Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии
реклама
УДК 512.89(075) ББК 51.1я73 В68 Электронный учебно-методический комплекс по дисциплине «Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии» подготовлен в рамках реализации Программы развития федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет» (СФУ) на 2007–2010 гг. Рецензенты: Красноярский краевой фонд науки; Экспертная комиссия СФУ по подготовке учебно-методических комплексов дисциплин В68 Волова, Т. Г. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии [Электронный ресурс] : лаб. практикум / Т. Г. Волова, Е. И. Шишацкая, П. В. Миронов. – Электрон. дан. (3 Мб). – Красноярск : ИПК СФУ, 2009. – (Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии : УМКД № 1324–2008 / рук. творч. коллектива Т. Г. Волова). – 1 электрон. опт. диск (DVD). – Систем. требования : Intel Pentium (или аналогичный процессор других производителей) 1 ГГц ; 512 Мб оперативной памяти ; 50 Мб свободного дискового пространства ; привод DVD ; операционная система Microsoft Windows XP SP 2 / Vista (32 бит) ; Adobe Reader 7.0 (или аналогичный продукт для чтения файлов формата pdf). ISBN 978-5-7638-1665-5 (комплекса) ISBN 978-5-7638-1772-0 (лабораторного практикума) Номер гос. регистрации в ФГУП НТЦ «Информрегистр» 0320902484 (комплекса) Настоящее издание является частью электронного учебно-методического комплекса по дисциплине «Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии», включающего учебную программу дисциплины, учебное пособие, методические указания по самостоятельной работе, контрольно-измерительные материалы «Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Банк тестовых заданий», наглядное пособие «Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Презентационные материалы». В лабораторном практикуме изложены краткие теоретические сведения, необходимые для подготовки и выполнения лабораторных работ, дано описание технологического и измерительного оборудования, задания и порядок их выполнения, контрольные вопросы. Предназначен для студентов направления подготовки бакалавров 020000.62 «Биология» укрупненной группы 020000 «Естественные науки». © Сибирский федеральный университет, 2009 Рекомендовано к изданию Инновационно-методическим управлением СФУ Редактор М. В. Саблина Разработка и оформление электронного образовательного ресурса: Центр технологий электронного обучения Информационно-телекоммуникационного комплекса СФУ; лаборатория по разработке мультимедийных электронных образовательных ресурсов при КрЦНИТ Содержимое ресурса охраняется законом об авторском праве. Несанкционированное копирование и использование данного продукта запрещается. Встречающиеся названия программного обеспечения, изделий, устройств или систем могут являться зарегистрированными товарными знаками тех или иных фирм. Подп. к использованию 30.11.2009 Объем 3 Мб Красноярск: СФУ, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79 Оглавление ВВЕДЕНИЕ................................................................... 5 МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ, КЛЕТОЧНОЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ» ............................................................. 6 Работа 1.1. Знакомство с классификацией полимерных материалов биомедицинского назначения..................................................................... 6 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКОБИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ ......................... 10 Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов .......................................................................... 10 Работа 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения: прямое компрессионное формование; экструзия ............................... 26 Работа 2.3. Приготовление растворов полимеров. Получение двумерных полимерных матриксов ....................................................... 39 Работа 2.4. Исследование свойств поверхности полимерных матриксов ...................................................................................................... 42 Работа 2.5. Получение трехмерных пористых матриксов в виде губок из композита полимера гидроксимасляной кислоты и коллагена....................................................................................................... 47 Работа 2.6. Определение свойств матриксов: плотности, пористости, влагоемкости ......................................................................... 49 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ ...................... 51 Работа 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины .......................... 51 Работа 3.2. Спектроскопические и термические исследования биополимеров .............................................................................................. 68 Работа 3.3. Рентгенострутурный анализ и ЯМР-спектроскопия биополимеров .............................................................................................. 77 МОДУЛЬ 4. (ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ НЕ ПРЕДУСМОТРЕНЫ) ................................................... 82 Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 3 ОГЛАВЛЕНИЕ МОДУЛЬ 5. (ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ НЕ ПРЕДУСМОТРЕНЫ) ................................................... 82 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ....... 83 Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса ... 83 Работа 6.2. Посуда и питательные среды для работы с клеточными культурами.................................................................................................... 94 Работа 6.3. Пересев клеток. Окраска, подсчет и фотографирование клеток .............................................................................................................. 97 МОДУЛЬ 7. ТЕХНОЛОГИЯ ВЕДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР .................................................................. 104 Работа 7.1. Получение и ведение клеточных культур ....................... 104 Работа 7.2. Субкультивирование клеточных культур ....................... 107 Работа 7.3. Определение интенсивности клеточной пролиферации в ММТ-тесте................................................................................................. 108 МОДУЛЬ 8. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ . 110 Работа 8.1. Техника выделения МСК из костного мозга крыс ........ 112 Работа 8.2. Оценка прикрепления клеток и распределения клеток на материалах с помощью электронного микроскопа (СЭМ) ............... 114 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ......................... 116 Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 4 ВВЕДЕНИЕ Создание экологически чистых материалов с полезными свойствами остается одной из ключевых проблем современности. Наиболее актуален поиск специализированных биосовместимых материалов для сформировавшегося в последние годы нового направления биоматериаловедения – клеточной и тканевой инженерии, связанного с разработкой биоискусственных органов. Цель курса – дать знания о новейших направлениях биотехнологической науки и практики, интегрирующих потенциал биомедицинского материаловедения, клеточных культур и технологий, тканевого инжиниринга, наиболее перспективных технологиях реконструктивной биомедицины. Цикл лабораторных работ, сопровождающий лекционный курс «Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии», направлен на формирование у студентов представлений о возможностях и уровне медицинского материаловедения, методах и потенциале клеточных технологий. Практикум включает следующие разделы: Введение в предмет «Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии»; Полимеры медико-биологического назначения; Методы изучения материалов биомедицинского назначения; Биология клетки в культуре. Культивирование животных клеток; Технология ведения клеточных культур; Новейшие клеточные технологии. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 5 МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ, КЛЕТОЧНОЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ» Цель – дать представление о классификации, многообразии и типах полимерных материалов, применяемых в биомедицинских областях, и требованиях, предъявляемых к ним. Задачи: знакомство с типами полимерных материалов, применяемыми в биомедицине (реконструктивной хирургии, тканевой инженерии, фармакологии); обучение приемам и методам, необходимым для оценки пригодности материалов для биомедицины. Объект: набор полимерных материалов, отраслевые инструктивные материалы, регламентирующие необходимые методы исследования для применения материалов в биомедицине. Работа 1.1. Знакомство с классификацией полимерных материалов биомедицинского назначения Цель работы: приобретение знаний о высокомолекулярных материалах; требованиях, предъявляемых к ним, и методах тестирования. Проблема использования новых материалов в различных областях медицины, помимо фундаментальных вопросов, связанных с изучением взаимодействия материала с тканями организма, представляет большой интерес для практической медицины. Исследования в области материалов медицинского назначения являются одним из актуальных направлений, соответствуют задачам и уровню развития науки, технологий и техники РФ и перечню критических технологий Российской федерации, в котором приоритетным направлением являются «Технологии создания биосовместимых материалов». Эти исследования реализуются на стыке медицины, химии высокомолекулярных соединений, биотехнологии, биофизики, молекулярной и клеточной биологии и включают в себя следующие взаимосвязанные задачи: • разработку новых материалов, методов их модификации и переработки их в специализированные изделия биомедицинского назначения; • изучение механизма взаимодействия биоматериалов с кровью и тканями; • оценку физико-химических и медико-биологических свойств биоматериалов и изделий из них; • экспериментально-клиническое исследование и применение новых Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 6 МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ, КЛЕТОЧНОЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ» Работа 1.1. Знакомство с классификацией полимерных материалов биомедицинского назначения материалов и изделий. Материалы биомедицинского назначения, предназначенные для контакта со средой живого организма, должны обладать комплексом необходимых биологических свойств и физико-механических свойств. Таковыми являются биологическая совместимость на уровне культивируемых клеток, а также тканей макроорганизма; отсутствие токсичности, включая образуемые продукты деградации; материал должен обладать поддерживающей для клеток функцией, способствовать пролиферации и дифференцировке клеток, обеспечивать свободный доступ субстратов и отток продуктов метаболизма. Помимо необходимой механической прочности материал должен подлежать стерилизации общепринятыми методами, обладать устойчивостью к воздействию агрессивных биологических средств и перерабатываться в изделия общепринятыми методами. Перечень материалов, получение которых актуально для развития и совершенствования восстановительной хирургии и трансплантологии, включает разнообразные материалы и композиты с различными функциональными характеристиками и базовыми свойствами. В настоящее время предпринимаются усилия для классификации и создания базы данных по биоматериалам. При этом выделяют материалы для сердечно-сосудистой и тканевой хирургии, урологии, ортопедии и стоматологии, покрытия раневых поверхностей и создания систем доставки лекарственных веществ. В данной работе для формирования представлений о многообразии и необходимых свойствах полимеров биомедицинского назначения в качестве примера дается набор полимерных материалов с описанием их характеристик и потенциальных областей применения. Материалы и оборудование 1. Набор полимерных материалов (полигидроксибутират, полилактид, полигликолид, полиэтилен). 2. Описание физико-химических, санитарно-химических и физикомеханических свойств полимеров. Ход работы 1. Ознакомиться с образцами полимеров, внешним видом и описанием их физико-химических свойств. Полимеры по отношению к воздействию температуры подразделяются на два типа: термоотверждаемые и термопластичные. Термопластичные полимеры могут быть использованы для получения имплантатов различной конфигурации из расплавов путем формования, прессования, экструзии. Термопласты не имеют межмолекулярных связей и, как правило, состоят из линейных полимерных цепей. Термоотверждаемые полимеры полимеризуются, приняв свою окончательную форму и не могут быть переформированы с целью изменения формы в результате нагрева. В зависимости способа получения полимеры классифицируются как: аддитивные полимеры (полимеры, полученные ступенчатой полимери Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 7 МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ, КЛЕТОЧНОЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ» Работа 1.1. Знакомство с классификацией полимерных материалов биомедицинского назначения зацией) и конденсационные полимеры. Аддитивные полимеры (полиэтилен, полиметилметакрилат) синтезируются в реакции присоединения свободного радикала из ненасыщенных мономеров, содержащих двойные углеродноуглеродные связи. Конденсационные полимеры образуются путем совместной реакции двух полимеров, в результате которой выделяется вещество с небольшим молекулярным весом, например вода. Примерами конденсационных полимеров являются полиамиды. Некоторые конденсационные полимеры могут подвергаться гидролизу в организме и разрушаться. Важнейшими характеристиками полимеров служат величина молекулярной массы и степень полимеризуемости. Реакции полимеризации приводят к распределению отрезков цепи в полимере и к распределению молярной массы (Mв). Кристаллические полимеры не могут быть получены на 100 % кристаллическими, они не имеют строго определенной точки плавления (Tпл), и плавятся в некотором диапазоне температур. Кристалличность влияет на многие свойства полимеров – с увеличением кристалличности снижается проницаемость полимера для диффузии жидкостей, так как диффузия малых молекул часто может происходить только через аморфные части. Полигликолид – продукт полимеризации (О-СО-CHR)-n, где R = Н. ПГК высокого молекулярного веса представляют собой твердый кристаллический полимер с температурой плавления порядка 228 °С; температура стеклования составляет 37 °С. Молекулярный вес существенно зависит от условий синтеза и переработки в изделия и может составлять от 2×104 до 1,45×105. ПГА получают посредством полимеризации с раскрытием кольца в присутствии в качестве катализаторов солей металлов. Молярная масса полимера зависит от температуры и концентрации катализатора. Полимер нерастворим в большинстве органических растворителей. Полилактиды – полимеры, которые образованы повторяющимися остатками – (O-CO-CHR)-n, где R = СН3. По химическим, физическим и биологическим свойствам полилактид близок к полигликолиду. ПЛК уступают многим синтетическим полимерам по теплостойкости, при нагревание свыше 50 °C) изделия из него деформируются, и, как следствие этого, не могут быть подвергнуты стерилизации с применением тепловых методов. Полилактид относится к резорбируемым полимерам, для него характерны высокие скорости разрушения в биологических средах. Поэтому время его резорбции in vivo исчисляется небольшим периодом (10–12 суток). Разрушение часто является автокаталитическим. Разрушение толстых участков может происходить быстрее, чем тонких участков из-за накопления молочной кислоты и локализованного низкого рН (3,2–3,4), сопровождающего разрушение внутри толщи полимера. Полиэтилен имеет следующую химическую структуру [-СН2-СН2]n; выпускается в трех модификациях: низкой плотности, высокой плотности и ультравысокого молекулярного веса; гидрофобен и биоинертен; имеет низкий предел текучести. Полиэтилен низкой плотности молекулярной массы 50–200 Да, степень кристалличности 60–65 %. Полиэтилен высокой плотно Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 8 МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ, КЛЕТОЧНОЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ» Работа 1.1. Знакомство с классификацией полимерных материалов биомедицинского назначения сти имеет более высокую степень кристалличности (80 %); применим для создания отдельных типов имплантатов. Полиэтилен ультравысокого молекулярного веса имеет молекулярную массы свыше 106 Да; не поддается формованию и для получения изделий предварительно подвергается спеканию; это частично кристаллический полимер со степенью кристалличности 45–60 %, температура плавления от 85 °С до 125–145 °С. Полиметилметакрилат – биоинертный, твердый и стеклообразный полимер с температурой стеклования около 100 °С; при температуре свыше 110 °С размягчается и переходит в вязкотекучее состояние; легко перерабатывается в различные изделия формированием и литьем под давлением. ПММА – один из наиболее термостойких полимеров: он начинает разлагаться только при температуре свыше 330 °С; обладает высокой прочностью. Полигидроксибутират – линейный полимер гидроксимасляной кислоты, синтезируется микроорганизмами. Полимер имеет широкий диапазон молекулярного веса, от сотен до млн. дальтон; степень кристалличности 70–75 %; температура плавления 170–180 °С; относится к термопластам; разрыв между температурой плавления и деградации составляет 80–100 °С; характеризуется высокими физико-механическими характеристиками; перерабатывается в изделия из растворов, порошков, расплавов, гелей. 2. Заполнить таблицу 1.1. 3. Провести сравнительный анализ температурных свойств, молекулярных весов, степени кристалличности полимеров. 4. Оценить, какой тип полимеров из рассмотренных наиболее пригоден для применения в медицине. Свойства полимерных материалов Таблица 1.1 Образец Температура Температура Степень Молекулярная полимера плавления, °С деградации, °С кристаллличности, % масса, Да Полигидроксибутират Полилактид Полигликолид Полиэтилен Полиметил-метакрилат Вопросы 1. Как велик перечень, полимерных материалов, применяемых в биомедицине? 2. Какими необходимыми свойствами должны обладать высокомолекулярные материалы, применяемые в медицине? 3. Почему полимерные материалы, растворяющиеся в жидкостях, непригодны для биомедицины? 4. Какие физические свойства полимеров позволяют производить их переработку в изделия из расплавов? Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 9 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Цель: освоение методов получения высокоочищенных образцов полимерных материалов, переработки в специализированные изделия в виде двухи трехмерных матриксов и конструкций и изучение их свойств. Задачи: обучение технике экстракции и очистки полимеров, измельчения и стерилизации; ознакомление с принципами современных технологий переработки полимеров в изделия биомедицинского назначения (компрессионное формования полимеров из порошков и расплавов); освоение метода испарения растворителя для получения двумерных матриксов в виде гибких пленок и мембран; освоение методов изучения свойств поверхностей полимерных матриксов; знакомство с методами получения из полимеров плотных и пористых трехмерных матриксов в виде губок. Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов Полимерные материалы, используемые в медицине, должны быть высокой степени чистоты, не содержать токсичных примесей и технологических добавок; поддаваться стерилизации доступными методами без изменения структуры и физико-химических свойств. Природные линейные термопластичные полимеры микробиологического происхождения – полигидроксиалканоаты (ПГА) – отвечают требованиям, предъявляемым в медицинским полимерам, обладают разрушаемостью, высокой биосовместимостью, поддаются переработке в изделия из различных фазовых состояний общепринятыми методами, позволяют получать изделия различной конфигурации с высокими физико-химическими характеристиками. Цель работы: освоение методов экстракции и очистки полимеров (ПГА) из биомассы бактерий до получения гомогенных образцов, не содержащих органических примесей и пригодных для медицинских применений. Определение эффективности экстракции и качества получаемого полимера. Полигидроксиалканоаты имеют широкие перспективы применения Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 10 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов в различных сферах, включая медицину и фармакологию, они становятся в настоящее время лидирующим классом биополимеров для тканевой инженерии и реконструктивной хирургии. Известно свыше 100 различных типов ПГА, которые вследствие различия структуры существенно различаются между собой физико-механическими свойствами и кинетикой биодеструкции. Наиболее изученный из семейства ПГА высококристалличный полимер β-гидроксимасляной кислоты (полигидроксибутират, ПГБ) обладает идеальной биосовместимостью, потому что сам полимер и его дериваты являются естественными продуктами обмена клеток и присутствуют в крови и тканях. Однако реакция клеток и тканей на ПГА, как и другие биоматериалы, зависит не только от химической структуры и базовых свойств материала, но также и от степени чистоты, способов переработки и формы изделий, характеристик поверхности и методов ее обработки. Для биомедицинских исследований нельзя использовать технические образцы полимеров, так как в них могут присутствовать эндотоксины в виде обломков микробных клеток, содержащих липополисахаридные (ЛПС) и другие комплексы, способные вызывать негативные реакции со стороны клеток в системах in vitro и пирогенные реакции in vivo. Бактерии A. eutropha, являющиеся одним из наиболее активно изучаемых продуцентов ПГА, относятся к грам-отрицательным микроорганизма, клеточные стенки которых содержат липополисахаридные эндотоксины. Компонентом липидной составляющей ЛПС грам-отрицательных бактерий является липид А, в состав которых входят гидроксикислоты с длиной цепи от 12 до 18 атомов углерода, а также ряд насыщенных жирных кислот (ЖК). В связи с тем, что спектр ЖК ЛПС достаточно специфичен для отдельных групп бактерий, воздействие эндотоксина на организм может быть разным. В связи с этим процедура экстракции полимера из биомассы бактерийпродуцентов должна быть очень тщательной, обеспечивающий такую степень очистки полимера, при которой исключается наличие в нем продуктов распада бактериальных клеток, клеточных структур и макромолекул. Следует иметь в виду, что процедура экстракции не должна негативно влиять на структуру полимера и не изменять степень полимеризуемости и молекулярного веса материала. В связи с тем, что ПГА растворяются в неполярных растворителях, процедура экстракции полимера сводится к его извлечению из биомассы с использованием растворителей ПГБ; далее экстракт смешивают с другим реагентом (осадителем), в котором полимер не растворяется, т. е. выпадает в осадок. Материалы и оборудование 1. Биомасса бактерий A. eutropha В 5786, полученная с использованием автоматизированной ферментационной системы «Bio-Flo» (New Brunswek, США) с известным содержанием полимера, определенным заранее хроматографическим методом. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 11 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов 2. Набор реагентов: растворители (хлороформ, 1 ,2-дихлорэтан, дихлорметан) и осадители полигидроксибутирата (гексан, дихлорметан, этанол). 3. Высокоскоростная центрифуга Avanti J-26XPI (Beckman Int., США). 4. Лабораторные весы «Adventurer» ™ OH – AR2140, США. 5. Роторный вакуумный испаритель Rotovapor R 2000/250 ( Büchе. Швейцария). 6. Лабораторный вертикальный автоклав Sanyo MLS-3781L, Япония. 7. Вытяжной шкаф LABCONCO (серия 070976143V). 8. Термостат, модель BD-115, BINDER, Германия. 9. Хроматомасс-спектрометр Agilent 5975Inert, Agilent, США. 10. Система гель-проникающей хроматографии «Waters A lliance GPC 2000 Series» (Waters. США) с набором полистериновых стандартов. Характеристика оборудования Для экстракции полимера бактериальную суспензию осаждают до получения пасты с использованием высокоскоростной напольной центрифуги Avanti J-26XPI (Beckman Int., США) с загрузкой до 6 литров, позволяющей вести процесс при 6000 об/мин в условиях пониженной температуры (рис. 1). Рис. 1. Высокоскоростная напольная центрифуга с охлаждением Avanti J-26XPI фирмы «Beckman Coulter Int.S.A.», США Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 12 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов Технические характеристики центрифуги Avanti J-26XPI фирмы «Beckman Coulter Int.S.A.» Размеры в мм – 865×876×711 мм; Максимальная скорость вращения – 26 000 об/мин; Максимальное ускорение – 82 000 g; Максимальная вместимость ротора – 6 л; Контроль скорости: ±10 об/мин; Объем центрифужных пробирок – от 1,5 до 1000 мл; Система охлаждения камеры: экологически безопасный хладогент; Устанавливаемый температурный режим камеры: от –10 °С до 40 °С; Контроль температуры камеры: ±2 °С; Контроль дисбаланса: ±2,5 % при загрузке в противоположные позиции; Тип двигателя: вентильно-индукторный; Программы, устанавливаемые пользователем: 30 программ (двухэтапные); Установка времени: до 180 минут; Динамическое определение ротора: автоматическое; Набор роторов: Ротор на 8 стаканов – 8×50 мл, 26 000 об/мин, 81 770 g; Ротор на 6 пробирок – 6×1000мл, 8 000 об/мин, 15 910 g. Для извлечения полимера из бактериальной пасты используется набор реагентов (растворители и осадители полимеров), в т. ч. ЛВЖ, поэтому все работы выполняются в вытяжном шкафу (рис. 2). Рис. 2. Вытяжной шкаф металлический фирмы LABCONCO, США Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 13 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов Технические характеристики вытяжного шкафа LABCONCO: Комплектация: 2 встроенные тумбы; мойка, люминесцентный светильник. Материал рабочей камеры – нержавеющая сталь. Рабочая поверхность химически устойчива. Диаметр воздуховода, мм: 200. Габаритные размеры, в мм: длина – 1500, ширина – 840, высота – 2400. Рабочие габариты камеры, в мм: длина 1420, ширина – 670, высота – 1400. Оборудование должно быть рассчитано на напряжение в сети 220 В, частоту 50 Гц. Для концентрирования полимерных экстрактов предусмотрен высокопроизводительный роторный испаритель Rotovapor R210/V фирмы «Buchi», Швейцария (рис. 3). Испаритель позволяет проводить операции по упариванию растворов термолабильных веществ в органических и водных растворителях в условиях, предотвращающих их разложение, в том числе в вакууме с возможностью автоматической регулировки уровня вакуума, подачи инертных газов в систему, улавливания растворителей и работы без использования ловушек жидкого азота, а также проведение сопутствующих операций, включая сушку твердых веществ, перекристаллизации и т. п. Рис. 3. Роторный испаритель Rotovapor R210/V фирмы «Buchi», Швейцария Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 14 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов Технические характеристики роторного испарителя Rotovapor R210/V: Испаритель включает следующие функциональные блоки: 1) электроподъемник в комплекте с вертикальным холодильником с испарительной колбой 1 л, приемной 1 л, нагревательной баней В-491 (возможность использовать отгонные колбы до 4 литров), шланг для подвода охлаждающей воды и подставку для колбы; 2) Вакуумный насос с автоматическим контроллером-регулятором вакуума, защитной ловушкой насоса и ловушкой остаточных паров за насосом. Обеспечивает возможность использования отгонных колб объемами от 50 мл до 4 литров с весом колбы с растворителем до 3 кг; запитки отгонной колбы без остановки операции отгонки; оборудован электромеханическим подъемником отгонной колбы. Скорость вращения отгонной колбы регулируется от 0 до 280 оборотов в минуту. Нагревательная баня с цифровым дисплеем индикации заданной и реальной температуры с регуляцией температуры в пределах от комнатной до 180 °С. Вакуумное уплотнение, устойчивое к органическим растворителям и агрессивным средам. Наличие инертного к агрессивным средам и растворителям безмасляного вакуумного насоса обеспечивает производительность до 30 л в минуту и вакуум до 7 мм рт. ст. Наличие вакуумного контроллера обеспечивает задание вакуума в мм рт. ст. или мбарах, автоматическое поддерживание заданного вакуума в вакуумируемой системе, индикацию заданного и реального вакуума. Источник питания: напряжение в сети 220 В, частота 50 Гц. Вакуумный десикатор для высушивания и хранения образцов, чувствительных к влаге фирмы LABCONCO, США (рис. 4). Рис. 4. Вакуумный десикатор LABCONCO Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 15 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов Технические характеристики вакуумного десикатора LABCONCO: Объем камеры: 28 л; Размер камеры, в см: 30,5×30,5×30,5 см; Материал корпуса: прочное стекловолокно; Камера оборудована 2 съемными перфорированными алюминиевыми полками с диаметром отверстий – 22 мм для размещения различных образцов, имеется возможность варьировать уровнем установки полок. Дверца оборудована закаленным стеклом толщиной 9,5 мм, надежным замком и герметичным уплотнением; Для вакуумирования и заполнения камеры инертным газом предусмотрен игольчатый клапан, набор вакуумных шлагов и аксессуаров для монтажа Имеется тальной лоток для заполнения осушителем; В комплекте: диафрагменный вакуумный насос с производительностью 35 л/мин. Общие габариты: в см, 43,2×34,3×39. Хроматомасс-спектрометр Agilent 5975Inert (Agilent, США) используется для определения структуры и содержания полимеров, а также других биологически активных веществ в биомассе микроорганизмов (рис. 5). Рис. 5. Хроматомасс спектрометр Agilent 5975 Inert Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 16 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов В модели Agilent 5975 Inert оптимизирована процедура настройки режима химической ионизации: поток газов-реактантов управляется электронными регуляторами, и настройка их оптимальных значений осуществляется в автоматическом режиме практически без участия оператора. Применение технологии QuickSwap дает возможность экспрессно производить замену аналитической хроматографической колонки без выключения хроматомассспектрометра, проводить обратную продувку колонки для удаления тяжелых компонентов. Используя функцию eMethod, оператор может загружать аналитические методы, разработанные компанией Agilent для анализа тех или иных групп химических соединений непосредственно с интернет-сайта www.agilent.com. Программа выявления индивидуальных спектров позволяет находить и идентифицировать целевые соединения в сложных матрицах, даже в случаях, когда эти вещества не имеют выраженного хроматографического пика. Технические характеристики хроматомасс спектрометра Agilent 5975 Inert: В стандартный комплект входят программы автоматической настройки, программы сбора и обработки данных, включая библиотечный поиск массспектров и распечатки отчетов о различных форматах. Имеется комплект стандартных диагностических программ. Дополнительно включены библиотеки масс-спектров NIST-05 (190 825 соединений) со структурными формулами, WiLey (621 600 соединений). Технические характеристики масс-селективного детектора: диапазон масс – 1,6–1050 а.