Характеристика

ГИСТОЛОГИЯ И ГИСТОФИЗИОЛОГИЯ
(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)
С. В. Барышева, Г. В. Брюхин
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ
ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ
У ЖИВОТНЫХ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ГЕПАТИТОМ
У животных с экспериментальным Д-галактозаминовым поражением печени
изучены пластические свойства перитонеалъных макрофагов, а также исследована лизосомалъная и фагоцитарная активность данных клеток. Установлено
изменение морфофункциональных особенностей перитонеалъных макрофагов у
экспериментальных животных с поражением печени, которое проявилось снижением активности лизоса, способности макрофагов к фагоцитозу Staph. aureus
и нарушением адгезивных свойств.
В основе нормальной жизнедеятельности лежат процессы реактивности и резистентности организма. Важными эффекторными клетками неспецифической иммунной системы, выполняющими свою функцию посредством способности к фагоцитозу, являются макрофаги. Помимо этого макрофаги участвуют в реакциях специфической защиты,
обеспечивая антигенпрезентацию. Посредством секреции большого количества биологически активных веществ, ферментов и цитокинов макрофаги выполняют роль регулирующих клеток, поддерживают тканевый гомеостаз, участвуют в неспецифическом
звене защиты организма, индуцируя и развивая воспалительные реакции, направленные
на удаление чужеродного агента [4; 6; 8].
Кроме того, макрофаги имеют важное значение в хронизации воспалительного процесса. Многими исследователями установлено изменение функциональной активности
макрофагов при различных заболеваниях печени. Целью нашего исследования явилось
изучение морфофункциональных особенностей перитонеальных макрофагов у животных с экспериментальным Д-галактозаминовым поражением печени.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования явились половозрелые белые лабораторные крысы-самцы. Исходя из поставленных задач, у экспериментальных животных нами моделировалось Д-галактозаминовое поражение печени.
Экспериментальные животные были разбиты на две группы. В первую группу выделены интактные животные — «контрольная группа», во вторую — животные с поражением печени — «опытная группа».
Перитонеальные макрофаги получали общепринятым методом. В ходе работы нами
исследованы адгезивные свойства перитонеальных макрофагов, проведена оценка лизосомальной и фагоцитарной активности.
Адгезивные свойства исследуемых макрофагов оценивали по нединамическому методу, который основан на способности клеток прикрепляться к чистой стеклянной поверхности. Для этого клеточную суспензию, содержащую МО5 клеток, наносили на чистое предметное стекло и инкубировали во влажной камере в термостате при t = 37 °С
в течение 60 минут. После удаления неприкрепившихся клеток фиксированные мазки окрашивали раствором эозината метиленового синего в метиловом спирте по МайГрюнвальду [7].
Оценку адгезии и распластывания проводили при световой микроскопии (объектив
*4U, окуляр х 7 ) . Показатель адгезии перитонеальных макрофагов оценивали путем
подсчета клеток, прикрепившихся к стеклу, и выражали это значение в процентах от
количества всех клеток, нанесенных на стекло. Оценку распластывания проводили путем подсчета количества распластанных и нераспластанных макрофагов. При этом нераспластанными считали макрофаги округлой формы без отростков, а за распластанные принимались клетки неправильной формы с тем или иным количеством отростков.
Результат теста распластывания перитонеальных макрофагов оценивали путем определения процентного соотношения распластанных форм к общему количеству прикрепившихся клеток.
Для определения активности лизосомального аппарата в цитоплазме перитонеальных макрофагов к полученному монослою клеток добавляли ОД мл акридинового оранжевого в концентрации 2 мкг/мл. Инкубировали в темноте в течение 10 мин, после чего
промывали физиологическим раствором. Полученный влажный препарат под покровным стеклом изучали в люминесцентном микроскопе. При оценке результатов данного
теста учитывалось процентное содержание клеток с разной лизосомальной активностью.
