Выделение ДНК из растений на магнитных частицах

Методика
тел:
Выделение ДНК из растений на
магнитных частицах
версия от 25 сентября 2013
ЗАО "Силекс"
+7 (495) 737 42 24
+7 (495) 998 42 88
+7 (495) 737 42 24
факс:
эл. почта: info@sileks.com
Выделение ДНК из растений на магнитных частицах
Содержание:
1. Состав набора
2. Описание
3. Меры предосторожности
4. Протоколы
5. Проблемы и решения
6. Связанные продукты
1. Состав набора
Входящие в набор реактивы позволяют провести 100 процедур выделения
• Буфер PlantDNAPrep
50 ml
• Буфер Start
12 ml
• Буфер PlantLysis
• Буфер Binding
• Магнитные частицы DNA Grade
25 ml
40 ml
2 ml
• Буфер Wash 1
15 ml
• Буфер Wash 3
30 ml
• Буфер Wash 2
• Буфер Final Wash
• Буфер Elution
Условия хранения: +4 °C
15 ml
30 ml
10 ml
Рекомендуемые для работы материалы, не включённые в набор
• Хлороформ
Использование хлороформа не является обязательным для работы набора. Тем не менее
его применение позволяет получить больший выход ДНК с более высокой чистотой.
Более подробную информацию о наборе для
выделения ДНК из растений Вы можете получить на
нашем
интернет­сайте,
перейдя
по
ссылке
http://www.sileks.com/ru/shortlink/Kits_Isol_DNA_Plant
или воспользовавшись расположенным рядом
QR­кодом, который можно отсканировать любым
смартфоном, планшетом, веб­камерой.
Выделение ДНК из растений на
магнитных частицах
ЗАО "Силекс"
Страница 1 из 8
2. Описание
2.1. Сфера применения
Спектр задач, требующих качественного выделения ДНК из растений, очень широк. Он
включает в себя как научные и исследовательские работы, так и поточную диагностику для
нужд сельского и лесного хозяйства. При выделении ДНК из растительного материала
существует ряд специфических особенностей, которые необходимо учитывать.
Растительная клетка покрыта прочной оболочкой из целлюлозы. Это довольно инертное
вещество, обладающее к тому же немалой прочностью. Эти два фактора существенно
усложняют процесс выделения ДНК, т. к. для его полноценного проведения целлюлозную
оболочку необходимо разрушить. Другая специфическая для растительного материала
проблема — высокое содержание полифенолов. Полифенолы, называемые также танинами,
затрудняют выделение ДНК и, кроме того, ингибируют многие ферментативные реакции.
Помимо этого, растения часто содержат в большом количестве различные запасные вещества
(например, крахмал), также затрудняющие выделение.
Существует множество методик, позволяющих проводить выделение ДНК из растительного
материала. Большая часть этих методик ориентирована на использование жидкого азота,
который облегчает растирание образца в мелкодисперсную массу и останавливает действие
нуклеаз. Однако далеко не в любой лаборатории имеется жидкий азот, что делает эти
методики трудно реализуемыми. Кроме того, в подавляющем большинстве методик
предполагается растирание образца в стандартной фарфоровой ступке. Это применимо при
условии обработки нескольких образцов. В случае же поточной диагностики такой вариант
исключён, т. к. после растирания каждого образца каждую пару ступка­пестик необходимо
тщательно вымыть и прогреть до ~200°C.
2.2. Описание набора
Предлагаемый набор включает все необходимые компоненты и в большинстве случаев
позволяет проводить всю процедуру выделения непосредственно в пробирке на 1,5 мл. Тем
не менее в случае работы с некоторыми специфическими типами образцов может
потребоваться растирание в ступке.
Набор предназначен для эффективного и быстрого (~60 мин) выделения ДНК из
растительных образцов. Выделенная ДНК может использоваться как в ПЦР, так и для любых
других молекулярно­биологических применений (мечение, клонирование, секвенирование и
т.д.). Полученная с помощью набора ДНК обычно содержит примеси тотальной РНК. Если Вам
необходимо получение чистой ДНК без примеси РНК, используйте обработку РНазами.
В набор входят все необходимые реактивы и буфера. Протокол выделения можно
модифицировать для масштабирования, в случае, когда требуется получение большего
количества ДНК. Для масштабирования необходимо пропорционально изменить количества
используемых реактивов.
Принцип используемого в наборе метода основан на обратимом связывании ДНК на
поверхности магнитных частиц. На Рисунке 1 схематически представлена процедура
выделения ДНК.
