фотометрические методы анализа

Министерство здравоохранения Российской Федерации
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ
ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ
УДК 543.061
Ч-16
Ч-16 Чакчир Б. А., Алексеева Г. М. Фотометрические методы анализа: Методические указания.— СПб.: Изд-во СПХФА,
2002.— 44 с.
ISBN 5-8085-0044-3
Приведены методические указания по изучению спектрофотометрического и фотоколориметрического методов анализа, использованию их для
качественного и количественного исследования различных соединений, в
том числе и фармацевтических препаратов.
Указания предназначены для студентов фармацевтического факультета и факультета промышленной технологии лекарств.
ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Рекомендовано методической комиссией
фармацевтического факультета
Рецензент
д-р хим. наук К. Н. Зеленин (СПбВМА)
Методические указания
ISBN 5-8085-0044-3
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
2002
2
 Санкт-Петербургская государственная
химико-фармацевтическая академия, 2002
ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА
ВВЕДЕНИЕ
Все химические соединения взаимодействуют с электромагнитным излучением, уменьшая интенсивность его потока.
Абсорбционная спектроскопия основана на измерении уменьшения интенсивности излучения, прошедшего через раствор анализируемого вещества.
Из методов абсорбционной спектроскопии наибольшее распространение получил фотометрический метод анализа. Эффективность его использования обусловлена рядом обстоятельств, важнейшими из которых являются:
— наличие разнообразных фотометрических методик анализа
практически на все элементы периодической системы и многочисленные органические вещества;
— возможность использования относительно недорогой
и доступной аппаратуры;
— возможность фотометрических определений соединений
в интервале от 100 до 10–6 %, включая анализ веществ высокой степени очистки.
Специфичность, чувствительность, относительная простота
и точность определений, достигаемая с помощью современной аппаратуры, обеспечивает широкое использование метода в различных областях науки и практики.
Фотометрический метод, в частности, успешно применяется для
контроля качества лекарственных средств при их производстве и
хранении.
3
Фотометрический метод анализа основан на способности определяемого вещества поглощать электромагнитное излучение оптического диапазона. Концентрацию поглощающего вещества определяют, измеряя интенсивность поглощения. Поглощение при
определенной длине волны является информацией о качественном
и количественном составе определяемого вещества и составляет аналитический сигнал.
Фотометрический анализ относится к молекулярному абсорбционному анализу, т. е. анализу основанному на поглощении света
молекулами анализируемого вещества и сложными ионами в ультрафиолетовой (УФ), видимой и инфракрасной (ИК) областях спектра.
В настоящих указаниях рассматриваются метода анализа, основанные на избирательном поглощении электромагнитного излучения в видимой и ультрафиолетовой областях спектра: фотоколориметрия и спектрофотометрия.
Спектрофотометрический метод анализа — основан на поглощении монохроматического излучения, т. е. излучения с одной
длиной волны в видимой и УФ областях спектра.
Фотоколориметрический метод анализа — основан на поглощении полихроматического (немонохроматического) излучения,
т. е. пучка лучей с близкими длинами волны в видимой области
спектра. Фотоколориметрию используют в основном для анализа
окрашенных растворов.
Оба метода основаны на общем принципе — пропорциональной
зависимости между светопоглощением и концентрацией определяемых веществ.
С помощью фотометрического анализа можно определять малые количества вещества, например, содержание примесей не ниже
5 × 10–5 % (спектрофометрически) и 1 × 10–4 % (фотоколориметрически) при погрешности определения 1—3 %.
4
2. СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ
Таблица 1
Основные области электромагнитного излучения
2.1. Происхождение молекулярных спектров поглощения
№
п/п
Как известно, внутренняя энергия молекулы складывается из
трех основных составляющих: энергии движения электронов (Еэл.),
энергии колебаний атомов молекулы (Екол.) и энергии вращения
молекулы (Евр.).
1. Ультрафиолетовая
(УФ)
вакуумная
ближняя
2. Видимая
3. Инфракрасная (ИК)
ближняя
Е = Еэл. + Екол. + Евр.
При поглощении излучения в видимой и УФ областях спектра
происходит изменение электронной составляющей общей энергии.
Поэтому мы будем рассматривать энергию движения электронов.
Если излучение определенной длины волны проходит через веществ и не поглощается, то энергическое состояние молекулы остается без изменения. Если же излучение поглощается, то молекулы
вещества переходят из одного энергетического состояния с меньшей энергией (Е1) в другое энергетическое состояние с большей
энергией (Е2). Этот процесс сопровождается поглощением кванта
энергии:
∆Е = Е2 – Е1 = h · ν = h ⋅
c
= h⋅c⋅ ν
λ
(2.1)
где h — постоянная Планка (6,62 × 10–34 Дж · с),
ν — частота излучения (с–1, Гц),
с — скорость света (3 × 1010 см/с),
λ — длина волны, нм (1 нм = 10–9 м или в микронах 1 мк =
1· 10–6 м),
ν — волновое число (см–1).
ν=
=
Область
электромагнитного излучения
Длина
волны λ,
нм
Волновое число ν ,
см–1
Энергия Е,
кДж/моль
100—200
200—400
400—750
(10—5) · 104
(5—2,5) · 104
(2,5—1,3) · 104
1200—600
600—300
300—160
750—1560 (1,3—0,66) · 104
160—80
Изучая поглощение излучения веществом различных длин волн
в видимой и УФ областях спектра можно получить электронный
спектр поглощения.
Спектром поглощения называют графическую зависимость интенсивности поглощения от длины волны (λ) или волнового числа (
ν ). Для каждого поглощающего вещества имеется определенное
распределение интенсивности поглощения по длинам волн, при
этом на кривой поглощения имеются один или несколько максимумов. Область интенсивного поглощения называется полосой поглощения (рис. 2.1).
По спектру поглощения можно определить состав и строение
соединений, т. к. различные функциональные группы характеризуются определенными полосами поглощения в спектре.
2.2. Основные характеристики полосы поглощения
ε
1
λ
(A)
Энергия кванта определяет длину волны, а число поглощенных
квантов — интенсивность излучения. Обычно энергию электронного
перехода относят к молю вещества и выражают в кДж/моль. Зная
длину волны и волновое число можно рассчитать энергию электронного перехода.
1
2
δ11/2
δ12\2
λ1
λ2
λ, нм
Рис. 2.1. Электронный спектр поглощения молекулы
5
6
К основным характеристикам полосы поглощения относятся:
длина волны в максимуме поглощения (λмакс), интенсивность поглощения в максимуме εmax, полуширина полосы (δ1/2), которая
равна ширине полосы в единицах длин волн или волнового числа
при значении интенсивности, составляющей половину интенсивности поглощения в максимуме.
2.3. Основной закон светопоглощения
При прохождении электромагнитного излучения интенсивностью I0
через частично поглощающую среду, например, через раствор с концентрацией поглощающего вещества С (моль/л) и толщиной поглощающего
слоя l, часть этого излучения будет поглощаться (In), небольшая часть
излучения отражается от стенок кюветы (Iотр.), и часть проходит через
раствор (I). Таким образом, интенсивность падающего излучения равна
сумме трех составляющих:
I0 = I + Iотр. + In.
(2.2)
Значение Iотр. очень мало, поэтому это значение можно не учитывать.
I0
III
Iп
I
Iотр.
Iотр.
Рис. 2.2. Схема поглощения света раствором
Связь между интенсивностями световых потоков I0, I с концентрацией поглощающего вещества и толщиной слоя раствора устанавливает объединенный закон Бугера-Ламберта-Бера. Этот закон
выведен для монохрамотического излучения.
–ελ · c · l
I = I0 · 10
(2.3)
l — толщина поглощающего слоя (см),
ελ — молярный коэффициент поглощения (моль–1 л · см–1).
В логарифмической форме закон будет иметь следующий вид:
lgI = lgI0 – ελ · l · c,
lg
(2.4)
I0
называют оптической плотностью и обозначают
I
А. Оптическая плотность характеризует поглощательную способность вещества.
А = ελ · l · c
(2.5)
При соблюдении основного закона светопоглощения, оптическая плотность раствора прямо пропорциональна молярному коэффициенту поглощения, концентрации вещества и толщине поглощающего слоя.
