом производной спектрофотометрии. 4. ПЛАН ЗАНЯТИЯ: 4.1. Объяснение преподавателя по теме и разбор заданий для лабораторной работы. 4.2. Выполнение лабораторной работы и оформление протокола. 4.3. Проверка выполнения заданий. 4.4. Текущий контроль. Задание 1. Приготовить 0,001% растворы кофеина и бензоата натрия в 0,01 М растворе натрия гидроксида. Измерить спектры поглощения растворов препаратов в области 220-300 нм. 89 Задание 2. Рассчитать вторые производные и построить графики. Задание 3. По графику определить, что при длине волны 280 нм вторая производная для бензоата натрия равна нулю. Поэтому для количественного определения кофеина в присутствии бензоата натрия необходимо использовать значения длин волн 272, 276, 280, 284, 288 нм. Задание 4. Выполнить количественное определение кофеина в таблетках кофеина-бензоата натрия методом производной спектрофотометрии: Методика определения: Около 0,05 г (точная навеска) порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 30 - 40 мл воды, перемешивают в течение 10 - 15 мин, доводят водой до метки и дают отстояться 10 - 15 мин. Не взбалтывая, 2 мл раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят до метки 0,01 М раствором натрия гидроксида. Измеряют оптическую плотность раствора при длинах волн 272, 276, 280, 284, 288 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Параллельно измеряют значения оптической плотности стандартного раствора кофеина. Приготовление стандартного раствора: 0,05 г (точная навеска) предварительно высушенного при температуре 800С кофеина растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. 1 мл раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят до метки 0,01 М раствором натрия гидроксида. В 1 мл стандартного раствора содержится 0,00001 г кофеина. Содержание кофеина в граммах вычисляют по формуле: , где: и - значения второй производной для исследуемого и стандартного растворов: Р,, = 2А1 – А2 – 2А3 – А4 + 2А5; Р – средняя масса таблетки, г; а – навеска, г. 90 Задания для текущего контроля: Ситуационные задачи 1. Количественное определение раствора дибазола 1% для инъекций проводят в соответствии с НД спектрофотометрическим методом по следующей методике: 2 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора спиртом до метки и перемешивают. 5 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл спирта, 1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, доводят объем раствора спиртом до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при = 244 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют спирт. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца (РСО) дибазола. 1 мл раствора РСО содержит около 0,00002 г дибазола. Правильно ли выбран метод количественного определения? Проверьте расчеты навески препарата дибазола. 2. В соответствии с ФСП количественное определение таблеток пикамилона 20 мг проводят УФ-спектрофотометрическим методом по методике: около 0.08 г (точная навеска) порошка растертых таблеток количественно переносят с помощью воды в мерную колбу вместимостью 500 мл, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр (красная лента). Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 262 ± 2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно проводят измерение оптической плотности раствора стандартного образца пикамилона. В качестве раствора сравнения используют воду. Правильно ли выбран метод количественного определения? Оцените методику с позиции метрологии. 91 Занятие 6 1.ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Метод Фирордта. 2. ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЗАНЯТИЯ: 2 часа. 3.ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить способы анализа лекарственных средств методом Фирордта. 4. ПЛАН ЗАНЯТИЯ: 4.1. Объяснение преподавателя по теме и разбор заданий для лабораторной работы. 4.2. Выполнение лабораторной работы и оформление протокола. 4.3. Проверка выполнения заданий. 4.4. Текущий контроль Задание 1. Выполнить количественный анализ лекарственной формы спектрофотометрическим методом (метод Фирордта): Папаверина гидрохлорида 0,03 Дибазола 0,03 (таблетки «Папазол») 1.1. Измерить спектры поглощения растворов. Приготовить 100 мл 0,005%-го раствора папаверина гидрохлорида и 100 мл 0,002 %-го раствора дибазола в 0,01М растворе кислоты хлористоводородной. Для этого точную навеску папаверина гидрохлорида (0,05 г) и дибазола (0,1 г) помещают в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяют в 30-40 мл 0,01 М растворе кислоты хлористоводородной и доводят до метки тем же растворителем. Переносят 1 мл раствора папаверина гидрохлорида или 2 мл раствора дибазола в мерные колбы вместимостью 100 мл и доводят до метки тем же растворителем. Измеряют значения оптической плотности растворов относительно раствора сравнения (0,01 М раствор кислоты хлористоводородной) на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм в области от 220 до 290 нм. По полученным значениям рассчитывают удельный показатель поглощения каждого препарата по формуле: 92 E11%см А , где: C l А – оптическая плотность; С – концентрация раствора, %; l – толщина кюветы, см. По полученным данным строят графики зависимости показателя светопоглощения от длины волны. Спектры поглощения позволяют осуществить выбор длин волн для выполнения анализа лекарственной формы. Обычно при анализе смеси в качестве аналититческих выбирают такие длины волн, при которых наблюдается максимальное отношение величин поглощения растворов препаратов. В данном случае они соответствуют максимуму поглощения препаратов, т.е. 250 нм для папаверина гидрохлорида и 270 нм для дибазола. 1.2. Установить удельный показатель поглощения папаверина гидрохлорида и дибазола при 250 и 270 нм. 1.2.1. Папаверина гидрохлорид. Приготовить серию из 6 растворов папаверина гидрохлорида с содержанием в пределах 0,0001 - 0,0006%. В качестве растворителя использовать 0,01 М раствор кислоты хлористоводородной. Провести измерения оптической плотности при 250 и 270 нм. Рассчитать значение удельного показателя светопоглощения. 