Оценку проводили визуально полуколичественным методом с вычислением среднего
гистохимического показателя (СГП) Astaldi и Verga по формуле
где 0,1,2,3 — коэффициенты люминесцентного свечения лизосом;
А, Б, В, Г — количество клеток с разным уровнем лизосомальной активности;
п — общее количество учтенных клеток.
При этом за «А» принимали клетки без видимого свечения; за «Б» — макрофаги с
единичными светящимися лизосомами; в качестве «В» учитывали клетки с умеренным
свечением лизосом в цитоплазме; за «Г» — макрофаги с ярко выраженным свечением
лизосом, занимающих всю цитоплазму клетки.
Фагоцитарную активность оценивали по способности макрофагов поглощать Staph.
aureus, который инкубировали с монослоем макрофагов в течение часа при 37 °С [2].
Исследование проводили под люминесцентным микроскопом. Учитывали процент клеток, поглотивших бактерии, количество поглощенных бактерий и процент убитых микроорганизмов. При этом живые микроорганизмы имели зеленое свечение, а мертвые —
красное.
Статистическая обработка проводилась с помощью непараметрического критерия
Манна-Уитни.
Результаты исследования и их обсуждения. Важным свойством макрофагов, отличающим их от ряда других клеток, является способность прикрепляться к различным
субстратам и постепенно распластываться. Эта особенность используется в качестве
критерия при оценке активности и зрелости макрофагов [3]. Адгезия фагоцитирующих клеток к субстрату является одним из факторов их активации. Адгезия необходима для осуществления всех стадий-фагоцитоза, начиная от распластывания макрофага на поверхности объекта-мишени и заканчивая перевариванием субстрата. При
этом чем выше способность клеток к адгезии, тем больше фагоцитарная активность
макрофагов. Клеточная адгезия и расспластывание — важнейшие характеристики,
обусловливающие межклеточную кооперацию, экстравазацию и другие свойства фагоцитов [1].
В результате проведенного исследования нами установлено, что у экспериментальных животных с Д-галактозаминовым поражением печени способность клеток прикрепляться к чистой стеклянной поверхности снижена в 1,3 раза по сравнению с контрольной
группой (табл. 1).
61
Таблица 1
Оценка адгезии перитонеальных макрофагов
экспериментальных животных (М ± т )
Группа
Количество клеток, подвергшихся адгезии
абсолютное
относительное, %
Контрольная п = 6
1356 ±16
1,36 ± 0,016
Опытная п =6
1047 ± 1 5 *
1,05 ± 0,015*
* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р< 0,05).
Анализ способности перитонеальных макрофагов к распластыванию у животных с
экспериментальным гепатитом показал снижение пластических свойств данных клеток
в 1,86 раза, по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы животных
(табл. 2).
Таблица 2
Оценка распластывания перитонеальных макрофагов
экспериментальных животных (М ± т )
Группа
Количество распластанных макрофагов, %
Контрольная п = 6
52,6 ± 2,01
Опытная п = 6
28,3 ±2,97*
* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р <0,05).
Таким образом, у животных с экспериментальным Д-галактозаминовым поражением печени происходит нарушение пластических свойств перитонеальных макрофагов по
сравнению с контролем, что может обусловить нарушение функциональной активности
макрофагов при поражении печени.
Перитонеальные макрофаги являются активно фагоцитирующими клетками. Для
осуществления конечной стадии фагоцитоза — переваривания чужеродного агента или
патологически измененного субстрата им необходима высокая активность лизосомального аппарата. Состояние мембран лизосом и набор гидролитических ферментов обусловливают функциональную активность макрофагов. Нарушение лизосомальной активности макрофагов приводит к снижению неспецифической резистентности организма
[5]. Недостаток лизосом в макрофагах может привести к нарушению восприимчивости
организма к различным бактериальным и вирусным инфекциям.