е.м., параметры могут быть выбраны внутри этого диапазона; максимальная скорость сканирования составляет 10 000 а.е.м./сек. Чувствительность при ионизации электронным ударом, режим сканирования: 1 пикограмм октафторнафталина при введении в 1 мкл изооктана и использовании стандартной колонки HP-5MS 0,25 мм×30 м×0,25 мкм. Позволяет получать отношение сигнал/шум до 200:1 на отдельной хроматограмме по массе m/z 272. Чувствительность при ионизации электронным ударом, режим регистрации отдельных ионов – 20 фемтограмм октафторнафталина при введении в 1 мкл изооктана и использовании стандартной колонки HP-5MS 0 ,25 мм×30 м×0,25 мкм дают отношение сигнал/шум не хуже 50:1 на отдельной хроматограмме по массе m/z 272. Система Agilent 6890/5975 Inert работает при объемной скорости потока газаносителя (гелия или водорода) до 2 мл/мин при использовании стандартного турбомолекулярного насоса, до 4 мл/мин при использовании высокоэффективного турбомолекулярного насоса (262 л/сек) и колонок с внутренним диаметром 0,32 мм. Лабораторные весы «Adventurer»™ OH–AR2140,США предусмотрены для взвешивания образцов полимеров и различных веществ (рис. 6). Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 17 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов Рис. 6. Лабораторные весы «Adventurer»™ OH–AR2140 Технические характеристики лабораторных весов «Adventurer» ™ OH – AR2140: предусмотрено наличие автоматической внутренней калибровки двумя встроенными грузами или внешней калибровки; имеется возможность калибровки пипеток; предел взвешивания 81/210 г; точность 0,01/0,1 мг; время стабилизации 12/5 с; возможность счета штук; возможность взвешивания брутто/нетто; наличие автоматического обнуления и тарирования; наличие автоматической калибровки при изменении температуры внешней среды; возможность взвешивания в процентах; возможность измерения плотности образца с помощью встроенной программы; наличие калибровочных грузов; наличие набора для определения плотности; размер чашки весов 90 мм; размеры 20×30×45,7 см. Для высушивания биологических образцов до постоянного веса предусмотрен термостат фирмы SANYO, Япония и сухожарочный шкаф Binder GmbH, Германия (рис. 7). Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 18 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов Рис. 7. Термостат SANYO Технические характеристики термостата SANYO: объем камеры не менее 100 л; диапазон температур от +10 ºC до 70 ºC; точность ±0,1 ºC (при 40 ºC); равномерность ±0,4 ºC (при 40 ºC); время нагрева – 45 минут до 40 ºC; контроллер температуры – цифровой PID с автонастройкой; внутренне покрытие – нержавеющая сталь, толщина 0,8; внешнее покрытие – сталь, толщина 0,8; полки из нержавеющей стали, полированные; изоляционный материал – огнеупорный полистирол (20/10 мм); дверное уплотнение – высокий температурный сорт пенистого каучукового силикона; окно обзора – небьющееся стекло; таймер – установка времени включения/выключения (максимум – 99 ч 59 мин, минимум – 1 мин), сетевой предохранитель – 2,1 А, нагревательный элемент – 500 Вт, напряжение 220 В, 60 Гц; размеры внутренние: в мм, 480×410×520; размеры внешние 675×605×855. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 19 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов Рис. 8. Сухожарочный шкаф Binder GmbH Технические характеристики сухожарочного шкафа Binder GmbH (рис. 8): диапазон стабилизации температуры от 40 до 250 ºC (200 ºC); наличие системы вынужденной циркуляции воздуха, обеспечивающей однородную температуру во всех точках камеры в диапазоне ±2,5 ºC (при 200 ºC); микропроцессорный контроль; возможность программирования до 3 температурных циклов; цифровой дисплей; материал внутренних поверхностей – нержавеющая сталь; мультифункциональный таймер, рассчитанный на 99 ч 59 мин; наличие функции автоматического старта и остановки; объем 90 л; 2 полки; внутренние размеры: в см, 45×47,5×45; внешние – 58×59,5×82. Стационарный pH-метр фирмы Sartorius, Meter, Германия предназначен для измерения pH, окислительно-восстановительного потенциала и температуры (рис. 9). Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 20 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов Рис. 9. Стационарный pH-метр Sartorius Технические характеристики рН-метра Sartorius: рН-метр укомплектован сетевым адаптером (блока питания), позволяющим работать от сети переменного тока; имеется автоматическая компенсация температуры от –5 °С до 105 °С. Калибровка до 5 буферов с определением 10. Сохранение до 200 результатов; выбор диапазона разрешения; pH: от –2 до 18 с точностью до 0,01; mV: ± 1999,9 с точностью до 0,01; температура от –5 до 105 с точностью до 0,3. Электрод пригоден для использования в жидкостях; диапазон pH от 0 до 14; сенсор температуры; диапазон температуры от 0 до 80 °С; размеры – диаметр 12×120 мм. Прилагаются pH буферные растворы объемом 250 мл каждый: ±0,02 pH 4.00 при 20 °С, 4,01 при 25 °С; ± 0,02 pH 7,02 при 20 °С, 7,001 при 25 °С; ±0,02 pH 9,23 при 20 °С, 9,18 при 25 °С. Имеется универсальный штатив, поддерживающий до 4-х сенсоров или электродов; стакан и жидкости для хранения электрода. Для измерения молекулярной массы образцов полимеров предусмотрен хроматограф для гель-проникающей хроматографии Waters Breeze System, фирмы Waters, США (рис. 10). Метод основан на разделении молекул веществ по размеру при прохождении через слой пористого носителя за счет их разной способности проникать в поры. Более крупные молекулы способны проникать в меньшее число пор носителя и выходят первыми. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 21 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов Рис. 10. Хроматограф для гель-проникающей хроматографии Waters Breeze System Технические характеристики хроматографа Waters Breeze System Хроматограф включает изократический насос Waters 1515 с нагревателем колонок, инжектор Reodyne 7725i, рефрактометрический детектор Waters 2414. Используются колонки: Styragel HR4E и Styragel HR5. Управление хроматографом осуществляется с персонального компьютера с программным обеспечением Breeze для Windows. Ход работы 1. Навески сырой биомассы бактерий с известным содержанием полимера (не менее 70–80 %) (по 1–2 г) поместить в колбы с притертыми пробками. Подписать колбы следующим образом: № 1, № 2, № 3 и т. д. В качестве экстрагентов полимера использовать предложенный набор растворителей (хлороформ, 1,2-дихлорэтан, дихлорметан); залить в колбы по 10–15 объемов растворителей по отношению к взятому объему полимера. 2. Колбы разместить в аппарате для встряхивания жидкостей на 1 ч. 3. Слить образованные экстракты полимера в чистые стеклянные конические колбы со шлифами, помеченные аналогично п. 1. 4. С использованием роторного испарителя отогнать растворители; полученные осадки полимера перенести на фильтровальную бумагу и досушить в термостате при 40 °С в течение 10–15 минут. 5. Произвести взвешивание полученных образцов полимера и определить полноту экстракции, которая выражается в % от исходного количества полимера, содержащегося в образце биомассы. Пример: пусть содержание полимера в биомассе составляет 80 %. Если было взято 2 г биомассы, то содержание полимера в ней составляло 1,6 г. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 22 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов Принимаем это количество за 100 % и определяем полноту экстракции полимера по формуле: 1,6 г : 100 % = полученная масса полимера: Х %, где Х – полнота экстракции, %. Например, выделено их взятой навески биомассы 1,0 г полимера, тогда полнота экстракции составляет 1,6 : 100 %= 1,0: Х %, т. е. 62,5 %. Полученные результаты внести в таблицу 2.1. Таблица 2.1 Результаты выделения и очистки полимера из биомассы R.eutropha B 5786 разными способами Номер Способ экстракции Масса Полнота Молекулярный Сумма жирных образца (экстрагентосадитель) ПГБ, г экстракции, % вес ПГБ, Мв, кДa кислот, мол. % Хлороформ, осажде1 ние гексаном 1,2-дихлорэтан, оса2 ждение диэтиловым эфиром Дихлорметан, осажде3 ние диетиловым эфиром 1,2-дихлорэтан : эта4 нол (60 : 40 по объему), осаждение этанолом 6. Получить метиловые эфиры мономеров гидроксимасляной кислоты, образующих полимер. Для этого к навескам образцов ПГБ (4–5 мг) долить метилирующую смесь (метанол : серная килсота). 7. Химическую чистоту метиловых эфиров гидроксимасляной кислоты определить с использованием газо-хроматографического анализа с последующей идентификацией масс-спектров. Если в полимере отсутствуют примеси липидной природы, а именно, другие жирные кислоты, в том числе длинноцепочечные, помимо гидроксимасляной, на полученных хроматограммах будут содержаться только пики, соответствующие времени выхода гидроксибутирата (на рис. 11 приведена в качестве примера хроматограмма химически чистого образца полигидроксибутирата), а на рис. 12 – хроматограмма образца ПГБ, загрязненного примесями жирных кислот с длиной С-цепи свыше С4). Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 23 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов Рис. 11. Хроматограмма высокоочищенного образца сополимерного ПГА (ПГБ/ПГВ), образованного мономерами С4 : С5 = 75,09 : 24,91 мол. %, не содержащего микропримесей посторонних ЖК (спектр Е. И. Шишацкой) Рис. 12. Хроматограмма образца сополимерного ПГА (ПГБ/ПГВ), образованного мономерами С4 : С5 = 73,87 : 23,84 мол. %, содержащего 2,29 мол. % примесей посторонних ЖК с длиной С-цепи С6–С18 (спектр Е. И. Шишацкой) 8. Проанализировать полученные хроматограммы образцов метиловых эфиров ЖК полимера, провести идентификацию состава ЖК с использованием базы данных масс-спектров. По величине пиков на хроматограмме рассчитать величину фракций ЖК. Содержания ЖК в образце полимера определяют по соотношению площадей пиков внутреннего стандарта (0,5 мг бензойной кислоты) и мономера – гидроксибутирата, вводя коэффициент пересчета. Коэффициент пересчета (К) получают из хроматограммы чистого полимера. Обычно он колеблется от 5,85 до 6,3. Пример: если А – площадь пика внутреннего стандарта, Б – площадь Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 24 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов пика мономера гидроксимасляной кислоты, составляем пропорцию: А – 0,5 мг; Б – В мг, тогда В = К · Б · 0,5 / А мг ЖК в образце (Н). Находим содержание ЖК в мол. % к сухому веществу из пропорции: В–Х% Н – 100 %, тогда Х % = В · 100 / Н. 9. Полученные результаты состава метиловых эфиров ЖК полимера внести в табл. 2.2. Если в образцах полимера будут присутствовать примеси ЖК, определить их суммарное содержание и внести в табл. 2.1. Таблица 2.2 Наличие и состав жирных кислот, присутствующих в образцах полимера, полученных с применением различных методов экстракции Жирные кислоты * β-OH-4:0** β-OH-5:0 β-OH-6:0 12:0 13:0 14:0 14:1 15:0 16:0 16:1 ω9*** 17:0 17:1 с-17:0**** β-ОН-12:0 2-ОН-14:0 18:0 18:1 ω7 с-19:0 β-ОН-14:0 β-ОН-16:0 β-ОН-18:0 ЖК образцов ПГБ, полученных с применением различных методов экстракции 1 2 3 4 * – первая цифра обозначает количество атомов углерода; вторая – количество двойных связей; ** – гидроксикислоты с ОН-группой в β-положении; *** – указано положение двойных связей от метильного конца; **** – циклопропановые кислоты. 10. Для определения молекулярного веса образцов ПГБ взять 2–3 мг полимеров, растворить в хлороформе и произвести хроматографирование с использованием системы CGP относительно полистериновых стандартов Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 25 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.1. Получение высокоочищенных полимеров; измельчение и стерилизация образцов известного молекулярного веса. Результаты внести в табл. 2.1. 11. Оставшиеся количества образцов полимера измельчить с использованием бытовой кофемолки (или фарфоровой ступки), поместить в пластиковые пробирки Eppendorf объемом 2 мл и проавтоклавировать при давлении 1 атм и 120 °С в течение 45 минут. В результаты выполнения работы будут получены образцы полимера с использованием различных реагентов, определена полнота экстракции полимера, степень химической чистоты и молекулярный вес. Необходимо сопоставить полученные образцы полимера и определить степень пригодности их для медицины. Вопросы 1. На каком принципе базируются способы экстракции полимеров гидроксимасляной кислоты (ПГА) из биомассы бактерий-продуцента? 2. Почему необходимо определять наличие (или доказывать отсутствие) в образцах ПГА микропримесей длинноцепочеченых ЖК? 3. Чем важен показатель Мв при получение образцов полимерных материалов, предназначенных для изготовления биомедицинских изделий и конструкций? 4. Почему возможность применения стандартных методов стерилизации (например, автоклавирования) важна для полимерных материалов биомедицинского назначения? Работа 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения: прямое компрессионное формование; экструзия Цель работы: обучение технике переработки полимера (на примере ПГА) в специализированные изделия из различных фазовых состояний (порошков и расплавов). Из полигидроксиалканоатов возможно получение широкого спектра изделий различных типов, используемых в медицине (пленок, мембран, волокон, пористых матриксов, микрочастиц) различными способами, в том числе из образцов полимеров, находящихся в различных фазовых состояниях. ПГА можно перерабатывать из расплавов, а также холодным прессованием, поливом из растворов, гель-технологией и др. Наличие выраженного диапазона между температурой начала плавления (150–160 °С) и температурой начала разложения (Тразл) (260–280 °С) является существенно важным технологическим свойством полиоксиалканоатов, так как делает возможным получение из них различных изделий общепринятыми термическими методами переработки полимерных материалов. В процессе переработки ПГА из расплавов могут иметь место пробле Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 26 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения мы из-за относительной близости (80–100 °С) их температуры плавления и температуры деградации. Для исправления ситуации используют различные подходы: применяют пластификаторы и другие агенты, влияющие на процесс кристаллизации полимера, привлекают физические и химические методы для модификации структуры полимеров, а также получают смеси и композиты с использованием различных соединений. Известно, что скорость при первичной нуклеации ПГА может быть сопоставима с таковой у полипропилена и нейлона, и это позволяет получать изделия хорошего качества. Применение мономерных полимерных пластификаторов при переработке полиоксиалканоатов позволяют улучшить свойства полимеров и изделий в результате инициации вторичной кристаллизации. Пластификаторы, оказывая влияние на реологические свойства расплавов полимеров, позволяют в отдельных случаях облегчить процедуру переработки расплавов. В качестве пластификаторов могут быть использованы: 1) высококипящие эфиры ряда основных кислот (фталаты, изофталаты, цитраты, фумараты, глютамат, фосфаты или фосфиты); 2) высококипящие эфиры полиоксиспиртов, особенно гликоля, полигликоля и глицерина; 3) ароматические сульфонамиды. Для получения достаточно прочных, не слишком хрупких частиц полимеров, например ПГБ, достаточно применение данных пластификаторов в количестве 6–12 % (вес/к весу). Одним из ключевых свойств термопластичных полимеров, в том числе ПГА, являются реологические характеристики расплавов, прежде всего вязкость при удлинении (extensional viscosity), толщина при удлинении и увеличение вязкости при удлинении (или текучести). Эти характеристики важны для стабилизации полимеров в процессах их переработки, включая такие процессы, как вытягивание из расплава (выдувание пленок, вытягивание и скручивание волокон, покрытие расплавами и т. п.). Реологические характеристики расплавов ПГА существенно зависят от параметров обработки. По мере снижения вязкости расплава сополимера значительно увеличивается скорость обрыва (shear thinning). Увеличение молекулярного веса полимера ведет к возрастанию сдвиговой вязкости (shear viscosity) и вязкости при удлинении (extensional viscosity). Влияние молекулярного веса, как установлено, более значительно на величину extensional viscosity, чем на shear viscosity. Прочность расплава может быть повышена ветвлением линейных полимеров. Разветвленные композиты ПГА могут быть получены путем введения реагентов в ходе экструзии полимера, когда температура экструзии и время реакции достаточно для плавления ПГА и выше температуры разложения 3-радикального индуктора, например, пероксида. Расплавы ПГА пригодны для переработки в изделия в промышленных условиях на стандартном оборудовании в связи с тем, что их точка плавления близка к таковой у широко применяемых термопластов типа полиэтилена и полипропилена. Установлена также применимость ряда традиционных технологических процессов для переработки расплавов ПГА, включая экструзию, литье под давлением, литье с раздувом, термопереработку, ориенти- Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 27 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения рованное и неориентированное литье или выдувку пленок, моно- и мультифиламетное прядение волокон, вспенивание и покрытие. Твердофазная экструзия сополимерных ПГА, имеющих более низкую температуру плавления по сравнению с ПГБ, возможна ниже температуры плавления материала (135–150 °С) в зависимости от содержания гидроксивалерата в сополимере. Полученные таким образом образцы изделий, однако, не обладали выраженной ориентацией полимерной цепи по направлению экструзии. Повышение температуры экструзии, близкое к температуре плавления, улучшает качество изделий, в частности, их механическую прочность. Литье под давлением применимо для расплавов ПГА на оборудовании для полиэтилена с фильерами, имеющими соотношение длины к диаметру у форсунок 20/1. Следует, однако, учитывать время пребывания расплава в плавильной емкости с целью предотвращения термической деградации материала. Оптимальная температура процесса литья для быстрой кристаллизации полимера при минимальном времени цикла составляет 60 °С. Процесс переработки ПГА экструзионным литьем под давлением с поддувом возможен на аппаратах с одной или нескольким насадками, оборудованными фильерами для переработки полиэтилена и соотношением длины к диаметру 24/1. Данный процесс минимизирует брак в ходе переработки ПГА. Более доступным, но не менее востребованным является способ переработки ПГА из твердофазного состояния в изделия прямым холодным прессованием. Этот метод вызывает большой интерес в настоящее время в связи с возможностью использования ПГА для получения прочных, биодеградируемых и биоактивных конструкций и имплантатов для реконструкции дефектов костных тканей. Показано, что ПГА, главным образом полигидроксибутират и сополимеры гидроксибутирата с гидроксивалератом, образуют биосовместимые композиты с различными типами гидроксиапатитов (ГАП), а добавление гидроксиапатита улучшает остеоинтегративные свойства ПГА и взаимодействие с тканями, так как физико-механические характеристики данных композитов близки костным тканям конечностей и могут быть использованы для изготовления сложных костных протезов, включая моделирование губчато-кортикальных конструкций. Остеобласты при контакте с таким гибридным материалом, проникая в пористую структуру композита, лучше закрепляются в ней и нормально пролиферируют. По мере деградации ПГА и формирования пор в матриксе композита скорость биодеградации последнего возрастает и гибридный имплантат постепенно замещается вновь образованной костной тканью. Конструкции из ПГА и композитов ПГА с наполнителями и керамиками (волластонитом, гидроксиапатитом и др.) в силу своих хороших механико-физических свойств и биодеградабельности активно исследуется в связи с перспективами применения в медицине для восстановления дефектов повреждений костей. Помимо повышения пористости, добавление волластонита или гидроксиапатита усиливает гидрофильность ПГА, делая его более пригодным для пролиферации остеобластических кле- Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 28 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения ток. Добавление к ПГА или композитам ПГА с керамиками водорастворимых наполнителей типа сахарозы или хлорида натрия позволяет получать пористые конструкции высокого качества. Материалы и оборудование 1. Образцы ПГА, полученные на опытном производстве полимеров. 2. Весы «Adventurer» ™ OH – AR2140 – USA. 3. Фарфоровая ступка, шпатель, лабораторная посуда. 4. Гидроксиапатит биологический, хлорид натрия, сахароза. 5. Автоматический лабораторный пресс Сalver 3887/4SDOBOI (США). 6. Лабораторный мини-экструдер Brabender® E 19/25 D (Германия). 7. Термостат BD-115, BINDER (Германия). 8. Лабораторная система PDS 2010 Labcoter™ для нанесения полимерных покрытий и влагозащиты фирмы «Labcoater» (США). 9. Ультразвуковой гомогенизатор Sonicator 3000 фирмы Misonix Incor, США. 10. Электрическая верхнеприводная мешалка Heidolph. 11. Универсальная электромеханическая испытательная машина Инстрон 5565, 5KN фирмы Instron, Великобритания. 12. Термоупаковочная машины NS 1000 фирмы «Howo Gmby» (Германия). 13. Устройство для автоматической стерилизации медицинских изделий с использованием низкотемпературных плазменных технологий стерилизацией перекисью водорода при температуре от +50 до +55 °C Sterrad NX фирмы Johnson& Johnson, США. Характеристика оборудования Для переработки полимеров из твердофазного состояния в изделия прямым холодным прессованием используется 25-тонный автоматический электрический настольный пресс Calver 3887/4SDOBOI, США (рис. 13). Технические характеристики автоматического пресса Calver 3887/4SDOBOI Автоматический электрический настольный пресс снабжен встроенной гидравлической системой и микропроцессорным контролем операций в комплекте с пресс-формой и вакуумным насосом. Максимальное давление – не менее 25 т. Размер рабочих (зажимных) поверхностей, диаметр в мм: 127. Материал зажимных поверхностей: нержавеющая сталь. Высота пресса – 1016 мм. Расстояние между зажимными пластинами, в мм, от 38,1 до 184,1. Размеры пресс-формы, в мм, 508, 812,8. Имеется система цифрового контроля процесса прессования, включающая в себя программирование показателей давления, скорости его нагнетания и продолжительности, количество циклов прессования, индикацию Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 29 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения фазы процесса, автоматическое открывание защитной панели при завершении программы. Пресс оборудован микропроцессорной сенсорной панелью для ввода параметров процесса. Система безопасности включает: защитный чехол с прозрачной передней панелью, закрывающийся при помощи одновременного нажатия обеих закрывающих кнопок, клапан безопасности давления, ограничитель давления, плавкий предохранитель; пресс-формы из нержавеющей стали, соединяемые с вакуумным насосом, диаметром 6, 12, 25, 31 и 40 мм; вес пресса – 148 кг; источник питания: 230 В, 50 Гц. Для переработки полимеров из расплава предусмотрен лабораторный мини-экструдер Brabender® 19/25 D, Германия (рис. 14). Рис. 13. Автоматизированный лабораторный пресс «Calver 3887/4SDOBOI» Технические характеристики лабораторного мини-экструдера Brabender® 19/25 D: Экструдер включает одношнековую перерабатывающую часть, привод, контроллер температуры и скорости, шнек для измерительного экструдера, суппорт на роликах, преобразователь давления, термопару, компьютер с программным обеспечением и картой связи. Электропотребление: 3 · 400 В/AC + N + PE, 50/60 Гц, 32 A. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 30 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения Оснащен технологией CAN-open bus. Модель состоит из следующих основных частей: одношнековая перерабатывающая часть, привод контролирования температуры и скорости: цилиндр: ∅ 19 мм, L = 25 D, нагрев: 1 нагревательная- и 2 нагревательно-охладительные зоны, каждая 1,300 Вт; электрический нагрев и воздушное охлаждение; зона питания: цилиндрическая секция питания, водяное охлаждение; измерение: гнезда: 2,5×20 UNF на цилиндре; бункер: объем приблизительно 3 л, передвигаемый на три позиции: заполнение, остановка и разгрузка бункера; максимальное давление: 700 бар; привод: 1,5 кВт, инвертный двигатель максимальный крутящий момент: 150 Нм4, диапазон скоростей: 2– 150 об/мин; допускаемое давление: 700 бар; температура до 450 °C. Размеры экструдера, в мм: 960×700×825. Источник питания: 230 В, 50/60 Гц, 2 А. Рис. 14. Лабораторный мини-экструдер Brabender® 19/25 D, Германия Для работы с полимерными растворами и микронизации полимерной субстанции предусмотрены ультразвуковой гомогенизатор Sonicator 3000 фирмы Misonix Incor (рис. 15), США и электрическая верхнеприводная мешалка Heidolph (рис. 16). Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 31 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения Рис. 15. УЗ – гомогенизатор Sonicator 3000 фирмы Misonix Incor Рис. 16. Электрические верхнеприводные мешалки Heidolph Технические характеристики Sonicator 3000 Misonix Incorporated Высокочастотный УЗ-гомогенизатор с пьезоэлектрическим преобразователем; обеспечивает контроль амплитуды. В комплекте: проточная ячейка; загрузочная ячейка; наличие крышки для ячейки (экспоненциальный зонд); Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 32 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения наличие крышки для 20 и 50 мл пробирок (для 9,5мм зонда); наличие крышки для ячейки (9,5 мм зонд); возможность работы с объемами образцов проб от 2 мл до 100 мл; наличие таймера; наличие звуконепроницаемой камеры с прозрачной дверью; наличие титанового зонда 9,5 мм наконечника. Технические характеристики электрической верхнеприводной мешалки Heidolph Количество редукторов – 2; Управление аналоговое; Скоростной диапазон 1: от 35 до 250 оборотов в минуту; Скоростной диапазон 2: от 280 до 2200 оборотов в минуту; Выходная мощность: 18 Вт; Высокий крутящий момент до 100 Нсм; Вязкость до 40000 мПс; Защита от перегрева; Кулачковый патрон для зажима вала до 8,5 мм; класс защиты IP 20; Размер лопастей – 50×12 мм; Материал – нержавеющая сталь AISI 304; Длина – 400 мм. Лабораторная система PDS 2010 Labcoter™ для нанесения полимерных покрытий и влагозащиты фирмы Labcoater США показана на рис. 17. Рис. 17. Система нанесения полимерных покрытий и влагозащиты PDS 2010 Labcoter™ Технические характеристики системы нанесения полимерных покрытий влагозащиты PDS 2010 Labcoater™: Система включает функциональные блоки: автоматический контроллер Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 33 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения покрытия, программируемый цифровой дискретный контроллер температуры для зон разогрева, базовую охлаждающую приставку, вакуумную помпу направленного действия (5,7 CFM); термозащитную систему двери; ротационный фиксатор, адаптированный для системы автораспыления, камеру из нержавеющей стали со съемной крышкой. Вакуумная помпа направленного действия: (5,7 CFM), привод 50 Гц/ 10 CFM. Цифровая охлаждающая приставка. Камера из нержавеющей стали со съемной крышкой с ручками и набивкой буны, объем 21 л. Фиксатор, кассета 1/2 ширины лавсановой пленки и кассета 1 ширины лавсановой пленки; микрораспылитель с комплектом насадок: насадка на 1 OD; насадка на 2 OD; ручная насадка, до 36; насадка до 24; режущее лезвие. Внешние размеры в мм: 490×121,9×60,9. Внутренние размеры, в мм: 305×305. Источник питания: напряжение в сети 220 В, 1 фаза, частота 50 Гц, 15 А. Для измерения физико-механических характеристик разрабатываемых полимерных изделий используется универсальная электромеханическая испытательная машина Инстрон 5565, 5KN фирмы Instron, Великобритания (рис. 18). Рис. 18. Универсальная электромеханическая разрывная машина Инстрон 5565, 5KN фирмы Instron, Великобритания Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 34 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения Технические характеристики универсальной электромеханической разрывной машины Инстрон 5565, 5KN Комплектация включает одну зону испытаний: высота до 1122 мм; ширина рабочей зоны: 420 мм; сдвоенные винтовые предварительно натянутые шаровые пары приводы; хромированные колонны диаметром 45 мм; 32-битная электроника управления и обработки данных с обратной связью; цифровые каналы данных по нагрузке и перемещению; автоматическое распознавание и калибровка подключаемых датчиков; выбор системы измерения для получаемых параметров; высокоточный независимый датчик нагрузки; захваты для образцов, датчик деформации. Управляющая станция, принтер и программное обеспечение. Высокоточный независимый датчик нагрузки (типа «сэндвич»): уровень нагрузки +/– 5кН. Точность измерения нагрузки – 0,4 % от измеряемой величины в диапазоне от 1 % до 100 % номинальной мощности датчика нагрузки – 0,5 % от измеряемой величины в диапазоне от 0,4 % до 100 % номинальной мощности датчика нагрузки. Точность позиционирования 0,05 % от измеряемой величины. Точность измерения скорости – 0,1 % от измеряемой величины. Точность измерения деформации – 0,5 % от измеряемой величины. Управляющий контроллер: 32-битный контроллер с частотой одновременного сбора и обработки данных по всем каналам 500 Гц; Пневматические захваты образцов тисочного типа. Усилие +/– 5кН, температурный диапазон от 0 до 100 °С. Комплект губок для удержания плоских образцов толщиной от 0 до 20 мм и шириной до 25 мм. Качающийся переходник для выравнивания образцов. Панель управления испытаниями на раме машины; Автоматическая электронная система защиты образца и оператора. Датчик деформации: бесконтактный видео-экстенсометр: базовая длина от 10 до 200 мм, диапазон измерений до 200 мм, погрешность измерения 0,5 %, скорость испытаний до 500 мм/мин, испытание образцов в камере, комплект специальных маркеров. Процессор Intel® Pentium® D 925. Гигабитный сетевой контроллер Intel Pro 1000 PT PCIe. Программное обеспечение Office Basic Edition 2003 Win32 Russian. Набор управляющих программ. Источник питания: 230 В, 1 фаза, 50 Гц, 15 А. Для стерильной упаковки образцов полимерных изделий предусмотрена термоупаковочная машина NS 1000 фирмы «Howo Gmby», Германия (рис. 19). Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 35 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения Рис. 19. Термоупаковочная машина NS 1000 Технические характеристики термоупаковочной машины NS 1000 Машина для стерильной упаковки полимерных изделий медицинского назначения включает: печатающее устройство (принтер) – однострочное; с возможностью создания различных форматов дат стерилизации и истечения срока годности, автоматическое обновление; указание номера партии, личного номера упаковщика, обозначения в соответствии со стандартом EN 980, сертификат СЕ с сопроводительным текстом, сохранение текста в памяти, настраиваемая начальная граница области печати, печать с поворотом на 180° (начиная с нижнего края), изменяемые начертание шрифта и межзнаковый интервал, доступ спереди для замены ленты, возможность отключения; граница поля печати, бесступенчатая регулировка, задается в мм. Скорость запаивания – 10 м/мин. Бесступенчатая регулировка ширины полосы запаивания 5–30 мм. Запас расстояния от шва пайки до упаковываемых товаров > 30 мм. Регулировка температуры – микропроцессорная. Температура запаивания 80–220. Погрешность поддержания температуры ± 2 %. Мощность – 500 Вт. Напряжение питания – 230 В / 50 Гц. Габаритные размеры ширина × глубина × высота – не более 620×260×250 мм. В комплекте – СТЕРРАД прозрачные упаковочные пакеты в рулонах 150 мм × 70 м не менее 3 шт. Компактное устройство для автоматической стерилизации медицинских изделий с использованием низкотемпературных плазменных технологий стерилизацией перекисью водорода при температуре от +50 до +55 ° C Sterrad NX фирмы Johnson& Johnson, США (рис. 20). Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 36 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения Рис. 20. Стерилизующая система Sterrad NX фирмы Johnson& Johnson Технические характеристики стерилизующей системы Sterrad NX Температура в стерилизационной камере не выше 55 °С. Система укомплектована датчиком, реагирующим на повышенную влажность внутри стерилизационной камеры для предотвращения коррозии стерилизуемых изделий медицинского назначения. Габариты, в мм: 840×840×560. Ширина двери/угол открытия, 560 мм/100º. Размеры стерилизационной камеры, в мм, 200×610×330, общий объем 40 л, полезный объем стерилизационной камеры 30 л. Размеры полок (2 полки), 610×330 мм. Длительность цикла стерилизации: стандартный цикл 28–30 мин, продленный цикл 38–40 мин. Условия рабочего помещения: температура от +18 до –35 ºС , влажность от 10 % до 85 % до 30 ºС, далее линейное уменьшение от 85 % при 30 ºС до 70 % при 40 ºС без образования конденсата. Источник питания: однофазное питание, 180–264 В переменный ток, 47–63 Гц, 10 А, максимальная мощность 2 кВт. Ход работы 1. Выделенный из бактериальной биомассы хлопьевидно-волокнистый полимер измельчить с использованием кофемолки; смешать с навеской хлорида натрия или гидроксиапатита (для получения однородной массы растереть смесь в агатовой ступке в жидком азоте до получения однородной смеси в виде порошка). Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 37 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.2. Переработка полимерных материалов в специализированные изделия биомедицинского назначения 2. Приготовить навески: а) из порошкообразного полимера (по 200 мг), б) полимера в смеси (1:1 по массе) с хлоридом натрия, в) из композиции ПГА:ГАП (1:1 по массе). 3. С использованием пресс-формы, заполняя ее приготовленными образцами порошков полимера или смесей полимера с солью, композиции полимера с гидроксиапатитом, на автоматическим лабораторном прессе при давлении порядка 120 кгс/см2 спрессовать трехмерные компакты в виде таблетированных форм. 4. Формы, полученные из смеси полимера и хлорида натрия (или сахарозы) поместить в дистиллированную воду и прокипятить в течение 1 ч. Применение данной техники выщелачивания позволяет получить пористые матриксы. 5. Формы, полученные из композиции ПГА/ГАП, в течение 30 мин подвергнуть температурному закаливанию при 105 ºС. 6. Переработку ПГА из расплава в изделия в виде монофиламентных волокон произвести с использованием лабораторного мини-экструдера. 7. Навеску полимера (10 г) поместить в загрузочную камеру одношнекового мини-экструдера с диаметром насадки 1 мм. Температуру экструдата выставить порядка 175–180 ºC, в зоне насадки – 170 ºC. Время нахождения волокон в зоне нагрева при вытягивании не должно превышать 2,5 мин во избежание температурного распада полимера. Полученные образцы изделий в виде плотных и пористых трехмерных матриксов и волокон будут использованы на последующих занятиях для изучения их структуры и свойств. Вопросы 1. Каковы основные требования к переработке полимеров из расплавов? 2. Какие ограничения имеют место при переработке термопластичных полимеров из расплавов? 3. Почему метод холодного компрессионного формования полимерных материалов востребован в настоящее время? 4. Отличия и преимущества методов переработки полимеров из расплавов и порошков. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 38 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.3. Приготовление растворов полимеров. Получение двумерных полимерных матриксов Цель работы: освоить технику получения полимерных пленочных и мембранных матриксов с использованием техники испарения растворителя. Рис. 21. Микрофотография фрагмента полигидроксибутирата, увлажненного хлороформом (фото Т. Г. Воловой) В связи с хорошей растворимостью полигидроксиалканоатов в неполярных растворителях растворы этих полимеров различной плотности и вязкости, обладающие выраженными волоконнообразующими свойствами (рис. 21), пригодны для изготовления двумерных матриксов в виде гибких пленок и пористых мембран, имеющих широкие перспективы применения в клеточных технологиях и реконструктивной хирургии. Из ПГА возможно получение различных типов полимерных пленок и мембран методом полива растворов полимера различной концентрации, от 1–5 до 20 %, на обезжиренную поверхность, например стекол. В зависимости от химического состава полимера, скорости кристаллизации изделия в процессе испарения растворителя получаются пленки, имеющие различную топография и свойства (смачиваемость, пористость, проницаемость для паров воды и жидкостей и т. д.). Методом полива раствора ПГА (гомогенного полигидрокисбутирата и сополимеров гидроксибутирата с гидроксивалератом) различной концентрации (от 1 до 5 %) в хлороформе и дихлорметане на поверхность обезжи Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 39 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.3. Приготовление растворов полимеров. Получение двумерных полимерных матриксов ренных чашек Петри можно получить гибкие прозрачные пленки толщиной от (0,016 ± 0,002) до (0,062 ± 0,008) мм. Показано, что топография поверхности пленок, полученных из полимеров различного состава, имеет некоторые отличия. Более эластичные пленки из менее кристалличного сополимерного материала ПГБ/ПГВ имеют выраженную пористую и ламинарную структуру по сравнению с более кристалличными и плотными пленками из высококристалличного ПГБ (рис. 22). а б Рис. 22. Микроструктура поверхности полимерных пленок, полученных из гомогенного полигидрокисбутирата (ПГБ) (а) и сополимера гидрокисбутирата с гидроксивалератом (ПГБ/ПГВ) (б). Маркер 1 мкм (материал и фото Е. И. Шишацкой) С использованием растворов полигидроксибутирата (1 % вес/объем), выливаемых на поверхность стекол из пирекса при 45 оC при условии медленного испарения растворителя с использованием подогрева (80–90 ºC) при полном испарении растворителя образуются пленки хорошего качества, имеющие толщину 0,04–0,07 мм. Сорбционная способность пленок, исследованная в системе «этанол-вода» при различной концентрации компонентов, оказалось различной. На проницаемость пленок влияло количество и состояние аморфной фазы в полимере. Проницаемость водно-этанольной смеси для пленок, изготовленных из ПГБ, достигает 35–40 % и 10–15 % – для пленок из менее кристалличного сополимера гидроксибутирата с гидроксивалератом (ПГБ/ПГВ). Селективность по отношению к смеси «спирт/вода» у изделий из гомогенного ПГБ более чем в 5 раз может превосходить селективность сополимерных пленок. Проницаемость паров воды и паров спирта, измеряемая гравиметрически при изменении температуры (30–50 ºC), показала, что пленки из ПГБ имеют более высокую селективность проницаемости для паров спирта и воды (около 10 и 70 бар соответственно) по сравнению со значениями, полученными для пленок из ПГБ/ПГВ (36 и 59 бар соответственно). Различия проницаемости мембран, полученных из разных типов ПГА, связаны, вероятно, с различиями скоростей и течения процесса кристаллизации, различия Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 40 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.3. Приготовление растворов полимеров. Получение двумерных полимерных матриксов ми размеров образующихся сферолитов, которые и определяют транспортные свойства неупорядоченной фазы полимера. Материалы и оборудование 1. Образцы полимеров (ПГБ и ПГБ/ПГВ). 2. Растворители (хлороформ, дихлорметан). 3. Весы «Adventurer ™» OH – AR2140 – USA. 4. Термостат BD-115, BINDER (Германия). 5. Фильтры Шотта. 6. Формы для налива растворов полимера (чашки Петри, полированные металлические пластины, стекла). 7. Бокс-ламинар фирмы «LABCONCO»(США). 8. Стеклянная посуда, колбы, мерные стаканы, пипетки, бюксы. 9. Микрометр. 10. Цифровой фотоаппарат. Ход работы 1. В боксе-ламинаре приготовить серию навесок полимеров ПГБ и ПГБ/ПГВ. 2. Поместить навески в пронумерованные стеклянные конические колбочки с притертыми крышками, прилить растворитель. 3. Для ускорения растворения колбочки поместить в термостат на 15– 20 мин. 4. Проанализировать растворимость разных типов ПГА в различных растворителях. Результаты внести в табл. 2.3. 5. Исследовать влияние температуры на процесс растворения полимеров. Для этого варьировать температуру в термостате в диапазоне 60–140 ºС. 6. Для исключения наличия в растворе частичек нерастворенного полимера профильтровать растворы через фильтры Шота. 7. В боксе-ламинаре произвести налив растворов полимера на обезжиренные поверхности приготовленных форм; часть форм предварительно подогреть до 35–30 ºС. 8. Оставить формы с налитыми полимерными растворами в потоке стерильного воздуха на 30–45 мин до полного испарения растворителя. 9. Снять образованные пленки с поверхности форм. Сфотографировать с помощью цифрового фотоаппарата, распечатать и внести в лабораторную тетрадь. 10. С помощью микрометра измерить толщину пленок, полученных из различных типов полимеров, приготовленных из растворов различной плотности. Значения занести в тетрадь. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 41 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.3. Приготовление растворов полимеров. Получение двумерных полимерных матриксов Таблица 2.3 Максимальная растворимость образцов ПГА (весовая доля, %) Образец ПГА ПГБ/ПГВ ПГБ хлороформ Растворитель дихлорэтан тетрахлорэтан диоксан Вопросы 1. На каком химическом свойстве ПГА основано получение двумерных полимерных матриксов на базе метода полива растворов и испарения растворителя? 2. Каковы основные требования к методике получения полимерных матриксов из растворов? 3. Каковы преимущества техники испарения растворителя? 4. Каким образом можно получить пористые полимерные матриксы с использованием техники полива растворов и испарения растворителя? Работа 2.4. Исследование свойств поверхности полимерных матриксов Цель: освоение методов исследования свойств поверхности полимерных матриксов различных типов, предназначенных для культивирования клеток in vitro. Свойства поверхности матриксов играют большую роль для прикрепления и пролиферации клеток. Для повышения адгезионных свойств поверхности по отношению к клеткам, улучшения газодинамических свойств изделий и повышения их проницаемости для субстратов и продуктов обмена клеток применяют различные подходы, включая обработку изделий физическими факторами или химическими реагентами. Свойства поверхности и пористость полимерных матриксов играют большую роль для прикрепления и пролиферации клеток. Требования к размерам пор специфичны в зависимости от типа культивируемых клеток. Например, при культивировании остеобластов маленькие поры могут вызвать состояния гипоксии, а также остеохондрозные состояния при костеобразовании, в то время как более крупные размеры пор обеспечивают нормальное протекание остеогенеза и способствуют васкуляризации имплантата. От размера пор в матриксе зависят диффузионные свойства конструкции, определяющие отток продуктов обмена клеток и снабжение их питательными компонентами. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 42 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.4. Исследование свойств поверхности полимерных матриксов Новым направлением модификации поверхности клеточных матриксов является обработка физическими факторами или химическими реагентами с целью улучшения механических и биомедицинских свойств. Это делается для повышения адгезионных свойств поверхности по отношению к культивируемым животным клеткам, улучшения газодинамических свойств изделий и повышения их проницаемости для субстратов и продуктов обмена клеток. Химическая модификация включает изменение функциональных групп на поверхности полимерного материала, что повышает гидрофильность и обеспечивает лучшую прикрепляемость и лучший рост клеток. Один из подходов, применяемых для модификации поверхности изделий из ПГА, заключается в обработке газовой плазмой. При обработке, например, пленок из полигидроксиоктаноата аммониевой плазмой в течение 10 мин происходит включение в структуру пленки до 8 % азота. Это сопровождается значительным изменением свойств поверхности изделий. Так, контактные краевые углы сокращаются на 20–30º. Поверхность становится гидрофильной, и это свойство сохраняется во времени. В ходе химической модификации поверхности полимерных пленок применяют также биологически активные и лекарственные вещества, способствующие лучшему прикреплению, росту клеток и дифференцировке формирующихся тканей. Например, возможно при обработке газовой плазмой применять активные формы биотина, аминокислоты и др. а б Рис. 23. Электронные микрофотографии матриксов, полученных из ПГБ (а) и сополимера (ПГБ/ПГВ) (б). Увеличение х 2000 (фото Т. Г. Воловой) Для повышения биосовместимости матриксов из ПГА известны положительные примеры иммобилизации на поверхности пленочных матриксов коллагена, прививание хитозана, хитозан/полисахаридов. Один из способов получения пористых матриц из ПГА – это получение двухкомпонентных смесей и последующее выщелачивание в растворе одного из компонентов, Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 43 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.4. Исследование свойств поверхности полимерных матриксов обладающего растворимостью в данной системе. Применение многокомпонентных растворных систем ПГА позволяет получать гамму пористых материалов с пористостью до 90 % при размере пор от 100 до 350 нм. Для этого к раствору или расплаву полимеров добавляют частицы хлорида натрия размером от 80 до 200 мкм в соотношении 1:2 по массе. Из смеси формуют изделия, которые потом промывают водой. В качестве подложки при формовании волоконоподобных трубочек употребляют, например, тефлон. При использовании техники выщелачивания («leaching»), как правило, применяют кристаллы хлорида натрия или сахарозы, которые обладают высокой растворимостью. Варьируя концентрацию последних, можно задавать общую пористость матриксов и размеры пор. На рис. 23 показаны микрофотографии матриксов, полученных из двух типов ПГА (ПГБ и ПГБ/ПГВ); видно, что размеры и количество пор у матриксов, полученных из разных по структуре полимеров, различаются. Сравнительно недавно стали появляться работы, в которых для модификации свойств полимерных матриксов начали применять лазерную обработку. Показано, что на поверхности полимерных мембран при лазерной обработке образуются специфические зоны различной ширины, от 10 до 20–40 мкм, с измененной структурой сферолитов. При засеве на такие пленки клеток фибробластов мыши L 929 лучше всего клетки адгезировали и росли именно в месте возникновения этих зон. Обработка материалов лазером имеет преимущества в сравнении с другими методами, так как позволяет прицельно модифицировать поверхности без разрушения материала и образования токсичных продуктов. Предполагается, что в областях, обработанных лазером, увеличивается прочность адгезионного шва между фазами, возрастает гидрофильность и, следовательно, повышаются адгезионные свойства поверхности матриксов. При обработке пленок из ПГА CO 2 -лазером, мощность которого варьируется в диапазоне от 3,0 до 30,0 Вт получена серия пленок с измененной поверхностью, от выраженных шероховатостей до сквозных перфораций (рис. 24) и установлено. что оптимальными параметрами лазерного излучения являются Римп = 18,46 Вт и τ = 3 мс. Поверхность полимерных пленок, обработанная в таком режиме, максимально гидрофильна. Свойства поверхности двумерных матриксов оценивают, как правило, на базе измерения контактных краевых углов смачивания водой, размер которых позволяет с использованием известных уравнений Де Жен вычислять ряд показателей. Материалы и оборудование 1. Образцы двух- и трехмерных матриксов, полученные на занятиях 2.2 и 2.3. 2. Автоматическая микропипетка. 3. Дистиллированная вода. 4. Цифровая фотокамера. 5. Персональный компьютер. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 44 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.4. Исследование свойств поверхности полимерных матриксов а б в Рис. 24. Морфология поверхности полимерных мембран из ПГБ, обработанных лазером с различной мощностью излучения: а – P = 6,15 Вт; б – Р = 8 Вт; в – Р = 9 Вт (фото Е. И. Шишацкой) Ход работы 1. Для определения контактных (краевых) углов смачивания образцы матриксов в виде пленок различной толщины, пористости, изготовленные из ПГА различной химической структуры (ПГБ и ПГБ/ПГВ), поместить на предметное стекло и с помощью автоматической микропипетки наносить на поверхность пленок капли дистиллированной воды объемом 100, 200 и 300 мкл, по 10 каждого объема. 2. С помощью цифровой камеры получить компьютерное изображение капли (рис. 25). 3. Определить величину угла (среднее значение величины угла из измерения 10 капель каждого объема). 4. Для определения свойств поверхности матриксов произвести необходимые вычисления. Свободную поверхностную энергию полимерных матриксов (эрг/см2) находят по уравнению: γs = γL(1+ cos θ)2/ 4, где γL – cвободное поверхностное натяжение воды, равное 72,8 эрг/см2. Свободную энергию межфазовой поверхности «полимер – вода» (γSL, эрг/см2) – по уравнению: γSL = γS + γL – WSL, где γ SL – критерий остаточной межфазовой энергии; γS и γ L – соответственно, свободная энергия поверхности пленки и воды. Силу сцепления, характеризующую прочность адгезионного шва между фазами, вычисляют из зависимости: WSL ≈ 2 γ S γ L (эрг/см2). Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 45 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.4. Исследование свойств поверхности полимерных матриксов 5. Полученные значения занести в таблицу 2.4. 6. Определить свойства поверхности трехмерных матриксов, полученных из ПГБ и композита полимера с гидроксиапатитом, используя процедуры, описанные в пп. 1–3 выше. 7. Вычислить значения для матриксов свободной поверхностной энергии (γ s), свободную энергию межфазовой поверхности «полимер – вода» (γSL, эрг/см2), силу сцепления (WSL). 8. Полученные значения занести в табл. 2.5. Проанализировать полученные результаты и сопоставить свойства поверхности матриксов разных типов. Рис. 25. Фото микрокапли воды на поверхности полимерного матрикса Таблица 2.4 Характеристика поверхности полимерных двумерных матриксов Показатель Контактный угол смачивания (θ, град) Поверхностное натяжение (γ, эрг/см2) Свободная энергия межфазовой поверхности (γSL, эрг/см2) Величина сил сцепления, (WSL, эрг/см2) Состав полимера и тип матрикса ПГБ ПГБ ПГБ/ПГВ ПГБ/ПГВ плотная пористая плотная пористая пленка пленка пленка пленка Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 46 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.4. Исследование свойств поверхности полимерных матриксов Таблица 2.5 Характеристика свойств поверхности трехмерных матриксов, полученных из композитов полимера и гидроксиапатита (ПГА/ГАП) Соотношение ПГА/ГАП в % (по весу): 100/0 90/10 80/20 70/30 60/40 50/50 0 I 0 I 0 I 0 I 0 I 0 72 06 68 01 69 12 60 00 51 01 46 03I Краевой угол смачивания θ, град Поверхностное натяжение γ, эрг/см2 31,18 34,41 33,56 40,95 48,30 49,49 Свободная энергия межфазовой 8,70 7,11 7,50 4,55 2,50 2,24 поверхности γSL, эрг/см2 Показатель Вопросы 1. На каком показателе основываются методы определения свойств поверхности полимерных матриксов, предназначенных для культивирования клеток? 2. Каковы основные требования, предъявляемые к свойствам поверхности клеточных матриксов? 3. В чем основные отличия матриксов, представляющих собой плотные гибкие пленки и пористые мембраны? Работа 2.5. Получение трехмерных пористых матриксов в виде губок из композита полимера гидроксимасляной кислоты и коллагена Цель работы: получение композитных матриксов с высокоразвитой поверхностью из биосовместимого композита «полигидрокисбутират/коллаген». Серьезной и пока нерешенной остается проблема длительного сохранения функциональной активности имплантированных клеток in vivo. Для успешной индукции остеосинтеза в месте имплантации необходимо создать высокую начальную концентрацию клеток (до 107–108 клеток). Простое введение суспензии клеток оказывается зачастую малоэффективным, поэтому возникла серьезная проблема поиска адекватного носителя для закрепления трансплантируемых клеток в организме реципиента. Наиболее ответственным этапом использования культивированных клеток является трансплантация их в зону повреждения, которая зависит от того, какая часть клеток попадет в зону дефекта; адгезируются ли культивированные клетки на носителе, сохранят ли они активное функциональное состояние. При этом одной из сложных проблем является выбор адекватного носителя для клеток, так как для реализации своих потенций культивируемые клетки должны определенное время находиться в фиксированном к носителю состоянии. Это может Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 47 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.5. Получение трехмерных пористых матриксов в виде губок из композита полимера гидроксимасляной кислоты и коллагена быть связано с гистогенетическим свойством данных клеток проявлять свои остеогенные свойства, будучи организованными в сложные трехмерные структуры. Быстрая деградация носителя-подложки способствует вымыванию клеток вместе с транссудатом из раны. Поэтому остеозамещающие имплантаты должны иметь пролонгированный срок биодеградации. Среди биоматериалов, изучаемых с целью конструирования объемных пористых матриц функционирующих клеток (инкубаторов или scaffolds) – альгинаты, коллаген, полилактиды и полигликолиды и с недавних пор – природные биоразрушаемые полиэфиры полигидроксиалканоаты (ПГА). Наиболее распространенным и применяемым биоматериалом, в том числе для конструирования клеточных имплантатов, в настоящее время является коллаген. Основной его недостаток заключается в быстрой резорбции в организме. Для увеличения срока функционирования биомедицинских изделий из коллагена применяют стабилизирующие и сшивающие агенты, в том числе УФ-излучение, температурное воздейcтвие, химические методы. Материалы и оборудование 1. Образец высокоочищенного полигидроксибутирата, измельченного в виде мелкодисперсного порошка. 