1.2.2. Дибазол. Приготовить серию из 6 растворов дибазола с содержанием в пределах 0,0005 - 0,002%. В качестве растворителя использовать 0,01 М раствор кислоты хлористоводородной. Провести измерения оптической плотности при 250 и 270 нм. Рассчитать значение удельного показателя светопоглощения. 1.3. Выполнить количественное спектрофотометрическое определение содержания папаверина гидрохлорида и дибазола в таблетках. Для этого около 0,05 г (точная навеска) порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 30-40 мл 0,01 93 М раствора кислоты хлористоводородной, взбалтывают в течение 3-5 мин и доводят до метки тем же растворителем. Фильтруют, отбрасывая первые 15 мл фильтрата. Помещают 4 мл фильтрата в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной и перемешивают. Измеряют оптические плотности при 250 и 270 нм. Содержание препаратов рассчитывают путем решения системы уравнений: Аλ1 = (Е1λ1·С1 + Е2λ1·С2)·l Аλ2 = (Е1λ2·С1 + Е2λ2·С2)·l где: С1 и С2 – содержание папаверина гидрохлорида и дибазола соответственно; Е1 и Е2 – удельные показатели поглощения компонентов при длинах волн λ1 и λ2; l – толщина кювета, см. Решив систему уравнений относительно С1и С2 получают: Содержание папаверина гидрохлорида (х1) и дибазола (х2) в таблетках рассчитывают по формулам: где: С1 и С2 – рассчитанное содержание папаверина гидрохлорида и дибазола соответственно, %; Р – средняя масса лекарственной формы, г; а – навеска лекарственной формы, взятая на анализ, г. 5. Домашнее задание по следующей теме: «Измерение оптической плотности. Идентификация биологически активных веществ по оптическому спектру». 94 Задания для текущего контроля: Ситуационные задачи 1.Количественное определение субстанции рибофлавина, согласно ФС, проводят спектрофотометрическим методом по методике: около 0,07 г рибофлавина (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, прибавляют 5 мл воды и перемешивают до полного увлажнения пробы. Прибавляют по каплям (не более 5 мл) 1 М раствор натрия гидроксида и перемешивают до полного растворения пробы. Сразу же приливают 100 мл воды и 2,5 мл кислоты уксусной ледяной, перемешивают и доводят объем раствора водой до метки. 20 мл этого раствора переносят в мерную колбу вместимостью 200 мл, прибавляют 3,5 мл 0,1 М раствора натрия ацетата и доводят объем раствора водой до метки. Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 444 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Содержание рибофлавина в процентах вычисляют по формуле: X D 5000 , где a 328 D – оптическая плотность испытуемого раствора; а – навеска рибофлавина в г; 328 – удельный показатель поглощения при 444 нм. Обоснуйте выбор метода и способа расчета содержания рибофлавина по удельному показателю поглощения. Проверьте правильность расчета навески. Занятие 7 1.ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Измерение оптической плотности. Идентификация биологически активных веществ по оптическому спектру. 2. ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЗАНЯТИЯ: 2 часа. 3.ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить способы идентификации лекарственных средств по оптическому спектру. 95 4. ПЛАН ЗАНЯТИЯ: 4.1. Объяснение преподавателя по теме и разбор заданий для лабораторной работы. 4.2. Выполнение лабораторной работы и оформление протокола. 4.3. Проверка выполнения заданий. Задание 1. Определение максимума светопоглощения натрия парааминосалицилата. Для испытаний используют 0,002% раствор препарата в воде очищенной (она же используется в качестве раствора сравнения), который должен иметь максимум светопоглощения при 265± 2 нм. Методика анализа: точную массу препарата (около 0,2 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют и объем раствора доводят до метки водой очищенной, перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А пипеткой переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, объем раствора доводят до метки, перемешивают. Оптические плотности полученного раствора измеряют в интервале от 259 до 270 нм. По полученным данным сроят кривую спектра поглощения. Задание 2. Провести идентификацию оксикобаламина по отношению оптических плотностей при различных длинах волн Методика анализа: готовят 0,005% раствор препарата в ацетатном буфере при рН 4,5 (этот буфер используется и как раствор сравнения) и измеряют оптическую плотность при длинах волн 274 и 351 нм. Отношение оптической плотности (А) при 274нм к оптической плотности при 351нм должно быть не менее 0,8. Задание 3. Провести идентификацию фурацилина в таблетках по оптическому спектру. Методика анализа: около 3,0 г (точная навеска) порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, встряхивают с 30 96 мл диметилформамида в течение 15 мин, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют, отбрасывая первые порции фильтрата. 5 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре в области от 245 до 400 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения, в качестве которого используют воду. Спектр раствора препарата в области от 245 до 400 нм должен иметь максимумы поглощения при 260±2 нм и 375±2 нм минимум поглощения при 306±2 нм. Задания для текущего контроля: Ситуационные задачи Дайте обоснование использованию УФ – спектрофотометрического метода в анализе количественного лекарственных анализа с полной средств, предложите расчетной методику аргументацией. При выполнении задания используйте алгоритм и пример решения задачи. 1. Раствор анаприлина 0,25 % в ампулах CCO 0,00002 г мл 2. Раствор кислоты никотиновой 1% в ампулах CCO 0,00001 г мл 3. Раствор пиридоксина гидрохлорида 1% в ампулах CCO 0,00001 г мл 4. Мазь гидрокортизоновая глазная 0,5 % - 3,0 CCO 0,00001 г мл 5. Мазь синафлана 0,025 % - 15,0 6. Суппозитории вагинальные с метронидазолом 250мг CCO 0,00001 г мл C CO 0,00001 г мл Алгоритм к составлению методики количественного анализа лекарственных средств УФ спектрофотометрическим методом 1. Обосновать выбор метода. 