Из выражения (2.5) видно, что если l = 1 см и с = 1 моль/л, то А
= ε. Это равенство отражает физический смысл молярного коэффициента поглощения. Молярный коэффициент поглощения характеризует внутренние свойства вещества и зависит от температуры,
длины волны электромагнитного излучения и природы вещества. ε
не зависит от толщины слоя, концентрации вещества и интенсивности падающего излучения.
В фармацевтической практике часто пользуются значением
удельного коэффициента поглощения E с1 %м , что соответствует поглощению 1 %-го раствора вещества при l = 1 см.
М
При этом ε = E с1 %м ⋅
,
(2.6)
10
где М — молярная масса вещества.
Для характеристики поглощения используют также величину,
которая называется пропусканием, эта величина равна отношению
I
.
I0
Величину lg
где I0 — интенсивность падающего излучения,
I — интенсивность прошедшего излучения,
с — концентрация поглощающего вещества (моль/л),
Т=
7
I0
= ελ · l · c.
I
8
I
· 100 %
I0
(2.7)
Связь между значением оптической плотности и пропусканием
I
определяется следующей зависимостью: lgT = lg
+ 2 = 2 – A,
I0
A = 2 – lgT .
(2.8)
Величины А и Т меняются в следующих пределах: А = 0,
Т = 100 % до А = ∞ , Т = 0. (Например, А = 1, Т = 10 %, А = 2,
Т = 1 %.) Отклонение от закона Бугера-Ламберта-Бера могут быть
вызваны физическими и химическими причинами. К физическим
причинам относятся: высокая концентрация раствора
(> 0,01
моль/л), недостаточная монохроматизация света и рассеивание света. К химическим причинам относятся: процессы ассоциации, диссоциации, протонирования, комплексообразования, которые могут
протекать в растворе.
3. АППАРАТУРА И ТЕХНИКА ФОТОМЕТРИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИЙ
Фотометрические методы определения концентрации веществ в
растворах основаны на сравнении поглощения или пропускания
света стандартными и исследуемыми растворами. Степень поглощения света фотометрируемых раствором измеряют с помощью
фотоэлектроколориметров и спектрофотометров. Измерение оптической плотности производят по отношению к раствору сравнения
(нулевого раствора). В качестве раствора сравнения чаще всего
используют растворитель.
3.1. Основные узлы приборов для фотометрических измерений
Независимо от области спектра приборы для измерения пропускания или поглощения света раствором состоят из следующих пяти
основных узлов (рис. 3.1):
Источника излучения (1), монохроматора (2), устройства, которое позволяет выделить ограниченную область длин волн, кювет с
исследуемым раствором и раствором сравнения (3 и 3′) (приборы
комплектуются набором кювет с l= 10 – 0,1 см), преобразователя
(4), который превращает энергию излучения в электрический сигнал (фотоэлемент), индикатора сигнала (5) (регистрирующее
устройство).
Приборы, применяемые для измерения поглощения растворов,
можно классифицировать следующим образом:
1. По способу монохроматизации лучевого потока: приборы с
призменным или решетчатым монохроматорами, которые позволяют достигнуть высокой степени монохроматизации рабочего излучения называют спектрофотометрами; приборы, в которых монохроматизация достигается с помощью светофильтров, называют
фотоэлектроколориметрами.
2. По способу измерения: однолучевые с прямой схемой измерения, и двулучевые с компенсационной схемой измерения.
3. По способу регистрации измерений: регистрирующие и нерегистрирующие.
3.2. Фотоэлектроколориметры
Фотоэлектроколориметры предназначены для измерения пропускания или оптической плотности растворов в диапазоне 315—
630 нм и определения концентрации растворов фотоколориметрическим методом.
Все приборы снабжены набором узкополосных светофильтров,
спектральные характеристики которых приведены в табл. 3.1, которые поглощают большую часть излучения и пропускают ограниченный участок длин волн.
Таблица 3.1
Характеристики светофильтров
3′
1
2
3
4
5
Рис. 3.1. Основные узлы приборов для абсорбционных измерений
9
10
Маркировка светофильтра
Длина волны, соответствующая
максимальному пропусканию, нм
1
2
3
4
5
315 + 5
364 + 5
400 + 5
440 + 10
490 + 10
Продолжение таблицы 3.1
Маркировка светофильтра
Длина волны, соответствующая
максимальному пропусканию, нм
6
7
8
9
540 + 10
572 + 10
590 + 10
630 + 10
Перед началом проведения измерений необходимо выбрать
светофильтр. Светофильтры нужно выбирать так, чтобы максимум
пропускания и минимум поглощения светофильтра совпадали бы с
максимумом поглощения определяемого вещества (рис. 3.2).
А
источники излучают сплошной спектр в интервале 180—375 нм. В
одинаковых рабочих условиях дейтеривая лампа дает излучение
большей интенсивности, чем водородная.
Для измерения оптической плотности или пропускания в УФ
области спектра требуются кюветы из кварцевого стекла, т. к.
обычное стекло сильно поглощает это излучение.
Источником видимого излучения служит лампа накаливания с
вольфрамовой нитью, излучающая сплошной спектр в области
315—1100 нм.
В спектрофотометрах в качестве устройства для выделения части излучения применяют монохроматоры двух типов: призму и
дифракционную решетку, которые позволяют непрерывно менять
длину волны.
ВЫБОР ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ
1
4. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО
МЕТОДА. ПОГРЕШНОСТЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
2
нм
Рис. 3.2. Поглощение излучения: 1 — раствором, 2 — светофильтром
Фотоколориметры применяют в основном для измерения поглощений в видимой области спектра. Если вещество не поглощает электромагнитное излучение в этой области, то его путем химической
реакции можно перевести в окрашенный продукт. Кюветы, используемые в фтоколориметрии изготавливают из стекла.
По чувствительности, селективности и точности фотоколориметрические измерения несколько уступают спектрофотометрическим,
так как определяется поглощение не монохроматического света, а
пучка лучей с определенным интервалом длин волн.
3.3. Спектрофотометры
Спектрофотометры предназначены для измерения пропускания
или оптической плотности в диапазоне 190—1100 нм. Источником
УФ излучения служат водородная или дейтеривая лампа. Данные
11
Для характеристики чувствительности в методе фотометрии
чаще всего используют минимальную определяемую концентрацию
(Сmin, моль/л) и открываемый минимум (m, мкг).
Сmin — это минимальная концентрация элемента вещества
в растворе, которую можно определить фотометрическим методом:
Сmin = Аmin/εmax · l, моль/л
(4.1)
где Аmin — это минимальное значение оптической плотности, которое можно измерить с помощью приборов, используемых для фотометрических определений.
Чувствительность будет в основном определяться величиной молярного коэффициента поглощения εmax. Если при спектрофотометрическом определении принять ε = 104 моль–1 · л · см–1, толщину слоя
l = 1 см и минимальное значение оптической плотности 0,01, то
Сmin = 0,01/104 · 1 = 10–6 моль/л.
Открываемый минимум (m) — это наименьшее массовое содержание вещества (мкг), которое еще может быть количественно
определено данным методом, в определенном объеме (мл).
12
m = Cmin · V · M = 103 · M · Amin/ εmax · l
(4.2)
2
Обозначим V/l = g — эффективное сечение кюветы (см )
m = Amin · g · M · 103/ εmax
(4.3)
Если принять ε = 104 моль–1 · л · см–1, Amin = 0,01, g = 1 см2,
а среднюю молярную массу 100 (г/моль), то получим значение
m = 0,1 мкг.
Чувствительность и погрешность фотометрического определения зависит от выбранного интервала длин волн поглощаемого
излучения. Чем больше значение молярного коэффициента поглощения, тем больше чувствительность определения. Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера наибольшее значение молярный коэффициент поглощения имеет при длине волны (λmax), для которой
наблюдается максимальное поглощение.
Следовательно, если проводить определение вещества, при
длине волны λmax мы достигнем большей чувствительности.
Для получения хорошо воспроизводимых результатов анализа
необходимо правильно выбрать оптимальное значение оптической
плотности.
Оптимальной оптической плотностью Аопт. называется та плотность, при которой относительная погрешность в определении концентрации вещества будет минимальна.
Зависимость относительной погрешности определения от оптической плотности представлена на рис. 4.1.