В целом использование данного набора позволяет избежать применения хлороформа. Тем не
менее при включении в протокол очистки хлороформом качество и количество выделенной
ДНК существенно повышается. Окончательное решение о целесообразности использования
хлороформа остаётся за конечным пользователем.
2.3. Сбор, хранение и подготовка растительного материала
Самым оптимальным вариантом является выделение ДНК из свежесобранных образцов. При
невозможности провести выделение в течение суток образцы следует хранить в не
пропускающей влагу упаковке (например, полиэтиленовом пакете) в холодильнике при
температуре +4 °C. При необходимости длительного хранения образцы необходимо либо
засушить либо заморозить. В первом случае рекомендуется пассивная сушка при комнатной
температуре. Использование нагревающих сушильных шкафов для ускорения высушивания
существенно снижает выход ДНК. В случае, если выбран второй вариант, важно помнить, что
после оттаивания образец должен быть обработан немедленно. Хранение или повторная
заморозка размороженного образца крайне нежелательны. Из­за разрыва клеток кристаллами
льда высвобождается множество нуклеаз, вызывающих быструю деградацию ДНК.
Для отбора и обработки пробы удобны следующие приёмы:
• Лист. Высечку листовой пластины в форме диска легко получить с помощью стандартной
пробирки типа Эппендорф. Для этого поместите листовую пластину между горлышком
пробирки и крышкой. Закрыв крышку, вырежьте таким образом из листа диск.
• Хвоя. Хвоинку можно поместить в пробирку целиком. Перед процедурой выделения хвоинку
лучше разрезать на фрагменты не длиннее 5 мм. Это существенно облегчит её
гомогенизацию.
Выделение ДНК из растений на
магнитных частицах
ЗАО "Силекс"
Страница 2 из 8
Рисунок 1. Схема процедуры выделения ДНК.
• Семена, зёрна. Можно хранить непосредственно в пробирке. Перед обработкой семена
необходимо замочить в буфере PlantDNAPrep и дать им набухнуть. В зависимости от
характеристик исходного материала для набухания может потребоваться от 30 мин. до
нескольких часов (необходимо подбирать экспериментально в каждом конкретном случае).
• Мясистые ткани. Например, мякоть плодов, ткани растений­суккулентов. Из­за
сравнительно малого числа клеток на единицу объёма содержание ядер, а следовательно,
нуклеиновых кислот, в таких тканях невелико. В связи с этим требуется большее количество
исходного материала. Рекомендуемый объём образца — не менее 100­150 мм3. Для
получения образца удобно воспользоваться скальпелем или ножом, вырезав образец
кубической формы со стороной около 5 мм.
Таблица 1. Рекомендуемые количества различных образцов*.
Образец
Листья без выраженной сочной или мясистой
паренхимы (напр., клён, берёза, роза, огурец и т.п.).
Листья с выраженной сочной или мясистой
паренхимой (напр., сочные чешуи и побеги луков,
листья капусты, разл. толстянки и т.п.).
Хвоя
Количество образца
1 диск диам. 10 мм
2­3 диска диам. 10 мм
или объём 150 мм3
1­2 хвоинки ели, пихты
0,5­1 хвоинка сосны, кедра
Мякоть плодов (томат, яблоко и т.п.)
150 мм3
Проростки
1 шт. длиной 1 см
Сухие семена и зёрна
2­3 шт. мелких семян,
1 зерно или крупное семя
Гербарные образцы, сухие растения**
Аналогично
соответствующим
свежим образцам (см. выше)
*Приведённые в таблице данные являются приблизительными. В каждом конкретном случае
требуется подбор оптимального количества.
**Если растения подвергались активной сушке при повышенной температуре, выход ДНК
может значительно снизиться.
Выделение ДНК из растений на
магнитных частицах
ЗАО "Силекс"
Страница 3 из 8
3. Меры безопасности
Некоторые компоненты набора могут нанести вред здоровью в случае
проглатывания, длительной ингаляции или попадания на кожу и в глаза.
Не смешивайте компоненты набора с кислотами, хлорными дезинфектантами и
отбеливателями. Это может привести к реакции с выделением токсичных паров.
Если для удаления промывочных буферов Вы используете аспиратор,
проследите, чтобы его колба­ловушка была пуста или не содержала кислот и хлорных
дезинфектантов.
В наборе используются органические соединения, длительное ингаляционное воздействие
которых может вызывать головокружения и головные боли.
Избегайте попадания компонентов набора на одежду, кожу и в глаза.
При попадании в глаза немедленно промыть большим количеством воды, продолжая эту
процедуру не менее 15 минут, затем обратиться к врачу. Эффективность промывания
возрастает, если принудительно оттянуть веки пальцами. При сохранении неприятных
симптомов (покраснения, раздражённости, жжения) обязательно обратиться за медицинской
помощью.