2. Рассчитать навеску анализируемого образца с учетом исходных данных о концентрации раствора стандартного образца. 97 3. Решить вопрос о предварительной обработке. 4. Составить методики приготовления раствора испытуемого препарата и раствора стандартного образца. 5. Составить методику спектрофотометрического анализа. 6. Составить расчетную формулу содержания действующего вещества. Пример ответа Раствор адреналина гидрохлорида 0,1% - 30 мл C Объектом анализа CO 0,00005 г является раствор мл для инъекций с низким содержанием лекарственного вещества. Последнее обстоятельство требует использования в количественном анализе наиболее чувствительного метода. К таким методам относится УФ–спектрофотометрия. Кроме того, данный метод не требует трудоемких и длительных аналитических операций. Применение в анализе лекарственного вещества спектрофотометрического метода возможно при наличии в его структуре системы сопряженных связей. OH H N HO CH3 HO Адреналин Адреналин ароматическому по химической ряду, к структуре группе относится катехоламинов. к жирно– Поглощение электромагнитного излучения в УФ–области обусловлено наличием в структуре ароматического кольца, содержащего два фенольных гидроксила в орто–положении. Это позволяет использовать в количественном анализе адреналина гидрохлорида УФ–спектрофотометрический метод. Расчет навески: отправным моментом для расчета навески лекарственной формы при ее спектрофотометрическом анализе является 98 концентрация раствора стандартного образца C CO ,г мл , относительно которого будет осуществляться определение. В условии задачи приведена концентрация раствора рабочего стандартного образца (РСО) C CO 0,00005 г мл . Анализируемый раствор необходимо приготовить примерно такой же концентрации. Для обеспечения точности анализа используют макронавеску и мерную посуду для ее разведения. Анализируемый раствор является 0,1%, следовательно, можно составить пропорцию: 0,1 г адреналина - 100 мл раствора 0,00005 г - х х = 0,05 мл Рассчитанную навеску можно увеличить в 100 раз. Это позволит использовать для ее измерения пипетку объемом 5 мл, а для последующего разведения мерную колбу вместимостью 100 мл. Тогда 0,1 г - 100 мл 0,005 г - 100 мл хг х г - 1 мл - 5 мл х = 0,005 г х = 0,00005 г/мл Выбор способа предварительной обработки: Спектрофотометрическое определение адреналина гидрохлорида осуществляется в 0,1 М растворе кислоты хлороводородной. Выбор растворителя обусловлен обеспечением стабильности лекарственного вещества в его растворе. Поскольку объектом анализа является водный раствор, дополнительных аналитических операций по извлечению вещества из его лекарственной формы не требуется. 99 Методика: 5 мл раствора адреналина гидрохлорида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора 0,1 М раствором кислоты хлороводородной до метки. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при аналитической длине волны в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора рабочего стандартного образца (РСО) адреналина гидрохлорида. В качестве раствора сравнения применяют 0,1 М раствор кислоты хлороводородной. Расчет результатов. Содержание адреналина гидрохлорида вычисляют по формуле: Х D Х ССО W 1 мл DСО a , где DХ ; DСО – значения оптических плотностей испытуемого раствора и раствора РСО адреналина гидрохлорида соответственно. Задания для зачетного занятия Тестовые задания 025. В основе спектрофотометрического метода лежит избирательное поглощение электромагнитного излучения анализируемым веществом 2) испускание электромагнитного излучения возбужденными атомами или молекулами 3) отражение электромагнитного излучения анализируемым веществом 026. Поглощение электромагнитного излучения веществом зависит от 1) 1) интенсивности светового потока 2) природы вещества 3) толщины поглощающего слоя 4) содержания вещества в анализируемом растворе 027. Установите соответствие Область Характер спектра электромагнитного излучения 100 1) УФ-область а) колебательный 2) ИК-область б) электронный 028. Спектр поглощения в УФ-области представляет собой 1) графическую зависимость оптической плотности (D) или молярного коэффициента поглощения ( ) от длины волны ( ) падающего света 2) графическую зависимость пропускания (Т) от частоты ( ), выраженной в обратных сантиметрах 029. Спектр поглощения в ИК-области представляет собой 1) графическую зависимость оптической плотности (D) или молярного коэффициента поглощения ( ) от длины волны ( ) падающего света 2) графическую зависимость пропускания (Т) от частоты ( ), выраженной в обратных сантиметрах 030. Картина спектра в УФ-области зависит от 1) массы атомов и действующих между ними сил 2) числа атомов и числа образованных между ними связей 3) наличия в структуре системы сопряженных связей 031. Картина спектра в ИК-области зависит от 1) массы атомов и действующих между ними сил 2) числа атомов и числа образованных между ними связей 3) наличия в структуре системы сопряженных связей 032. Полосы поглощения в спектре в УФ-области характеризуются 1) расположением аналитических длин волн max , min 2) положением в аналитической области спектра всего набора полос поглощения 3) интенсивностью поглощения, выраженной через 1% удельный показатель поглощения ( Е1см ) 4) относительной интенсивностью, характеризуемой как малой, средней и высокой степени 033. Полосы поглощения в спектре в ИК-области характеризуются 1) расположением аналитических длин волн max , min 2) положением в аналитической области спектра всего набора полос поглощения 101 3) интенсивностью поглощения, выраженной 1% удельный показатель поглощения ( Е1см ) через 4) относительной интенсивностью, характеризуемой как малой, средней и высокой степени 034. Установите соответствие Область ИК-спектра Аналитическая информация 1) область 1300 - 400 см 1 2) область 4000 - 1300 см 1 а) характеристика ядерного скелета молекулы в целом область «отпечатка пальцев» б) характеристика входящих в состав молекулы функциональных групп «характеристическая область» 035. Более селективным и информативным для целей определения подлинности лекарственных