в интервале оптической плотности от 0,2 до 0,8 — относительная
погрешность не превышает 3 %. Значение А = 0,434 называют оптимальной оптической плотность (Аопт.). Следовательно для более
точных определений рекомендуется подобрать концентрацию раствора и толщину поглощающего слоя так, чтобы измерения проводились в интервале оптической плотности 0,2—0,8. Однако, толщина поглощающего слоя не должна превышать 5 см, так как с
увеличением толщины слоя увеличивается рассеивание света. Чаще
всего используют кюветы с l = 1 см. Если вещества очень сильно
поглощают, то пользуются разнообразными кюветами с вкладышем, позволяющим уменьшить толщину слоя до 0,01 см.
В реальных условиях погрешность фотометрического определения может достигнуть 5 % из-за погрешностей, возникающих
при приготовлении растворов, проведения измерения на приборе и
др.
При проведении фотометрического анализа большее значение
имеет выбор растворителя. Выбор растворителя должен определяться растворимостью анализируемого вещества и его способностью к поглощению излучения. Растворитель не должен поглощать
в исследуемом интервале длин волн. В табл. 4.1 приведены некоторые растворители, используемые в спектрофотометрических методах и их нижний предел пропускания.
Таблица 4.1
Предел пропускания излучения некоторых растворителей
Растворители
2,7
∆С/C %
Рис. 4.1. Зависимость
относительной
погрешности измерения
концентрации от оптической
плотности раствора
1,8
0,9
А
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
Приведенная кривая показывает, что при А = 0,434 относительная погрешность в определении концентрации составляет ~ 0,9 %, а
13
Нижний предел пропускания,
(при l = 1 см)
Вода
185
Метанол
210
Изопропанол
210
Циклогексан
210
Ацетонитрил
212
Этанол
220
Хлороформ
240
Бензол
280
Толуол
285
Ацетон
330
Например, предел пропускания ацетона 330 нм, поэтому нельзя
снять спектр вещества в ацетоне, поглощающего при λ < 330 нм.
14
Таким образом для проведения фотометрического анализа
необходимо правильно подобрать условия его проведения. К таким
условиям относятся выбор растворителя, длины волны, оптической
плотности и связанных с ней толщины поглощающего слоя и концентрации раствора.
б) разрыхляющие σ* и π*-электроны, которые находятся на
разрыхляющих орбиталях;
в) несвязывающие n-электроны, которые находятся на несвязывающих п-орбиталях.
На рис. 5.1 изображены основные типы электронных переходов.
Е
5. КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОМ ФОТОМЕТРИИ
Молекулы различных веществ характеризуются своей системой
энергетических уровней, поэтому спектры поглощения их будут
различаться по числу полос поглощения, их положению в шкале
длин волн и интенсивности. Этот факт используют для идентификации и проведения качественного анализа веществ, используя для
этого значения λmax и εmax, которые зависят от природы вещества.
Ультрафиолетовые спектры поглощения обычно имеют две-три и
более полос поглощения. Для идентификации исследуемого вещества записывают его спектр поглощения в различных растворителях и сравнивают полученные данные с соответствующими спектрами
исходных веществ известного состава. Если спектры поглощения исследуемого вещества в разных растворителях совпадают со спектром
известного вещества, то делают заключение об идентичности химического состава этих соединений.
При идентификации вещества следует также обратить внимание
на интенсивность поглощения. Очень многие органические вещества имеют полосы поглощения, максимумы которых расположены
при одинаковой длине волны, но интенсивности их различны.
Например, в спектре фенола наблюдается полоса поглощения при
λ = 255 нм, для которой ε = 1450. При той же длине волны ацетон
имеет полосу поглощения, для которой ε = 17.
Появление полос поглощения в электронных спектрах обусловлено переходами электронов в молекуле вещества между электронными уровнями из основного — в возбужденное состояние.
5.1. Основные типы электронных переходов
В молекуле различают:
а) связывающие σ и π-электроны, которые находятся на связывающих σ и π-орбиталях;
15
σ*
π*
п
π
σ
Рис. 5.1. Основные типы электронных переходов в молекуле
Различные электронные переходы требуют неодинаковой энергии и поэтому могут наблюдаться при различных длинах волн и
иметь различные значения молярного коэффициента поглощения.
Для возбуждения σ → σ* переходов требуется значительная энергия (УФ в вакуумной области, λ = 100—150 нм), т. к. σ — электроны прочно связаны в молекуле. Такие переходы редко реализуются
и характеризуются большой интенсивностью. Значительно меньше
энергии требуется для осуществления π → π*-перехода. Они наблюдаются в области 200—250 нм и характерны для молекул ароматических соединений с сопряженными связями. Значение коэффициента
молярного поглощения для этих переходов равно ~104 л · моль-1
· см-1.
Еще легче возбуждаются наименее прочно связанные пэлектроны, поэтому п-π* переходам соответствуют полосы поглощения в области λ = 250—300 нм. Такие переходы характерны для
соединений имеющих атомы с неподеленными парами электронов
(N, S, O, галогены). Значение ε ≈ 100 л · моль-1 · см-1.
При исследовании электронных спектров поглощения органических молекул — чаще всего имеют место переходы π → π*
и п → π*. Все указанные переходы можно отличить друг от друга,
исследуя влияние кислотности и природы растворителя на спектр
поглощения. Так, например, протонирование затрагивает неподеленную пару электронов, что приводит к исчезновению полосы
поглощения п → π* перехода и абсолютно не влияет на полосу по16
глощения π → π* переходов. При увеличении полярности растворителя полоса п → π* перехода, которая сопровождается увеличением дипольного момента молекул, смещается в область коротких
длин волн (гипсохромное смещение), а полоса π → π*, которая сопровождается уменьшением дипольного момента, смещается в
длинноволновую область (батохромное смещение).
Многие неорганические соединения, которые имеют d-электроны
(преимущественно комплексные соединения), дают в спектре поглощения малоинтенсивные полосы d → d переходов, которые наблюдаются в видимой области спектра, коэффициенты молярного поглощения, которых составляют ε ~ 10—15 л · моль-1 · см-1. Переходами
между d или f-орбиталями обусловлена окраска соединений.
Из изложенного следует, что анализ спектров поглощения веществ в видимой и УФ областях позволяет сделать заключение
относительно их строения. Однако наиболее полная и однозначная
информация о строении соединений может быть получена путем
исследования их ИК-спектров.
выбранный интервал концентрации соответствовал области возможных изменений концентраций анализируемых растворов. Строят градуировочный график в координатах А ÷ C. В случае подчинения закону Бугера — Ламберта — Бера и при измерении
оптической плотности относительно растворителя, график представляет собой прямую (рис. 6.1), проходящую через начало координат. Измеряют оптическую плотность исследуемого раствора Ах
и по графику находят концентрацию Сх вещества в растворе.
А
А3
А4
Ач
А1
С, моль/л
С1
Сх
С2
С3
Рис. 6.1. Градуировочный график
6. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Концентрация исследуемого вещества может быть определена
методом фотометрии в том случае, если в спектре поглощения раствора этого вещества имеются ясно выраженные полосы поглощения в УФ и видимой областях спектра.
В основе количественного определения лежит закон Бугера —
Ламберта — Бера, который устанавливает прямопропорциональную зависимость между оптической плотностью и концентрацией
вещества в исследуемом растворе. С помощью фотометрии можно
проводить анализ как индивидуальных веществ, так и их смесей.
6.1. Методы определения индивидуальных веществ
6.1.1. Метод градуировочного графика
Записывают спектр поглощения раствора вещества и находят
длину волны, соответствующую максимуму поглощения. Затем
готовят серию стандартных растворов с различным содержанием
определяемого компонента и измеряют их оптическую плотность
при выбранной длине волны и толщине слоя. Необходимо, чтобы
17
Более точные результаты получают при построении графика
методом наименьших квадратов.
При построении градуировочного графика различают три варианта:
— график для стандартных растворов, не содержащих посторонние вещества, построенный при оптимальных условиях;
— график, построенный в присутствии отдельных посторонних
компонентов;
— график, построенный по стандартным растворам, содержащим все компоненты анализируемых объектов.
6.1.2. Метод стандартного раствора (метод сравнения)
В этом методе сравнивают поглощение исследуемого раствора
и стандартного Аст. с известной концентрацией. Расчет концентрации Сх проводят по формуле, исходя из закона Бугера — Ламберта — Бера:
Cx =
18
Ax ⋅ C с т .
.
Ас т .
(6.1)
Измерения проводят с несколькими стандартными растворами,
близкими по концентрации к исследуемому, и усредняют Сх. Этот
способ требует строгого подчинения поглощения закону Бугера —
Ламберта — Бера.
