Государственный контракт № 16.522.12.2002 от 18 апреля 2011 г.

Государственный контракт № 16.522.12.2002 от 18 апреля 2011 г.
Тема: «Разработка технологии масс-спектрометрического скрининга маркерных
пептидов для определения белков 18-й хромосомы человека (российская часть международного проекта «Протеом человека»)»
В рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 – 2013 годы»
Заказчик – Министерство образования и науки Российской Федерации
Разработана технология масс-спектрометрического скрининга маркерных пептидов
для количественного определения состава протеома человека, наработанные маркерные
пептиды применены для выявления в биоматериале белков, кодируемых генами 18-ой
хромосомы.
1.
Основные результаты проекта
Получено более 900 уникальных сигнатур маркерных пептидов, для 570 осуществлен синтез пептидов, с помощью которых измерена концентрация в биологической пробе
225 белков. Диапазон концентраций измеряемых целевых белков в биопробе составил от
10-9 до 10-15 моль/л. Эффективность выполнения ключевой технологической операции составляет от 70 до 75%. Это в два раза превосходит показатели аналогичных техпроцессов,
разработанных за рубежом. Определены оптимальные режимы и параметры выполнения
ключевых хроматографических и масс-спектрометрических операций (хроматографический градиент; режим накопления сигнала; число транзиций в методе; число пептидов в
методе; число технических повторов на один пептид и др.), позволяющие сократить время разработки МРМ-метода для 50 белков до одной недели.
Для обеспечения единства измерений разработаны стандартные образцы раствора
аминокислот (ГСО 10105-2012) и стандартные образцы состава маркерных пептидов (ГСО
10155-2012), предназначенные для градуировки и калибровки масс-спектрометрических
средств измерений с целью определения молекулярных масс и массовой концентрации
пептидов и белков в различных средах.
Получены экспериментальные образцы аффинных реагентов к целевым белкам.
Экспериментальные образцы использованы для концентрирования целевых белков, содержащихся в пробе биологического происхождения в концентрации 10-15 моль/л.
Сбор, хранение, передача данных, регистрация и учет продукции, каталогизация
сведений о масс-спектрометрических сигнатурах маркерных пептидов и их импорт во
внешние репозитории осуществляется с применением программного обеспечения «Информационно-аналитическое сопровождение технологии». В состав программного обеспечения входит два блока: программный комплекс «База знаний» и «Учетная система».
2.
Назначение и область применения результатов проекта
Разработанная технология применяется для измерения концентрации белков, значимых для современной молекулярной медицины и биотехнологии. Технология обеспечивает количественный анализ белков с абсолютной (100%) специфичностью и чувствительностью до 10-15 моль/л, что на два порядка превосходит существующие методы, основанные на иммуноферментном анализе. Отличие разрабатываемой технологии от су1
ществующих зарубежных аналогов в том, что отбор пептидов осуществляется в ходе технологической операции анализа биоматериала с последующим выбором для синтеза образцов с уникальными масс-спектрометрическими сигнатурами.
3.
Эффекты от внедрения результатов проекта
Внедрение результатов проекта позволит заместить сначала в лабораторной экспериментальной практике биомедицинских исследований, затем – в клиникодиагностических лабораториях ряд типовых тестов, включая иммуногистохимический
анализ, вестерн-блоттинг, белковые микрочипы и иммуно-ферментный анализ. При исследовании хорошо изученного белка (менее 1% всех белков человека), зарегистрированного в установленном порядке как биомаркер заболевания, при условии выпуска в
промышленном масштабе антител к нему, себестоимость анализа с использованием разрабатываемого набора реагентов будет снижена в 2-3 раза. При исследовании менее изученных белков, к которым относятся 99% генома, экономия будет составлять в 10-50 раз,
за счет отсутствия в себестоимости новой продукции затрат на разработку, тестирование и
производство антител.
4.
Основные публикации по результатам ОТР:
1. Zgoda VG, Kopylov AT, Tikhonova OV, Moisa AA, Pyndyk NV, Farafonova TE, Novikova SE,
Lisitsa AV, Ponomarenko EA, Poverennaya EV, Radko SP, Khmeleva SA, Kurbatov LK, Filimonov AD, Bogolyubova NA, Ilgisonis EV, Chernobrovkin AL, Ivanov AS, Medvedev AE,
Mezentsev YV, Moshkovskii SA, Naryzhny SN, Ilina EN, Kostrjukova ES, Alexeev DG,
Tyakht AV, Govorun VM, Archakov AI. Chromosome 18 transcriptome profiling and targeted proteome mapping in depleted plasma, liver tissue and HepG2 cells. J Proteome
Res. 2013 Jan 4;12(1):123-34
2. Elena Ponomarenko, Ekaterina Poverennaya, Mikhail Pyatnitskiy, Andrey Lisitsa, Sergei
Moshkovskii, Ekaterina Ilgisonis, Alexey Chernobrovkin, and Alexander Archakov. Comparative Ranking of Human Chromosomes Based on Post-Genomic Data. OMICS A Journal of Integrative Biology. Number 11, 2012; Volume 16.
3. Natalia A Petushkova*, Olesya V Larina, Aleksey L Chernobrovkin, Oksana P Trifonova,
Yulia S Kisrieva, Andrey V Lisitsa, Irina I Karuzina and Alexander I Archakov. Optimization
of the SDS-PAGE gel slicing approach for identification of human liver microsomal proteins via MALDI-TOF mass spectrometry. J Proteomics Bioinform 2012.
2