средств является 1) спектрофотометрия в УФ-области 2) спектрофотометрия в ИК-области 036. Идентификация лекарственного вещества по ИК-спектрам может быть проведена 1) по совпадению полос поглощения и относительной интенсивности со спектром стандартного образца 2) по совпадению полос поглощения и относительной интенсивности с рисунком спектра, приведенным в ФС 3) по положению и интенсивности аналитических длин волн, регламентированных в ФС 037. При испытании на подлинность лекарственных веществ УФспектрофотометрический метод рассматривается как 038. а) основной б) дополнительный Определение подлинности лекарственных веществ УФ- спектрофотометрическим методом может быть осуществлено 1) по спектральной кривой 2) по калибровочному графику 3) по величине удельного показателя поглощения при аналитической длине волны 102 039. Чувствительность определения выше, а погрешность измерения величины поглощения меньше 1) в УФ-области 2) в ИК-области 040. В количественном анализе лекарственных веществ используется 041. 1) спектрофотометрия в УФ-области 2) спектрофотометрия в ИК-области Подготовка образца для количественного УФ- спектрофотометрического определения предполагает взятие макронавески лекарственного вещества с последующим ее растворением и разбавлением соответствующим растворителем с использованием мерных колб 2) растирание лекарственного вещества с вазелиновым маслом или другой жидкостью и помещение полученной суспензии между двумя пластинками из калия бромида 3) растирание лекарственного вещества с калия бромидом и последующее прессование 042. Выбор концентрации раствора анализируемого вещества в УФ1) спектрофотометрических определениях осуществляют 1) по спектральной кривой 2) по калибровочному графику 3) исходя из концентрации стандартного раствора 043. В методике количественного определения лекарственных веществ УФспектрофотометрическим методом должны быть регламентированы 1) величина макронавески 2) мерная посуда для разведения навески 3) концентрация раствора анализируемого вещества 4)концентрация стандартного раствора или способ его приготовления 5) аналитическая длина волны 6) раствор сравнения 103 044. В более длинноволновой части спектра расположены полосы поглощения COOH NH 2 N N OH OCH3 OCH3 N O S NH N N O O S NH N O OCH 3 OCH 3 1) сульфадиметоксин 2) салазопиридазин 045. Отличить лекарственные вещества CH3 CH3 CH3 NH CH3 NH . HCl N . HCl N O O CH3 CH3 CH3 CH3 Лидокаина гидрохлорид CH3 Тримекаина гидрохлорид возможно с применением метода 1) спектрофотометрия в УФ-области 2) спектрофотометрия в ИК-области 046. Для двух производных 5- нитрофурана полосы поглощения в УФ-области спектра O O O2N N O O2N N H NH2 N O N NH O Фурацилин Фурагин 1) позволяют отличить лекарственные вещества 2) не позволяют отличить лекарственные вещества 104 047. Использование УФ-спектрофотометрического метода в анализе глюкозы обосновано с целью H C O H C OH HO C H H C OH H C OH HOH 2C CH2OH Глюкоза O C H O гидроксиметилфурфурол 1) определение подлинности глюкозы 2) определения примеси гидроксиметилфурфурола 3) количественного определения глюкозы 048. Для двух лекарственных веществ из класса антибиотиков более специфичной является NH 2 NH S O N CH3 O Ампициллин CH3 COOH NH 2 HO NH S O N O Амоксициллин CH3 CH3 COOH 1) область «отпечатка пальцев» в ИК-спектре 2) характеристические полосы поглощения ИК-спектра 105 Занятие 8 1.ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Количественное определение. Способы расчета концентраций. 2. ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЗАНЯТИЯ: 2 часа. 3.ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить способы расчета количественного содержания лекарственных средств методом спектрофотометрии. 4. ПЛАН ЗАНЯТИЯ: 4.1. Объяснение преподавателя по теме и разбор заданий для лабораторной работы. 4.2. Выполнение лабораторной работы и оформление протокола. 4.3. Проверка выполнения заданий. 4.4. Текущий контроль Задание 1. Выполнить количественное определение рибофлавина в лекарственном средстве фотоколориметрическим «Раствор методом, рибофлавина используя удельный 0,02%» показатель поглощения, градуировочный график, раствор РСО рибофлавина. 1.1. Выбор аналитической длины волны для проведения фотометрического анализа. К 2,5 мл 0,004% раствора РСО рибофлавина прибавляют 7,5 мл воды и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре в диапазоне 350 – 500 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Раствор сравнения – вода очищенная. Полученные данные заносят в таблицу 1. Таблица 1 - Зависимость оптической плотности от длины волны , нм 350 360 370 380 390 А , нм 400 410 420 430 440 А Результаты испытаний: , нм 441 442 443 444 445 А А , нм , нм 460 446 470 447 480 448 490 449 450 500 λmax = положительный или отрицательный А 106 1.2. Построение градуировочного графика. Расчет удельного показателя поглощения. Точные количества 0,004% раствора РСО рибофлавина (1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 мл) помещают в сухие пробирки и прибавляют в каждую с помощью пипетки воду очищенную, доводя объем до 10,0 мл. Измеряют оптическую плотность растворов в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм при длине волны λmax. Раствор сравнения – вода очищенная. Полученные данные заносят в таблицу. Таблица 2- Зависимость оптической плотности от концентрации рибофлавина № п/п Объем раствора РСО, мл Концентрация, Концентрация, Оптическая г/мл % плотность (С) (С%) (А) Удельный показатель поглощения 1% А1см 1 2 3 4 5 6 7 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 1% А1см средн= Удельный показатель поглощения рассчитывают по формуле: % А11см По данным рассчитывают таблицы уравнение 2 А С% l строят градуировочный градуировочного графика в график или координатах: оптическая плотность (А) – концентрация рибофлавина (С, г/мл*10-6) 1.3. Количественное определение рибофлавина: 1.3.1. Методика: К 0,5 мл лекарственного средства прибавляют с помощью градуировочной пипетки 9,5 мл воды и измеряют оптическую плотность полученного раствора (Ах) на спектрофотометре 107 при длине волны λmax = в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Раствор сравнения – вода очищенная. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора РСО (Аст), содержащего 2,5 мл 0,004% раствора РСО рибофлавина и 7,5 мл воды. 1.3.2. Расчет содержания рибофлавина в граммах (Х) в анализируемом лекарственном средстве: 1) по удельному показателю поглощения: Х Ах 10 10 % А11см 1 0,5 100 2) по градуировочному графику (или по уравнению градуировочного графика): Х С х 10 10 0,5 3) по стандартному раствору: Х Ах 0,0001 10 Аст 0,5 Задания для текущего контроля: Ситуационные задачи Дайте метода обоснование в анализе количественного использованию лекарственных анализа с полной УФ-спектрофотометрического средств, предложите расчетной методику аргументацией. При выполнении задания используйте алгоритм и пример решения задачи. 1. Суппозитории ректальные с диклофенаком натрия 50 и 100мг C CO 0,00002 г мл 2. Суппозитории с димедролом 0,02 г для детей 3. Таблетки кортизона ацетата 0,025 г Средняя масса 0,106 г 108 C CO 0,0005 г мл C CO 0,00001 г мл 4. Таблетки преднизолона 0,001 г Средняя масса 0,052 г C CO 0,00001 г мл 5. Таблетки этинилэстрадиола 0,00001 г Средняя масса 0,056 г C CO 0,00001 г мл Алгоритм к составлению методики количественного анализа лекарственных средств УФ-спектрофотометрическим методом 1. Обосновать выбор метода. 2. Рассчитать навеску анализируемого образца с учетом исходных данных о концентрации раствора стандартного образца. 3. Решить вопрос о предварительной обработке. 4. Составить методики приготовления раствора испытуемого препарата и раствора стандартного образца. 5. Составить методику спектрофотометрического анализа. 6. Составить расчетную формулу содержания действующего вещества. Пример ответа Раствор адреналина гидрохлорида 0,1% - 30 мл C CO Объектом анализа является 0,00005 г раствор мл для инъекций с низким содержанием лекарственного вещества. Последнее обстоятельство требует использования в количественном анализе наиболее чувствительного метода. К таким методам относится УФ–спектрофотометрия. Кроме того, данный метод не требует трудоемких и длительных аналитических операций. Применение в анализе лекарственного вещества спектрофотометрического метода возможно при наличии в его структуре системы сопряженных связей. 109 OH H N HO CH3 HO Адреналин Адреналин ароматическому по химической ряду, к структуре группе относится катехоламинов. к жирно– Поглощение электромагнитного излучения в УФ-области обусловлено наличием в структуре ароматического кольца, содержащего два фенольных гидроксила в орто–положении. Это позволяет использовать в количественном анализе адреналина гидрохлорида УФ-спектрофотометрический метод. Расчет навески: отправным моментом для расчета навески лекарственной формы при ее спектрофотометрическом анализе является концентрация раствора стандартного образца C CO ,г мл , относительно которого будет осуществляться определение. В условии задачи приведена стандартного образца (РСО) C CO концентрация раствора рабочего 0,00005 г мл . Анализируемый раствор необходимо приготовить примерно такой же концентрации. Для обеспечения точности анализа используют макронавеску и мерную посуду для ее разведения. Анализируемый раствор является 0,1%, следовательно, можно составить пропорцию: 0,1 г адреналина - 100 мл раствора 0,00005 г - х х = 0,05 мл Рассчитанную навеску можно увеличить в 100 раз. Это позволит использовать для ее измерения пипетку объемом 5 мл, а для последующего разведения мерную колбу вместимостью 100 мл. 110 Тогда 0,1 г - 100 мл 0,005 г - 100 мл хг х г - 1 мл - 5 мл х = 0,005 г х = 0,00005 г/мл Выбор способа предварительной обработки: Спектрофотометрическое определение адреналина гидрохлорида осуществляется в 0,1 М растворе кислоты хлороводородной. Выбор растворителя обусловлен обеспечением стабильности лекарственного вещества в его растворе. Поскольку объектом анализа является водный раствор, дополнительных аналитических операций по извлечению вещества из его лекарственной формы не требуется. Методика: 5 мл раствора адреналина гидрохлорида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной до метки. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при аналитической длине волны в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора рабочего стандартного образца (РСО) адреналина гидрохлорида. В качестве раствора сравнения применяют 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной. Расчет результатов. Содержание адреналина гидрохлорида вычисляют по формуле: Х D Х ССО W 1 мл , DСО a где DХ ; DСО – значения оптических плотностей испытуемого раствора и раствора РСО адреналина гидрохлорида соответственно. 111 Занятие 9 1.ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Спектрофотометрия в ИК-области. Идентификация с использованием стандартных образцов. Идентификация с использованием эталонных спектров. 2. ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЗАНЯТИЯ: 2 часа. 3.ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить способы идентификации лекарственных средств методом ИК-спектрофотометрии. 4. ПЛАН ЗАНЯТИЯ: 4.1. Объяснение преподавателя по теме и разбор заданий для лабораторной работы. 4.2. Выполнение лабораторной работы и оформление протокола. 4.3. Проверка выполнения заданий. 4.4. Текущий контроль Задание 1. Проведите определение подлинности тетрациклина, если, согласно требованию ФС, ИК-спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом в области от 4000 до 400 см-1, по положению полос поглощения должен соответствовать рисунку спектра тетрациклина. см-1 Рисунок – ИК-спектр тетрациклина Задание 2. На ИК-спектре стандартного образца (СО) преднизолона должны быть полосы поглощения в области 1654,1612,1708,887,1112, 1085 112 см-1. Установите подлинность испытуемого образца преднизолона, если зерегистрированный спектр должен полностью совпадать ИК-спектром СО преднизолона. Рисунок – ИК-спектр преднизолона Задание 3. Проведите определение подлинности кодеина, если согласно требованию ФС 42-0218-07, инфракрасный спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом в области от 4000 до 400 см -1, по положению полос поглощения должен соответствовать рисунку спектра СО аскорбиновой кислоты. Задание 4. Проведите определение подлинности аскорбиновой кислоты, если согласно требованию ФС 42-0218-07, инфракрасный спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом в области от 4000 до 400 см-1, по положению полос поглощения должен соответствовать рисунку спектра СО аскорбиновой кислоты. 