6.1.3. Метод добавок
В этом методе сначала измеряют оптическую плотность анализируемого раствора Ах, объем которого равен Vx, далее добавляют в
раствор небольшой объем раствора того же вещества (V0) с известной концентрацией С0 и находят оптическую плотность Ах+g после
добавки. При условии подчинения закону Бугера — Ламберта —
Бера величину Сх рассчитывают из следующих уравнений:
Ax
Cx
C ⋅V
=
; Cg = 0 0 ;
Ax + g C x + C g
V x + V0
Cx =
C 0 ⋅V0
Ax + g
⋅ (V x + V0 ) − V x
Ax
.
(6.2)
(6.3)
Метод добавок обычно применяют для устранения мешающего действия посторонних примесей, а также в ряде случаев для оценки правильности методики определений. Этот метод позволяет создать одинаковые условия для фотометрирования исследуемого раствора и
раствора с добавкой, поэтому его целесообразно применять для определения небольших количеств различных соединений в присутствии больших количеств посторонних веществ. Метод добавок
требует обязательного соблюдения основного закона светопоглощения.
6.1.4. Метод дифференциальной фотометрии
Дифференциальный метод применяют для повышения воспроизводимости результатов анализа при определении больших количеств веществ, когда нарушается основной закон светопоглощения
или когда значения оптических плотностей выходят за пределы
шкалы прибора, а дальнейшее разбавление раствора может привести к увеличению погрешности определения.
Сущность метода состоит в том, что оптические плотности исследуемого и стандартных растворов измеряют не по отношению к
19
чистому растворителю с нулевым поглощением, а по отношению к
раствору определяемого вещества с концентрацией С0 близкой к
концентрации исследуемого раствора.
Полученное значение оптической плотности называют относительной оптической плотностью (Аотн.).
Аотн. = Ах – А0 = ε · l (Cx – C0)
(6.4)
где Аотн. — относительная оптическая плотность,
Ах — оптическая плотность исследуемого раствора,
С0
раствора сравнения,
А0 — оптическая плотность
Cx — концентрация вещества в анализируемом растворе, моль/л,
C0 — концентрация вещества в растворе сравнения, моль/л,
ε — молярный коэффициент поглощения, А · моль–1см–1.
С помощью дифференциальной фотометрии анализируют концентрированные растворы, у которых оптическая плотность больше
1. Так, например, при измерении оптической плотности по отношению к растворителю получили А = 1,3, измерение такого значения
оптической плотности недостаточно точно. Если мы в качестве
раствора сравнения возьмем раствор анализируемого вещества с А0
= 0,8, то получим Аотн. = 0,5, что соответствует оптимальным условиям измерения (разд. 4). Метод дифференциальной фотометрии
является наиболее точным методом.
Рассчитать концентрацию вещества в методе дифференциальной фотометрии можно с использованием градуировочного графика или методом стандарта.
При построении градуировочного графика в дифференциальной
фотометрии различают два варианта: метод односторонней дифференциальной фотометрии и метод двухсторонней дифференциальной фотометрии.
В методе односторонней дифференциальной фотометрии для
построения градуировочного графика используют раствор сравнения с концентрацией меньшей, чем концентрации стандартных растворов, т. е. С0 < Cст. Графическая зависимость имеет вид, представленный на рис. 6.2.
Аотн.
20
•
Сст., моль/л
Рис. 6.2. Градуировочный график при односторонней дифференциальной фотометрии
В методе двухсторонней дифференциальной фотометрии используют стандартные растворы с концентрацией большей
и меньшей, чем концентрация раствора сравнения (рис. 6.3).
C0
Готовят серию стандартных растворов и измеряют оптическую
плотность каждого раствора по отношению к первому, затем всех
последующих — по отношению ко второму и т. д. По формуле (6.7)
вычисляют фактор F и находят его среднее значение. При определении концентрации неизвестного раствора измеряют Аотн., х этого
раствора по отношению к одному из растворов стандартной серии,
оптическая плотность которого наиболее близка к оптической
плотности анализируемого раствора и рассчитывают концентрацию
Сх по уравнению (6.8).
В дифференциальной фотометрии используют специальные
приемы выбора раствора сравнения с целью повышения точности
определения. Для этого готовят серию стандартных растворов с
одинаковой разностью концентраций ∆С, при этом соответствующая им разность оптической плотности ∆А должны быть равны
0,3—0,4. Затем измеряют оптическую плотность каждого последующего раствора по сравнению с предыдущим и рассчитывают текущее значение
εi = Ai/∆Ci и εi · С0,
Рис. 6.3. Градуировочный график при двухсторонней
дифференциальной фотометрии
В случае, когда концентрация раствора сравнения С0 больше,
чем концентрация стандартного раствора
С > C Сст., то значения Аотн. берут
ст.
0
со знаком минус.
ст., моль/лв дифференциПри применении для расчета концентрацииCвещества
< C0
альной фотометрии методаСст.
сравнения
используют следующие соотношения:
Aо т н, .x
Aо т н, .с т .
C x = C0 +
=
С x − C0
C с т. − С 0
Aо т н., х ⋅ (С с т. − С 0 )
Aо т н, .с т .
Cс т . − С0
= F (фактор пересчета)
Ао т н, .с т .
Сх = С0 + F · Aотн., х
где С0 — концентрация раствора сравнения в данном измерении.
Тот раствор, для которого значение εi · С0 будет наибольшим и
используют в качестве раствора сравнения.
Методы дифференциальной спектрофотометрии и фотоколориметрии находят все большее применение при анализе лекарственных веществ. Например, этим методом определяют спазмолитин, апрофен,
анальгин, амидопирин. Погрешность определения в методе дифференциальной фотометрии составляет 0,5—1,0 %.
(6.5)
(6.6)
6.2. Методы определения смеси веществ
В данном разделе будут рассмотрены примеры определения
смеси веществ, состоящих из двух компонентов. Для смеси поглощающих веществ, если они не взаимодействуют друг с другом,
наблюдается аддитивность оптической плотности:
(6.7)
(6.8)
Аобщ. = (А1 + А2 + А3 + ... + Ап) =
21
22
= (ε1 · с1 + ε2 · с2 + ε3 · с3 + ... +εп · сп) · l
(6.9)
В зависимости от поглощения компонентов, различают несколько вариантов анализа смесей.
6.2.1. Спектры поглощения определяемых компонентов
накладываются друг на друга в широком интервале длин волн
Измерение оптической плотности смеси приводят при двух
длинах волн и, используя свойство аддитивности оптической плотности, составляют систему из двух уравнений:
 Aλ = ε1λ ⋅ c1 ⋅ l + ε 2λ ⋅ c2 ⋅ l

(6.10)

 Aλ = ε1λ ⋅ c1 ⋅ l + ε 2λ ⋅ c2 ⋅ l
Значение молярных коэффициентов поглощения либо берут из
таблицы, либо, чаще всего определяют экспериментально при тех
длинах волны, при которых проводят фотометрирование с использованием стандартных растворов индивидуальных веществ. Полученные значения коэффициентов светопоглощениея подставляют в
систему уравнений (6.11) и решают ее относительно С1 и С2.
1
1
1
21
2
2
A λ ⋅ ε λ − A λ ⋅ ε 2λ
C1 = λ λ1
ε 2 ⋅ ε1 − ε1λ ⋅ ε 2λ
C2 =
2
1
1
2
1
2
2
2
A λ ⋅ ε1λ − A λ ⋅ ε1λ
ε 2λ ⋅ ε1λ − ε1λ ⋅ ε 2λ
2
1
1
2
1
2
2
1
(6.11)
Количественное определение смеси двух компонентов в случае
налагающихся спектров можно проводить только спектрофотометрическим методом, фотоколориметрически этот анализ практически осуществить невозможно.
6.2.2. Спектры поглощения определяемых компонентов частично накладываются друг на друга
В этом случае можно найти область длин волн, где один компонент поглощает, а другой — нет.
Примером такого определения спектрофотометрическим методом
является определение смеси лекарственных веществ папаверина гидрохлорида и никотиновой кислоты. Оба компонента поглощают при λ =
261 нм, а при λ = 325 нм — поглощает только папаверин гидрохлорид.
23
По поглощению
смеси при λ = 325А нм определяют концентрацию
А
папаверина гидрохлорида С1.