2. Коллагеновая губка (ОАО «Лужский з-д Белкозин»). 3. Растворитель (хлороформ, хлористый метилен). 4. Весы лабораторные Adventurer OH-AR2140 (USA). 5. Бокс-ламинар фирмы «LABCONCO». 6. Стеклянная посуда (стаканы, мерные цилиндры, пипетки). 7. Фильтровальная бумага. 8. Цифровой фотоаппарат. Ход работы 1. Приготовить 3,6 % (по массе) раствор полимера в хлороформе. 2. Вырезать фрагменты губки размером 5×5 мм и высотой 10 мм. 3. Опустить фрагменты губки в раствор полимера на 30 мин (раствор должен полностью покрывать губку). 4. Извлечь образцы из раствора, промокнуть на фильтровальной бумаге. 5. Высушить образцы на воздухе в боксе-ламинаре. 6. Для удаления из матрикса коллагена, непропитанного полимером, образцы культивировать в 0,1 % растворе коллагеназы (ICN) на среде RPMI1640 (ICN) при 37 ºС в течение 24 ч; повторно высушить в боксе. 7. Эффективность ферментативной обработки оценить по изменению массы образца до и после обработки и высушивания в сопоставлении с исходной коллагеновой губкой. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 48 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2.5. Получение трехмерных пористых матриксов в виде губок из композита полимера гидроксимасляной кислоты и коллагена 8. Определить способность матрикса поглощать жидкость весовым способом с применением среды RPMI-1640. Время выдерживания образца в жидкости – 30–60 мин. 9. Для полного удаления хлороформа перед последующим засевом клетками матриксы промыть в изотоническом растворе NaCl, высушить на воздухе. 10. Стерилизовать матриксы 1 ч при 121 ºС. Вопросы 1. Почему пористые матриксы предпочтительнее для культивирования клеток? 2. Каков размер пор, оптимальный для размножения клеток разных типов (фибробластов, остеобластов)? 3. Почему коллагеновый матрикс не может быть использован в качестве носителя клеток для длительной имплантации? Работа 2.6. Определение свойств матриксов: плотности, пористости, влагоемкости Цель работы: обучение навыком тестирования физико-механических свойств клеточных матриксов. Свойства поверхности матриксов играют большую роль для прикрепления и пролиферации клеток. Для повышения адгезионных свойств поверхности по отношению к клеткам, улучшения газодинамических свойств изделий и повышения их проницаемости для субстратов и продуктов обмена клеток применяют различные подходы, включая обработку изделий физическими факторами или химическими реагентами. К числу основных требований, предъявляемых к матриксам для культивирования клеток, является комбинация механической прочности с высокой объемной пористостью конструкции. Требования к размерам пор специфичны в зависимости от типа культивируемых клеток. От размера пор в матриксе зависят диффузионные свойства конструкции, определяющие отток продуктов обмена клеток и снабжение их питательными компонентами. Смачивание поверхности матриксов из биоматериалов жидкостями, то есть их гидрофильность, являются одним из показателей биосовместимости. Материалы и оборудование 1. Полимерные матриксы в виде пленок и трехмерных плотных и пористых компактов, полученные ранее. 2. Реагенты: раствор изопропилового спирта, хлороформ, сбалансированный фосфатный буфер. 3. Весы лабораторные. 4. Стеклянная посуда (колбы, мерные стаканчики и цилиндры), автома Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 49 МОДУЛЬ 2. ПОЛИМЕРЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 2.6. Определение свойств матриксов: плотности, пористости, влагоемкости тически и стеклянные пипетки. Ход работы 1. Для определения плотности образцы погружают в изопропиловый спирт, налитый в мерный цилиндр; по шкале замеряют высоту столба жидкости. Значение плотности образцов вычисляют по формуле: V2 – V1 = P (см3/г), где V1 и V2 – начальный и конечный объем изопропилового спирта. 2. Влагоемкость матриксов определяют гравиметрическим методом, для этого необходимо погрузить образцы в сбалансированный фосфатный буфер на 30–60 мин; параметр определить по формуле: Влагопоглощение (%) = (W2 – W1) /W2 · 100, где W1 и W2 – вес сухого образца и вес образца, насыщенного жидкостью. 3. Метод нахождения пористости матриксов основан на определении объема воды, заполняющей поры образцов при кипячении матрикса в воде в течение 15–30 мин. Избыток воды из образцов удаляют путем отсасывания при помещении образцов в герметичный сосуд при разряжении 60 мм. рт. ст. Суммарную пористость определяют по формуле: Gв – Gc V∑ = ———— (см3/г), Gc ρw где Gв – вес влажного образца после удаления излишней воды в г; Gс– вес сухого образца в г; ρw – плотность воды в г/см3. Плотность воды принята равной 1 г/см3, что при точности данного метода в 2,5 %, справедливо для любой комнатной температуры до 35 ºС. Вопросы 1. Какие методы применимы для получения из ПГА двух- и трехмерных матриксов? 2. Какими физико-химическими свойствами должен обладать полимерный материал для применения в ходе его переработки расплавов? 3. Какие полимерные изделия можно получить, используя полимерные растворы, и методом полива и испарения растворителя? 4. К какому классу органических соединений относятся полигидроксиалканоаты? 5. Какими приемами можно обеспечить пористость полимерного матрикса? Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 50 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Цель: дать представление о требованиях, предъявляемых к материалам и устройствам для медицины и методах оценки биологической безопасности. Задачи: знакомство с системами тестирования биоматериалов и устройств биомедицинского назначения, принятыми в России, США и странах ЕС; обучение приемам и методам, необходимым для оценки пригодности материалов для биомедицины. Объекты: отраслевые инструктивные материалы, регламентирующие необходимые методы исследования для применения материалов в биомедицине; образцы полимерных материалов, необходимый набор реактивов и тест-объектов (кровь, клетки, лабораторные животные). Работа 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины Цель работы: приобретение знаний о требованиях, предъявляемым к материалам, предназначенным для использования в медицине, и принципах тестирования биологической безопасности. Необходимость внедрения новых медицинских технологий для увеличения продолжительности жизни пациентов и повышения качества лечения делает актуальной разработку новых материалов, усовершенствование конструкций устройств и технологий их применения. Все новые материалы и изделия из них должны быть проверены на безопасность прежде, чем они будут допущены в клинику. В зависимости от класса медицинских устройств привлекаются различные уровни законодательных контрольных механизмов. В США регистрация медицинских устройств регулируется Администрацией по продуктам питания и препаратам (FDA); в Великобритании – Агентством по медицинским устройствам; в Японии – Министерством здравоохранения и социального обеспечения; в ЕС для изделий предусмотрена маркировка СЕ. В России в 1999 г. на базе действующего Международного стандарта ИСО 10993-99 по оценке биологической безопасности медицинских мате- Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 51 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины риалов и изделий, принятого в настоящее время в США и странах ЕС, введен ГОСТ Р ИСО 10 993.99 «Оценка биологического действия медицинских изделий. В 2007 г. издан Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ № 488 «Об утверждении Административного регламента Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития по исполнению государственной функции по выдаче разрешений на применение новых медицинских технологий». Неотъемлемой частью процесса выдачи разрешения на применение новой медицинской технологии является классификация в зависимости от степени потенциального риска применения в медицинских целях по трем классам: класс 1 – медицинские технологии с низкой степенью риска, включающие в себя прочие медицинские технологии; класс 2 – медицинские технологии со средней степенью риска, включающий в себя медицинские технологии, оказывающие прямое (хирургическое) воздействие на кожу, слизистые оболочки и естественные полости организма; терапевтические, физиотерапевтические и хирургические манипуляции в дерматокосметологии; класс 3 – медицинские технологии с высокой степенью риска, включающий в себя медицинские технологии, оказывающие прямое (хирургическое) воздействие на органы и ткани организма (за исключением медицинских технологий, относящихся ко 2-му классу); пластические реконструктивные операции; медицинские технологии, связанные с использованием клеточных технологий и генных манипуляций, трансплантации органов и тканей. Выдача разрешений на применение новых материалов и устройств для новых медицинских технологий в РФ осуществляется Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на основании результатов соответствующих исследований, испытаний и экспертиз, подтверждающих эффективность и безопасность медицинской технологии. Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития осуществляет контроль за соблюдением действующих требований к порядку проведения клинических и биомедицинских исследований новой медицинской технологии и средств для ее реализации. В США FDA классифицирует медицинские устройства по риску для пациента, связанному с использованием этого устройства. Устройства класса 1 – это, как правило, устройства с низким уровнем риска, которые подвергают пациента незначительной опасности и неинвазивные в частности такие, как реактивы, применяемые in vitro для анализов в целях диагностики болезней или некоторых типов состояний. Устройства класса 2 представляют собой более высокий уровень риска для пациента и могут включать неинвазивные или инвазивные, краткосрочные устройства типа катетеров, устанавливаемых всего лишь на короткое время, или некоторые электронные устройства, используемые для тестирования или анализа здоровья пациента. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 52 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины Оборудование для ЭКГ (электрокардиограммы) и рентгена – это устройства класса 2. Класс 3 – это устройства с высокой степенью риска, имплантируемые на продолжительный срок. В США существует два основных пути к получению законодательного статуса: получение разрешения после того, как будет продемонстрировано, что устройство, предлагаемое к выводу на рынок, в значительной степени эквивалентно устройству, выведенному на рынок до принятия Поправки о медицинских устройствах 1976 г. (известное как разрешение 510 (k), или предпродажного разрешения, которое предполагает подачу и рассмотрение подробных данных, касающихся устройства, для подтверждения безопасности и работоспособности. В Европе принята четырехуровневая система, основанная на степени риска, связанного с использованием устройства, времени, в течение которого устройство находится в контакте с организмом человека, и степени инвазивности устройства (Директива ЕС 93/42 «Медицинское устройство»). Медицинские устройства являются частью общей системы законодательства, регламентирующего требования к качеству и безопасности всех изделий, продаваемых в Европе. Изделия, соответствующие этим правилам, имеют марку «СЕ». Европейская комиссия выпускает директивы для координации системы во всем Европейском Союзе (ЕС). Директивы, относящиеся к медицинским устройствам, содержат классификацию и другие существенные требования, которые должны соблюдать производители и государства-члены. Специальные директивы определяют также технологические процессы, которые необходимо выполнять тем, кто связан с производством, продажей, использованием и регулированием, касающимся медицинских устройств. В ЕС устройства класса 2а, как правило, очень похожи на устройства класса 2 в соответствии с классификацией FDA в США. Однако ЕС создал класс 2b, в который входят имплантируемые устройства, включающие рассасывающиеся материалы и другие типы долгосрочных имплантатов. Устройства класса 3 связаны с высоким уровнем риска для пациента в случае их выхода из строя, представляют собой долгосрочные имплантируемые устройства, которые либо считаются жизнеобеспечивающими, либо в случае выхода из строя приведут к серьезной опасности для здоровья и благополучия пациента. К устройствам класса 3 относятся кардиостимуляторы, устройства полной замены бедра и колена, материалы костных трансплантатов, кардиологические устройства стимуляции и клапаны сердца. По отношению к изделиям из полимерных материалов, используемых в современной медицине, установлен ряд критериев, необходимых для контроля с точки зрения их биологической безопасности. Первоочередным при этом является комплекс исследований физико-химических свойств материала; далее переходят к биологическим испытаниям материала и экстрактов материала в системах in vitro и in vivo. При этом первоначальный скрининг проводится in vitro и ex vivo, затем выполняется комплекс острых и хронических тестов in vivo и только после этого приступают к клиническим испыта- Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 53 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины ниям. В настоящее время документом, регламентирующим исследования такого рода в США и ряде зарубежных стран, является международный стандарт ИСО 10993 (Standards for Biological Evaluation, 1993). В общем виде система тестов ИСО 10993 включает серию последовательных стадий, различающихся как методам так и объектами исследований (табл. 3.1). В России для исследования биологических свойств медицинских изделий и материалов, помимо вышеотмеченного документа, который с 1999 года является ГОСТОМ (ГОСТ Р ИСО 10993) действуют также рекомендации Минздрава РФ (Сборник руководящих методических материалов, 1987; Сборник методических рекомендаций, 1991). Наиболее полное представление о существующих современных подходах и методах исследования новых материалов и изделий медицинского назначения дает коллективная монография ведущих специалистов России в данной области, подготовленная под редакцией руководителя Центра по экспериментальному исследованию гемосовместимых биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов Минздрава России, профессора В. И. Севастьянова (Биосовместимость, 1999). Программа исследований нового биоматериала формируется с учетом длительности и характера контакта с живым организмом. Таблица 3.1 Программа испытаний медицинских изделий по стандарту ИСО 10993 Стадия Содержание I стадия. Характеристика и тести- Экспресс-оценка химических, физических и биолорование исходного сырья гических показателей (цитотоксичность, гемолиз in vitro) до и после технологических операций (прессование, экструзия и пр.) II стадия. Исследование биосовмес- Оценка биологической безопасности отдельных тимых свойств компонентов изделий составляющих изделия III стадия. Оценка качества и эффек- Аттестация производственных помещений (оценитивности контроля на производстве вается система контроля исходного сырья и конечного продукта) IV стадия. Контроль качества ко- Контроль исходного сырья и конечного продукта нечного продукта на соответствие паспортным данным и требуемым медико-техническим свойствам Cанитарно-химические методы, включающие измерения рН-, УФи ИК-спектроскопии позволяют понять природу реакции организма на имплантируемый материал. Рекомендовано также анализировать окисляемость и бромируемость водных вытяжек из полимеров для оценки стабильности материала и потенциальной миграции в среду продуктов синтеза полимера и технологических стабилизаторов и добавок. Важным моментом является изучение механико-физических свойств материала и изделий, включаю топографию и микроструктуру поверхности, электрические, температурные, Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 54 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины динамические и другие свойства. Токсикологические исследования биоматериалов включают биологические тесты (раздражающий эффект, цитотоксичность in vitro, на острую токсичность, гемолитическое действие, биодеградацию, имплантационные тесты с последующим морфологическим анализом); иммунологические методы; мутагенность, канцерогенность, воздействие на репродуктивную функцию, перинатальное и постнатальное развитие. Цитотоксичность материала, экстрактов и изделий на его основе исследуют in vitro на различных клетках (сперма крупного рогатого скота, клеточные культуры фибробластов, макрофагов, кератоцитов и др.) Данные тесты позволяют выявить прямое воздействие химических веществ, составляющих материал. Тест на раздражение дает возможность определить способность материала или его экстракта вызывать воспалительную реакцию при прямом контакте с тканью in vivo. С помощью имплантационного теста оценивают местное (макро- и микроскопическое) патогенное воздействие на ткани. Исследование общей (острой) токсичности направлено на определение летальной дозы материала или вытяжки (ЛД) или ЛД50 и выявление возможного токсического эффекта материала при однократном или многократном воздействии в течение периода времени менее 24 ч. Субхроническая (не менее 90 сут) и хроническая токсичность (свыше 90 сут) определяется для материалов, предназначенных для длительного контакта с внутренней средой организма. В ходе эксперимента анализируют поведение животных, динамику их привесов, массу внутренних органов, формулу крови. Сенсибилизационный тест применяют для выявления возможных проявлений аллергических реакций организма под воздействием веществ, экстрагируемых из материала. В качестве дополнительных методов рекомендованы тесты на генотоксичность, эмбриотоксичность и канцерогенность. Исследование гемосовместимых свойств материалов проводят в системах in vitro, ex vivo и in vivo по набору методов, характеризующих процессы взаимодействия материала с кровью, включая изменения свойств компонентов крови и собственно материала или изделия. Для оценки гемосовметимости новых полимерных материалов, исходя из многофакторности данного понятия, в настоящее время принята комплексная система методов, разработанная в рамках межправительственной СССР-США программы «Исследование и разработка искусственного сердца», а также международной рабочей группой «Взаимодействие синтетических полимеров с живыми системами» при Международном союзе по теоретической и прикладной химии (ИЮПАК). Данная система методов является составной частью международного стандарта ИСО 10 993 по оценке биологической безопасности медицинских материалов и изделий и предусматривает исследование физикохимических и физико-механических характеристик, а также два уровня оценки собственно гемосовместимых свойств тестируемых материалов. Первый уровень исследования включает экспресс-методы предварительной оценки Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 55 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины гемосовместимых свойств (определение времени рекальцификации, оптической плотности супернатанта, количества адгезированных тромбоцитов). Второй уровень предусматривает исследование реакции высвобождения тромбоцитов, степени распластывания адгезированных тромбоцитов, активации системы комплемента, динамики адсорбции альбумина и кальция. Тканевая реакция на имплантат является важным моментом в оценке биосовместимости имплантируемого материала. Экспресс-методы, применяемые для этого, включают исследования in vivo и in vitro. Последние проводят на различных типах клеток (фибробластах, моноцитах, лимфоцитах, макрофагах и др.) с целью оценки реакции клеток на инородный материал, например, жизнеспособности по интенсивности матричных процессов (включение 3Н-тимидина ядрами, окрашивание трипановым синим) и высвобождения клетками специфических компонентов и тканевых медиаторов, а также получение количественных оценок. Эксперименты in vivo предусматривают имплантацию испытуемого материала (в виде пленок, губок, волокон, пластин) подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, а также в органы и сосуды на различные сроки в зависимости о конкретных задач. В ходе опытов оценивается как общая реакция организма и местных тканей, так и структура и морфология внутренних органов, в которых возможна аккумуляция продуктов деструкции материала. Материалы и оборудование 1. Образцы полимеров (на примере ПГА). 2. Водные вытяжки и экстракты полимеров. (Далее в ходе описания конкретных тестов приведены описания оборудования, материалов и хода исследований.) Ход работы по приготовлению водных вытяжек полимеров 1. Экстракты готовят из материалов в соотношение единицы площади к единице объема дистиллированной воды (1 см : 1 мл) в течение 3 суток при t = 37 ºС. Контрольным раствором служит дистиллированная вода, которая является основой для экстракта, термостатируемая без образцов. 2. Обязательным для исследования любого нового материала является набор тестов, представленный в табл. 3.2). А. Санитарно-химические испытания (измерение рН и УФ водных вытяжек из образцов пленок) Данные методы не относятся к биологической оценке, однако они позволяют понять природу реакции организма и относятся к обязательным тестам. Определение водородного показателя, наличия примесей, свободных химических связей, а также остатков мономера в водных экстрактах необходимо для контроля биологической безопасности изделий. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 56 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины Таблица 3.2 Программа испытаний новых биоматериалов (на примере ПГА) А. Санитарно-химические испытания (обя- Измерение рН вытяжек зательные) УФ-поглощение В. Испытания на токсичность Цитотоксичность на половых клетках крупного рогатого скота Гемолиз Культура тканей. Вычисление зональной активности роста, интенсивности роста и дегенерации. Острая токсичность при внутрибрюшинном введении вытяжек мышам (до 24 ч) Раздражающий эффект Имплантация (1 неделя, 3 кролика) С. Иммунотоксичность Время рекальцификации плазмы крови D. Аллергенность Количество адгезированных тромбоцитов Е. Гистологические исследования (1 обра- (метод сканирующей электронной микрозец – 5 стекол) F. Испытания на гемосов- скопии с морфометрическим анализом) местимость (только для изделий, контакти- Активация системы комплемента рующих с кровью) Примечание: все измерения проводятся не менее, чем в 2 независимых экспериментах. А. Санитарно-химические испытания (измерение рН и УФ водных вытяжек из образцов пленок) Данные методы не относятся к биологической оценке, однако они позволяют понять природу реакции организма и относятся к обязательным тестам. Определение водородного показателя, наличия примесей, свободных химических связей, а также остатков мономера в водных экстрактах необходимо для контроля биологической безопасности изделий. Материалы и оборудование 1. рН-метр PP-15 (Sartorius). 2. Дифференциальный регистрирующий спектрофотометр «Uvikon» (Италия). 3. Водные экстракты полимеров. Ход работы 1. Выполнить измерения рН вытяжек из образцов полимера. Регистрируемым параметром является изменение рН (∆рН): ∆рН = рН выт. – рН контр. где рН выт. – значение рН вытяжки, рН контр. – значение рН контрольного раствора. Материал пригоден для общей хирургии, если изменение рН не более ±1. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 57 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины 2. Измерить на спектрофотометре в области УФ поглощение вытяжек в диапазоне 220–360 нм. Метод позволяет определить наличие свободных С=С связей, мигрирующих из изделия в окружающую среду. Измерения производят относительно контроля («холостого» раствора). Для этого контрольный раствор и полимерные вытяжки в специальных кюветах помещают в прибор и производят замеры оптической плотности относительно контроля. По данным замеров строят графики. Допустимый уровень динамики показателя составляет ∆ D = D выт. – D контр., не более 0,3 – для общей хирургии и 0,1 – для имплантатов, контактирующих с кровью. В. Испытания на токсичность Цитотоксичностъ материала по клеточному тест-объекту «семя крупного рогатого скота». Метод относится к группе биологических тестов, позволяющих провести испытания в условиях in vitro. Тест на цитотоксичность позволяет выявить прямое воздействие на клетки токсических веществ, потенциально содержащихся в образцах полимеров. Материалы и оборудование 1. Весы. 2. Микроскоп. 3. Водяная баня с автоматической регуляцией температуры. 4. Реагенты (хлорид натрия для доведения водного экстракта до физиологической среды, физиологический раствор для растворения гранул с клетками, гранулы замороженной в жидком азоте спермы). Ход работы 1. Взять мерной пипеткой 1,5 мл полимерного экстракта. 2. Добавить к экстракту 0,0135 г хлорида натрия. 3. Внести в пенициллиновые флаконы по 6 мл физиологического раствора. 4. Включить водяную баню на 36–37 ºС и установить в ней по 3 пробирки на каждый исследуемый экстракт; прогреть образцы. 5. Внести в 6 мл теплого физиологического раствора 6–7 гранул клеток. 6. После прогревания всех пробирок в каждую внести по 0,5 мл (или по 10 капель) исследуемых растворов. Добавить в каждую из пробирок по 0,5 мл (или по 10 капель) раствора клеток. 7. Определить выживаемость клеток сразу после смешивания растворов. Анализируют подвижность клеток каждые 10–20 минут. Наблюдение производят в течение 2 ч. Относительную выживаемость клеток вычисляют в %. За 100 % принимают время выживания клеток в контроле. Порог токсичности составляет 80 %. Определение раздражающего действия полимерных экстрактов Данный тест является одним из важнейших показателей токсичности. Действие экстрактов проверяют на глазах кролика из-за способности слизистых Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 58 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины конъюнктивы вызывать немедленную реакцию. Материалы и оборудование 1. Полимерные экстракты. 2. Стерильные пипетки. 3. Кролики. 4. Офтальмоскоп Heine. Ход работы 1. Набрать в стерильную пипетку образец экстракта. 2. Закапывать в глаза кролика три раза в день в течение 3 дней. Наблюдение осуществляют с момента закапывания в течение недели методом прижизненной биомикроскопии с помощью офтальмоскопа Heine в режиме работы щели. Параллельно оценивают аллергическую реакцию немедленного типа. Токсичность экстракта оценивают по степени выраженности реакции животного. Имплантационный тест Наиболее чувствительным и быстрым тестом in vivo является имплантация исследуемых образцов материала (в виде фрагмента пленки) в переднюю камеру глаза кролика сроком от 1 недели до 1 месяца. Материалы и оборудование 1. Стерильные образцы полимера в виде пленки. 2. Кролики. 4. Щелевая лампа. Ход работы 1. Приготовить стерильный фрагмент испытуемого полимерного материала в виде пленки размером 3×4 мм. 2. Образец имплантировать в переднюю камеру глаза через 5-ти миллиметровый роговичный разрез на фоне общей анестезии (0,1 мл гексенала на 1 кг массы тела) с добавлением ретро-бульбарно 2,0 мл 2 %-ного раствора новокаина. После имплантации на роговицу ложить непрерывный шов. 3. Производить наблюдение ежедневно с помощью щелевой лампы в течение первых 7 дней, далее – 1 раз в неделю на протяжении месяца. Реакцию тканей глаза оценивают по 4 бальной шкале: 0-я степень – ареактивное течение: глаз спокоен, среды прозрачны, радужка рельефна, имплантированный материал интактен. 