113 Рисунок – ИК-спектр кислоты аскорбиновой Задание 5. Проведите определение подлинности бензойной кислоты, если согласно требованию ФС, инфракрасный спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом в области от 4000 до 400 см -1, по положению полос поглощения должен соответствовать рисунку кислоты. 114 спектра СО бензойной Задание 6. На рисунках 1, 2 и 3 приведены ИК-спектры продукта реакции, холестерина и кислоты стеариновой в вазелиновом масле. Полученные результаты показывают, что продукт реакции это новое вещество, отличающееся от исходных веществ. Как можно это доказать? Т,% см-1 Рисунок – ИК-спектр холестерилстеарата (1) в вазелиновом масле (2) Т,% 115 см-1 Рисунок – ИК-спектр холестерилстеарата (1) и кислоты стеариновой (2) в вазелиновом масле Т,% см-1 Рисунок – ИК-спектр холестерилстеарата (1) и холестерина (2) в вазелиновом масле 116 Задание 7. Укажите, какие характеристические полосы имеет ИКспектр СО тетрациклина, приведенный на рисунке (см. задание 4). см-1 Рисунок – ИК-спектр тетрациклина Задание 8. Укажите, какие характеристические полосы имеет ИКспектр СО аскорбиновой кислоты, приведенный на рисунке (см. выше). Задание 9. Укажите, какие характеристические полосы имеет ИКспектр СО кодеина, приведенный на рисунке. Рисунок – ИК-спектр кодеина Задание 9. Проведите определение подлинности и сделайте заключение о качестве субстанции лидокаина гидрохлорида если согласно ФС 420-0251-07, ИК-спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом в области от 4000 до 400 см-1, должен соответствовать по положению полос поглощения спектру СО лидокаина гидрохлорида. 117 Задание 10. Проведите определение подлинности и сделайте заключение о качестве субстанции глутаминовой кислоты, если согласно ФС 42-0229-07, ИК-спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом в области от 4000 до 400 см-1, по положению полос поглощения должен соответствовать спектру СО глутаминовой кислоты. Задание 11. Проведите определение подлинности и сделайте заключение о качестве субстанции кофеина безводного, если согласно ФС 42-0249-07, ИК-спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом в области от 4000 до 400 см-1, по положению полос поглощения должен соответствовать спектру СО кофеина безводного. Задание 12. Установите подлинность кислоты салициловой, используя метод ИК-спектроскопии. На ИК-спектре кислоты салициловой, полученном Вами; должны быть следующие полосы поглощения: 758, 1657, 1288, 1210, 1250, 1150 см-1 (в дисках калия бромида). Зарегистрированный ИК-спектр должен полностью совпадать с ИК-спектром стандартного образца: Задание 13. На ИК-спектре теофиллина, полученном Вами, должны быть следующие полосы поглощения: 1670, 1717, 1567, 745, 980, 1190 см-1 (в дисках калия бромида). Установите подлинность теофиллина, используя метод ИКспектроскопии. Зарегистрированный ИК-спектр должен полностью совпадать с ИК-спектром стандартного образца: Т,% см-1 Рисунок – ИК-спектр теофиллина 118 Задание 14. На ИК-спектре салициламида, полученном Вами, должны быть следующие полосы поглощения: 1250, 752, 758, 1670, 1626, 1537 см-1 (в дисках калия бромида). Установите подлинность салициламида, используя метод ИК-спектроскопии, Зарегистрированный ИК-спектр должен полностью совпадать с ИК-спектром стандартного образца: 8 9 2000 10 11 1500 12 13 14 15 1200 1000 900 Wavenumber 800 700 Рисунок – ИК-спектр салициламида Задание 15. Установите подлинность кислоты никотиновой, используя метод ИК-спектроскопии. На ИК-спектре кислоты никотиновой, полученном Вами, должны быть следующие полосы поглощения: 1300, 744, 1710, 1042, 694, 1180 см-1 (в дисках калия бромида). Зарегистрированный ИК-спектр должен полностью совпадать с ИК-спектром стандартного образца кислоты никотиновой: Рисунок – ИК-спектр кислоты никотиновой 119 Задания для текущего контроля: Ситуационные задачи Является ли принятое решение правильным? 1. При разработке нового проекта НД на субстанцию кислоты аскорбиновой аналитик предложил включить в раздел «Испытание на подлинность» вместо аналитических химических реакций спектральные характеристики вещества, полученные методами УФ- и ИК-спектроскопии. Оцените предложение аналитика. Пояснения к ситуационным задачам 1. Методы УФ- и ИК-спектроскопии обеспечивают надежность испытания кислоты аскорбиновой на подлинность. Поэтому аналитические химические реакции можно исключить. Принятые НД реакции, как правило, подтверждают присутствие в структуре кислоты аскорбиновой ен–диольной группировки, обусловливающей восстановительные свойства вещества. OH OH H O O HO CH CH2OH Однако в структуре вещества имеются также первичная и вторичная спиртовые группы, внутренняя сложноэфирная группировка, которые не оцениваются химическим методом. Только ИК-спектр кислоты аскорбиновой дает полную информацию о структуре вещества по наличию характеристических полос поглощения енольных и спиртовых ОН – групп, двойной связи в кольце и лактонной группировки, а также по набору полос поглощения в области «отпечатков пальцев». Достоверность обеспечивается сравнением спектра аскорбиновой кислоты со спектром ее стандартного образца или рисунком спектра. УФ-спектр кислоты аскорбиновой отражает присутствие в структуре только сопряженных двойных связей. Поэтому УФ-спектроскопия является 120 дополнительным методом, а ИК-спектроскопия – главным методом в испытаниях на подлинность. Таким образом, предложение аналитика о применении комплекса методов УФ- и ИК-спектроскопии в испытании кислоты аскорбиновой на подлинность является обоснованным. 