а)
б)
A 325
C1 = 325
ε1 ⋅ l
С, моль/л
1
2
(6.12)
С, моль
Оптическая плотность смеси веществ при λ = 261 нм аддитивное
складывается из поглощения обоих компонентов, при l = 1 см.
A 261 = C1 ⋅ ε1261 + C 2 ⋅ ε 2261 ,
(6.13)
где С2 — молярная концентрация никотиновой кислоты.
Значение молярных коэффициентов поглощения папаверина
гидрохлорида при λ = 235 нм и λ = 261 нм и никотиновой кислоты
при λ = 261 нм определяют предварительно по стандартным растворам чистых компонентов. Концентрацию никотиновой кислоты
рассчитывают по формуле при l = 1 см.
A 261 ⋅ ε1325 − A1 ⋅ ε1261
C2 =
.
325
ε 261
2 ⋅ ε1
(6.14)
Фотоколориметрически таким способом определяют концентрацию в смеси KMnO4 и K2Cr2O7 с использованием градуировочного графика.
При λ = 550 нм (зеленый светофильтр) поглощает только
KMnO4, а при λ = 430 нм (синий светофильтр) поглощают оба компонента. По стандартным растворам перманганата калия и дихромата
калия строят градуировочные графики при λ = 550 нм, λ = 430 нм
(рис. 6.4).
Рис. 6.4. Градуировочный график: а) KMnO4 при λ = 550 нм;
24
б) KMnO4 (1) при λ = 430 нм, K2Cr2O7 (2) при λ = 430 нм
По значению оптической плотности исследуемой смеси при λ =
550 нм определяют сразу концентрацию марганца в растворе, одновременно при помощи кривой 2 определяют оптическую плотность
раствора перманганата при 430 нм. Затем по разности оптических
плотностей исследуемой смеси и раствора перманганата при 430 нм
( ∆Ax430 = Ax430 − AK430M nO ) по кривой 1 находят концентрацию K2Cr2O7 в
положению точки излома (или перегиба) находят точку эквивалентности (ТЭ). На рис. 6.5, а — г приведены кривые спектрофотометрического титрования.
А
а)
А
εп ≈ εТ ≈ 0
ε0 > 0
б)
ε0 ≈ εп ≈ 0
εT > 0
4
исследуемой смеси.
V
6.2.3. Спектры поглощения определяемых компонентов не
накладываются друг на друга
В этом случае определение каждого из компонентов проводят
независимо друг от друга любым описанным в разделе 6.1. методом
анализа (градуировочного графика, стандарта, добавок).
Сюда же относится случай, если имеется область длин волн, где
определяемый компонент поглощает, а остальные — нет. Например, содержание аминозина в растворах для инъекций, в состав
которых кроме него входят хлорид, метабисульфит натрия, аскорбиновая кислота, можно определять при λ = 305 нм, так как при
этой длине волны поглощает только аминозин.
А
в)
V
А
ε0 ≈ εТ ≈ 0
г)
εп > 0
Т.Э.
Т.Э
V
V
6.3. Фотометрическое титрование
А
А
Фотометрическое титрование — это разновидность титрометрического анализа, при котором точку эквивалентности определяют
по изменению оптической плотности раствора при добавлении титранта.
Спектрофотометрическое и фотометрическое титрование заключается в том, что в процессе титрования исследуемого раствора
фиксируют изменение оптической плотности. Используют обычные
реакции, применяемые в количественном анализе; точку эквивалентности устанавливают по максимальному изменению оптической
плотности. Предполагается, что поглощение раствора подчиняется
закону Бугера — Ламберта — Бера. Титрование проводят непосредственно в спектрофотометрах, снабженных специальными кюветными крышками с отверстиями для ввода кончика полумикробюретки и мешалки, в кюветах объемом 25 мл. По полученным
данным строят зависимость А от V, где V — объем титранта, и по
д)
е)
25
ε00 >> 00
εεTT >> 00
εεn ≈> 00
n
Т. Э.
Т. Э
εn > εТ > 0
ε0 ≈ 0
Рис. 6.5. Различные формы кривых спектрофотометрического титрования:
а) поглощает титруемое вещество, титрант и продукт реакции не поглощают.
ε0 — молярные коэффициент погашения анализируемого вещества, εп и εТ — то же
для продута и титранта. Пример — титрование бихромата калия в кислой среде
арсенитами и солями Fe2+;
V
V
Т. Э.
Т.реакции
Э.
б) поглощает титрант,
титруемое вещество и продукт
не поглощает.
Например, при титровании Fe2+ бихроматом калия;
26
в) поглощает продукт реакции, титруемое вещество и титрант не поглощают.
Такой вид имеет кривая фотометрического титрования солей Сu2+ раствором трилена Б при λ = 625 нм, где преимущественно поглощает комплекс;
г) поглощает титруемое вещество и титрант;
д) поглощает продукт и титрант, титруемое вещество не поглощает;
е) реакция не доходит до конца; поглощает продукт
Точность установления точки эквивалентности тем больше, чем
резче выражен излом на кривой вблизи этой точки. Это наблюдается для практически необратимых реакций и для реакций, с большой
константой равновесия, например, при образовании устойчивых
комплексных соединений. В тех случаях, когда на кривых спектрофотометрического титрования отсутствует резкий излом, а имеет
место главное изменение оптической плотности (реакция не доходит до конца, продукт реакции малоустойчив) (рис. 6.5е) точку эквивалентности находят, эксстраполируя касательные к участкам
кривой титрования. Точность спектрофотометрического титрования
составляет ± 0,5 % и превышает точность прямой спектрофотометрии. Большая чувствительность спектрофотометрических методов
позволяет производить титрования и в разбавленных растворах.
K =
[H + ]⋅ [Ind − ] [H + ]α
=
.
[HInd ]
1− α
(7.1)
где α — степень диссоциации; α — рассчитывают по поглощению
в λ1:
α=
A − AHInd
,
AInd − AHInd
(7.2)
−
где А — оптическая плотность смеси,
АHInd — оптическая плотность неионизированной и АInd —
ионизированной форм индикатора.
K =
[H + ] ⋅ ( A − AH Ind )
AInd − A
(7.3)
−
pK = pH + lg
AInd − A
−
(7.4)
A − AH Ind
4
А
3
7. ПРИМЕНЕНИЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНСТАНТЫ ДИССОЦИАЦИИ ИНДИКАТОРОВ
ИЛИ ОРГАНИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ
2
Определение Kg индикатора или органического реагента основывается на различии в спектрах поглощения ионизированной и
неионизированной форм индикатора. С этой целью записывают на
регистрирующем спектрофотометре спектры поглощения индикатора в сильно кислой и сильно щелочной средах (рис. 7.1). Если
индикатор представляет собой слабую одноосновную органическую кислоту, то спектр в кислой среде соответствует неионизированной, а в щелочной среде — ионизированной формам.
Далее приготавливают серию буферных растворов с известным
значением рН, содержащих одну и ту же концентрацию индикатора, и записывают их спектры поглощения (крив. 2, 3). Для расчета
константы выбирают длину волны, соответствующую наибольшему
различию в спектрах поглощения недиссоциированных молекул и
ионов индикатора (λ1). Для индикатора одноосновной кислот HInd
27
1
Рис. 7.1. Спектры индикатора при различных рН.
Кривые 1 — HInd, 4 — Ind–
2
Спектрофотометрические методы позволяют
определить
константу диссоциации слабой кислоты с рК 3= 10 и более, что не удается сделать потенциометрическими
методами.
1
4
λ1
Лабораторная работа № 1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФУРАЦИЛИНА
28
λ
МЕТОДОМ СТАНДАРТНЫХ РАСТВОРОВ
O
Фурацилин —
O 2N
O
противомик-
CH=N—NH—C
NH2
В основе работы лежит измерение интенсивности собственной
окраски рибофлавина (витамина В2) в растворах различных концентраций.
робное средство. Метод основан на измерении поглощения щелочных растворов фурацилина и сравнении оптической плотности
стандартного и анализируемого растворов.
Оборудование и реактивы: фотоэлектроколориметр; колбы
мерные вместимостью 50 мл — 6 шт.; бюретка вместимостью
25 мл; исходный раствор рибофлавина, 0,1 мг/мл.