В результате проведенного исследования нами установлено снижение лизосомальной активности перитонеальных макрофагов у животных с экспериментальным
Д-галактозаминовым поражением печени. У опытных животных произошло увеличение
количества неактивных макрофагов (А) и макрофагов с единичными лизосомами соот-
IZITZIВ
ГгЗГ
™ И ' ? Р а 3 а П° с р а в н е н и ю с ^тролем. Напротив, количество макрофагов
( } ИЯРК ш р а ж е н н ь ш
°
мнением лизосом, занимающим всю цитоплазму
2 15 р а з а ™ Г з Г О Т Н Ы Х C ™ ° C b П ° СРаВНеНШ° ° К ° Н Т Р ° Л е М с о о т в е т с т в е н н о * ^
й
к о г о Д ~ Г я Т о Г П ° Д Т В е р Ж Д а ю т с я с н ™ е м в 1,56 раза среднего гистохимичесЖИВ0ТНЫХ Ш С р а В Н е Ш Ш с
Гольной™е
л о г и ч н ы м показателем в конт62
Таблица 3
Характеристика лизосомальной активности перитонеальных макрофагов
экспериментальных животных (М ± т )
Содержание клеток
с различной лизосомальной активностью, %
Группа
сгп
А
Б
В
Г
Контроль п = 6
5,2 ± 1,20
16,6 ±1,73
32,2 ±3,30
46,0 ±3,2
2,18 ± 0,141
Опытная п = 6
24,1 ± 3,11*
28,0 ±4,30
26,5 ±2,31
21,4 ±6,53*
1,40 ±0,141*
* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р<0,05).
Анализ показателей фагоцитарной активности выявил нарушение у животных с
Д-галактозаминовым поражением печени одной из важных функций макрофагов. У животных с поражением печени происходит снижение в 1,34 раза фагоцитарного показателя
(то есть процента клеток поглотивших бактерии). В опытной группе произошло выраженное снижение — в 2,35 раза — фагоцитарного индекса (количество микроорганизмов, поглощенных одним макрофагом). Аналогичная тенденция выявлена при оценке
киллинговой активности (процент убитых поглощенных микроорганизмов). У животных
с поражением печени показатель киллинговой активности снизился в 1,17 раза по сравнению с контролем (табл. 4).
Таблица 4
Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов
экспериментальных животных (М ± т )
Киллинговая
Фагоцитарный
Фагоцитарный индекс
Группа
активность, %
показатель, %
8,63 ± 1,052
81,0 ±4,637
82,8 ±2,414
Контроль п = 6
3,67
±0,757*
69,44
±5,030
61,67
±9,387
Опытная п = 6
* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р<0,05).
Таким образом, в ходе исследования у животных с экспериментальным поражением
печени выявлены морфофункциональные изменения, а именно нарушение пластических
свойств, снижение лизосомальной и фагоцитарной активности, что может способствовать
развитию неадекватных защитных реакций организма на внедрение чужеродного агента.
Список литературы
1. Адаменко, Г. П. Роль адгезии клеток в рецепторных механизмах взаимодействия
поли- и мононуклеарных фагоцитов крови человека / Г. П. Адаменко // Иммунология.
2000. № 1. С. 57.
2. Брюхин, Г. В. Фагоцитарная активность моноцитов периферической крови и перитонеальных макрофагов у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени / Г. В. Брюхин, А. Ю. Грачев // Физиолог, журн. 1990. № 6. С. 99-102.
3. Гудима, Г. О. Клеточный центр макрофагов, гранулоцитов и лимфоцитов при распластывании, поляризации и движении клеток in vitro / Г. О. Гудима, И. А. Воробьев,
Ю. С. Ченцов // Цитология. 1984. Т. 26, № 9. С. 1002-1007.
4. Луговская, С. А. Структура и функции моноцитов и макрофагов / С. А. Луговская
// Клинич. и лаборатор. диагностика. 1997. № 9. С. 10.
5. Маянский, А. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А. Н. Маянский, Д. Н. Маянский. Новосибирск, 1989. С. 166-195.
63
6 Олиферук, Н. С. Оценка фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов
и макрофагов / Н. С. Олиферук, А. Н. Ильинская, Б. В. Пинегин // Иммунология. 2005.