121 Темы самостоятельной работы Термины и определения, используемые в спектрофотометрии. Контрольные вопросы для собеседования: 1. Что называют оптической плотностью? Что означает величина оптической плотности? 2. Что такое максимум поглощения? 3. Что называют спектром поглощения? 4. Дайте понятие электронным спектрам. 5. Что называют молярным показателем поглощения? 6. Что называют удельным показателем поглощения? 7. Дайте определение термину -максимуму поглощения. -минимум поглощения -батохромный эффект (сдвиг); -гипсохромный эффект (сдвиг); -гиперхромный эффект; -гипсохромный эффект; -характеристические полосы; -"бензольная" полоса поглощения. 8. Что такое структурные элементы? 9. Каковы основные числовые характеристики спектров? 10. Что измеряют в методе спектрофотометрии в УФ-области? 11. Дайте определение основному закону светопоглощения. 1. Теоретические основы метода (основной закон светопоглощения, его графическое и математическое выражение, удельный и молярный показатели поглощения, их взаимосвязь и использование в анализе) Контрольные вопросы для собеседования: 1. Какие определения основаны на измерении поглощения электромагнитного излучения? 2. В основе каких методов лежит 122 избирательное поглощение электромагнитного излучения? 2. Сформулируйте основной закон светопоглощения. 3. Чем вызваны отклонения от закона Бугера-Ламберат-Бера? 4. Как можно проводить расчет содержания определении лекарственных веществ при количественном методом спектрофотметрии в УФ-области? 5. На чем основаны методы абсорбционной спектрофотометрии (спектроскопические методы анализа)? 6. Что называют удельным показателем поглощения? 7. Что называют молярным показателем поглощения? 8. Как взаимосвязаны между собой удельный и молярный показатели светопоглощения? 9. От каких факторов зависят удельный и молярный показатели светопоглощения? 10.Что возникает, если электроны на некоторых орбиталях поглощают кванты света и переходят на более высокие энергетические уровни? 11.На чем основаны методы абсорбционной спектрофотометрии (спектроскопические методы анализа)? 12.Что представляет собой градуировочный график? 3. Спектр поглощения – как отражение электронного строения вещества (понятие об «ауксохромах» и «хромофорах», характеристика основных типов электронных переходов, их энергоёмкость, соотнесение к областям поглощения спектра) Контрольные вопросы для собеседования: 1. Назовите основные константы, характеризующие спектр поглощения? 2. Что такое спектр поглощения? 3. Что выражает зависимость оптической плотности от длины волны? 4. Какие группы относят к ауксохромным? 5. Какие структурные элементы получили название хромофоров? 123 6. Какой концентрации раствор используют при определении молярного показателя светопоглощения? 7. Чем объясняется возникновение спектров поглощения в УФ- и видимой областях? 8. Какой диапазон длин волн подразумевают под УФ-областью? 9. Что возникает, если электроны на некоторых орбиталях поглощают кванты света и переходят на более высокие энергетические уровни? 4. Применение спектрофотометрии для испытаний на подлинность и чистоту лекарственных веществ Контрольные вопросы для собеседования: 1. Для каких аналитических целей используют метод спектрофотометрии? 2. Какой метод используют для определения светопоглощающих примесей в фармацевтических субстанциях? 3. Можно ли при лекарственном определении веществе светопоглощающих использовать отношение примесей в оптических плотностей при определенных длинах волн? 4. Как подтверждают подлинность (идентификацию) лекарственных веществ методом спектрофотометрии в УФ-области? 5. Какие значения откладываются на оси абсцисс и ординат при графическом отображении УФ-спектров? 5. Факторы, влияющие на воспроизводимость результатов фотометрических методов анализа и выбор оптимальных условий анализа Контрольные вопросы для собеседования: 1.Как формулируется соотношение, известное, как закон Бугера- Ламберта-Бера? 2. Приведите математическое выражение закона Бугера-Ламберта-Бера. 3. Приведите графическое выражение закона Бугера-Ламберта-Бера? 4.Какие методы анализа называются фотометрическими? 124 5. Какие диапазоны длин волн можно использовать для аналитических целей? 6. От чего зависит поглощение света раствором того или иного вещества? 7. Возможны ли отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера? 8. Чем могут быть вызваны отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера? 9. Какова погрешность спектрофотометрических определений? 10.В каких единицах выражают толщину кюветы при расчете содержания анализируемого вещества 11. Что такое воспроизводимость результатов? 6. Непосредственная спектрофотометрия. Дифференциальная спектрофотометрия. Производная спектрофотометрия. Метод Фирордта. для Приборы спектрофотометрического анализа. Разрешающая способность методики Контрольные вопросы для собеседования: 1. К каким методам относят спектрофотометрию в УФ- и видимой областях? 2. В основе каких методов лежит избирательное поглощение электромагнитного излучения? 3. Чем является логарифм отношения интенсивности падающего света к интенсивности света, прошедшего через раствор? 4. Какие способы расчета количественного содержания лекарственных веществ в субстанции или однокомпонентных лекарственных формах используют? 5. Что используют для расчета количественного содержания вещества методом производной спектрофотометрии ? 6. Перечислите общие элементы УФ-спектрофотометра. 7. Что означает понятие «разрешающая способность»? 8. В каких случаях невозможно использовать метод непосредственной спектрофотометрии? 9. В чем заключается сущность метода производной спектрофотометрии. 125 10. Приведите примеры лекарственных средств, анализ которых проводится методом производной спектрофотометрии. 11. Поясните, в чем сущность дифференциальной спектрофотометрии. 12. Приведите примеры происхождения, лекарственных анализ которых средств растительного проводится методом дифференциальной спектрофотметрии. Обоснуйте использование этого метода. 