Оборудование и реактивы: фотоэлектроколориметр; колбы
мерные вместимостью 500 мл — 2 шт.; бюретка вместимостью
25 мл; раствор NaOH, 0,1 М; исходный раствор фурацилина, 0,1 мг
в 1 мл.
Выполнение работы. Для приготовления стандартных растворов в пять мерных колб вливают определенные объемы исходного
раствора рибофлавина, содержащие 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мг рибофлавина и доводят объем раствора до метки водой. Используя один
из растворов, выбирают оптимальный светофильтр, соответствующий максимальному поглощению вещества. Измерения проводят в
кювете с l = 50 нм. Далее измеряют оптическую плотность стандартных растворов в той же кювете с выбранным светофильтром.
По полученным данным строят градуировочный график.
Измеряют оптическую плотность анализируемого раствора и по
градуировочному графику определяют содержание рибофлавина
(мг).
Выполнение работы. Готовят стандартный раствор с содержанием фурацилина 0,015 мг/мл. Для этого в мерную колбу вместимостью 50 мл помещают рассчитанный объем исходного раствора
фурацилина, 10 мл 0,1 М раствора NaOH и доводят до метки водой.
Растворы выдерживают 20 мин, далее фотометрируют в кювете с l
= 50 мм со всеми светофильтрами и выбирают светофильтр, соответствующий максимальному поглощению.
К исследуемому раствору фурацилина в мерной колбе вместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл 0,1 М раствора NaOH, перемешивают и доводят водой до метки. Через 20 мин измеряют оптическую
плотность раствора (Ах) в такой же кювете с выбранным светофильтром. Концентрацию фурацилина в растворе Сх (в мг/мл) вычисляют по формуле:
Cx =
Ax ⋅ C с т.
,
Aс т.
где Сст. — концентрация стандартного раствора, Аст.— его оптическая плотность. Измерения повторяют несколько раз и рассчитывают среднее значение Сх.
Лабораторная работа № 3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИОНОВ ХРОМА (VI) С ДИФЕНИЛКАРБАЗИДОМ
Дихромат калия окисляют количественно в кислой среде дифенилкарбазид с образованием растворимого красителя краснофиолетового цвета.
Проводят реакцию с избытком дифенилкарбазида, можно, измерив интенсивность окраски, судить о количестве ионов хрома
(VI).
Лабораторная работа № 2
Оборудование и реактивы: фотоэлектроколориметр; раствор
дихромата калия, 0,02 мг/мл; колбы мерные вместимостью 50 мл — 6
шт.; полумикробюретка вместимостью 5 мл; серная кислота, С = 2,5
моль/л; раствор дифенилкарбазида.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РИБОФЛАВИНА МЕТОДОМ КАЛИБРОВОЧНОГО
ГРАФИКА
Выполнение работы. Отбирают из полумикробюретки 1, 2, 3,
4, 5 мл раствора дихромата калия в колбы вместимостью 50 мл,
29
30
добавляют в каждую по 2 мл раствора дифенилкарбазида и по 2 мл
2,5 М H2SO4. Растворы доводят до метки дистиллированной водой
и оставляют на 10 мин, предварительно перемешав. Для одного из
растворов выбирают светофильтр в кювете с l = 50 мм и измеряют в
этих же условиях оптическую плотность стандартных растворов.
Строят градуировочный график.
К раствору с неизвестным содержанием ионов хрома (VI)
в мерной колбе вместимостью 50 мл, добавляют 2 мл раствора
дифенилкарбазида и 2 мл 2,5 М H2SO4, доводят объем до метки
дистиллированной водой и размешивают, оставляют на 10 мин и
фотометрируют, используя в качестве раствора сравнения дистиллированную воду. Содержание хрома рассчитывают по градуировочному графику.
Приготовление раствора дифенилкарбазида: перед употреблением растворяют 0,1 г реагента в 15 мл ацетона в мерной колбе на
50 мл и доводят до метки водой.
Лабораторная работа № 4
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
МАРГАНЦА В КОНЦЕНТРИРОВАННОМ РАСТВОРЕ
Методы дифференциальной двусторонней спектрофотометрии и
фотоколориметрии применимы к анализу концентрированных растворов. Они основаны на линейной зависимости относительной
оптической плотности от концентрации поглощающего вещества.
Оборудование и реактивы: фотоколориметр; колбы вместимостью 50 мл — 6 шт.; исходный раствор KMnO4, содержащий
0,5 мг/мл Mn2+; бюретка вместимостью 25 мл.
Выполнение работы. В шесть мерных колб вместимостью
50 мл вводят определенные объемы исходного раствора с содержащим 1, 2, 3, 4, 5 и 6 мг марганца, и доводят объем раствора до метки водой. Выбирают оптимальный светофильтр и измеряют оптическую плотность стандартных растворов (Aст.) по отношению к
раствору сравнения (А0). В данном случае в качестве раствора сравнения используют раствор с промежуточной концентрацией (3—4
мг). Измеряют в кювете с l = 5 мм. Строят градуировочный график
31
в координатах Аотн.= Аст.– А0 = f (Cст.). Анализируемый раствор
разбавляют в мерной колбе водой до 50 мл, измеряют оптическую
плотность по отношению к выбранному раствору сравнения и по
градуировочному графику находят концентрацию марганца и рассчитывают его массу.
Лабораторная работа № 5
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕВОМИЦЕТИНА
В ВОДНОМ РАСТВОРЕ
Цель работы. Спектрофотометрическое определение содержания в растворе вещества, имеющего максимум в ультрафиолетовой
области спектра, методом градуировочного графика.
Сущность работы. Левомицетин — синтетическое лекарственное вещество группы антибиотиков, имеющее полосу поглощения в
УФ-области спектра.
O
|
OH NH—C—CHCl2
| |
C—C—CH2OH
O2N
| |
H H
Определение левомицетина основано на подчинении интенсивности поглощения вещества по закону Бугера — Ламберта — Бера:
I0
= ε ⋅c ⋅l
(1)
I
При постоянных толщине поглощающего слоя (кюветы) l
и молярном коэффициента погашения (экстинкции) ε, при выбранной длине волны, отвечающей максимуму поглощения, оптическая
плотность исследуемого раствора прямопропорциональна концентрации (содержанию) вещества:
A = lg
А = К · С.
(2)
Графически эта зависимость (2) выражается прямой, проходящей через начало координат под углом к оси абсцисс, тогда:
32
K = tgα = ε · l, а при l = 1 см K = tgα = ε.
П р и м е ч а н и е. В зависимости от способа выражения концентрации различают молярный коэффициент погашения ε (л · моль-1 · см-1), если С — молярная
концентрация, и коэффициент погашения α (л · г-1 · см-1), если С — концентрация,
выраженная в г/л или мг/мл. Оба коэффициента взаимосвязаны соотношением — ε
= α · М, где М — молекулярная масса.
П р и м е ч а н и е. Построение зависимости А = f(g) в данном случае возможно, т. к. объемы эталонных растворов одинаковы.
Из построенного графика определяют коэффициент поглощения
и молярный коэффициент поглощения левомицетина.
Таблица
Данные для построения калибровочного графика
при определении левомицетина (λ
λmax )
Измерив оптическую плотность вещества в исследуемом растворе можно, используя график зависимости А = f(C), определить
его концентрацию и содержание в пробе.
Оборудование и реактивы: спектрофотометр; кюветы кварцевые с
l = 1см — 2 шт.; полумикробюретка — 1 шт.; мерные колбы на 50 мл —
6 шт.; стандартный раствор левомицетина (С = 0,3 мг/мл).
№
эталонного
раствора
Выполнение работы
Приготовление эталонных растворов и выбор длины волны для
построения калибровочного графика
В 5 мерных колб объемом 50 мл с помощью полумикробюретки
помещают такие объемы стандартного раствора левомицетина (С =
0,3 мг/мл), чтобы получить серию эталонных растворов, содержащих
от 0,3 до 1,5 мг левомицетина, и доводят до метки дистиллированной
водой. Растворы тщательно перемешивают. Затем для снятия электронного спектра поглощения левомицетина используют один из приготовленных эталонных растворов (с содержанием 0,8—1,0 мг вещества); для этого измеряют оптическую плотность выбранного раствора
в области длин волн 220—350 нм через каждые 10 нм и результаты
заносят в таблицу.
1.
2.
3.
4.
5.