В случае попадания на кожу немедленно промойте место контакта с мылом и большим
количеством воды.
4. Протоколы
Перед началом работы убедитесь, что в буфере не образовался осадок или компоненты
буфера не расслоились. Расслоение или выпадение осадка не влияет на качество буфера.
Если образовался осадок, прогрейте буфер при 50 °C до полного растворения осадка.
ВАЖНО! Буфера PlantDNAPrep, Binding, Wash 1 и Wash 2 перед началом работы
необходимо тщательно перемешать.
Мацерация
Стандартное выделение ДНК из растений.
1. Внесите в пробирку на 1,5 мл подготовленный образец растительной ткани
(некоторые подсказки по улучшению подготовки материала Вы можете найти в
разделе "Сбор, хранение и подготовка растительного материала").
2. Добавьте 100 мкл буфера PlantDNAPrep и частично гомогенизируйте образец.
3. Добавьте ещё 400 мкл буфера PlantDNAPrep и продолжите гомогенизацию.
Шаги 2 и 3 можно объединить, но многие образцы бывает тяжело гомогенизировать сразу в
большом объёме. Полная гомогенизация не требуется, необходимо лишь мацерировать ткань,
разбив её на группы клеток.
4. Центрифугируйте 5 мин при 8000 об./мин и удалите супернатант.
5. Поместите образец в морозильник при ­20 °C на 20 мин.
Данная стадия не является обязательной для всех типов образцов, но существенно повышает
выход ДНК, а для некоторых образцов наличие стадии вымораживания необходимо.
Л и з и с
6. К замороженному осадку добавьте 250 мкл буфера PlantLysis и гомогенизируйте
образец как можно более полно.
7. Центрифугируйте 3 мин при 12­16 тыс. об./мин.
8. Отберите 150 мкл супернатанта в чистую пробирку.
9. Добавьте к отобранному супернатанту 100 мкл хлороформа, встряхните на вортексе и
центрифугируйте 3 мин. при 12­16 тыс. об./мин.
Хлороформ не включён в набор, т. к. его применение не является обязательным и оставлено на
усмотрение конечного пользователя. Применение очистки хлороформом повышает качество и
количество выделенной ДНК.
Выделение ДНК из растений на
магнитных частицах
ЗАО "Силекс"
Страница 4 из 8
Л и з и с
10. Перенесите 100 мкл очищенного хлороформом супернатанта в чистую пробирку и
добавьте 120 мкл буфера Start. При отборе супернатанта от хлороформа не
задевайте интерфазу между водной частью и хлороформом.
11. Тщательно перемешайте раствор и
температуре 3 минуты.
оставьте инкубироваться
при
комнатной
12. Центрифугируйте раствор при 12­16 тыс. об./мин. в течение 1 минуты.
13. Подготовьте пробирку со смесью 400 мкл буфера Binding и 20 мкл магнитных частиц
DNA Grade. Тщательно размешайте частицы в буфере.
Сорбция
14. Перенесите полученный после центрифугирования супернатант в пробирку с
суспензией магнитных частиц в буфере Binding.
15. Тщательно перемешайте раствор пипетированием и оставьте при комнатной
температуре на 5 мин.
Отмывка 1 Отмывка 2
16. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью
собраться на стенке пробирки (может потребоваться вплоть до 1 минуты) и удалите
супернатант.
17. Перенесите пробирку в немагнитный штатив. Внесите в пробирку 150 мкл хорошо
перемешанного буфера Wash 1, тщательно перемешайте пипетированием.
18. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью
собраться и удалите супернатант.
19. Перенесите пробирку в немагнитный штатив. Внесите в пробирку 150 мкл хорошо
перемешанного буфера Wash 2, тщательно перемешайте пипетированием.
20. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью
собраться и удалите супернатант.
Если необходимо получить экстра чистую ДНК, проведите дополнительную стадию промывки с
буфером Extra Wash (не входит с состав набора, приобретается отдельно).
а. Внесите в пробирку 300 мкл хорошо перемешанного буфера Extra Wash, тщательно
перемешайте пипетированием.
б. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью собраться и
удалите супернатант.
Отмывка 3 Финишная Э л ю ц и я
отмывка
21. Перенесите пробирку в немагнитный штатив. Внесите в пробирку 300 мкл буфера
Wash 3, тщательно перемешайте пипетированием.
22. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью
собраться и удалите супернатант.
23. Перенесите пробирку в немагнитный штатив. Внесите в пробирку 300 мкл буфера
Final Wash, тщательно перемешайте пипетированием.
24. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью
собраться и удалите супернатант.