1-я степень – слабо выраженная реакция: отек эпителия роговицы в области шва, симптом Тиндаля во влаге передней камеры, фибрин или преципитация на имплантат, отек, гиперемия зрачкового края радужки или легкая ирритация всей радужки. 2-я степень – реакция средней тяжести: отек эпителия половины роговицы, единичные складки десцеметовой оболочки, фибрин во влаге передней камеры, экссудат на лин Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 59 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины зе, выраженный отек, расширение сосудов радужки. 3-я степень – резко выраженная реакция: отек всей роговицы, утолщение стромы, грубый десцементит, экссудат, возможно гипопион, гифема в передней камере, выраженная экссудация на имплантате, синехии вплоть до его запаивания, экссудат на радужке, новообразованные сосуды. Реакция глаза 1-й степени может считаться адаптационной, соответствующей степени тяжести операционной травмы и вместе с 0-й степенью свидетельствует о хорошей биосовместимости имплантированного материала. С. Сенсибилизирующий и иммунотоксический эффект Данные тесты необходимы, так как экстрагируемые из изделия вещества способны вызывать аллергические реакции при сенсибилизации организма или угнетать иммунную систему. Тест «Реакция дегрануляции тучных клеток» (сенсибилизирующее действие) Способность перитонеальных тучных клеток сенсибилизированных животных на дегрануляцию позволяет выявить степень выраженности реакции живого организма на материал. Сенсибилизировать можно как экстрактом, так и самой имплантацией. Материалы и оборудование 1. Среда 119, физиологический раствор. 2. Центрифужные пробирки. 3. Лабораторный световой микроскоп. 4. Лабораторные животные (крысы) 5 шт. Ход работы 1. Сенсибилизация животных проводится внутрибрюшинным введением 1–2 мл полимерных вытяжек в течение 14 дней. 2. На 15 день животных забить методом декапитации с забором крови. 3. Умерщвленной каждому интактному животному внутрибрюшинно ввести 10 мл прогретого до 37 ºС физиологического раствора. 4. Произвести разрез длиной 1 см по белой линии и собрать в центрифужные пробирки взвесь тучных клеток. 5. Экссудат центрифугировать в течение 5 мин при 3 000–5 000 об/мин. 6. Собранные клетки микроскопировать под большим увеличением, считая тучные клетки, подвергшиеся дегрануляции и нормальные. Если относительное количество дегранулированных клеток не превышает 10 % – сенсибилизирующий эффект отсутствует; от 10 до 15 % – слабо выраженный сенсибилизирующий эффект; до 25 % – выраженный сенсибилизирующий эффект; более 25 % – сильно выраженный сенсибилизирующий эффект. Тест на иммунотоксичность «Фагоцитарная активность Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 60 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины макрофагов» Метод основан на определении оптической плотности лизирующего раствора после разрушения фагоцитов, поглотивших частицы нейтрального красного. Материалы и оборудование 1. Краситель нейтральный красный. 2. Среда 199, эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС). 3. Лизирующий раствор (смесь уксусной кислоты с этанолом). 4. Пластиковые чашки Петри 40 мм. 5. Лабораторный световой микроскоп. 6. Термостат. 7. Лабораторные белые мыши. 8. Бокс-ламинар. Ход работы 1. 1 мл стерильной вытяжки ввести внутрибрюшинно мышам (5 животных на один тип вытяжки). 2. Через 7 дней животных вывести из эксперимента путем дислокации шейных позвонков. 3. Асептически освободить брюшину и внутрибрюшинно ввести каждому животному 5 мл среды 199, содержащей 20 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). После массажа брюшной полости для получения большего количества перитониальных клеток введенную среду откачать шприцом. 4. Порции клеточной суспензии, полученные от 5-ти животных, объединить в общий пул. 5. Концентрацию живых клеток довести в пробе до 1,5х10 клеток/мл. 6. Суспензию клеток в боксе-ламинаре стерильно разлить по 2 мл в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм. 7. Инкубировать образцы 2 ч при 37 ºС. 8. Суспензию клеток после инкубации отмыть средой 199, ввести краситель с последующей инкубацией проб в течение 60 мин. 9. Отмыть клетки средой 199. добавить в чашки Петри по 3 мл лизирующего раствора для лизиса макрофагов, поглотивших краситель. По оптической плотности лизирующего раствора определяют степень поглощения красителя макрофагами. Сравнивают фагоцитарную активность макрофагов с фагоцитарной активностью в контрольной среде (внутрибрюшинная жидкость животных после введения физиологического раствора). Плотность лизирующего раствора в эксперименте не должна достоверно отличаться от плотности лизирующего раствора в контрольном опыте. F. Методы для оценки гемосовместимых свойств материалов и изделий Данная группа методов является обязательной только для материалов Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 61 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины или изделий, предназначенных для контакта с кровью. Тест «Время рекальцификации плазмы крови в присутствии исследуемого образца» Метод основан на определении времени свертывания рекальцифицированной плазмы крови (кролика или человека) после ее непосредственного контакта с поверхностью исследуемых материалов. Время рекальцификации плазмы крови (ВРПК), определяемое этим методом, отражает активацию внутренней системы коагуляции, обусловленную контактом крови с поверхностью материала и возможной экстракцией кровью веществ из объема материала. Материалы и оборудование 1. Центрифуга рефрижераторная 5810R (Eppendorf). 2. Гемокоагулометр Fibrintimer II. 3. Реагенты: 3,8 % раствор лимоннокислого натрия, 0,025 моль/л раствор хлористого кальция, 0,85 % раствор хлористого натрия, спирт этиловый. Ход работы 1. Очищенные и тщательно отмытые в физиологическом растворе образцы материала и контрольный образец (обычно предметное стекло или стеклянные шарики) инкубировать в пластиковых пробирках с цитратной, 1:9 (декальцифицированной) плазмой крови в течение 5 мин при 37 ºС. Тестируемый материал берут из расчета 50 см на 1 мл плазмы крови. 2. Пробы плазмы по 50–100 мкл перенести в реакционные кюветы, добавить равные объемы раствора хлористого кальция. 3. Перемешать и на коагулометре измерить время свертывания при непрерывном перемешивании пробы. Количественной характеристикой метода является время рекальцификации плазмы крови в абсолютных (ВРП, сек) или относительных единицах (ОВРП): время свертывания плазмы крови в присутствии исследуемого образца ОВР = ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– время свертывания исходной плазмы крови Относительная ошибка метода 5–10 % при надежности 0,95. Определение величины гемолиза при непосредственном контакте материала с кровью Метод основан на изучении влияния контакта материала с кровью на лизис эритроцитов. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 62 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины Материалы и оборудование 1. Суховоздушный термостат. 2. Центрифуга рефрижераторная 5810R (Eppendorf) 3. Регистрирующий спектрофотометр «Uvikon» (Италия). 4. Реагенты: 3,8 % раствор цитрата натрия, 0,85 % раствор хлористого натрия. 5. Образцы полимерного материала в виде пленок площадью 90 и 120 см на тест при толщине > 0,5 мм и < 0,5 мм, соответственно – 6 г материала на тест. Ход работы 1. Очищенные и тщательно отмытые в физиологическом растворе образцы материала инкубировать в бюксах с 10 мл физиологического раствора при 37 ºС в течение 30 мин. 2. В каждый бюкс добавить по 200 мкл цитратной крови (9:1), перемешать и вновь инкубировать в термостате при 37 ºС в течение 4 ч. После инкубации произвести отбор проб из бюксов в центрифужные пробирки. 3. Пробы в пробирках центрифугировать для осаждения крови в течение 15 мин при 400 g. 4. На спектрофотометре (или фотоэлектроколориметре) произвести регистрацию оптической плотности супернатанта в области 530–550 нм. За количественный критерий метода принимают относительную величину гемолиза (αг) в %, определяемую по следующей формуле: Дх − Дк (αг) = ————— 100 %, Д100 − Дк где Дх – оптическая плотность пробы, инкубируемой с исследуемым материалом; Дк – оптическая плотность контрольной пробы (отрицательный контроль); Д100 – оптическая плотность пробы после 100 % гемолиза (положительный контроль). Относительная ошибка метода при нахождении *г – 10–15 % при надежности 0,95. Метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) для определения количества адгезированных тромбоцитов Активации тромбоцитов является одной из определяющих стадий взаимодействия чужеродной поверхности с кровью. К основным характеристикам гемосовместимости материалов и изделий на клеточном уровне относятся количество и степень морфологических изменений адгезированных тромбоцитов в условиях in vitro, определяемые двумя методами. Рекомендуемыми являются методы: радиоизотопный и сканирующая электронная микроскопия. Адгезия тромбоцитов на поверхность материала сопровождается значительными морфологическими изменениями клеток, степень выра Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 63 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины женности которых пропорциональна степени активации тромбоцитов. Чем сильнее воздействует материал на клетки, тем интенсивнее протекают процессы образования псевдоподий, распластывания по поверхности и, наконец, формирования на поверхности агрегатов. Все адгезированные тромбоциты разбивают на четыре класса: 1. Неактивированные клетки. К ним относятся недеформированные клетки (без признаков распластывания и псевдоподий); 2. Клетки с псевдоподиями. Активированные тромбоциты с явно выраженными псевдоподиями; 3. Полностью распластанные тромбоциты. Они имеют очень большой диаметр по сравнению с одиночными клетками и малую толщину, так что полностью повторяют структуру поверхности образца; 4. Агрегаты. Они могут образовываться в объеме или непосредственно на поверхности; Основными параметрами для характеристики процесса взаимодействия тромбоцитов с поверхностью, регистрируемой методом СЭМ, служат: количество тромбоцитов, адгезированных на поверхность исследуемого материала (относительно контрольного материала); количество клеток каждого из указанных выше классов (относительно контрольного материала); морфология одиночных клеток. Материалы и оборудование 1. Сканирующий электронный микроскоп. 2. Аппарат для ионного напыления. 3. Установка количественного анализа изображения или программа морфологического анализа на персональном компьютере. 4. Реагенты: Спирт этиловый (50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %). Физиологический раствор (0,9 %-ный раствор NaCI). Глютаровый альдегид (2,5 %ный раствор). Цитрат натрия (3,8 %-ный раствор). 5. Кровь здорового донора. Ход работы 1. Образцы крови отбирать в силиконизированные пробирки, содержащие цитрат натрия, в соотношении кровь/антикоагулянт 9:1. 2. Кровь отцентрифугировать при 100 g в течение 20 мин для получения обогащенной тромбоцитами плазмы. 3. Каплю тромбоцитарной плазмы (~ 50 мкл) нанести на поверхность каждого образца и инкубировать при 20 ºС в течение 15 мин. Время инкубации подбирают для исследуемого ряда образцов в отдельном эксперименте так, чтобы количество адгезированных клеток было достаточным для количественного анализа. 4. Образцы промыть в физиологическом растворе для удаления не адгезированных тромбоцитов и неадсорбированных белков плазмы. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 64 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины 5. Образцы зафиксировать в течение 1 ч в 2,5 %-ном растворе глутаральдегида и провести через растворы этилового спирта возрастающих концентраций (вода, 50 % – 20 мин, 70 % – 20 мин, 90 % – 20 мин, 100 % – 20 мин). 6. Высушить образцы на воздухе и покрыть слоем меди для микроскопирования. 7. В ходе микроскопирования на поверхности каждого из образцов произвольным образом выбрать 25 полей размером 20х20 мкм. Просмотр образцов толщиной 50 нм проводить на СЭМ при 5 кВ и рабочих увеличениях 1500–5000. 8. Для оценки результатов для каждого образца суммировать по всем полям количество клеток и вычислить относительный показатель адгезии тромбоцитов (ОПАТ): ОПАТ = Nop / N КОНТР, где Nop и N КОНТР – количества клеток на образце и контроле (ПЭ) соответственно. Значения ОПАТ вычисляли и для каждого класса тромбоцитов ОПАТi (i = 1, 2, 3, 4). а б Рис. 26. Микрофотографии адгезированных клеток на пленках из полиэтилена: 1 – не активированные клетки (не деформированные) без признаков распластывания и псевдоподий; 2 – клетки с псевдоподиями (активированные тромбоциты с явно выраженными псевдоподиями; 3 – полностью распластанные тромбоциты; 4 – агрегаты (а); характерная картина тромбоцитов, адгезированных на поверхности пленок из ПГА (б) 1 (фото из монографии Т. Г. Воловой, В. И. Севастьянова, Е. И. Шишацкой) На рис. 26 приведены в качестве примеры результаты электронной микроскопии адгезии тромбоцитов на поверхности различных материалов. Метод позволяет даже при одинаковом количестве тромбоцитов на образцах парциальные OnATi получать дополнительную информацию об акти* Т. Г. Волова, В. И. Севастьянов, Е. И. Шишацкая. Полиокисалканоаты – разрушаемые полимеры для медицины. – Новосибирск, 2003. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 65 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины вации тромбоцитов и тромбогенных свойствах материалов. Относительная ошибка метода – 10 % при надежности 0,9. Гемолитический метод определения степени активации комплемента поверхностью материала Взаимодействие чужеродной поверхности с кровью приводит к быстрой активации всех систем гемостаза (свертывающей, фибринолитической, кининовой). Исследование степени активации комплемента, являющегося системой гуморального иммунного ответа, представляется важным для прогнозирования гемосовместимости материалов и изделий. Предлагаемый метод регистрирует изменение суммарной активности системы комплемента после контакта сыворотки крови человека с исследуемым образцом. Материалы и оборудование 1. Центрифуга рефрижераторная 5810R (Eppendorf). 2. Установка кинетического титрования комплемента. 3. Специальные кюветы для инкубации крови. 4. ФЭК. 5. Реагенты и материалы: эритроциты барана; сыворотка крови человека; гемолитическая сыворотка кролика; гепарин; веронал-мединаловый буфер. Приготовление буфера: маточный раствор – 5,76 г веронала растворяют в 500 мл дистиллированной воды, охлаждают, добавляют 85 г NaCI, 3 ,75 г мединала, 0,22 г CaCl2*2H2O, 1,0 г MgCl2*6H2O, доводят до 2 л дистиллированной водой – 3,75 г мединала, 0,22 г СаСl2*2H2O, 1,0 г MgCl2*6H20, доводят до 2 л дистиллированной водой. Раствор хранят в холодильнике. Рабочий раствор готовят непосредственно перед употреблением, доводя 100 мл маточного раствора до 500 мл дистиллированной Н2О. Ход работы 1. Приготовить суспензию трижды отмытых эритроцитов барана в веронал-мединаловом буфере (центрифугированием при 400 g в течение 15 мин) с концентрацией по шкале плотности ФЭК, равной 0,5 против буфера. 2. Для сенсибилизации эритроцитов в суспензию добавить гемолитическую сыворотку кролика, растворенную в веронал-мединаловом буфере до титра 1:2400, из расчета 0,3 мл на 55 мл суспензии эритроцитов. 3. Поместить образцы перед началом эксперимента в термостат на 30 мин при 37 ºС, периодически перемешивая. 4. Приготовить эталон сравнения по светопропусканию, соответствующий 50 % лизису эритроцитов путем смешивания 2,5 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов с 2,5 мл лизата эритроцитов. 5. Оптическую плотность эталона сравнения замерить на ФЭК против буфера при длине волны 540 нм; полученную величину фиксировать в течение всего времени эксперимента диафрагмой на левом барабане ФЭК. 6. Провести инкубацию предварительно очищенных и отмытых образ Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 66 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 3.1. Знакомство с системой тестирования биологической безопасности материалов и изделий для медицины цов исследуемого материала в виде пленок (удельной площадью 20 см2) или гранул (весом 5 г) с разбавленной веронал-мединаловым буфером сывороткой крови человека в специальных кюветах объемом 1 мл без доступа воздуха. 7. Активность комплемента определить добавлением 100 мкл исследуемой разбавленной сыворотки к 5 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов. Для обеспечения постоянной температуры (37 ºС) и кинетического режима реакции использовать термостатические ячейки с мешалкой. Количественными критериями метода являются: константа скорости индуцированной активации системы комплемента (kинд, см2 сек–1 ) и относительная (по купрофану) константа скорости индуцированной активации системы комплемента (kотнинд): kiинд = ln(τобр1/2 / τс1/2) / S · t · kотнинд = kобринд / kкупринд), где τобр1/2, τ1/2 – время полулизиса эритроцитов барана комплементом сыворотки после инкубации с образцом и в контрольной кювете (без образца) соответственно (с); S – площадь поверхности образца полимера, см2; t – время инкубации (с); kобринд, kкупринд – константы скорости индуцированной активации системы комплемента образца и стандарта соответственно. В качестве контроля можно также использовать любой материал медицинского назначения с известными медико-биологическими свойствами. Относительная ошибка метода – 5–7 % при надежности 0,95. Материал считается пригодным для контакта с кровью, если относительная константа скорости индуцированной активации системы комплемента kинд ≤ 1,50 + 0,1 равна отношению (kинд)обр / (kинд)купроф. Вопросы 1. Каковы различия систем тестирования новых биомедицинских материалов, действующих в России, США и странах ЕС? 2. Какой набор тестов является обязательным при оценке нового биоматериала? 3. Какие тесты наиболее информативны при выявлении потенциальной токсичности биоматериала? 4. Почему санитарно-химические исследования биоматериалов являются необходимым этапом в ходе тестирования биоматериала? 5. Какие требования, предъявляются к материалам, предназначенным для контакта с кровью? Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 67 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.2. Спектроскопические и термические исследования биополимеров Развитие науки и техники приводит ко все более широкому внедрению в медицине высокомолекулярных полимерных соединений синтетического, а также природного происхождения. Разнообразие полимеров, варьирование в широких пределах их стереоконфигурации и молекулярной массы, возможность получения композитов в разнообразных сочетания с различными веществами, – все это является основой для получения широчайшего спектра новых материалов с новыми ценными свойствами. Термин «полимер» состоит из двух терминов: «поли» – много и «мер» – единица, таким образом, полимер – это молекула, состоящая из множества единиц. Важный вопрос для характеристики многокомпонентных полиоксиалканоатов – это композиционное распределение мономеров. Понимание механизма этого процесса позволяет прояснить такие важные моменты, как закономерности образования концентрационных областей (со-кристаллизованных и блочных), структура аморфной и кристаллической фаз, появление концентрационных эффектов подавления кристаллизации и ограничение образования малокомпозиционных полиэфиров. Анализ литературы свидетельствует о том, что эффекты внутримолекулярного движения в различных многокомпонентных полиэфирах практически всегда тесно связаны с процессами со-кристаллизации и структурой макромолекулярных цепей. Конфигурация полимеров определяется химической структурой. Конформация полимера относится к его трехмерной структуре, и требуется только вращение связей для того, чтобы преобразовать одну конформацию в другую. Виниловые полимеры типа СНХ = СНХ и CH2 = CXY образуют синдиотактические, атактические и изотактические формы. Полимеры типа СН2 = СНХ являются стереорегулярными и не обладают никакой регулярностью молекулярной структуры. Свойства полимеров определяются типом хирального центра. Хиральным центром называют атом углерода с четырьмя прикрепленными различными группами. Существуют левые (L) и правые (D) формы хирального центра. Хиральные центры, как правило, приводят к оптической активности полимеров. Молекула полимера может поворачивать поляризованный свет плоскости. Наличие хиральных центров в структуре полимеров влияет на процесс полимеризации, который может реализовываться несколькими способами: 1) левосторонний и правосторонний хиральные центры могут связываться произвольно, или атактически; 2) хиральные центры могут соединяться чередующимся образом, синдиотактически; 3) хиральные центры могут связываться друг с другом с помощью одной схемы, или изотактически. Для переработки термопластичных полимеров в специализированные Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 68 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.2. Спектроскопические и термические исследования биополимеров изделия большое влияние на процесс оказывают температурные характеристики. Температурные характеристики полиметров относят к наиболее значимым параметрам полимеров, так как они определяют термомеханические свойства и, следовательно, возможность получения из этих полимеров изделий. У ряда полимеров, в том числе у ПГА, температура, при которой происходит их деформация, несколько ниже температуры кипения (температуры деградации), поэтому газовое состояние в этих полимерах не реализуется и основным видом фазового равновесия в них является конденсированное состояние – кристаллическое, стеклообразное, вязкотекучее и жидкое. Температура, при которой полимерный материал из стеклообразного состояние переходит в резиноподобное, является температурой стеклования (Тg). Температура стеклования совпадает с сегментным перемещением полимерных цепей и 4–5-кратным уменьшением модуля. Процессы диффузии в полимере увеличиваются на несколько порядков при прохождении Тg. Весьма важны также значения температуры плавления (Тпл) и термической деградации (Тдегр.) полимеров. Если у полимера существует значительный разрыв (порядка 80–100 оС) между значениями этих величин, можно применять методы переработки из расплава. Полимеры по механическим свойствам существенно различаются между собой; среди них – упругие твердые вещества, резиноподобные эластомеры, вязкие жидкости. В отличие от металлов и керамики, механические свойства полимеров (абсолютная прочность, модуль Юнга, степень кристалличности) могут изменяться во времени. Это поведение известно под названием «вязкоупругость». Основными гидродинамическими характеристиками полимерных макромолекул являются их поступательные, вращательные и более сложные конформационные движения, экспериментально исследуемые методами диффузии, седиментации, рассеяния света, осмометрии и вискозиметрии. В растворах в равновесном состоянии макромолекулы полимерных материалов могут образовывать различные конформационные структуры, зависящие от типа растворителя, длины и жесткости молекулярных цепей, химической структуры мономолекулярных секторов. В области больших молекулярных масс для анализа внутримолекулярного состояния часто используются представления о конформациях в виде запутанных «клубков», при этом цепи повышенной жесткости образуют более рыхлую упаковку по сравнению с гибкоцепными полимерами. Как следствие этого, в жесткоцепных молекулах практически отсутствуют эффекты «исключенного» объема, поэтому их свойства очень мало будут зависеть от качества растворителя. В гибкоцепных молекулах растворитель, наоборот, оказывает определяющее влияние на гидродинамические и вязкоупругие характеристики. Для изучения структуры высокомолекулярных биоматериалов используют ЯМР- и ЭПРспектроскопию, рентгеноструктурный анализ, ИК-спектроскопию. Полигидроксиалканоаты по ряду физико-химических свойств сходны с синтетическими полимерами (полипропиленом, полиэтиленом). Линейная структура молекул ПГА придает им свойство термопластичности. При нагре Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 69 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.2. Спектроскопические и термические исследования биополимеров вании молекулярные цепи в ПГА легко сдвигаются относительно друг друга, в результате этого материал размягчается и приобретает текучесть. Данное технологическое свойство имеет большую коммерческую ценность, так как позволяет с использованием различных методов (прессования, экструзии и др.) получать из ПГА разнообразные изделия и материалы. Помимо термопластичности, эти полимеры обладают оптической активностью, антиоксидантными свойствами, пьезоэлектрическим эффектом и, что самое главное, характеризуются биоразрушаемостью и биосовместимостью. Цель работы: знакомство с основными методами исследования структуры и свойств полимеров биомедицинского назначения. Материалы и оборудование 1. Образцы полимеров (ПГА) в виде пленочных дисков и порошка. 2. Реагенты: стирол, вазелиновое масло, хлороформ. 3. ИК-Фурье-спектрометр «ИНФРАЛЮМ ФТ-02», кюветы разборные с вкладышами. 4. Набор колец-стаканов, держатели для кювет, прокладки. 5. Автоматические пипетки. 6. Агатовая ступка с пестиком. 7. Прибор для комплексного термического анализа STA 449 Jupiter (NETZSCH, Германия). Качественный структурно-групповой анализ мономера гидроксимасляной кислоты и полигидроксибутирата методом ИК-спектроскопии. С помощью ИК-спектроскопии возможно изучение спектров поглощения различных, в том числе высокомолекулярных соединений. По форме интенсивности полос в низкочастотной области получают информацию о соотношении аморфной и кристаллической фаз в полимерах (например, полиэтилене, полипропилене и политетрафторэтилене), так как по мере увеличения степени кристалличности (Сх) становятся более узкими и интенсивными полосы спектра, обусловленые регулярными участками макромолекул, из которых построена кристаллическая область. Технические характеристики ИК-спектрометра Инфралюм ФТ-02 Универсальный Фурье-спектрометр среднего и дальнего ИК-диапазона (350–6500 см–1) (рис. 27). Прибор обеспечивает качественный и количественный анализ чистых соединений, в том числе биополимеров, а также многокомпонентных растворов и смесей. Позволяет проводить исследование структуры образцов биополимеров в виде растворов, суспензий в вазелиновом масле, в твердом состоянии в виде пленок или таблетированных с КВr тонких образцов. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 70 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.2. Спектроскопические и термические исследования биополимеров Рис. 27. Общий вид ИК-спектрометра фирмы «Люмэкс» Инфралюм ФТ-02 Температурные характеристики полимеров анализируются с помощью дериватографа (рис. 28). Технические характеристики: температурный диапазон: от 20 ºС до 1200 ºС; скорость нагрева: от 0,3 до 20 ºС/мин; масса образцов (ТГ): от 20 до 500 мг; чувствительность по ДТА – до ~10–3 ºС. Рис. 28. Дериватограф Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 71 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.2. Спектроскопические и термические исследования биополимеров Рис. 29. Общий вид прибора для комплексного термического анализа STA 449 Jupiter (NETZSCH, Германия) Для определение температур физических и химических превращений полимеров (температуры плавления и термодеструкции) по кривой ДТА (ДСК) и ТГ используется прибор для СТА – STA 449 Jupiter фирмы NETZSCH, Германия (рис. 29). Технические характеристики прибора для СТА – STA 449 Jupiter: температурный диапазон: от 20 ºС до 1500 ºС; скорость нагрева: от 0,3 до 20 ºС/мин; диапазон масс образцов (ТГ): до 5 г, дрейф весов < 1 мкг/ч; воспроизводимость базовой линии (ДСК – дифференциальная сканирующая калориметрия) ± 2 мВТ; шум ДСК – ~1 мкВт; программное обеспечение позволяет проводить измерения и расчеты данных ДСК, ДТА, ТГ, ДТГ; имеется набор образцов для калибровки температуры и энтальпии. Ход работы 1. Произвести градуировку прибора по пленке полистирола. Для этого пленку следует закрепить в держателе кюветы; поместить кювету в прибор и записать ИК-спектр в соответствии с инструкцией к спектрофотометру. 