λ, нм
Объем
стандартного
раствора
левомицетина,
мл
Содержание
левомицетина
в эталонном
растворе g,
мг
Концентрация
левомицетина
в эталонном
растворе С,
мг/мл
Оптическая
плотность
эталонных
растворов,
А
Определение содержания левомицетина в исследуемом растворе
Пробу исследуемого раствора, выданную лаборантом в мерную
колбу на 50 мл, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Определяют оптическую плотность полученного раствора Ах при λmax (берут среднюю величину из 2—3
измерений) и по калибровочному графику определяют содержание
левомицетина в пробе (gx, мг).
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350
А
По данным таблицы строят кривую светопоглощения левомицетина в координатах А + λ, нм и определяют длину волны λmax, соответствующую максимальному поглощению вещества (максимуму
полосы поглощения левомицетина).
Построение калибровочного графика
Для построения калибровочного графика измеряют оптическую
плотность всех приготовленных эталонных растворов при выбранной
длине волны λmax и строят зависимость А = f (С, или g), где С — концентрация левомицетина в эталонных растворах, мг/мл; g — содержание левомицетина в эталонных растворах, мг.
33
Лабораторная работа № 6
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СМЕСИ ГИДРОХЛОРИДОВ
ПАПАВЕРИНА И ДИБАЗОЛА
Цель работы. Определение концентрации и содержания вещества в растворе, содержащем смесь двух компонентов с налагающимися спектрами поглощения.
Сущность работы. Гидрохлориды папаверина и дибазола —
лекарственные вещества, обладающие спазмолитическим, сосудорасширяющим и гипотензивным действием:
34
CH3O
CH3O
N
N
· HCl
CH2
CH2
· HCl
N
CH3O
CH3O
Дибазол гидрохлорид
М.м. = 244,7
Папаверин гидрохлорид
М.м. = 375,9
Растворы гидрохлоридов папаверина и дибазола поглощают в УФобласти спектра, причем их спектры поглощения налагаются.
При подчинении поглощения отдельных компонентов смеси
закону Бугера — Ламберта — Бера и отсутствии взаимодействия
между ними, оптическая плотность раствора их смеси при определенной длине волны аддитивно складывается из оптических плотностей компонентов:
где εП(λ1), εП(λ2), εД (λ1), и εД (λ2) — молярные коэффициенты поглощения гидрохлоридов папаверина и дибазола, л · моль-1 · см-1;
СП и СД — молярные концентрации гидрохлодиров папаверина
и дибазола, моль/л.
Величины молярных коэффициентов поглощения εП(λ1), εП(λ2),
εД (λ1), εД(λ2) должны быть определены в ходе работы.
Решая систему уравнений (3) относительно неизвестных СП
и СД получим:
Cп =
CД =
A ( λ2 ) ⋅ ε Д ( λ1 ) − A ( λ1 ) ⋅ ε Д ( λ2 )
ε Д ( λ2 ) ⋅ ε П ( λ1 ) − ε П ( λ2 ) ⋅ ε Д ( λ1 )
,
A ( λ1 ) ⋅ ε П ( λ2 ) − A ( λ2 ) ⋅ ε П ( λ1 )
.
− ε Д ( λ2 ) ⋅ ε П ( λ1 ) + ε П ( λ2 ) ⋅ ε Д ( λ1 )
(4)
(5)
Если концентрация компонентов выражены в г/мл или мг/мл, то
формулы 4 и 5 примут вид:
n
Асмеси =
∑ Ai , при λ = const.
(1)
i =1
При анализе двухкомпонентной системы необходимо измерить
абсорбцию смеси по меньшей мере при двух длинах волн
и составить два уравнения с двумя неизвестными:
 A( λ 1 ) = A1 ( λ 1 ) + A2 ( λ 1 )
,
(2)

 A( λ 2 ) = A1 ( λ 2 ) + A2 ( λ 2 )
где А(λ1), А1(λ1) и А2(λ1) — оптическая плотность смеси и отдельных компонентов при λ1;
А(λ2), А1(λ2) и А2(λ2) — оптическая плотность смеси и отдельных компонентов при λ2.
Тогда в нашем случае, при анализе раствора содержащего папаверин и дибазол имеем при l = 1 см:
 A( λ 1 ) = AП ( λ 1 ) + AД ( λ 1 ) = ε П ( λ 1 ) ⋅ С П + ε Д ( λ 1 ) ⋅ С Д
,

 A( λ 2 ) = AП ( λ 2 ) + AД ( λ 2 ) = ε П ( λ 2 ) ⋅ С П + ε Д ( λ 2 ) ⋅ С Д
(3)
35
Cп =
A ( λ2 ) ⋅ α Д ( λ1 ) − A ( λ1 ) ⋅ α Д ( λ2 )
α Д ( λ2 ) ⋅ α П ( λ1 ) − α П ( λ2 ) ⋅ α Д ( λ1 )
,
(17)
CД =
A ( λ1 ) ⋅ α П ( λ2 ) − A ( λ2 ) ⋅ α П ( λ1 )
− α Д ( λ2 ) ⋅ α П ( λ1 ) + α П ( λ2 ) ⋅ α Д ( λ1 )
л
где αП(λ1), αП(λ2), αÄ (λ1), αÄ(λ2) — коэффициенты погашения,
-1
-1
-1
-1
· г · см (λ · мг · см ).
Величины молярных коэффициентов погашения и коэффициентов погашения взаимосвязаны соотношением — ε = α · М, где М —
молекулярная масса.
Рассчитав концентрации и зная объем раствора, определяют
содержание каждого компонента в пробе в мг.
Оборудование и реактивы: спектрофотометр; мерные колбы
на 50 мл — 7 шт.; полумикробюретки на 5 мл — 2 шт.; стандартный раствор папаверина гидрохлорида (С = 0,25 мг/мл); стандартный раствор дибазола гидрохлорида (С = 0,5 мг/мл).
36
Выполнение работы
Приготовление эталонных растворов и выбор длин волн для
анализа
В три мерные колбы объемом 50 мл с помощью полумикробюретки
помещают такие объемы стандартного раствора папаверина гидрохлорида (С = 0,25 мг/мл), чтобы получить серию стандартных растворов, содержащих от 0,6 до 1,0 мг вещества, и доводят до метки
0,1 М раствором HCl. Растворы тщательно перемешивают. Аналогично из стандартного раствора дибазола гидрохлорида (С = 0,5
мг/мл) готовят три эталонных раствора с содержанием вещества от
0,5 до 1,0 мг.
Для растворов с промежуточной концентрацией гидрохлоридов
папаверина и дибазола (желательно, чтоб СП ≈ СД) измеряют оптическую плотность веществ в интервале длин волн от 260 до 320 нм
через каждые 5 нм (раствором сравнения служит 0,1 М раствор
HCl) и результаты заносят в таблицу:
λ, нм 260
265
270
275
280
285
290
295
300
310
315
320
АÏ
AÄ
ного
раствора
1
2
3
Средне значение ε П (λ1, λ2); α П (λ1, λ2)
Дибазола гидрохлорид
1
2
3
Средне значение ε Д (λ1, λ2); α Д (λ1, λ2)
Определение содержания гидрохлоридов папаверина и дибазола
в исследуемом растворе
Пробу исследуемого раствора в мерной колбе на 50 мл доводят
до метки 0,1 М раствором HCl и тщательно перемешивают. Определяют оптическую плотность раствора при λ1 и λ2 (берут среднюю
величину из 2—3 измерений) и рассчитывают по формулам (4)—
(7).
П р и м е ч а н и е. Коэффициенты поглощения при одной и той же длине
волны для одного и того же вещества должны быть величиной постоянной и не
должны зависеть от концентрации.
Определение коэффициентов погашения гидрохлоридов папаверина и дибазола при λ1 и λ2 в 0,1 М HCl.
Объем
Концентрация
стандартн.
эталонного
А(λ
λ1)
ε(λ
λ1)
λ2)
а(λ
λ1) А(λ
ε(λ
λ2)
а(λ
λ2)
37
раствора
мг/мл моль/л
Папаверина гидрохлорид
По данным таблицы на одном графике строят спектры поглощения гидрохлоридов папаверина и дибазола в координатах А ÷ λ
нм и определяют две длины волны λ1 и λ2, при которых наблюдается наибольшее различие в поглощении компонентов. Поглощением
дибазола при λ 310 нм можно пренебречь, т. е. принять AII = 0.
