ОсОбеннОсти фОрмирОвания биОлОгиЧесКиХ пленОК

УДК 616.9 - 022.369 : 579.841.11
В.Б. Туркутюков, Э.В. Слабенко, Д.В. Фомин
Особенности формирования
биологических пленок
штаммами P.Aeruginosa
при внутрибольничных пневмониях
Владивостокский государственный медицинский университет;
Институт биологии моря ДВО РАН, г. Владивосток
Резюме
Колонии практически всех видов бактерий демонстрируют способность к клеточной дифференцировке и
многоклеточной организации. Эта способность наиболее
очевидна при формировании многоклеточных структур:
биологических пленок, бактериальных матов, плодовых тел [1, 3, 5, 6]. В организме человека они проходят
стадию колонизации, формируя различные сообщества,
обеспечивающие защиту от проникновения внутрь антибактериальных препаратов [2].
Целью данного исследования стало изучение особенностей формирования биологических пленок (biofilms)
штаммами P.aeruginosa, выделенных от больных с внутрибольничными инфекциями, находившихся в отделениях реанимации и интенсивной терапии.
При прогнозировании развития инфекционного процесса, вызванного P.aeruginosa, оценка экспрессии факторов вирулентности имеет большую ценность, один из
которых — механизм формирования биопленок. В этом исследовании методом электронной микроскопии были изучены особенности формирования биопленок P.aeruginosa у
пациентов с внутрибольничными пневмониями. Характер
и вид биопленок находится в прямой зависимости от степени тяжести инфекционного процесса и исхода болезни.
V.B. Turkutjukov, E.V. Slabenko, D.V. Fomin
Features of Р.aeruginosa biofilm
formation intrahospital pneumonias
Материалы и методы
В работе были исследованы 32 штамма Pseudomonas
aeruginosa, выделенные от больных с черепно-мозговыми
травмами (ЧМТ), находившихся в отделении реанимации
и интенсивной терапии (ОРИТ).
Для оценки этиологической значимости клинических
штаммов P.aeruginosa изучены особенности строения их
биологических пленок. Для этой цели была использована сканирующая электронная микроскопия по Б. Уикли
(1975) [4]. Перед микроскопией препараты высушивались
под давлением от 50 до 70 Bar (40-60 атм.) в СО2 с переходом СО2 из жидкой фазы в газ на установке «Critical
point dryer», марка CPD 030 («BAL-TEC», Германия). Напыление золотом проводилось на установке «AUTO306»
Vladivostok state medical university, Vladivostok Institute
of biology of the sea DVO RSA, Vladivostok
Summary
In predicting development of the infectious process caused
by P.aeruginosa, the estimation of expressiveness of virulence
factors has great value, one of which is the mechanism of biofilm formation. In this research, features of P.aeruginosa biofilm formation at patients with intrahospital pneumonias have
been studied by method of scanning electronic microscopy. The
character and kind of the bio films correlated with the intensity
of the infectious process and outcome of disease.
(«Edwards», Великобритания). Сканирующую электронную микроскопию проводили на микроскопе «Leo430»
(«Leo», Великобритания). Режим съемки: ускоряющее
напряжение 30kV, уровень вакуума 2×10-5 Тоrr (мм рт.
ст.), увеличения ×3000 и ×10000, детектор вторичных
электронов SE1 (основной режим). Фиксирование и обработка изображений на микроскопе производились
встроенной фирменной программой LEO UIF.
Результаты и обсуждение
При проведении исследования было установлено, что
биологические пленки штаммов P.aeruginosa, выделенных
от больных с внутрибольничными пневмониями, имеют
при формировании свои особенности. Так, на рис. 1 видно,
что сама пленка представляет собой несколько слоев микробных клеток, толщиной несколько сотен микрометров,
покрытых общим гликокаликсом — полимером полисахаридной природы и межклеточным матриксом.
Рис. 1. Культура P. aeruginosa, выделенная с трахеостомы. Режим
съемки: ускоряющее напряжение 30kV, уровень вакуума 2×10-5 Тоrr,
увеличение×10000, основной режим
59
Рис. 4. Культура P. aeruginosa, выделенная с трахеостомы 2. Режим
съемки: ускоряющее напряжение 30kV, уровень вакуума 2×10-5 Тоrr,
увеличение ×10000, основной режим
Рис. 2. Культура P. aeruginosa, выделенная с трахеостомы. Режим
съемки: ускоряющее напряжение 30kV, уровень вакуума 2×10-5 Тоrr,
увеличение ×10000, основной режим
Рис. 5. Культура P. aeruginosa, выделенная с трахеостомы. Режим
съемки: ускоряющее напряжение 30kV, уровень вакуума 2×10-5 Тоrr,
увеличение ×10000, основной режим
Рис. 3. Культура P. aeruginosa, выделенная с трахеостомы. Режим
съемки: ускоряющее напряжение 30kV, уровень вакуума 2×10-5 Тоrr,
увеличение ×3000, основной режим
На поверхности биопленки формируются дыхательные поры, означающие, что различные участки имеют
различный кислородный ингредиент (рис. 3). По данным
литературы, сходные градиенты обнаружены для рН и
химических (питательных) веществ [1]. Эти градиенты
обеспечивают физиологическую вариабельность среди
отдельных клеток: в глубине биопленки они растут гораздо медленнее, чем по периферии.