13. Что является раствором сравнения при анализе лекарственных средств методом дифференциальной спектрофотометрии? 14. В чем сущность метода Фирордта? 15. Обоснуйте целесообразность использования этого метода на примере одного лекарственного средства. 7. Количественное определение. Способы расчета концентраций Контрольные вопросы для собеседования: 1. Какие способы расчета содержания действующего вещества существуют? 2. Как проводить расчет содержания действующего вещества по калибровочному графику? 3. Как проводить расчет содержания действующего вещества по значению удельного или молярного показателей поглощения? 4. Как проводить расчет содержания действующего вещества по значению оптической плотности раствора стандартного образца? 5. Каковы достоинства и недостатки каждого из этих способов расчета? Какой наиболее точный метод расчета содержания действующего вещества? 8.Инфракрасные (колебательные) деформационные колебания, спектры. Валентные смешанные и валентно- деформационные колебания молекул Контрольные вопросы для собеседования: 1. На чем основаны методы абсорбционной 126 спектрофотометрии (спектроскопические методы анализа)? 2. От чего зависит способность вещества поглощать энергию ИКизлучения? 3. С какой целью измеряют зависимость величины пропускания от значения волнового числа? 4. Какой диапазон длин волн электромагнитного излучения подразумевают под ближней инфракрасной областью спектра? 5. За счет чего возникают ИК-спектры? 6. Какая область ИК-спектра наиболее приемлема для целей фармацевтического анализа? 7. Какая область ИК-спектра в настоящее время называется областью «отпечатков пальцев»? 8. Какие значения откладываются на оси абсцисс и ординат при графическом отображении ИК-спектров? 9. Дайте определение понятию пропускание? 10. Какая область спектра называется полосой поглощения? 11. Какое колебание называется валентным? 12. Какое колебание называется деформационным? 13. Что такое характеристические частоты? 14. Какие колебания называют смешанными валентно-деформационными? 15. Вследствие чего возникают инфракрасные (ИК) спектры? 16. Что измеряют для подтверждения подлинности лекарственных веществ методом спектрофотометрии в ИК-области? 17. Что происходит при поглощении электромагнитной энергии при колебаниях ядер атомов в молекулах? 9. Идентификация с использованием стандартных образцов. Идентификация с использованием эталонных спектров Контрольные вопросы для собеседования: 1. Какие этапы включает исследование спектроскопии? 127 вещества методом ИК- 2. Дайте характеристику метода взвесей с калия бромидом? 3. Опишите методику растирания образца с индифферентными жидкостями. 4. Перечислите общие элементы ИК-спектрофотометров? 5. Как проводить идентификацию согласно требованиям НД? 6. Назовите основные приемы исследований веществ методом ИКспектроскопии? 7. Приведите методику идентификации ЛС с использованием стандартных образцов? 8. Приведите методику идентификации ЛС с использованием эталонных спектров. 128 Для заметок 129 Литература 1. Арзамасцев А.П., Сенов П.Л. Стандартные образцы лекарственных веществ. М.: «Медицина», 1978. – 248 с. 2. Арзамасцев А.П., Дорофеев В.Л., Коновалов А.А., Кочин В.Ю., Лебедев Н.Н., Титов И.В. «Экспресс – анализ с целью выявления фальсифицированных Практическое средств» руководство. Фторхинолоны и цефалоспорины. Н.: Издательский дом «Русский врач», - 2003. – 132 с. 3. Арзамасцев А.П., Яскина Д.С. Ультрафиолетовые и инфракрасные спектры лекарственных веществ. М.: «Медицина», 1975.- 151 с. 4. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2-х ч. / В. Г. Беликов. – Пятигорск, 2003. - 720 с. 5. Государственная фармакопея СССР. / МЗ СССР. – 11-е издание. – М.: Медицина, 1987. – Вып. 1. – 336 с. 6. Государственная фармакопея СССР. / МЗ СССР. – 11-е издание. – М.: Медицина, 1989. – Вып. 2. – 400 с. 7. Государственная фармакопея Российской Федерации / 12-е издание. «Издательство «НЦЭСМП», 2008. – 704 с. 8. Казицина Л.А., Куплетская Н.Б. Применение УФ-, ИК-, ЯМР- и массспектроскопии в органической химии. М., Изд. Моск. ун - та, 1979.- 240 с. 9. Качественный анализ органических лекарственных средств: Методические указания для студентов 3 – 5 курсов /под ред. Гаврилина М.В. – Пятигорск: ГОУ ВПО Пятигорская ГФА Росздрава, 2007. – 181 с. 10. Мельникова Н.Б., Зимнякова О.Е., Пожидаев В.М., Саликова Т.В., Гусихина М.С. ИК–спектроскопия в фармацевтическом анализе: Учебнометодическое пособие для студентов 5 курса фармацевтического факультета. – Нижний Новгород: Изд-во государственной медицинской академии, 2006. – 65 с. 130 Нижегородской 11. Методы анализа лекарств/Н.П. Максютина и др.- Киев: Здоровья,1984. – 224 с. 12. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 2. Методы химического анализа: Учеб. для вузов / Под ред. Ю.А.Золотова. – 2-е изд. – М.: Высш. шк.; 2002. – 494 с. 13. Отто М. Современные методы аналитической химии. / М. Отто. – М.: Техносфера, 2006. – 416 с. 14. Смит А. «Прикладная ИК – спектроскопия»: Пер с англ. М.: Мир, 1982. – 327 с. 15. Тыжигирова В.В., Филиппова С.Ю. Применение ИК- и УФ- спектроскопических методов в фармацевтическом анализе: Учебное пособие / Под ред. А.П. Арзамасцева. – М.: ГЭОТАР – МЕД, 2004. – 640 с. 131 УЧЕБНОЕ ИЗДАНИЕ Д.С. Лазарян, А.Ю. Айрапетова, Л.Б. Губанова, Х.Н. Гюльбякова УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ ПО ОСВОЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ «Спектрофотометрические методы в анализе биологически активных веществ растительного и синтетического происхождения» ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ПРОГРАММА «ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, ФАРМАКОГНОЗИЯ» (подготовка научно-педагогических кадров) НАПРАВЛЕНИЕ ПОДГОТОВКИ 33.06.01 ФАРМАЦИЯ Технический редактор: Подписано к печати «________» ____________________ 201____ г. Формат 60×84, 1/16, бумага писчая, белая Усл. печ. л. _______ Уч.-изд. л. Тираж _______ экз. Заказ ____________ Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России 357532. г. Пятигорск, проспект Калинина, 11 132