Определение коэффициентов погашения гидрохлоридов папаверина и дибазола
При выбранных длинах волн λ1 и λ2 измеряют оптическую
плотность всех эталонных растворов гидрохлоридов папаверина
и дибазола, данные заносят в таблицу и по закону Бугера — Ламберта — Бера рассчитывают коэффициенты поглощения.
№
эталон-
раствора,
мл
38
Лабораторная работа № 7
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СМЕСИ ПАРАИ ОРТОВАНИЛИНОВ
Пара-ванилин (пищевой ванилин), M = 152,1, является промежуточным продуктом в промышленном синтезе противотуберкулезного препарата фтивазида. Синтез пара-ванилина сопровождается образованием его изомера — орто-ванилина:
Анализируемый раствор доводят водой до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл и измеряют (2—3 раза) оптическую плотность при длинах волн λ1 и λ2.
Рассчитывают концентрации п- и о-ванилина в мг/мл по уравнениям (1)—(2).
Лабораторная работа № 8
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТЫ КИСЛОТНОЙ ДИССОЦИАЦИИ
ИНДИКАТОРА СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
HC=O
HC=O
Кислотно-основные индикаторы, в зависимости от рН раствора,
находятся
в
различных
окрашенных
неионизированных
и ионизированных формах. Выражение условной константы кислотной диссоциации индикатора, обладающего функцией слабой
кислоты, имеет вид:
OH
OCH3
OCH3
OH
Пара-ванилин
K=
Орто-ванилин
Различия в УФ-спектрах поглощения делают возможным спектрофотометрическое определение каждого изомера при совместном
присутствии.
Оборудование и реактивы: спектрофотометр; колбы мерные
вместимостью 50 мл — 7 шт.; полумикробюретки вместимостью
5 мл — 2 шт.; исходный раствор п-ванилина 0,1 мг\мл; исходный
раствор о-ванилина, 0,1 мг/мл.
Выполнение работы. В три мерные колбы вместимостью 50 мл
отмеряют 3,0; 4,0 и 5,0 мл исходного раствора п-ванилина, доводят
дистиллированной водой до метки и перемешивают. Также готовят
и стандартные растворы о-ванилина.
Записывают спектр поглощения второго раствора из каждой
серии п- и о-ванилина в области 240—320 нм через каждые 10 нм и
выбирают две длины волны λ1 и λ2, при которых наблюдается
наибольшее расхождение в спектрах поглощения веществ.
Измерив оптическую плотность каждого из трех стандартных
растворов п-ванилина при λ1 и λ2, рассчитав коэффициенты поглощения ап(λ1) и ап(λ2) (в мл ·мг–1 · см–1). Аналогично определяют
коэффициенты поглощения а0(λ1) и а0(λ1) о-ванилина.
39
aн+ ⋅ [Ind ]
[HInd ]
.
Увеличение кислотности приводит к сдвигу равновесия
в сторону недиссоциированной формы HInd и наоборот. Для каждой из этих форм характерен собственный спектр поглощения. Изменяя рН раствор и записывая спектр поглощения системы, можно
наблюдать постепенный переход одной формы в другую. При
наличии двух форм, находящихся в равновесии, кривые светопоглощения, измеренные при различных рН, имеют одну точку пересечения при определенной длине волны, называемую изобестической точкой. При этой длине волны молярные коэффициенты
поглощения обеих форм равны. Для записи спектров в видимой
области используют регистрирующий спектрофотометр СФ-18.
Интервал рН, в котором проводится запись спектров, определяется
величиной константы диссоциации индикатора, если К ~ 10–8, то
применяют буферные растворы с рН 5—11. Расчет ведут для двух
длин волн, соответствующих максимуму поглощения ионизированной Ind– и неионизированной форм HInd.
( A − AHInd ) ⋅ aн +
Для λмакс. ионизированной формы: K =
.
( AInd − − A )
40
aн + ( A − AInd − )
.
( AHInd − A )
Константу диссоциации рассчитывают для трех растворов
с промежуточными значениями рН, содержащих обе формы
в соизмеримых количествах. В работе определяют константы диссоциации одного из трех индикаторов — фенолового красного (0,06
%), бромтимолового синего (0,12 %), крезолового красного (0,18 %)
в 50 % этиловом спирте.
ЛИТЕРАТУРА
Для λмакс. неионизированной формы: K =
Оборудование и реактивы: регистрирующий спектрофотометр; колбы мерные вместимостью 50 мл — 8 шт.; пипетка вместимостью 1 мл; бюретки вместимостью 25 мл — 2 шт.; смесь кислоты
и NaOH, 0,2 М; растворы индикаторов в 50 % спирте.
Выполнение работы. Для приготовления буферных растворов
в мерные колбы на 50 мл помещают по 1 мл раствора индикатора,
определенный объем раствора смеси кислот (интервал рН 5—11) и 0,2
М раствора NaOH, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Объемы растворов смеси кислот и 0,2 М раствора NaOH, а
также рН буферных растворов 1 записывают по форме:
№
раствора
Объем смеси кислот,
мл
Объем 0,2 М раствора NaOH,
мл
1. Бабко А. К., Пилипенко А. Г. Фотометрический анализ.— М.:
Химия, 1968.
2. Булатов М. И., Калинкин И. П. Практическое руководство по
фотометрическим методам анализа.— Л.: Химия, 1986.
3. Васильев В. П. Теоретические основы физико-химических
методов анализа.— М.: Высш. шк., 1979.
4. Иоффе Б. В., Костиков Р. Р., Разин В. В. Физические методы
определения строения органических молекул.— Л.: ЛГУ, 1976.
5. Крешков А. П. Основы аналитической химии. Т. 3.— М.: Химия, 1970.
6. Пособие по химическому анализу лекарств / Под ред. Кулешовой М. И.— М.: Медицина, 1974.
7. Скугг Д., Уэкст Д. Основы аналитической химии. Т. 2.— М.:
Мир, 1979.
8. Фритц Дж., Шэнк Г. Количественный анализ.— М.: Мир,
1978.
рН
Записывают спектр поглощения всех растворов с помощью регистрирующего спектрофотометра в стеклянных кюветах с толщиной
слоя 10 мм, заполненных примерно на 4/5 объема. Спектры записывают по мере возрастания рН растворов. При переходе к раствору другой концентрации кювету промывают дистиллированной водой и ополаскивают измеряемым раствором.
Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу:
№ раствора
рН
А(λ
λ1)
рК
А(λ
λ2)
рК
1
.
.
.
8
Расчет рК по формулам 7—4. Проводят статистическую обработку результатов анализа.
1
Лурье Ю. Ю. Справочник по аналитической химии.— М.: Химия, 1989.— С.
275.
41
42
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1. Общая характеристика метода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2. Спектры поглощения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1. Происхождение молекулярных спектров поглощения
2.2. Основные характеристики полосы поглощения . . . . . .
2.3. Основной закон светопоглощения . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. Аппаратура и техника фотометрических измерений . . . . . .
3.1. Основные узлы приборов для фотометрических измерений . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2. Фотоэлектроколориметры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3. Спектрофотометры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4. Чувствительность фотометрического метода. Погрешность
определения. Выбор оптимальных условий . . . . . . . . . .
5. Качественный анализ методом фотометрии . . . . . . . . . . . . .
5.1. Основные типы электронных переходов . . . . . . . . . . . .
6. Количественный анализ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1. Методы определения индивидуальных веществ . . . . . .
6.2. Методы определения смеси веществ . . . . . . . . . . . . . . . .
6.3. Фотометрическое титрование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7. Применение спектрофотометрического метода для определения константы диссоциации индикаторов . . . . . . . . . . . . . . .
8. Лабораторные работы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9. Литература . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
4
5
5
6
7
9
Чакчир Борис Александрович,
Алексеева Галина Михайловна
ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Методические указания
9
10
11
12
15
16
17
18
23
25
27
29
42
Зав. издательством В. Н. Храмцов
Редактор И. Ю. Дрябжина
Компьютерный набор и верстка Н. Н. Караваевой
Печать Н. Н. Белокуровой
Лицензия ЛР № 021251 от 23.10.97. Подписано к печати 24.09.02. Формат 60×901/16.
Гарнитура «Таймс». Бумага тип. Печать ризограф. Печ. л. 2,75. Уч.-изд. л. 2,25.
Тираж 600 экз (2-й завод 301—600). Заказ 420.
Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия
197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14
43
44