2. Полученный спектр сравнить со спектром эталона по характерным полосам поглощения в интервале 3160–2780 и 2000–570 см–1. 3. Снять ИК-спектр мономера (стирола). Для этого каплю жидкого мономера поместить между двумя окошками разборной кюветы, закрепить их в держателе и установить в рабочем канале спектрофотометра. Записать спектр исследуемого мономера в широком интервале длин волн. По справоч- Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 72 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.2. Спектроскопические и термические исследования биополимеров ным данным интерпретировать наиболее интенсивные полосы поглощения исследуемого мономера. 4. Снять ИК-спектр раствора полигидрокисбутирата (ПГБ). Собрать две кюветы с произвольно выбранной, но одинаковой толщиной слоя и заполнить одну из них растворителем, а другую – раствором полимера заданной концентрации. Поместить кюветы в спектрофотометр и произвести ориентировочную оценку спектра раствора. Если спектр нечеткий и не вписывается в шкалу оптической плотности (пропускания), то следует изменить первоначально выбранную толщину слоя и повторно произвести ориентировочную оценку спектра. Найдя опытным путем оптимальную толщину слоя раствора, записать его спектр в широком интервале длин волн 500–4000 см–1. Далее по справочным данным интерпретировать спектр по наиболее интенсивным полосам поглощения. 5. Снять ИК-спектр образца твердого полигидроксибутирата. Для этого образец в виде пленки поместить между окнами разборной кюветы, закрепить в держателе и установить в рабочем канале спектрофотометра. Из порошка полимера приготовить пасту, используя хлороформ и записать спектр в широком интервале длин волн. Полученный спектр интерпретировать, используя справочные данные. На рис. 30 приведен ИК-спектр полигидроксибутирата из базы данных OPUS. Волновое число, см-1 Рис. 30. ИК-спектр стандартного образца полигидроксибутирата из базы данных ИК-спектров OPUS фирмы Bruker Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 73 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.2. Спектроскопические и термические исследования биополимеров На основе расшифровки спектров мономера (стирол) и полимера (полистирол) объяснить наблюдаемые различия. Провести отнесение полос (пиков) поглощения в спектрах полигидроксибутирата. На основе полученной информации провести качественный структурно-групповой анализ. Определение температур физических и химических превращений полимеров (температуры плавления и термодеструкции) по кривой ДТА (ДСК) и ТГ. Материалы и оборудование 1. Образец полигидроксибутирата. 2. Оксид алюминия. 3. Дериватограф Q (Венгрия). 4. Тигли. Ход работы 1. Навеску исследуемого полимера (0,1 г) поместить в один платиновый тигель, а в другой – такую же навеску эталонного вещества. Оба тигля поместить в дериватограф на термопары, накрыть кварцевым стаканом, опустить в печь (работа согласно инструкции к прибору). TG /% DSC /(mW/mg) exo[1] TG 100.00 0 -592.1 J/g DSC 272.7 °C -0.5 -88.42 J/g 80.00 -1 189.2 °C -1.5 60.00 -2 -2.5 40.00 -3 -3.5 20.00 -4 Residual Mass: 0.71 (320.6) 297.0 °C [1] -4.5 0.00 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 Temperature /°C Рис. 31. Кривые термического анализа (ДСК и ТГ) полигидроксибутирата (спектр П. В. Миронова) Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 74 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.2. Спектроскопические и термические исследования биополимеров 2. На дериватографе записать кривые ДТА, ДТГ, ТГ и Т в виде функций определяемой величины от времени, которые переводят в кривые зависимости от температуры. Это осуществляется при помощи кривой Т, показывающей изменение температуры исследуемого образца во времени. Для нанесения на ось абсцисс температурной шкалы через точки пересечения горизонтальных калибровочных линий температуры и кривой Т опускают перпендикуляры на ось абсцисс и наносят соответствующие значения температур. На основании полученной температурной шкалы определить температуры переходов на кривых ДТА, ДТГ, ТГ, проектируя характерные точки перегибов на ось абсцисс. На рис. 31 в качестве примера приведены результаты термического анализа полимерного материала на основе полигидроксибутирата на приборе СТА фирмы NETZSCH (Германия). 3. Потерю массы образца (в %) найти на кривой ТГ, пользуясь штриховальной соответствующей шкалой. Определить температуру начала термодеструкции Тн, а также температуры, соответствующие потере 10, 20 и 50 % массы образца полимера – Т10, Т20 и Т50. 4. Проанализировать кривые ДТА, ДТГ и ТГ и объяснить изменения, происходящие при нагревании исследуемого образца полимера. 5. Определить температуры начала, максимума пика плавления и окончания плавления, начала и окончания термодеструкции. Результаты внести в рабочую тетрадь. Определение истинной температуры плавления кристаллического полимера (на примере полигидрокисбутирата) Материалы и оборудование 1. Образец полимера (ПГБ) в виде мелкодисперсного гомогенного порошка. 2. Оксид алюминия (эталон). 3. Дериватограф. 4. Тигли (5 шт.). 5. Весы лабораторные. Ход работы 1. Приготовить 4 навески полигидроксибутирата (по 0,1 г), внести в тигли. 2. Провести анализ в одинаковых условиях при скоростях нагрева 5, 10, 15 и 20 ºС/мин в соответствии с инструкцией к дериватографу. 3. Выполнить обработку полученных экспериментальных кривых, аналогична приведенной в предыдущей. На кривых ДТА отметить температуры максимумов пиков плавления полимера Тпл. 4. Построить график зависимости Тпл от скорости нагрева. Экстраполя- Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 75 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.2. Спектроскопические и термические исследования биополимеров цией Тпл на нулевую скорость нагрева определить истинную температуру плавления полимера. 5. Проанализировать высоту и форму эндотермических пиков плавления, рассчитать площади пиков и объяснить причину их изменения в зависимости от скорости нагрева. Определить истинную температуру плавления образца ПГБ. Результаты внести в рабочую тетрадь. Определение теплоты плавления и степени кристалличности полимеров (на примере полигидроксибутирата) Материалы и оборудование 1. Образец полимера (ПГБ) в виде мелкодисперсного гомогенного порошка. 2. Оксид алюминия (эталон). 3. Дериватограф. 4. Тигли (3 шт.). 5. Весы лабораторные. 6. Бензойная кислота. Ход работы 1. Приготовить навески полигидроксибутирата (по 0,1 г), внести в тигли. 2. Провести анализ в одинаковых условиях в соответствии с инструкцией к дериватографу. 3. Выполнить обработку полученных экспериментальных кривых аналогично приведенной в предыдущей. 4. По кривым ДТА определить температуры плавления исследуемых образцов и определить теплоты плавления по отношению к бензойной кислоте. 5. Рассчитать степень кристалличности полимеров (Сх). 6. Определить теплоту плавления и степень кристалличности исследуемого образца полигидроксибутирата. 7. Все полученные результаты внести в рабочую тетрадь. Вопросы 1. Какие основные методы исследования полимеров позволяют определить структуру материала? 2. Для чего необходимо определение температурных характеристик полимеров? 3. Какие методы исследования позволяют определить температуру размягчения, температуру плавления и термической деградации полимеров? 4. По каким показателям при расшифровке ИК-спектров можно объяснить зарегистрированные различия в образцах полимеров разной природы и структуры? Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 76 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.3. Рентгенострутурный анализ и ЯМР-спектроскопия биополимеров Цель работы: Знакомство с прецизионными физическими методами исследования структуры полимеров (на примере ПГА различного химического состава). Свойства ПГА определяются их строением, прежде всего они зависят от строения боковых групп в полимерной цепи, а также от расстояния между эфирными группами в молекуле. На примере только нескольких типов ПГА показано, что свойства этих полимеров значительно меняются в зависимости от типа и соотношения мономеров в полимерной цепи. В результате этого на базе ПГА можно иметь спектр материалов с различными физикомеханическими свойствами, пригодными для различных применений. Первым среди выделенных и наиболее полно к настоящему моменту охарактеризованным ПГА был полигидроксибутират (ПГБ). Полигидроксибутират (С4H6O2) – это гомополимер D(–)–3–β-гидроксимасляной кислоты, представляет собой изотактический полиэфир с регулярными, повторяющими единицами (С4H6O2). Процесс кристаллизации ПГБ (и других ПГА) имеет место только после экстракции полимера из клеточной биомассы растворителями; кристаллизация полимера находится под кинетическим контролем и ингибируется субмикронными частицами, в оболочках которых ассоциированы белки и фосфолипиды в полимерных внутриклеточных гранулах. ПГБ представляет собой бесцветное полукристаллическое гидрофобное вещество, плотность его аморфной фазы составляет 1,177 г/см3, кристаллической – 1,23–1,26 г/см3. В ПГБ кристаллическая фаза доминирует над аморфной. ПГБ представлен плотно упакованными двойными спиралями, повторяющимися на расстоянии 5,95 Ă и двукратно закрученными вправо вокруг оси. Конформация спирали стабилизируется взаимодействием карбонилметильных групп и не зависит от гидроксильных групп. Цепь оксибутирата имеет 21 спиральную конформацию, орторомбические ячейки в решетке при пространстве группы P212121 характеризуются следующими параметрами: а = 5,76 Ẫ, б = 13,20 Ả, с = 5,96А. На рис. 32 в качестве примера представлены дифрактограммы кристаллизованного полигидроксибутирата; дифрактограммы нативных кристаллов сняты на высушенных клетках с содержанием полимера до 60 % (рис. 32, а) и волокнах (рис. 32, б). Кристаллическая структура ПГБ исследуется рентгенострутурным анализом ориентированных полимерных волокон (рис. 33). Рентгенограммы волокон показали повторение вдоль оси цепи на расстоянии 0,596 мкм двойных антипараллельных цепей, упакованных в орторомбические ячейки решетки. Изолированные монокристаллы ПГБ имеют сетчатую структуру со следующими параметрами осей: короткая 0,3–2,0; длинная 5,10 нм. Толщина одного кристалла составляет 4–10 нм в зависимости от молекулярного веса полиме Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 77 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.3. Рентгенострутурный анализ и ЯМР-спектроскопия биополимеров ра, типа растворителя и температуры кристаллизации. ПГБ в кристалле формируют сферолиты при кристаллизации из расплавов в твердофазное состояние. а б Рис. 32. Рентгеновские дифрактограммы ПГБ: а – кристаллический полимер (экспозиция образца 2 ч); б – волокно с ориентированным кристаллом ПГБ (экспозиция образца 2 ч) Рис. 33 Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 78 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.3. Рентгенострутурный анализ и ЯМР-спектроскопия биополимеров Рис. 34. 13С спектр поли-3-гидроксибутирата (ПГБ) Для мономолекулярного звена молекулы ПГБ зарегистрированы три возможные изомерные конформации (рис. 34) методом ЯМР при измерении протонного спектра 1Н (500 МГц) в дейтерохлороформе при комнатной температуре. Полученные спектры ЯМР показывают, что данный полимер представляет собой изотактический полиэфир с регулярными, одинаково ориентированными последовательными единицами D-(β)-3-оксимасляной кислоты: [-O-CΗ(CH3)-CΗ2-CΟ-]n Спектры ЯМР 13С (125 МГц) и 1Н (500 МГц) образцов ПГБ, синтезированного бактериями R. eutropha В5786 при использовании ими в качестве источника энергии водорода и углерода углекислоты совпали с высокой точностью с аналогичными спектрами образцов ПГБ, синтезированных R. eutropha Н16 при росте на фруктозе и Bacillus megaterium KM – на глюкозе. Приведенный на рис. 35 1Н (500 МГц)-спектр раствора ПОБ в дейтерохлороформе при комнатной температуре иллюстрирует форму мультиплетов для СН-, СН2- и СН3-групп протонного спектра. Полученная форма линии для СНгруппировки строго согласуется с теорией, согласно которой все приведенные на рис. 35, б мультиплеты должны быть симметричными. Анализ констант-дипольного взаимодействия между протонами НА, НВ и НХ в магнитноизолированном фрагменте, показанном на рисунке, позволил получить данные по трем возможным конформациям, которые обозначены через I, II и III (рис. 35, а), обусловлены поворотами вокруг связей Н3СНХС-СНАНВ. С учетом общепринятых теоретических значений для констант, характеризующих транс- и гош-конформации, получено свидетельство о доминировании в полиоксибутирате конформации I и II типа и практическом отсутствии конформации III типа. С использованием рентгеноструктурного анализа выявлено доминирование в полиоксибутирате кристаллической фазы над аморфной. Степень кристалличности различных образцов ПГБ мало зависит от условий получения и лежит в диапазоне 0,62–0,80. Типичный рентгеновский спектр полигидроксибутирата представлен на рис. 36. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 79 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.3. Рентгенострутурный анализ и ЯМР-спектроскопия биополимеров Рис. 35. Три возможные изомерные конформации (I – транс; II – гош; III – протии воположная гош) (а) и прецизионная регистрация отдельных линий спектра 1Н (500 МГц) полиоксибутирата (б), синтезированого Ralstonia eutropha B 5786 (спектр из работы А. В. Фалалеев, Т. Г. Воловой, Э. П. Зеера) Рис. 36. Рентгеновский спектр полиоксибутирата, синтезированого Ralstonia eutropha B5786, степень кристалличности Сх 72 % (из работы Т. Г. Волова с соавт., 2002) Рентгеноструктурный анализ серии образцов полигидроксибутирата, синтезированных бактериями R.eutropha B5786 в различных режимах биосинтеза на различных источниках углерода, свидетельствует о достаточно постоянных для данного материала значениях степени кристалличности Хс. Разброс величин, полученных на серии из нескольких десятков образцов, лежит в диапазоне 66–78 %. Проведение рентгеноструктурного анализа и определение степени крситалличности ПГБ Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 80 МОДУЛЬ 3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Работа 3.3. Рентгенострутурный анализ и ЯМР-спектроскопия биополимеров Материалы и оборудование 1. Образцы гомогенного ПГБ и сополимеров ПГБ/ПГВ в виде пленок (или прессованных трехмерных компактов диаметром 5 мм). 2. Рентгеноспектрометр D8 ADVANCE фирмы Bruker (Германия) (графитовый монохроматор на отраженном пучке). Ход работы 1. Образцы ПГА последовательно помещать в кювете рентгеноспектрометра. 2. Используя инструкцию по работе на приборе, снять спектры в пошаговом режиме («scan-step») с шагом 0,04º и 2-секундной выдержкой для измерения интенсивности в точке (режим работы прибора 40 кВ х 40 μА . 3. Записать полученные спектры. 4. С использованием ЭВМ произвести обработку полученных спектров, определить соотношение аморфной и упорядоченной фаз; вычислить степень кристалличности (Сх). 5. Сопоставить значения Сх для ПГБ и сополимера ПГБ/ПГВ. 6. Внести полученные спектры и результаты в рабочую тетрадь. Ознакомление с принципом работы ЯМР-спектрометра Материалы и оборудование 1. Образцы гомогенного ПГБ виде пленок (или прессованных трехмерных компактов диаметром 2 см). 2. ЯМР-спектрометр. Ход работы 1. Образец ПГБ поместить в кювете ЯМР-спектрометра. 2. Используя инструкцию по работе на приборе, провести запись спектра. 3. С использованием ЭВМ произвести обработку полученного спектра. 4. Внести полученные спектры и результаты в рабочую тетрадь. Вопросы 1. Какую информацию о структуре полимеров можно получить, анализируя данные рентгеноструктурного анализа? 2. Как влияет соотношение аморфной и кристаллической фаз в полимерном материале на его технологические свойства? 3. Насколько информативна ЯМР-спектроскопия при изучении химической структуры полимеров? Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 81 МОДУЛЬ 4. (ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ НЕ ПРЕДУСМОТРЕНЫ) МОДУЛЬ 5. (ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ НЕ ПРЕДУСМОТРЕНЫ) Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 82 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Цель – дать представление о требованиях, предъявляемым к условиям, помещению, оборудованию, материалам и средам для ведения клеточных культур. Задачи: знакомство с современным культуральным оборудованием; обучение специфическим приемам и методам, необходимым для работы с культурами клеток. Объекты: боксированные помещения, культуральная посуда и среды, оборудование для хранения, выращивания и исследования клеток. Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса Цель работы: приобретение знаний о требованиях, предъявляемым к рабочему месту, посуде, средам и материалам, предназначенным для работы с клеточными культурами, принципах обеспечения условий безопасной работы. Использование клеточных культур и клеточных технологий относится к одному из наиболее актуальных современных направлений биотехнологии. Культуры клеток используют для производства биологических материалов, предназначенных для получения целевых макромолекул и технологий тканевой инженерии. В культурах клеток можно варьировать условия среды, обеспечивая получение необходимых количеств клеточной массы требуемой дифференцировки. Клеточные культуры активно используют для тестирования биологической безопасности новых материалов, биологически активных и лекарственных веществ. Особое направление применения клеточных культур – тканевая инженерия. Следует подчеркнуть, что наиболее важным элементом успеха тканевой инженерии является наличие необходимого количества функционально активных клеток, способных дифференцироваться, поддерживать соответствующий фенотип и выполнять конкретные биологические функции. Клетки в ходе дифференцировки должны продуцировать внеклеточный матрикс (в его основе белки, в частности коллаген) соответствующей организации и структуры, выделять цитокины и другие сигнальные молекулы, а также Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 83 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса взаимодействовать с соседними клеткам или тканями. В связи с этим возникает необходимость создания адекватных условий для роcта и дифференцировки клеток in vitro. Принципы работа в клеточной лаборатории и основные асептические лабораторные методы В лаборатории, предназначенной для культивирования клеток, должны постоянно поддерживаться условия высокой асептики. В странах ЕС практика регламентируется директивами GLP. Директивы GLP касаются общих процедур, позволяющих успешно выполнить эксперимент и обеспечивают повторяемость эксперимента; они включает правильное планирование экспериментов, письменную регистрацию всех выполненных экспериментальных процедур (в лабораторной книге), обучение по крайней мере двух ученых, способных самостоятельно выполнить эксперимент и соответствующую маркировку этикетками всех веществ/сред/культур (наименование, дата, описание, номер пассажа и тип клеток). Следует обязательно письменно регистрировать методики или стандартные операционные процедуры, а также содержать лабораторное оборудование в чистоте. Протоколы GLP сводят до минимума потенциальные риски биологической опасности для исследователя. Важнейшее условие для работы с клеточными культурами – соблюдение правил стерильности. Микробная инфекция приводит к гибели клеток, снижается их рост и нарушается экспрессия клеточных белков, что ведет к искажению результатов эксперимента. При культивировании клеток следует обязательно выполнять приведенные ниже общие асептические приемы: следует обязательно надевать одноразовые перчатки (например, из нитрила) при работе в лаборатории с культурами клеток; надевать чистые лабораторные халаты, которые ни в коем случае не выносить из лаборатории; перед началом работы рабочие участки и руки в перчатках следует протирать 70 %-ным спиртом; работать только в специально обозначенных «чистых зонах», в частности в ламинарном шкафу для культур тканей; все предметы и руки в перчатках должны протираться 70 %-ным спиртом при каждом входе в стерильную зону, например бокс, ламинарный шкаф или термостат; стерильные флаконы или колбы следует открывать только в ламинарном шкафу непосредственно перед использованием и ни в коем случае не оставлять открытыми; стерильные одноразовые пипетки должны доставаться из упаковок внутри ламинарного шкафа и только непосредственно перед использованием; когда со стерильных флаконов или колб снимаются крышки, по возможности крышку не следует класть на рабочий стол, открытый флакон Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 84 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса нужно наклонить, чтобы микроорганизмы из среды попадали только на край флакона; жидкости не следует брать из разных флаконов одной и той же пипеткой; для каждого флакона должна использоваться новая стерильная пипетка; при выполнении процедур с культурой клеток нельзя разговаривать, кашлять или чихать; работа должна выполняться как можно быстрее во избежание инфекции клеток. Методы стерилизации Существует несколько методов стерилизации лабораторного оборудования и/или образцов: термическая обработка, фильтрация через поры диаметром 0,2 мкм, химическая очистка (моющее вещество или спирт) и ультрафиолетовое облучение. Большинство микроорганизмов нейтрализуется (уничтожается) при температуре 55–80 ºС, поэтому широко используются методы стерилизации более высокой температурой, а именно кипячение. Однако эндоспоры и прионы могут сохраниться и при кипячении, поэтому в большинстве лабораторий, культивирующих клетки, наиболее распространенным и эффективным методом является обработка в автоклаве. В автоклавах пар образуется при температуре около 134ºС под давлением. Больши нство современных автоклавов также включают функцию сушки в конце цикла. Преимущества и недостатки обычных способов стерилизации приводятся в табл. 6.1. Таблица 6.1 Преимущества и недостатки общепринятых способов стерилизации Метод Описание стерилизации и случаи применения 1 2 Обработка Пар, создаваемый при в автоклаве 120–134 ºС под давлением. Обычно используется для лабораторного оборудования, т. е. наконечников пипеток, пинцетов и т. д. Фильтры с по- Среды или другие чувстрами 0,2 мкм вительные к нагреванию жидкости пропускаются через стерильный фильтр с порами 0,2 мкм Ультрафио- Обычно используется летовый для стерилизации посвет верхностей и воздуха после уборки помещений Преимущества Недостатки 3 4 Эффективно уничто- Не подходит для стерилижает большинство мик- зации сред, так как уничроорганизмов (возмож- тожаются питательные вено за исключением щества. Может изменить некоторых белков-при- свойства материала. Треонов) бует регулярных проверок давления Простые и неинва- Микоплазма и вирусы не зивные для удаления удаляются. Должно выбактерий и грибков полняться в стерильных из жидкостей условиях Нейтрализует микро- Плохая проникающая споорганизмы и вирусы собность. Не подходит для стерилизации сред Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 85 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса Окончание табл. 6.1 1 Химический метод: 70 %ный спирт 2 Широко используется в качестве очищающего реагента. При стерилизации материалов иногда используется более продолжительное время воздействия Химический Часто используется для метод: газ медицинских материалов оксид этилена (ЕТО) Печи горячего воздуха (сухое нагревание) (как правило, 170 º С в течение 2 часов) 3 Низкая токсичность (по сравнению с другими химическими дезинфицирующими веществами), удобен 4 Не всегда эффективен против некоторых грибков, бактериальных эндоспор и некоторых вирусов Безвреден для большинства материалов, высокие уровни стерильности Не может стерилизовать жидкости, герметичные контейнеры и некоторые пластмассы. Требует много времени (3–7 дней), специализированного оборудования Обычно используется для Смачивание отсутст- Требуется более продолстерилизации стеклян- вует жительная обработка при ной посуды и металличеболее высоких температуских предметов рах по сравнению с автоклавом. Не подходит для пластмассовых изделий Для мытья и обработки лабораторной посуды предусмотрен дезинфекционно-моечный автомат G 7883 CD фирмы LABCONCO, США (рис. 37) Рис. 37. Дезинфекционно-моечный автомат G 7883 CD Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 86 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса Технические характеристики дезинфекционно-моечного автомата G 7883 CD Моечная машина для мойки универсального применения в лаборатории имеет следующие характеристики: материал – нержавеющая сталь; электронное управление; восемь моечных программ с возможностью модификации; объем моечной камеры – 0,13 м3; производительность циркуляционного насоса – 400 л/мин; встроенная система смягчения воды, встроенная система фильтрации; встроенный агрегат для сушки; встроенный насос для подачи дистиллированной воды; встроенный пароконденсатор; электообогрев; наличие сливного насоса; наличие 1 дозирующего насоса DOS 60/30 для жидких моющих средств; вставка для лабораторного стекла (широкогорлые стаканы) емкостью 250–600 мл; вставка для пробирок (от 160 до 200 пробирок) высотой до 200 мм; вставка для 38 половинок чашек Петри диаметром 100 мм; размеры машины: в мм, 820×900×700, размеры моечной камеры: в мм, 500×535×500 мм. Электроподключение 400 В, 50 ГЦ. Вертикальный программируемый автоматический автоклав фирмы «Sanyo» MLS-3781L, Япония, предназначен для стерилизации сред, элементов ферментационного оборудования (рис. 38). Рис. 38. Автоматический автоклав «Sanyo» Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 87 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса Технические характеристики автоматического автоклава «Sanyo»: Полезный объем, 75 л; Размеры камеры, в мм: 370х640; Материал камеры: нержавеющая сталь SUS404; Внешние размеры, в мм: 600х979х560; Автоклав рассчитан на максимальное давление, 0,235 МПа; Температура стерилизации: от 105 ºС до 135 ºC; Таймер стерилизации: от 1 до 250 мин; Таймер поддержания температуры; Задержка до 72 ч, автоматическое выключение; Программный таймер: от 1 до 99 ч; Источник питания: напряжение в сети 220 В, частоту 50 Гц. Клеточные технологии ориентированы на культивирование клеток на разнообразных средах и материалах, которые должны быть стерильными. Кроме нейтрализации микроорганизмов также крайне важно, чтобы метод стерилизации не изменял свойства материала. Многие используемые на практике матриксы для клеток изготовлены из резорбируемых материалов, поэтому к ним не применимы методы мокрой стерилизации, а должно применяться УФ-облучение, которое, однако, стерилизует только поверхность, не проникая внутрь материала или матрикса. Нагревание или химическая стерилизация может изменить химический состав и/или механические свойства материала. Кроме удаления живых микроорганизмов при исследовании материалов большое значение имеет удаление фрагментов мертвых микроорганизмов (в частности, бактерий) и продукты их обмена (эндотоксины). Поэтому в исследованиях биоматериалов необходимо тщательно мыть материалы и матриксы как дополнение к стерилизации. Рис. 39. Низкотемпературный морозильник New Brunswick scientific Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 88 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса Для хранения клеточного материала предусмотрен вертикальный низкотемпературный морозильник фирмы New Brunswick scientific, США (рис. 39). Технические характеристики низкотемпературного морозильника New Brunswick Морозильник включает: двухстадийную систему каскадного охлаждения; внешнюю дверь на петлях с изоляцией; внутренние камеры морозильника с индивидуальной изоляционной внутренней дверью на петлях; вентилятор с пониженным шумопроизводством; замок; систему запирающегося доступа к общему выключателю и выключателю системы сигнализации; панель управления с фронтальным расположением; регистратор данных с возможностью передачи данных на небумажные носители для облегчения валидации; полки из нержавеющей стали; стеллажи; моющийся фильтр; ролики для мобильного передвижения. Полезный объем: 570 л; число камер: 5; 25 стеллажей; вместимость: 570 шт. 2 дюймовых криобоксов или 300 шт. 3 дюймовых; 200 шт. 4 дюймовых криобоксов. Система охлаждения состоит из герметичной двустадийной каскадной системы; время понижения температуры – до 4,5 ч. Диапазон температур (при температуре внешней среды до +32 ºC): от –50 ºC до –86 ºC с шагом 1 ºC. Внешний замок; микропроцессорное управление; пароль доступа: 4 знака. Имеется сигнализация превышения или понижения температуры, отключении электроэнергии, необходимости замены батареи и смены фильтра. Внешние размеры в мм: 1925х1025х852. Внутренние размеры в мм: 1265х765х575. Источник питания: 220 В, 1 фаза, частоту 50 Гц, 15 А. Все работы с клеточными культурами выполняются в боксированном помещение (рис. 40). Культуральный бокс изготовлен из пластиковых стеклопакетов. Обрудован следующим комплектом необходимого оборудования: 1 – боксламинар «Labconco» (США), 2 – СО2-инкубатор фирмы «Sanya» (Япония), 3 – стол с инвертированным микроскопом Ломо (Санкт-Петербург, Россия), 4 – холодильники 2 шт., 5 – стеллаж для посуды, 6 – УФ-облучатель, 7 – баллон с СО2. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 89 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса Рис. 40. Фото культурального бокса, оборудованного в отделение клеточных культур Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ (кафедра биотехнологии) Оборудование культурального бокса: В комплект необходимого оборудования бокса для работы с клеточными культурами, должны входить: 1) бокс-ламинар 2-го класса защиты; 2) СО2-инкубатор; 3) Инвертированный микроскоп; 4) Холодильник для хранения сред; 5) Шкаф для посуды. Для культивирования клеток, выращиваемых в чашках Петри или пластиковых планшетах, предназначен СО2-инкубатор. В инкубаторе поддерживается необходимая температура (порядка 37 ºС), влажность и гумидная среда (5 % об. СО2). Фото СО2-инкубатора представлено на рис. 41. Рядом с инкубатором находится бокс-ламинар, позволяющий одновременно работать 2 студентам (или преподавателю и студенту) (рис. 42). Ламинар – это место, где производятся все манипуляции с клетками, то есть это и есть собственно рабочее место экспериментатора. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 90 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса Рис. 41. СО2-инкубатор Innova CO-48 фирмы «New Brunswick Scientific» (Япония) : 1 – двойная дверь, 2 – панель управления подачи СО2, 3 – цифровое табло стабилизации параметров среды, 4 – панель управления параметрам, 5 – баллон с СО2 (оборудоване кА федры биотехнологии ИФБиБ СФУ) 15 А. Технические характеристики СО2-инкубатора Innova CO-48 : Объем: 48 л; Размеры камеры, в мм: 401х401х308; Внешние размеры, в мм: 645х484х475; Оснащен ИК-датчиком СО2; Регулируемый диапазон температуры: от +1 С до +50 С; Точность установки температуры: ±0,1 С; Равномерность температуры: ±0,2 С; Диапазон поддержания СО2: от 0,2 до 20 %; Точность стабилизации СО2: ±0,1С; Восстановление концентрации СО2: 0,7 % за 1 мин; Оборудован 3 полками, резервуаром системы увлажнения; Осуществляется естественная конвекция; Бокс оснащен системой сигнализации для нештатных ситуаций; Источник питания: напряжение в сети 220 В, 1 фаза, частота 50 Гц, Бокс-ламинар биологической безопасности 2 класса защиты фирмы LABCONCO, США предназначен для работы с клеточными культурами (рис. 42) Ламинар оборудован УФ-облучателем, системой фильтров грубой и тонкой очистки воздуха, подсветкой. Поверхности изготовлены из нержавеющей стали, что позволяет обрабатывать ее с применением стерилизующих жидкостей и обжига. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 91 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса Рис. 42. Бокс-ламинар, подготовленный к работе На столешнице бокса размещают стакан с пинцетами, автоматическими пипетками, скальпелями; пенал с автоматическими и стеклянными пипетками, флакон со спиртом; упаковки стерильной посуды, приспособления для работы с клетками (наконечники, пробки, фильтры), а также горелка со спиртом, закрытая керамическим колпачком. Перед работой поверхность стола тщательно промывают водой с моющим раствором и обрабатывают кусочком ваты, смоченной в спирте. Это необходимо потому, что осевшая на поверхность стола пыль является потенциальным источником заражения клеточной культуры. При работе в боксе все операции следует проводить в непосредственной близости от зажженной горелки, чтобы обеспечить максимальную защиту посуды, растворов, сред и культур от заражения. Технические характеристики бокса-ламинара LABCONCO Бокс-ламинар обеспечивает надежную защиту продукта, оператора и окружающей среды; соответствует требованиям европейского EN 12469 и американского NSF49 стандартов. Оборудован: современными фильтрами ULPA с эффективностью очистки 99,9997 %; имеется микропроцессорный контроль и система сигнализации; автоматическая компенсация воздушного потока; наклон фронтальной панели 10º; антимикробное покрытие столешницы: на основе ионов серебра. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 92 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса Материал корпуса: 1,5 мм гальванизированная сталь, покрытие из порошковой эмали с последующей термообработкой. Внешние размеры: 1725x815x1640 мм. Внутренние размеры: 1565x623x715 мм. Бокс-ламинар оснащен микроволоконными минискладчатыми фильтрами ULPA (Ultra Low Penetrating Air, что позволяет достигнуть непревзойденных степеней очистки воздуха для частиц размером 0,12 мкм и 99,9997 %. Воздухозабор: исходное значение: 0,53 м/с. Нисходящий поток (70 %), м3/ч – 1134. Выходящий поток (30 %), м3/ч – 677. Чистота рабочей зоны: Класс 2 согласно ISO 14644.1. Тип фильтра для нисходящего и выходящего воздуха: UPLAфильтр в металлической защитной раме с уплотнителем, соответствие стандартам EN 1822 и IEST-RP-CC001.3. Эффективность фильтрации: минимум: 0,12 мкм, Соответствует требованиям NSF49; EN12469 и UL; по чистоте воздуха: ISO 14644.1 Class 2. По эксплуатационным качествам фильтров: IEST-RP-CC034.1, I ESTRP-007.1. Источник питания: напряжение в сети 220 В, частоту 50 Гц. Инвертированный микроскоп позволяет анализировать посевы клеток на поверхности сред в чашках Петри или планшете снизу, что очень удобно, так как клетки прикрепляются ко дну культуральной посуды (рис. 43). а б Рис. 43. Фото инвертироанного микроскопа (а) и принцип микроскопирования клеточных объектов (б) (оборудование кафедры биотехнологии ИФБиБ СФУ, фото Е. И. Шишацкой) При работе в боксе-ламинаре с клетками необходимо соблюдать правила личной гигиены. Студент, приступающий к работе, должен быть в чис Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 93 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.1. Знакомство с оборудованием культурального бокса том халате, шапочке, иметь ватно-марлевую повязку. Перед работой в ламинаре необходимо обработать руки ватным диском, смоченной в дезрастворе или спирте. После этой обработки уже не следует выносить руки за пределы ламинара. Если же это произошло, необходима повторная обработка рук для исключения попадания микроорганизмов в стерильную зону. Вопросы 1. Какое оборудование необходимо для работы с клеточными культурами? 2. Почему для клеточных технологий необходимо наличие боксаламинара 2-го класса защиты? 3. Какие методы стерилизации используют при работке с клеточными культурами? 4. Для чего требуется наличие в клеточной лаборатории СО2инкубатора и какие условия в нем следует стабилизировать? 5. Какие требования предъявляются к студентам и сотрудникам, работающим с клеточными культурами для обеспечения безопасных условий труда и условий строгой стерильности на рабочем месте? Работа 6.2. Посуда и питательные среды для работы с клеточными культурами Цель работы: ознакомить с набором посуды, используемой для выращивания клеток, с составом и принципами приготовления питательных сред. Для роста in vitro клеткам необходимы ростовые субстраты и факторы роста и дифференцировки; среди них – углеводы, соли, аминокислоты, витамины, жирные кислоты и белки. Основная культуральная среда должна содержать неорганические соли, аминокислоты, глюкозу, витамины, жирные кислоты и некоторые белки. В среду вносят также краситель феноловый красный и буферную систему на основе бикарбоната. Большинство клеток в культуре требуют оптимального рН в пределах от 7,2 до 7,4. Буферная система на основе бикарбоната в сочетании с атмосферными 5 % СО2 обеспечивает стабилизацию оптимальной величины рН. Феноловый красный в среде служит индикатором рН: он имеет розовый цвет при оптимальном рН, изменяет цвет на желтый, когда среда становится кислой, и на бордовый, когда среда становится щелочной. Основная или минимальная среда обычно дополняется 10–15 %-ной эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота (ЭТС), обогащенной белками и факторами роста. Сочетание антибиотиков и/или антигрибковых препаратов может также использоваться в культуре клеток для избежания заражения клеток бактериями и грибами. Клетки выращивают во влажном термостате при 37 ºС (оптимальная температура) Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 94 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.2. Посуда и питательные среды для работы с клеточными культурами в атмосфере, содержащей 5 % СО2. При обращении с клетками в культуре во избежание микробного заражения необходимо соблюдать условия строгой стерильности. Для приготовления питательной среды для клеток используют набор реагентов, среди которых: питательные среды, сыворотка, индикаторы, антибиотики, трипсин и т. д. Состав питательной среды: 1. L-изомеры аминокислот; 2. Неорганические соли; 3. Витамины; 4. Другие компоненты (сахара, кислоты, дрожжевой экстракт и т. д.). Приготовление питательной среды 1. Перед использованием готовых питательных сред в них следует добавить определенное количество (обычно 5–10 %) сыворотки (эмбриональной, крупного рогатого скота и т. д.). 2. Внести ростовые факторы, обеспечивающие диффренцировку исходных клеток в нужном направление (эпидермальные ростовые факторы – EGF, факторы роста фибробластов – FGF, эритропоэтин, интерлейкин-3 – IL-3). Ростовые факторы – это высокоспецифичные белки сыворотки; большинство из них вносится в питательные среды в очень незначительных количествах: 10–9–10–11 М. Функцией ростовых факторов является прежде всего стимуляция пролиферации клеток и клеточного метаболизма. Примерами богатых многокомпонентных сред могут служить: среда 199, среда DМЕМ. Эти среды мы и будем использовать (табл. 6.2). Таблица 6.2 Примеры широко используемых культуральных сред Компонент питательной среды Среда DМЕМ Гидролизат лакт-альбумина (ГЛА) Среда 199 Глутамин Сыворотка эмбриональная Нистатин Содержание, % 40 40 10 1–2 8–9 0,05 3. В среду обязательно внести антибиотики (из расчета на 100 мл): Пенициллин 1 000 000 ед. 20 мкг, гентамицин – 1000 ед. 25 мкл. 4. Питательные среды готовятся переливанием в один флакон всех составных частей в направлении уменьшения объема (DМЕМ→ ГЛА → среда 199 → и т. д.). 5. Компоненты составных питательных сред, которые не могут быть стерилизованы в автоклаве или сухожаровом шкафу, необходимо подвергнуть стерилизации фильтрованием. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 95 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.2. Посуда и питательные среды для работы с клеточными культурами 6. Внести индикатор. Культуральная клеточная среда имеет красный цвет в результате добавления в среду индикатора фенолового красного. Индикаторы добавляют в питательные среды для того, чтобы контролировать кислотность среды в любой момент выращивания клеток, которые подкисляют среду продуктами обмена, и индикатор приобретает желто-оранжевое окрашивание. В процессе культивирования клеток необходимо следить за степенью прозрачности среды. Замутнение среды или изменение цвета индикатора на ярко-желтый или красно-синий (малиновый) может свидетельствовать о заражении среды и культуры клеток посторонними микроорганизмами. В ходе культивирования и пересева клеток используют, помимо основных ростовых, антибиотических и индикаторных компонентов, трипсин и версен. Эти реагенты необходимы для дезагрегации монослоя при пересеве клеточной культуры или для выделения клеток из тканей при получении первичных культур. Обычно при пересеве используют раствор трипсин – версена в соотношении 1:1. Лабораторная посуда и мелкий инструментарий, необходимые для выращивания клеток 1. Пластиковые планшеты. 2. Чашки Петри. 3. Стеклянные и пластиковые флаконы. 4. Плоскодонные бутыли. 5. Сосуды Карреля. 6. Флаконы для питательных сред различного объема. 7. Пипетки автоматические с пластиковыми одноразовыми наконечниками. 8. Стеклянные мерные пипетки. 9. Пеналы для стерилизации и хранения пипеток. 10. Фильтры, пробки резиновые и ватно-марлевые. 11. Насосы-дозаторы. 12. Шейкеры-инкубаторы. 13. Шпатели. В случае использования стеклянной посуды перед процедурой стерилизации она тщательно моется поверхносто-активными веществами. Для этого используем посудомоечную машину LABCONCO ® фирмы Fiaskscrubber ® (США). После высушивания посуды все отверстия в стеклянной посуде (горлышки бутылей, флаконов, сосудов Карреля) заворачиваются в двойной слой фольги таким образом, чтобы внешний слой фольги был длиннее внутреннего. Это обеспечивает дополнительную защиту внутренней среды сосуда или флакона. Резиновые пробки, наконечники для автоматических пипеток, фильтродержатели с фильтрами помещаются в стеклянные стаканы, которые также закрываются перед стерилизацией двойным слоем фольги. Манипулирование с посудой, переливание растворов в ходе приготовления сред, пересевы клеток и пр., то есть все процедуры выполняются в работающем боксе- Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 96 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.2. Посуда и питательные среды для работы с клеточными культурами ламинаре таким образом, что горящая спиртовка отделяет рабочую зону от работающего. Вопросы 1. Какие компоненты являются обязательными в составе сред для выращивания клеток тканей и органов? 2. Для чего необходимо вносить в состав питательных сред для клеток антибиотики? 3. Какую роль играют в ходе выращивания клеток индикаторные красители? 4. Какую посуду, изготовленную из какого материала, используют для приготовления сред и культивирования клеток? Работа 6.3. Пересев клеток. Окраска, подсчет и фотографирование клеток Цель работы: обучить основным приемам работы с клеточными культурами in vitro в лаборатории. Различают два основных типа культуры клеток: первичную культуру и культуру стабильных клеточных линий. Первичные культуры получаются непосредственно из тканей животных и человека и культивируются либо как маленькие кусочки тканей, либо как отдельные клетки, полученные после обработки тканей ферментами, например трипсином и коллагеназой. Главным недостатком первичных культур является то, что они стареют физиологически и клетки утрачивают способность к делению, а также некоторые фенотипические признаки. Главное преимущество первичных культур – в сохранении многих первоначальных характеристик в течение всего ограниченного срока жизни. Стабильные клеточные линии могут поддерживаться в культуре либо в течение ограниченного числа клеточных делений, либо неопределенно долгий срок. Многие из таких линий получают из опухолевых тканей пациентов, при этом некоторые из клеточных линий становятся бессмертными (иммортализованными) при внедрении в клетку онкогенных вирусов. Эти клеточные линии могут продуцировать неограниченное число клеток, но клетки сохраняют очень мало специфичных для ткани характеристик. Для роста клеток, полученных из твердых тканей, требуется прикрепление к субстрату, в то время как клетки, полученные из крови, растут во взвеси. Клетки во взвеси имеют округлую форму, а клетки, прикрепленные к субстрату, различны по форме в зависимости от происхождения. Как только клетки прикрепятся к субстрату, они начинают делиться и размножаться, Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 97 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.3. Пересев клеток. Окраска, подсчет и фотографирование клеток образуя плотный непрерывный слой, покрывающий субстрат. Большинство клеток, в особенности первичные клетки, контактируя с соседними клетками, прекращают рост, однако опухолевые клетки обычно имеют тенденцию к трехмерному росту с образованием множества слоев. Клетки в культуре, занимающие 70–80 % субстрата, в идеале можно обрабатывать трипсином, и затем пересевать часть клеток в новый флакон со свежей культуральной средой, т. е. получать субкультуры. Материалы и оборудование 1. Флакон со стерильной средой. 2. Образец культуры. 3. Пипетки, шпатели. 4. Культуральные планшеты, флаконы. 5. Спиртовка. 6. Бокс-ламинар. Размораживание клеток Большинство имеющихся в продаже клеток приобретается в замороженном виде. После получения эти замороженные клетки должны незамедлительно переводиться в жидкий азот для хранения. В нижеприведенном протоколе дается описание того, как оживить замороженные клетки, хранящиеся под жидким азотом. Ход работы 1. Подготовьте среду для выращивания клеток. 2. Подогрейте среду. 3. Наклейте этикетку на культуральный флакон и на центрифужную пробирку объемом 15 мл. 4. Добавьте 8 мл среды в центрифужную пробирку. 5. Достаньте ампулу, содержащую клетки, из банка жидкого азота (необходимо надеть термические перчатки и маску). 6. Оставьте ампулу при комнатной температуре около 1 мин, но не дольше. 7. Перенесите ампулу в водяную баню при 37 ºС и дайте ей оттаивать около 4 мин. 8. Вытрите ампулу салфеткой, смоченной в 70 %-ном спирте, и перенесите сразу же в ламинарный шкаф. 9. Аккуратно пипеткой внесите клетки в центрифужную пробирку. 10. Промойте ампулу в 1 мл свежей среды и добавьте в пробирку. 11. Осадите клетки в пробирке при 200 g в течение 5 мин. 12. Удалите надосадочную жидкость, не задевая осадок. 13. Встряхните пробирку для того, чтобы поднять осадок. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 98 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.3. Пересев клеток. Окраска, подсчет и фотографирование клеток 14. Добавьте 1 мл свежей среды и аккуратно суспендируйте клетки пипеткой. 15. Добавьте необходимое количество культуральной среды во флакон. 16. Добавьте во флакон со средой суспензию клеток и хорошо перемешайте. 17. Поставьте флакон в термостат. Когда клетки покроют 70–80 % поверхности флакона, их нужно пассировать на материалы или во флаконы со свежей средой. С каждой субкультурой число пассажей растет. Для воспроизводимости эксперимента число пассажей в культуре должно быть одинаковым в различных экспериментах с культурами клеток. Увеличение числа пассажей может привести к фенотипическим изменениям в клетках. Тестирование состояния клеток и контаминации Ход работы 1. Проверить культуральную среду. Если среда мутная, есть вероятность бактериальной инфекции (для прикрепленных на субстрате клеток). 2. Определить число прикрепленных клеток по сравнению с числом плавающих клеток. Плавающие клетки – это, как правило, мертвые клетки. 3. Исследовать морфологию клетки. Как правило (в зависимости от типа клетки) прикрепленные здоровые клетки распластаны и имеют веретеновидную удлиненную форму, иногда с отростками, округлые клетки – это либо делящиеся клетки, либо гибнущие клетки. 4. Ищите гигантские клетки. В большинстве культур частота таких клеток относительно низкая и постоянна при одинаковых условиях культивирования. 5. Определите скорость, с которой клетки прикрепляются и приступают к делению после пассажа. Прикрепление в течение 1–4 часов свидетельствует о том, что клетки не травмированы. 6. В то время как грибковые и бактериальные инфекции относительно легко обнаруживаются опытными учеными, заражение микоплазмой невидимо и поэтому более сложно для распознавания. Наборы для распознавания микоплазмы имеются в продаже и должны использоваться, если возникают признаки инфекции. Посев клеток на материалах Для воспроизводимости результатов важно определить число клеток, посеянных на квадратный сантиметр материала. Только при постоянстве числа клеток в разных экспериментах можно точно оценить свойства биологического материала, в частности рост клеток, прикрепление или продукцию клеточных факторов. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 99 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.3. Пересев клеток. Окраска, подсчет и фотографирование клеток Тест на окрашивание трипановым синим используется для определения плотности посева. Трипановый синий – это прижизненный краситель, не окрашивающий клетки, у которых мембрана не повреждена. Клетки, не поглощающие краситель, являются жизнеспособными. Соотношение жизнеспособных и мертвых клеток можно определить с помощью гемоцитометра (камера Горяева). Окрашивание клеток трипановым синим Ход работы 1. Приготовьте суспензию клеток в соответствии с протоколом субкультивирования. 2. Подготовьте гемоцитометр и покровное стекло, распылив на них 70 %-ный спирт и вытерев чистой салфеткой. 3. Прикрепите покровное стекло к гемоцитометру, смочив покровное стекло водой или выдыхаемым воздухом, наденьте покровное стекло на камеру и перемещайте вперед и назад, создавая небольшое давление, до тех пор пока не появятся ньютоновы кольца (радужные кольца). 4. Внесите 0,2 мл соответствующей суспензии клеток (в полной питательной среде) в герметичный флакон. 5. Добавьте 0,2 мл 0,4 %-ного трипанового синего и тщательно перемешайте (коэффициент разбавления – 2). 6. Дайте красителю отстояться в течение 2–3 мин при 15–30 ºС (комнатная температура). Продолжительное воздействие трипанового синего убивает клетки. 7. Пипеткой заполните обе камеры гемоцитометра. Не заполняйте камеры слишком большим количеством среды и проследите за тем, чтобы не было воздушных пузырей. 8. Под микроскопом подсчитайте количество живых (неокрашенных) и нежизнеспособных (окрашенных в синий цвет) клеток в 8–10 квадратах 4x4 или на площади 0,1 см2. Подсчитайте клетки в квадратах и клетки на левой и верхней средней линии. 9. Подсчитайте число жизнеспособных и нежизнеспособных клеток на миллилитр, пользуясь приведенными ниже формулами. Подсчет клеток Количество клеток в суспензии просчитывают в камере Горяева (рис. 44). Как правило, одновременно определяют жизнеспособность клеток методом исключения красителя (трипановый синий, эритрозин В, нигрозин). Живые клетки не проницаемы для красителей, а мертвые клетки проницаемы и окрашиваются. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 100 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.3. Пересев клеток. Окраска, подсчет и фотографирование клеток Рис. 44. Гемоцитометр (камера Горяева). Технические данные: зазор – 0,1 мм. Сторона малого квадрата 0,05 ± 0,001 мм. Сторона большого квадрата – 0,2 ± 0,0015 мм. Сторона сетки – 3 ± 0,005 мм. Площадь сетки – 9 мм2. Объем камеры – 0,9 мм3 Ход работы 1. Для определения количества живых клеток аликвоту суспензии (~40µl) смешать с равным количеством 0,4 % ( w/v) раствора красителя трипанового синего. Шлифованное покровное стекло притереть к предметному стеклу гемоцитометра (белая стрелка) до появления колец Ньютона, так, чтобы покрыть заштрихованные области (голубая стрелка). 2. Несколько микролитров смеси внести под покровное стекло камеры Горяева. Количество «квадратов», в которых просчитываются клетки, зависит от плотности клеточной культуры и от той точности, которая необходима (лучше просчитывать не менее 40–50 клеток). 3. Каждая заштрихованная область состоит из 9 больших квадратов размером 1х1, т. е. объем, ограниченный каждым большим квадратом, оказывается равным 1 мм х 1 мм х 0,1 мм = 0,1 мм3. Отбирают часть окрашенной суспензии пастеровской пипеткой и заполняют счетную камеру гемоцитометра, используя капиллярное всасывание, не переполняя каналы камер. 4. Подсчитать количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей. Считать клетки, касающиеся правой и верхней ограничивающих линий, но не клетки, касающиеся левой и нижней ограничивающих линий. Поскольку объем большого квадрата составляет 0,1 мм3, то, умножив усредненное значение числа клеток в одном квадрате на 104, получают количество клеток в 1 мл суспензии. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 101 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.3. Пересев клеток. Окраска, подсчет и фотографирование клеток 5. Сосчитать клетки под объективом x10. Счет клеток проводить в 4 наборах из 16 маленьких квадратов (в каждом углу центральной заштрихованной области). Считать только неокрашенные клетки. Разделив полученное число на 4, получим среднее число клеток на 1 мм2. Поскольку высота камеры составляет 0,1 мм, то пересчетный коэффициент для гемоцитометра равен 104. Предположим, что полученное значение составляет 20 клеток на 1 мм2. Тогда 20х104 равно числу клеток в 1 мл окрашенной трипановым синим суспензии, а 2х20х104 равно числу клеток в 1 мл исходной суспензии, т. е. концентрация живых клеток в исходной суспензии составляет 4х105 клеток в 1 мл. Для клеток неразведенной суспензии: С [кл/мл] = 2,5 х 105 (количество клеток в одном большом квадрате); С [кл/мл] = 4 х 106 (количество клеток в одном малом квадрате. Для клеток разведенной в два раза (красителем) суспензии: С [кл/мл] = 5 х 105 (количество клеток в одном большом квадрате); С [кл/мл] = 8 х 106 (количество клеток в одном малом квадрате). Через 3–4 суток после первого посева вырастает плотный монослой клеток. Процесс образования монослоя можно пронаблюдать в инвертированный микроскоп. Клетки, достигшие состояния монослоя, нуждаются в пересеве.Этот процесс можно разделить на следующие этапы: трипсинизация и рассев клеток. Процесс трипсинизации клеток Ход работы 1. Открыть емкость с трипсином и внести в сосуд пипетку. 2. Слить среду из сосуда с клетками в пустой чистый стакан (емкость для слива). 3. Добавить раствор трипсина в сосуд с клетками (раствор трипсина должен покрывать поверхность субстрата с клетками). 4. Удалить трипсин из сосуда с клетками в емкость для слива. 5. Повторно добавить такой же объем трипсина в сосуд Карреля. 6. Сосуд Карреля поместить в термостат на 10–15 мин при температуре 37 ºС для трипсинизации. (Сосуды Карреля необходимо время от времени слегка встряхивать для обеспечения равномерности протекания процесса). 7. Анализ хода трипсинизации проводить по степени прозрачности раствора трипсин-версена. Открепляясь от поверхности посуды, клетки выходят в раствор, и он становится мутным. Рассев суспензии клеток Ход работы 1. Перед началом второго этапа – рассева суспензии клеток – и промаркировать сосуды Карреля: на сосуде, в котором был монослой, ставится знак «+», а на сосуде, где не было монослоя (или на новых сосудах) ставится знак «−». Еще раз обработать резиновые пробки всех сосудов с растворами горящей ватой, смоченной в спирте. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 102 МОДУЛЬ 6. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. ТЕХНИКА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Работа 6.3. Пересев клеток. Окраска, подсчет и фотографирование клеток 2. Открыть емкости с питательной средой и поместить в них пипетки. 3. Перенести определенное количество питательной среды в сосуды Карреля со знаком «+». Пример расчета необходимого количества среды: в сосуде с «+» вы имеете монослой (это примерно 1,2 млн клеток в мл), для его рассева на 2 части следует исходить из того, что сосуд Карреля имеет полезный объем около 10 мл. Новый сосуд, в который надо пересеять часть клеток, тоже имеет объем 10 мл. Поэтому в суспензию с трипсином (сосуд «+») следует налить 20 мл среды, чтобы затем 10 мл клеточной суспензии перенести в сосуд Карреля со знаком «−», а остальные 10 мл оставить в «ст аром» сосуде. 