№ 1. С. 10-12.
7. Роскин, Г. И. Микроскопическая техника / Г. И. Роскин, Л. Б. Левинсон. М., 1957.
467 с.
8. Balleux, R. E. The mind and the immune system / R. E. Balleux // Theor. Med. 1995.
Vol. 15, № 40. P. 387.
Т. И. Бирюкова, Г. В. Брюхин
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ТУЧНЫХ КЛЕТОК ВИЛОЧКОВОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПОТОМСТВА САМОК КРЫС
С ХРОНИЧЕСКИМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА
Рассмотрены морфофункционалъные особенности тучных клеток тимуса потомства самок крыс с хроническим поражением печени различного генеза.
Установлено, что в тимусе потомства самок крыс с хроническим пораоюением
гепатобилиарной системы имеет место увеличение числа тучных клеток и усиление их функциональной активности, о чем свидетельствует увеличение индекса
гранулярного насыщения, а также индекса дегрануляции.
Тучные клетки, или мастоциты, привлекают все большее внимание исследователей,
обусловленное тем, что этот тип клеток широко представлен практически во всех органах
и тканях. Они участвуют в развитии воспалительных, иммунных, аллергических реакций
и многих других патологических процессов, секретируя разнообразные биологически активные вещества [1]. Тучные клетки в тимусе животных представляют компонент специфического микроокружения, способствующего процессам созревания и дифференцировки лимфоцитов [4]. В связи с этим целью данного исследования явилось изучение морфофункциональных особенностей тучных клеток тимуса как центрального органа иммуногенеза у потомства самок крыс с хроническим поражением печени различного генеза.
Материалы и методы. В эксперименте были использованы белые лабораторные крысы-самки «Вистар» и их потомство на 1,15, 30, 45-е и 60-е сутки постнатального онтогенеза. Все животные были разбиты на две группы — «контрольную» и «опытную».
В группу контроля входило 50 животных, а в опытную — 97.
Опытнуюгруппу1составилопотомствоживотныхсхроническймБ-галактозаминовьш
поражением печени, а опытную группу 2 — потомство животных с поражением печени,
соответствующим гепатиту А. Моделирование хронического поражения в опытной группе 1 осуществляли введением взрослым половозрелым животным гепатотропного яда
D(+) - галактозаминагидрохлорида («Sigma-G0500», США) по общепринятой методике
(Н. П. Сугробова и др., 1992). По совокупности морфологических и биохимических критериев данная модель поражения печени соответствует вирусному гепатиту В человека.
Для воспроизводства модели поражения печени гепатитом А (опытная группа 2) в экспериментальных условиях применялась методика сенсибилизации животных культурой
Е. Coli (Б. А. Саков и др., 1967).
Для выявления тучных клеток депарафинированные серийные гистологические срезы окрашивали 0,1 %-м раствором толуидинового синего при рН 4,9 [2]. Для комплексной морфометрической оценки тучноклеточиой популяции использовали следующие
критерии: определение среднего количества клеток в единице площади, индекс насыщения гепарином, индекс дегрануляции, определение процентного соотношения клеток
с различной степенью насыщения и дегрануляции [2].
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы
SPSS for Windows 11.0.
Результаты. Оценка структурно-функционального состояния популяции тучных
клеток тимуса осуществлялась с помощью общепринятых критериев [2]. При этом оценивалось среднее содержание клеток в единице площади, а также процентное соотношение клеток с различной степенью гранулярного насыщения и дегрануляции. Полученные
результаты отражены в таблицах.
Как видно из табл. 1, у интактных животных наибольшее содержание тучных клеток
отмечается в период новорожденности, а на последующих этапах онтогенеза имеет место
постепенное снижение их числа. У подопытных животных период новорожденности, наоборот, характеризуется наименьшим содержанием тучных клеток на единицу площади,
а увеличение количества клеток приходится на период полового созревания у животных
опытной группы 1 и к периоду половой зрелости у животных опытной группы 2.