25. Поместите пробирку с открытой крышкой в термостат и сушите при 60 °C в течение
10 минут.
26. Внесите в пробирку 100 мкл буфера Elution. Тщательно ресуспендируйте частицы.
Для получения ДНК с более высокой концентрацией объем элюирующего буфера
можно уменьшить до 50 мкл.
Отношение объёма элюирующего буфера к исходному объёму частиц оптимально
составляет 5:1 или 4:1.
Предельно допустимо 2:1
27. Поместите пробирку в термостат для элюции и инкубируйте при 60 °C в течение 10­15
минут.
28. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью
собраться и перенесите супернатант, содержащий выделенную ДНК, в новую
пробирку.
Храните полученную ДНК при ­20 °C.
Выделение ДНК из растений на
магнитных частицах
ЗАО "Силекс"
Страница 5 из 8
Упрощённое выделение ДНК из растений.
Внимание! Данный протокол является упрощённым и может не обеспечить требуемого выхода ДНК
при работе с некоторыми типами образцов. В этом случае воспользуйтесь стандартным протоколом.
Мацерация
1. Внесите в пробирку на 1,5 мл подготовленный образец растительной ткани
(некоторые подсказки по улучшению подготовки материала Вы можете найти в
разделе "Сбор, хранение и подготовка растительного материала").
2. Добавьте 500 мкл буфера PlantDNAPrep и частично гомогенизируйте образец.
Полная гомогенизация не требуется, необходимо лишь мацерировать ткань, разбив её
на группы клеток.
3. Центрифугируйте 5 мин при 8000 об./мин и удалите супернатант.
Л и з и с
4. К осадку добавьте 250 мкл буфера PlantLysis и гомогенизируйте образец как можно
более полно.
5. Центрифугируйте 3 мин при 12­16 тыс. об./мин.
6. Отберите 150 мкл супернатанта в чистую пробирку.
7. Добавьте к отобранному супернатанту 100 мкл хлороформа, встряхните на вортексе и
центрифугируйте 3 мин. при 12­16 тыс. об./мин.
8. Перенесите 100 мкл очищенного хлороформом супернатанта в чистую пробирку и
добавьте 120 мкл буфера Start. При отборе супернатанта от хлороформа не
задевайте интерфазу между водной частью и хлороформом.
9. Тщательно перемешайте раствор и
температуре 3 минуты.
оставьте инкубироваться
при
комнатной
Сорбция
10. Подготовьте пробирку со смесью 400 мкл буфера Binding и 20 мкл магнитных частиц
DNA Grade. Тщательно размешайте частицы в буфере.
11. Смешайте раствор, полученный после инкубации с буфером Start, с суспензией
магнитных частиц в буфере Binding.
12. Тщательно перемешайте раствор пипетированием и оставьте при комнатной
температуре на 5 мин.
Отмывка 1 Отмывка 2 Отмывка 3 Финишная
отмывка
13. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью
собраться на стенке пробирки (может потребоваться вплоть до 1 минуты) и удалите
супернатант.
14. Перенесите пробирку в немагнитный штатив. Внесите в пробирку 150 мкл хорошо
перемешанного буфера Wash 1, тщательно перемешайте пипетированием.
15. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью
собраться и удалите супернатант.
16. Перенесите пробирку в немагнитный штатив. Внесите в пробирку 150 мкл хорошо
перемешанного буфера Wash 2, тщательно перемешайте пипетированием.
17. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью
собраться и удалите супернатант.
18. Перенесите пробирку в немагнитный штатив. Внесите в пробирку 300 мкл буфера
Wash 3, тщательно перемешайте пипетированием.
19. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью
собраться и удалите супернатант.
20. Перенесите пробирку в немагнитный штатив. Внесите в пробирку 300 мкл буфера
Final Wash, тщательно перемешайте пипетированием.
21. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью
собраться и удалите супернатант.
22. Поместите пробирку с открытой крышкой в термостат и сушите при 60 °C в течение 10
минут.
Выделение ДНК из растений на
магнитных частицах
ЗАО "Силекс"
Страница 6 из 8
Элюция
23. Внесите в пробирку 100 мкл буфера Elution. Тщательно ресуспендируйте частицы.
Для получения ДНК с более высокой концентрацией объем элюирующего буфера
можно уменьшить до 50 мкл.
Отношение объёма элюирующего буфера к исходному объёму частиц
оптимально составляет 5:1 или 4:1.
Предельно допустимо 2:1
24. Поместите пробирку в термостат для элюции и инкубируйте при 60 °C в течение 10­15
минут.