Одним из факторов вирулентности P. aeruginosa является способность к неспецифической и специфической
адгезии, обеспечиваемая пилями, генетическая детерминация (pilA и pilB) которых была обнаружена у исследованных штаммов методом ПЦР нами ранее (рис. 4).
Значительные структурные изменения биологических пленок были обнаружены у штаммов P. aeruginosa,
полученных от больных после интенсивной антибиотикотерапии аминогликозидами, цефалоспоринами и фторхинолами (рис. 5).
Такие штаммы микроорганизмов были выделены у
пациентов с благоприятным исходом внутрибольничной
пневмонии, на 12-15 день пребывания в ОРИТ.
Подавляющее большинство клеток находились в состоянии деградации и характеризовались высокой чувствительностью к воздействию антибиотиков.
Такой вид формирования биологических пленок был
характерен для высоковирулентных штаммов микроорганизмов, вызывавших тяжелое течение внутрибольничных
пневмоний, в трех случаях закончившихся летальным исходом. Клетки располагаются не хаотично, хорошо видна
определенная закономерность в архитектонике, что говорит о скооперированном и координированном управлении.
Присутствие феномена кооперативной чувствительности («quorum sensing») подтверждается выявленными
генетическими детерминантами, генами LasA и LasB у
данных штаммов микроорганизмов. Сливающиеся биологические пленки отображают структурную гетерогенность и меньшую плотность клеток.
Частично на поверхности и в архитектуре биопленки
видны включения внеклеточного полисахарида альгината, что свидетельствует об их выраженной патогенности
(рис. 2), это способствует формированию на поверхности
эпителиальных клеток дыхательных путей биологической пленки, которая обеспечивает защиту штаммов от
воздействия факторов резистентности макроорганизма и
действия антибиотиков.
60
Формирование биологических пленок (biofilms)
штаммами P.aeruginosa, основного возбудителя внутрибольничных пневмоний у пациентов с черепно-мозговой
травмой в ОРИТ, является важным аспектом для развития
легочной патологии. Развитие заболевания происходит
вследствие нарушения одного или нескольких факторов
защиты макроорганизма.
Биологические пленки формируются в организме на
слизистых оболочках с поврежденными анатомическими
барьерами, на имплантируемых устройствах, обусловливая длительную персистенцию возбудителя, а также
обеспечивая им защиту от антибактериальных препаратов. Данные свойства возбудителя также обеспечивают
переход эпидемического процесса в стадию истинного
госпитализма. Характер и структура биологических пленок коррелируют с тяжестью и исходом инфекционного
процесса.
В связи с этим изучение биологических пленок и
генетических систем, регулируемых по принципу кворум-сенсинга («quorum sensing»), должно внести существенный вклад в поиск мер профилактики и защиты от
патогенных микроорганизмов.
Рис. 6. Культура P. aeruginosa, выделенная с трахеостомы. Режим
съемки: ускоряющее напряжение 30kV, уровень вакуума 2×10-5 Тоrr,
увеличение ×10000, основной режим
Для сравнения был взят штамм, полученный с трахеостомы от пациента с ЧМТ на 4 день пребывания в ОРИТ.
По всей видимости, исследуемая культура — эндогенного происхождения. Как видно на фотографии, клетки деформированы, структура их изменена (рис. 6).
Такой вид биологических пленок, как нам кажется,
свидетельствует о фактах воздействия антибактериальных средств во время их существования в макроорганизме, что возможно, если данный пациент получал
антибиотикотерапию до поступления в ОРИТ.
Ли т е р а т у р а
1. Гинцбург А.Л., Ильина Т.С., Романова Ю.М. //
ЖМЭИ. 2003. №5. С. 86-93.
2. Тец В.В., Заславская Н.В. // Журн. микробиол. 2005.
№5. С. 24-26
3. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. // КМАХ. 2005. Т. 7,
№3. С. 271-285.
4. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. / Под ред. В.Ю. Полякова. М.: Мир, 1975. 324 с.
5. Lee Baoleri, Haagensen Janus A.J., Ciofu Oana //
Journal of Clinical Microbiology. 2005. №10. Р. 5247-5255.
6. Lewis Kim. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
2000. Vol. 45, №4. Р. 999-1007.
Выводы
Таким образом, исследованные штаммы Pseudomonas
aeruginosa обладают метаболическим потенциалом и
факторами вирулентности, которые позволяют им существовать в двух формах: подвижной и фиксированной
биологической пленки, обеспечивая, таким образом, развитие инфекционного процесса.
61