Таблица 1
Количество тучных клеток в тимусе потомства экспериментальных животных
в различные сроки постнатального периода
Количество тучных клеток на 105 мкм:i
Группа животных
30-е сут
60-е сут
15-е сут.
1-е сут.
2,0±0,3
1,7±0,06
2,3±0,05
1,8±0Д
Контрольная
3,4
* ±0,4
2,5±0,1
2,0±0,05
Опытная 1
2,4±0,1 .
2,6±0,2
2,3±0,2
2,6 * ±12
Опытная 2
1,9±0,2
* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем.
Обращает на себя внимание то, что на всех сроках исследования содержание тучных
клеток в тимусе подопытных животных обеих групп превышает таковые в контроле.
Исключение составили новорожденные крысята 2-й подопытной группы, у которых данный показатель оказался сниженным по сравнению с контролем. Одним из показателей
функционального состояния тучных клеток является критерий насыщения цитоплазмы
гранулами биологически активных соединений [3]. Нами был проведен анализ процентного содержания тучных клеток с различной степенью гранулярного насыщения цитоплазмы [2]. При этом мы оценивали количество клеток с очень высокой, высокой, умеренной и слабой степенью гранулярного насыщения. В группе контроля на всех сроках
развития преобладают клетки 4-го типа (клетки с очень высокой степенью гранулярного насыщения). Аналогичная закономерность выявлена и у подопытных крысят обеих
групп. Исключение составили подопытные крысята первой группы, у которых преобладали мастоциты со слабой степенью гранулярного насыщения.
Следует отметить тот факт, что у интактных крысят после рождения имеет место
существенное снижение числа мастоцитов с низкой степенью гранулярного насыщения и, напротив, увеличение числа тучных клеток с высокой степенью гранулярного
насыщения. На последующих этапах исследования данные показатели стабилизируются. Исключение составили 30-дневные крысята (начало периода полового созревания), у
которых выявлено заметное увеличение числа клеток с низкой степенью гранулярного
насыщения и напротив, снижение мастоцитов с высокой степенью гранулярного насыщения. Аналогичная закономерность выявлена и у крысят обеих подопытных групп.
65
Таблица 2
Содержание в тимусе экспериментальных животных тучных клеток
различной степени насыщения
Степень насыщенияо
Группа
1
2
Контрольная
Опытная 1
1 сут
30±3,1
15 сут
15±1,2
30 сут
22±3,2
45 сут
11±3,2
60 сут
16*4,0
32±2,4
16±1,1
20±2,2
16±1,8
14*2,1
3
4
1
13±252
21*1,3
23±2,8
22*1,2
15*2,3
25±3,8
11*±3,2
48±2,7
25*±3,2
35±3,4
15±2,3
51*1,4
15±2,3
55*3,1
12*2,4
2
33±3,6
20*±1,4
10*±1,6
10*±1,2
14*1,8
3
25*±3,5
2б±1,7
20±3,2
23±1,4
19±2Д
4
27±6,4
2б±4,6
29*±2,3
17±3,5
55*±4Д
6*±1Д
52±2,3
14*2,1
55*4,1
13*1,0
22±2,8
23*±0,5
11*±1,5
12*2,3
10*3,1
24*±1,6
15*1,1
27*±ЗД
20*2,1
25*±3,2
28±2,3
45±1,2
56*±3,6
54*3,1
52±4,3
1
Опытная 2
Содержание клеток различной степени
гранулярного насыщения цитоплазмы, %
2
3
4
о Степень гранулярного насыщения тучных клеток: 1 — очень светлые клетки, 2 — светлые
клетки, 3 — темные клетки, 4 — очень темные клетки.
* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем.
При этом почти на всех сроках исследования число тучных клеток с высокой степенью
гранулярного насыщения крысят обеих подопытных групп превышает таковое в контроле (рис. 1). Исключение составили крысята в подсосный период, у которых содержание в тимусе тучных клеток с высокой степенью гранулярного насыщения снижено по
сравнению с контролем.