25. Поместите пробирку в магнитный штатив, дайте частицам время полностью
собраться и перенесите супернатант, содержащий выделенную ДНК, в новую
пробирку.
Храните полученную ДНК при ­20 °C.
5. Проблемы и их решение
Проблема
Низкий выход ДНК
Возможная причина
Решение
A. Состояние образца
1. Исходный материал содержит 1. Возьмите больше исходного материала или проводите
мало клеток.
элюцию в меньшее количество буфера
2. Образец долго хранился в
ненадлежащих условиях или 2. Проведите сбор материала повторно.
подвергался
замораживанию­
оттаиванию.
Б. Образец содержит слишком В начале процедуры выделения проведите обработку
много
танинов
или буфером PlantDNAPrep дважды или трижды.
полисахаридов.
В.
Неполное
высушивание Увеличьте время сушки после удаления буфера Final Wash.
частиц
перед
добавлением
элюирующего буфера
Соотношение
ОП260/ОП280
слишком низкое
ДНК
деградировавшей
Г. Неполный лизис в буфере Перед внесением буфера PlantLysis поместите осадок
клеток на ­20 °C не менее, чем на 20 мин. и затем как
PlantLysis
можно тщательнее гомогенизируйте образец. Если и это
не помогает, необходимо растирание в ступке (бывает
нужно для растений, содержащих много веществ­
криопротекторов).
Д. Избыточный лизис в При обработке в буфере PlantDNAPrep не требуется
буфере PlantDNAPrep
полная гомогенизация образца, т.к. это будет
способствовать
потере
ДНК
с
отбираемым
супернатантом. Нужно только мацерировать ткань
(вызвать разрыв на клетки и группы клеток).
Г. Большой объем буфера Еlution Подберите оптимальный объём буфера, чтобы получить
желаемую концентрацию ДНК.
Примеси белка
1. В каждой процедуре, где используются частицы,
добивайтесь максимально тщательного их суспендирования.
2. Используйте меньшее количество частиц или большее
количество буфера Elution.
выглядит Старый образец, либо образец Проведите
сбор
материала
повторно.
Избегайте
подвергался
замораживанию­ замораживания образца в процесс транспортировки и
оттаиванию
хранения.
Важная информация
При необходимости получить экстра чистую ДНК мы рекомендуем использовать
дополнительный буфер Extra Wash. Буфером Extra Wash нужно провести
процедуру промывки выделяемой ДНК сразу после использования буфера
Wash 2. Также большей чистоте ДНК способствует применение очистки
хлороформом перед связыванием с частицами.
Есть ещё вопросы?
Если у Вас есть вопросы или Вы нуждаетесь в консультации:
телефон:
+7 495 737 4224
+7 495 998 4288
эл. почта:
info@sileks.com
Не оставайтесь наедине со своими вопросами и сомнениями.
Выделение ДНК из растений на
магнитных частицах
ЗАО "Силекс"
Страница 7 из 8
6. Связанные продукты
Буфер ExtraWash
30 мл, кат. номер BEW030
Рекомендуем использование дополнительной отмывки буфером
Extra Wash при необходимости получить экстра чистую ДНК.
Буфером Extra Wash нужно провести процедуру промывки
выделяемой ДНК сразу после использования буфера Wash 2.
Ссылка на раздел на интернет­сайте:
http://www.sileks.com/ru/shortlink/Buffers_MBSiO2
Для быстрого перехода на нужную страницу Вы можете
воспользоваться расположенным рядом QR­кодом.
Магнитные частицы SiO2
1 мл, кат. номер K0170
Ссылка на раздел на интернет­сайте:
http://www.sileks.com/ru/shortlink/MagBeads_SiO2
Для быстрого перехода на нужную страницу Вы можете
воспользоваться расположенным рядом QR­кодом.
Малогабаритный лабораторный миксер LabMix Mini
Способен значительно ускорить процедуру выделения,
полностью заменяя ручное пипетирование в процессе
перемешивания. Существенно снижает расход пластика.
Ссылка на раздел на интернет­сайте:
http://www.sileks.com/ru/shortlink/LabMixMini
Для быстрого перехода на нужную страницу Вы можете
воспользоваться расположенным рядом QR­кодом.
Магнитные штативы для работы с частицами
Магнитные штативы различных конструкций позволяют решать
самые разнообразные научные задачи с использованием
магнитных частиц.
Ссылка на раздел на интернет­сайте:
http://www.sileks.com/ru/shortlink/MagRacks
Для быстрого перехода на нужную страницу Вы можете
воспользоваться расположенным рядом QR­кодом.
Выделение ДНК из растений на
магнитных частицах
ЗАО "Силекс"
Страница 8 из 8