4. После того, как все сосуды со знаком «+» залиты рассчитанным количеством среды, приступать к рассеву клеточной суспензии в новые сосуды. Рассеять клеточную суспензию из сосудов с «+» в сосуды с «−». 5. Стеклянная пипетка погружается в сосуд со знаком «+». Клеточная суспензия набирается в пипетку (приблизительно до половины ее высоты) и с силой выпускается обратно в сосуд. Эта операция проделывается несколько раз для того, чтобы дезагрегировать клеточные кластеры и обеспечить в дальнейшем равномерный рассев клеток и прикрепление их к субстрату. 6. Половину объема среды (в примере было 10 мл) из сосуда Карреля с суспензией переносится в новый сосуд. Сосуды Карреля и бутыль со средой закрыть над пламенем горелки. Пересев клеток закончен. Одним из преимуществ клеточной культуры перед другими объектами исследования является возможность продолжительного наблюдения за жизнедеятельностью клеток, за состоянием отдельных клеточных органелл, за процессами, идущими в клетках, фиксировать состояние культуры с учетом количественных и качественных параметров. Для этих целей применяют методы микроскопии клеток (как прижизненной, так и после фиксации) и фотографирование. Вопросы 1. Почему процедура ведения клеточной культуры начинается со стадии размораживания? 2. Как определить наличие контаминации культуры? 3. Что позволяет определить процесс окрашивания клеток трипановым синим? Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 103 МОДУЛЬ 7. ТЕХНОЛОГИЯ ВЕДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР Цель: дать представление о клеточных технологиях, условиях, необходимых для получения биологически активного материала. Задачи: знакомство с процедурами получения первичной культуры оборудованием; обучение специфическим приемам и методам, необходимым для работы с культурами клеток. Объекты: боксированные помещения, культуральная посуда и среды, оборудование для выращивания и исследования клеток, матриксы, биологический материал для выделения клеток. Работа 7.1. Получение и ведение клеточных культур Цель работы: приобретение знаний об источниках и методах выделения клеток, требованиях, предъявляемых к материалам и матриксам для их ведения. В клеточных технологиях используют различные типы клеток различного происхождения, в том числе первичные клетки и стволовые клетки. Первичные клетки – это зрелые клетки определенной ткани. Такие клетки могут быть выделены из организма-донора в процессе хирургического вмешательства. Первичные клетки, как правило, являются дифференцированными неделящимися клетками, то есть не способными делиться, или их потенциал к размножению и росту низок. При культивировании таких клеток in vitro возможно проявление тенденции некоторых типов клеток к дедифференцировке при их культивации, в результате которой клетки теряют соответствующий фенотип. Так, хондроциты при ведении в культуре вне организма весьма часто продуцируют фиброзный, а не прозрачный хрящ. Эти негативные тенденции и проявления, присущие первичным клеткам, показали необходимость поиска альтернативных источников клеток для развития технологий клеточной инженерии. Такой альтернативой стали стволовые клетки. Стволовые клетки – недифференцированные клетки, способные делиться, самообновляться и дифференцироваться в один или более типов специализированных клеток. Различают «взрослые» стволовые клетки и «эмбриональные» стволовые клетки. Главное направление современных иссле Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 104 МОДУЛЬ 7. ТЕХНОЛОГИЯ ВЕДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР Работа 7.1. Получение и ведение клеточных культур дований стволовых клеток – нахождение факторов стимуляции и условий выращивания для дифференцировки стволовых клеток в необходимые типы клеток. Для получения конкретного типа тканей прежде всего необходимо произвести подбор наиболее подходящей стволовой клетки для формирования необходимой ткани. Основные принципы тканевой инженерии заключаются в разработке и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из биодеградирующихся материалов, которые используют в сочетании с донорскими клетками и/или с биоактивными веществами. На первом этапе получают клетки, далее клетки культивируют in vitro на подложке (каркасе, матриксе) (scaffold) из биодеградируемого и биосовместимого материала и затем конструкцию имплантируют в место дефекта ткани. Техника получения биоактивных имплантатов и биоискусственных органов включает: 1) изготовление биосовместимых и биоабсорбируемых конструкций (инкубаторов) (scaffolds) для культивирования аутологических клеток пациента или клеток, взятых из банка; 2) выращивание клеток и формирование тканей in vitro и 3) последующую имплантацию полученных конструкций пациенту. Матрикс (каркас будущих тканей) должен иметь структуру, которая действует как шаблон, для роста ткани в трех измерениях и стимулирует новый рост в форме, заданной каркасом. Шаблон должен быть сетью больших пор (макропор); поры должны быть соединены друг с другом, а отверстия между порами должны иметь диаметр более 100 мкм. Идеальные матриксы должны стимулировать рост кровеносных сосудов (ангиогенез) внутри сети пор. Функционирующие клетки должны прикрепляться к субстрату (матриксу), чтобы далее формировать свой внеклеточный матрикс. Следующее необходимое свойство идеальных матриксов – это способность к биоразрушению. Продукты разрушения (распада) материала матрикса должны представлять собой нетоксичные продукты, которые выводятся из организма или метаболизируются в нем. Матриксы должны активировать клетки ткани для саморегенерации, чтобы они функционировали в качестве системы доставки и контролируемого выхода веществ, активирующих клетки. Механические свойства матрикса должны соответствовать механическим свойствам ткани организма-хозяина. Структура и прочность рассасывающихся каркасов должны также сохраняться до тех пор, пока не будет регенерировано достаточно ткани организма-хозяина. В связи с тем, что клетки в тканях взаимодействуют между собой с помощью межклеточных контактов и между ними существуют многочисленные связи, прежде чем начать выделение клеток, следует разрушить эти связи. Для этого применяют механические и ферментативные методы. Для получения монослойных культур фибробластов обычно используют ткани, содержащие большое количество специализированных механоцитов (кожа, легкие, мышцы и др.) или клеточные линии. Облученные или об Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 105 МОДУЛЬ 7. ТЕХНОЛОГИЯ ВЕДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР Работа 7.1. Получение и ведение клеточных культур работанные ми-томицином С монослойные культуры фибробластов часто используют в качестве фидерного слоя для выращивания кератоцитов, миелоцитов, миоцитов и других типов клеток. Фибробласты, выделенные из эмбриональной ткани, применяют для формирования фидера в 2-слойных системах при культивировании стволовых клеток. Материалы и оборудование 1. Биологический материал для выделения клеток. 2. Культуральные среды и посуда. 3. Ножницы, термостат, СО2-инкубатор. 4. Бокс-ламинар. Ход работы 1. Обработать участок кожи, очищенный от волос, 70 % этанолом. Вырезать острыми ножницами блок объемом 1 мм3. 2. Перенести в 35 мм чашку Петри, промыть от крови охлажденным ССР (Хэнкса, Эрла, Дульбекко и т. п.). Для улучшения прикрепления и роста фибробластов дно чашек целесообразно дополнительно обрабатывать факторами адгезии (коллаген, желатин, поли-й-лизин и т. п.). 3. Фрагмент кожи с помощью ножниц измельчить на 6–12 кусочков. Раствор удалить и заменить полной средой, содержащей 90 % среды DIMEM с низким содержанием глюкозы, 10 % ЭТС, 250 мг/л L-глютамина, 10~6М дексаметазона, 50 мг/л гентамицина. Кусочек кожи должен быть обращен эпидермисом наружу. На каждый кусочек нанести по 1–2 капли среды. В одной чашке должно находиться не более 5–6 фрагментов кожи. Если фрагменты будут большими, то может происходить их закручивание. 4. Инкубировать образцы при 37 ºС, 100 % влажности и 5 % СО2. 5. Через 12–18 ч в культуру доливают 3–4 мл полной питательной среды (в которую дополнительно можно внести ФРФ в дозе 1–2 мкг/мл) так, чтобы частицы кожи не оторвались от дна чашки. 6. Материал культивируют при 37 ºС, 100 % влажности и 5 % СО2 в течение 14–30 суток до образования монослоя клеток. Культуру исследуют методом световой микроскопии. Вопросы 1. Какие клетки целесообразнее использовать и каким образом их можно получить? 2. Как создать оптимальные условия для роста и дифференцировки клеток? 3. Каким образом провести правильную оценку и интерпретацию результатов культивирования? Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 106 МОДУЛЬ 7. ТЕХНОЛОГИЯ ВЕДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР Работа 7.2. Субкультивирование клеточных культур Цель работы: приобретение навыков длительного ведения клеточных культур, освоение техники субкультивирования. Материалы и оборудование 1. Культура клеток. 2. Среды и стерильная посуда. 3. Бокс-ламинар Logic ™ (LABCONCO, USA). 4. Термостат BD-115, BINDER (Германия). 5. СО2-инкубатор Innova CO-48. Ход работы 1. Подготовить среду для роста клеток. 2. Подогреть среду, растворы трипсина с этилендиаминтетрауксусной кислотой (трипсин-EDTA) и фосфатный солевой буфер (PBS) без Са2+ и Mg2+. 3. Слить среду с клеток во флаконе (или планшете). 4. Промыть клетки сбалансированным фосфатным буфером. 5. Добавить трипсин-EDTA (приблизительно 1 мл на 25 см2). 6. Встряхнуть флакон, чтобы накрыть раствором монослой клеток. 7. Экспонировать колбу в термостате при 37 ºС в течение 4 мин. 8. Проверить под микроскопом отделение клеток от стенки флакона и убедиться в том, что клетки плавают. 9. Осторожно постучать по бокам флакона, для того чтобы открепить оставшиеся прикрепленными клетки. 10. Добавить культуральную среду во флакон в объеме, равном двойному объему трипсина, и перемешать. 11. Перенести суспензию клеток в центрифужную пробирку. 12. Центрифугировать пробирку при 200 g в течение 5 мин. 13. Удалить надосадочную жидкость, не задевая осадок. 14. Встряхнуть пробирку, чтобы поднять осадок. 15. Добавить 1 мл свежей среды, осторожно ресуспендировать клетки пипеткой. 16. Сосчитать клетки, пользуясь красителем трипановым синим и камерой Горяева. 17. Добавить необходимое количество среды во флакон с этикеткой. 18. Добавить необходимое количество суспензии клеток во флакон и перемешать, покачивая флакон. 19. Перенести флакон в термостат. В зависимости от типа клеток процедуру выращивания проводят от нескольких дней до десятков дней. Процедура замены стеры осуществляется через 1–2 дня. В ходе работы с культурами важно иметь стабильный источник актвиных клеток. Хранение замороженных клеток – это очень важная процедура в Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 107 МОДУЛЬ 7. ТЕХНОЛОГИЯ ВЕДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР Работа 7.2. Субкультивирование клеточных культур культуре клеток. Она позволяет хранить запас клеток в течение продолжительного периода времени. Она уменьшает риск заражения, риск фенотипических изменений, затраты и необходимость постоянно поддерживать линии клеток в культуре. Она также позволяет осуществлять эксперименты с постоянным числом пассажей культуры клеток. Замораживание прикрепленных клеток Ход работы 1. Приготовить замораживающую среду (10 %-ный диметил сульфоксид (DMSO) + 90 %-ный PBS). 2. Подогреть среду для хранения замороженных клеток, культуральную среду, раствор трипсина с EDTA и PBS (без Са2+ и Mg2+). 3. Выполнить пункты 3–14 предыдущего протокола субкультивирования. 4. Добавить 1 мл среды для хранения замороженных клеток и приготовить равномерную суспензию клеток посредством многократного осторожного перемешивания с помощью пипетки. 5. Произвести подсчет клеток и разбавьте суспензию клеток средой для хранения клеток, чтобы концентрация составила (2–4) х 106 клеток на мл. 6. Добавить 1 мл суспензии клеток в ампулу с этикеткой (криопробирку). 7. Поместить ампулу в замораживающую колбу (содержащую изопропанол) и оставить ее на ночь в морозильнике при −80 ºС (температура клеток понижается со скоростью 1 ºС/мин). 8. Перенести ампулу в банк жидкого азота и записать ее координаты в журнале. Вопросы 1. Для чего применяют методы размораживания и замораживания клеток? 2. Какие необходимы реагенты для снятия монослоя клеток при пересеве? Работа 7.3. Определение интенсивности клеточной пролиферации в ММТ-тесте Цель работы: знакомство с методами определения пролиферативной активности клеток на примере калориметрия с использованием ММТ [3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,50-дифенилтетразолбромида], являющемся индикатором NAD(P)H и сохранности функций митохондрий. Определение состояния клеток с помощью МТТ – это колориметрическая тестовая система, измеряющая восстановление компонента тетразола (МТТ) в нерастворимый продукт формазан желтого цвета в митохондриях живых делящихся клеток. После инкубации клеток с ММТ в среду добавля- Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 108 МОДУЛЬ 7. ТЕХНОЛОГИЯ ВЕДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР Работа 7.3. Определение интенсивности клеточной пролиферации в ММТ-тесте ют детергент, лизирующий (разрушающий) клетки и растворяющий цветные кристаллы формазана. Затем образцы анализируются на фотокалориметре. Интенсивность цвета прямо пропорциональна количеству жизнеспособных митохондрий и живых клеток. Система МТТ – это количественный, более чувствительный тест, чем тест с использованием трипанового синего, поскольку существует линейная зависимость между активностью клеток и их способностью поглощать ММТ; может измеряться скорость роста или гибели клеток. Тест с использованием трипанового синего является качественным и показывает только то, жива ли клетка. Материалы и методы 1. Клеточная культура. 2. Термостат BD-115, BINDER (Германия). 3. Центрифуга Beckman. 4. Культуральные планшеты с 96 ячейками, пипетки, 5. Раствор 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,50-дифенилтетразолбромида. 6. ФЭК. Ход работы 1. Приготовить раствор 5 мг/мл МТТ, растворенного в PBS, и стерилизовать его через фильтр. 2. За 5 часов до окончания инкубации добавить раствор МТТ (1 мл раствора паро-нитрофенолфосфата в концентрации 16 мМ/л) и выдержать 2 мин (использовать «Diagnostic kit 245», Sigma. Образующийся под воздействием щелочной фосфатазы паро-нитрофенол окрашивает в щелочной среде в желтый цвет) в каждой ячейке планшета, содержащей клетки. 3. Инкубировать планшеты в термостате с СО2 при 37 ºС в течение 5 ч. 4. Удалить среду с помощью иголки и шприца. 5. Добавить по 200 мкл DMSO в каждую ячейку и осторожно перемешать с помощью пипетки, чтобы растворить кристаллы. 6. Инкубировать клетки при 37 ºС в течение 5 мин. 7. Перенести на считывающее устройство фотокалориметра и измерить поглощение при длине волны 550 нм, используя калибровочную кривую. Если используются более крупные планшеты с большим количеством ячеек, изменить объемы в соответствии с числом ячеек. Вопросы 1. Каков принцип метода определения пролиферативной активности клеток в тесте ММТ? 2. Какие клеточные макромолекулы взаимодействуют с 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,50-дифенилтетразолбромидом? Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 109 МОДУЛЬ 8. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ Цель – дать представление об условиях, необходимых для выделения стволовых клеток из биологических тканей; принципах получения стволовых клеток. Задачи: знакомство с процедурой выделения клеток из костного мозга (МСК); обучение специфическим приемам и методам, необходимым для ведения стволовых клеток из МСК. Объекты: боксированные помещения, культуральная посуда и среды, оборудование для выращивания и исследования клеток, матриксы, биологический материал для выделения клеток. Достижения молекулярной и клеточной биологии составили основу принципиально новых биомедицинских технологий, с помощью которых становится возможным решение многих проблем восстановления поврежденных тканей и органов и лечения ряда тяжелых заболеваний человека. Успешное внедрение в практику экспериментальной биологии и медицины методов длительного культивирования клеток, в том числе клетокпредшественников специализированных тканей, создали предпосылки для разработки новых технологий заместительной клеточной и тканевой терапии и конструирования биоискусственных органов. Практически все типы клеток человека могут быть введены в культуру и служить средством и объектом во многих медико-биологических исследованиях. Наибольшее распространение получили культуры фибробластов. Широкое использование фибробластов для изучения патогенеза и диагностики наследственных болезней обусловлено легкостью их культивирования и тем, что соединительная ткань, главным клеточным элементом которой являются фибробласты, составляет значительную часть массы тела. Фибробласты составляют строму многих органов, являются важными участниками их морфогенеза и создают условия микроокружения, необходимого для дифференцировки и функционирования специализированных клеток. Стволовые клетки могут быть выделены из эмбрионов, зародышей, пуповинной крови, околоплодной жидкости или взрослой ткани (липосата, нозального эпителия, костного мозга), при этом диапазон типов клеток, в которые они могут дифференцироваться, колеблется. Эмбриональные стволовые клетки являются наиболее полипотентными, они могут стать самыми различными типами клеток при соответствующих условиях культивирования. Применительно к задачам тканевой инженерии стволовые клетки в принципе могут быть неистощимым источником клеток и тканей разных типов. «Взрослые» стволовые Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 110 МОДУЛЬ 8. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ клетки – это часть клеток, образовавшихся в результате дифференцировки клеток эмбриона, оставшихся не до конца дифференцированными. Каждый человек несет в себе свой собственный запас стволовых клеток в различных участках ткани, включая костный мозг, мозг, печень и кожу, а также кровеносную систему. Поэтому эти клетки можно выделять из организма пациента и использовать для создания тканеинженерного конструктора для последующей имплантации в случае необходимости замены или восстановлении органа. Для использования взрослых стволовых клеток необходимы знания о том, где и какие клетки следует взять для обеспечения их последующего роста вне организма и дифференцировки в необходимую ткань. Наиболее универсальным типом взрослых стволовых клеток, используемых в исследованиях и практических применениях, являются мезенхимальные стволовые клетки (МСК), способные дифференцироваться в клетки нескольких типов: жировые, костные и хрящевые. На процесс и направление дифференцировки МСК влияют состав культивационной среды и также физические факторы. Например, для превращения в клетки жировой ткани мезенхимальные стволовые клетки должны контактировать друг с другом; при слишком высокой плотности в культуре невозможно добиться их трансформации в костные клетки, даже при наличии в среде всех необходимых питательных веществ и ростовых факторов. Следует отметить, что не все типы взрослых стволовых клеток доступны для манипуляций. Представляется проблематичным в техническом плане получение стволовых клеток мозга. Возможны также ситуации редкой встречаемости некоторых типов клеток (известно, что в костном мозге на 100 тыс. клеток приходится только 1 стволовая клетка), но даже эта единственная клетка может не подойти из-за возраста пациента или имеющихся у него заболеваний. Эти обстоятельства вносят существенные ограничения в процесс использования взрослых стволовых клеток. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают гораздо большей пластичностью, чем взрослые, так как способны превращаться в клетки любого типа. Более ранние, тотипотентные ЭСК дифференцируются в любую из 250 линий специализированных клетки органов. Необходимо подчеркнуть, что ЭСК in vitro не продуцируют клеток трофобласта, плаценты, т. е. потенции генома ЭСК меньше зиготы. Соответственно биологический статус ЭСК меньше статуса раннего зародыша. Плюрипотентные ЭСК дают более ограниченный спектр фенотипов. Например, мезенхимальные стволовые клетки (МСК), локализованные в опорно-сосудистом каркасе органов, дифференцируются в культуре только в клетки хряща, кости, кардиомиоциты и миоциты. Монопотентные стволовые клетки (мышц, жировой ткани, периферических нервов) созревают до одного преобладающего фенотипа клеток. Стволовые региональные клетки взрослого организма наделены мультипотентностью – пластичной плюрипотентностью, которая сильно варьирует в контексте органа-реципиента. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 111 МОДУЛЬ 8. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ Работа 8.1. Техника выделения МСК из костного мозга крыс Цель: обучение технике выделения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК) и получения первичной культуры. Материалы и оборудование 1. Половозрелая крыса линии Вистар, масса около 200 г. 2. Реагенты: диэтиловый эфир, этанол, среда Дульбекко (DMEM), (ЭТС), антибиотики, трипсин. 3. Стерильная пластиковая и стеклянная посуда, пипетки. 4. Темостат BD-115, BINDER, СО2-инкубатор Innova CO-48. 5. Бокс-ламинар Logic (LABCONCO, USA). 6. Центрифуга настольная Centrifuge 5810 R фирмы Eppendorf, США. Сгущение клеточных суспензий производится с использованием центрифуги с охлаждением и охлаждением с набором роторов для различных объемов (рис. 45). Рис. 45. Центрифуга настольная Centrifuge 5810 R Eppendorf Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 112 МОДУЛЬ 8. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ Работа 8.1. Техника выделения МСК из костного мозга крыс Технические характеристики центрифуги Centrifuge 5810 R Eppendorf: имеется набор съемных роторов, что обеспечивает возможность центрифугирования объемов культур от 1,5 мл до 400 мл, включая стандартные пробирки, ПЦР стрипы, пробирки Falcon; максимальный центрифугируемый объем – 1600 мл; максимальная скорость – 15 500 об/мин; угловой ротор 6х85 мл с максимальной скоростью вращения 12 000 об/мин, автоклавируемый; стаканы полипропиленовые с крышкой (85 мл) к угловому ротору (6х85мл) – 10 шт; адаптер к угловому ротору (6х85 мл) 1х15 мл Falcon (6 шт), адаптер к угловому ротору (6х85 мл), 1х20 – 30 мл (6 шт.); пробирки центрифужные с крышкой из полипропилена (20–30 мл) для адаптера 1х20–30 мл к угловому ротору (6х85 мл) (10 шт.); адаптер к угловому ротору (6х85 мл) 1х50 мл Falcon (6 шт.); адаптер к угловому ротору (6х85 мл) 1х7–15 мл (6 шт.); температура центрифугирвоания: от –9 ºС до 40 ºС; минимальное время разгона и торможения менее 1 мин; имеется функция отсчета времени после достижения заданной скорости; автоматическая фиксация крышки; низкая высота конструкции для загрузки и выгрузки пробирок в центрифугу; охлаждение в режиме ожидания и функция «быстрого охлаждения»; автоматическое распознавание ротора и автоматическое отключение при дисбалансе; настройка параметров центрифугирования в процессе работы; источник питания: напряжение в сети 230 В; частота 50–60 Гц. Ход работы 1. Умертвить животное диэтиловым эфиром. 2. Выделить бедренную кость, зачистить от мягких тканей и обмыть в среде Дульбекко (DMEM), содержащей 1000 ед/мл пенициллина и 1000 ед/мл стретомицина. 3. Срезать метафизальные концы кости и на холоде шприцем вымыть столбик костного мозга в стерильную чашку Петри, используя 5 мл первичной среды DMEM, содержащей 20 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стретомицина. 4. Разбить столбик на клеточные агрегаты (гемопоэтические островки) шприцем с толстой иглой и разлить в центрифужные пробирки. 5. Костно-мозговой аспират центрифугировать при 400 g 10 мин. 6. Клеточный осадок ресуспендировать в первичной среде и перенести в T-75 культуральные флаконы, которые поместить в СО2-инкубатор. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 113 МОДУЛЬ 8. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ Работа 8.1. Техника выделения МСК из костного мозга крыс 7. Клетки инкубировать в гумидной среде при 5 % CO2 при 37 ºC. 8. После первого пассажа первичную среду заменить полной средой, содержащей DMEM с 20 % ЭТС, 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стретомицина, 10 мМ β-глицерофосфата, 50 г/мл L-аскорбиновой кислоты и 10 нМ дексаметазона, который добавляют для стимулирования образования остеобластов из стромальных клеток. 9. Среду менять на свежую ежедневно стандартной процедурой. Монослой трипсинизировать (0,25 % трипсин и 0,02 % EDTA). Клеточную суспензию разводить полной средой до концентрации 1 х 106 клеток/мл и использовать для дальнейших исследований. Вопросы 1. Почему наиболее приемлемым источником для получения клеток остеобластического ряда служат МСК костного мозга? 2. Какие ростовые факторы должна содержать основная ростовая среда для стимулирования клеточной дифференцировки в клетки остеобластического ряда? Работа 8.2. Оценка прикрепления клеток и распределения клеток на материалах с помощью электронного микроскопа (СЭМ) Материалы и оборудование 1. Суспензия клеток, выращенная ранее. 2. Электронный микроскоп, оборудование и реагенты для фиксации клеток и напыления. Ход работы 1. Вырастить клетки в культуральных флаконах. 2. Для получения клеточной суспензии надо следовать протоколу по субкультивированию клеток. 3. Сосчитать клетки, пользуясь протоколом окраски трипановым синим* (см. выше). 4. Определить плотность клеток, необходимую для посева на материалах. 5. Высевать клетки и дайте возможность им вырасти в течение необходимого периода времени. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 114 МОДУЛЬ 8. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ 8.2. Оценка прикрепления клеток и распределения клеток на материалах с помощью электронного микроскопа (СЭМ) 6. Не капать и не наливать растворы поверх клеток (существует очень большая вероятность смыва клеток). 7. Дважды промыть клетки PBS. 8. Закрепить клетки на поверхности 2,5 %-ным глутаровым альдегидом в PBS в течение 40 мин при 4 ºС. 9. Дважды промыть клетки PBS. 10. Обезвоживать этанолом в возрастающей концентрации. а) 25 % – 5 мин; б) 50 % – 5 мин; в) 70 % – 5 мин; г) 90 % – 5 мин; д) 100 % – 5 мин; е) 100 % – 5 мин. 11. Инкубировать клетки с гексаметилсилазаном (HMDS) в течение 5 мин. 12. Инкубировать клетки со свежим HMDS в течение 5 мин. 13. Напылить на образцы коллоидный раствор золота. 14. Рассмотреть под сканирующим электронным микроскопом. 15. Снимки клеток поместить в рабочую тетрадь. Вопросы: 1. Какие характеристики клеток выявляются с помощью световой и электронной микроскопии? 2. Почему электронная микроскопия стала неотъемлемым методом в ходе ведения и изучения клеточных культур? Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 115 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 1. Хенч, Л. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей / Л. Хенч, Д. Джонс, под ред. А. А. Лушниковой. – М. : Изд-во «Техносфера». Серия «Мир биологии и медицины», 2007. – 304 с. 2. Штильман, М. И. Полимеры медико-биологического назначения / М. И. Штильман. – М. : ИКЦ «Академкнига», 2006. – 399 с. 3. Волова, Т. Г. Полиоксиалканоаты – биоразрушаемые полимеры для медицины / Т. Г. Волова, В. И. Севастьянов, Е. И. Шишацкая. – Новосибирск : Наука, 2003. 4. Репин, С. В. Медицинская клеточная биология / С. В. Репин, Г. Т. Сухих. – М., 1998. 5. Фрешни, Р. Культура животных клеток. Методы / Р. Фрешни. – М. : Мир, 1991. 6. Методы культуры клеток / Р. Адамс. – М. : Мир, 1983. 7. Репин, В. С. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина / В. С. Репин, А. А. Ржанинова, Д. А. Шаменков. – М. : Реметэкс, 2002. 8. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир, 2002. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. Лаб. практикум 116