Количество клеток
с высокой степенью гранулярного насыщения, %
9080706050-
|~[| контроль
40-
Q
30-
133 опытная группа 2
опытная группа 1
20100
р„
66
; г/.
_ _ _ _ _ _ _ _
Возраст, сутки
Рис. 1. Количество тучных клеток с высокой степенью гранулярного насыщения
в тимусе экспериментальных животных
Эти результаты находятся в полном соответствии с динамикой изменения индекса
гранулярного насыщения тучных клеток как у интактных, так и у подопытных животных обеих групп (табл. 3).
Таблица 3
Индекс насыщения (Jl-насыщения) и индекс дегрануляции (Л-дегрануляции)
тучных клеток тимуса животных в различные сроки постнатального периода
1-е сут
15-е сут
Группа
30-е сут
45-е сут
60-е сут
животных
Л
J2
Л
J2
Л
J2
Л
J2
Л
J2
1,6±
1,8± 2,05± и±
Контрольная
2,1±
1,3±
1,5±
2,1±
1,У±
1,3±
0,3
0,03
0,2
1,3
0,2
ОД
од
од
од
-0,08
2±
1,6±
1,7±
2Д±
Опытная 1
1,8±
2,0±
1,8±
1,7±
2,0±
1,7±
0,09
ОД
0,05
0,06
0,09
0,05
0,07
0,06
од 0,07
о± 2,3± 1,8± 1,9± 2,2± 1,8± 1,9± 1,9± 2,3
Опытная 2
1,7±
0,25
0,04
0,1
од
0,1
0,09
0,09
0,2
од
од
Другим важным показателем, отражающим функциональное состояние тучных клеток, является их популяционныи состав по степени дегрануляции. Нами установлено, что
у интактных животных после рождения отмечается увеличение числа клеток с низкой
степенью дегрануляции до периода полового созревания, а затем, к 45 суткам,— резкое
снижение числа неактивных клеток. Такая же динамика наблюдается и в обеих подопытных группах.
Таблица 4
Содержание в тимусе экспериментальных животных тучных клеток
с различной степенью дегрануляции
Группа
Степень
дегрануляции*
Контрольная
0
Содержание клеток различной степени дегрануляции, %
45-е сут
60-е сут
15-е сут
30-е сут
1-е сут
23±3,3
28±3,0
22±ЗД
26±1,2
10±3,1
30±3,3
Опытная 1
31±ЗД
29±4,7
4±1,6
32±1Д
20±1,3
22±2,6
15*±3,2
38±2Д
22±3,5
18±3,3
1б±1,2
24*±2,4
26±1,5
24±1,3
27±2,2
15±1,5
24±2Д
33±ЗД
19±3,3
20±1Д
15*±3,4
30±2,8
29±1,4
18±3,8
26±2,2
29±1,3
24±1Д
34±2,2
26*±1,7
35±1Д
31*±ЗД
30*±2,3
31*±ЗД
44*±2,3
10*±1,3
10*±1,0
Опытная 2
17±2,2
6*±2,5
4±1,2
22±4,5
24±2Д
21*±1,4
31±1,5
16*±1,4
24±3,2
22±2,2
23±3,2
25±2Д
29±3,8
2
42*±3,3
44*±ЗД
39*±2,6
38*±1,2
51*±4,6
0
Степень дегрануляции тучных клеток: 0 — неактивные клетки, 1 — слабая дегрануляция,
2 — умеренная дегрануляция, 3 — сильная дегрануляция.
* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем.
Следует отметить, что на всех сроках развития число неактивных тучных клеток в
контроле превышает таковое в опытных группах. Данный показатель напрямую коррелирует с динамикой изменения индекса дегрануляции (табл. 3). При этом число активных тучных клеток в контрольной группе постепенно снижается к периоду полового
созревания, а затем происходит увеличение данного показателя к моменту наступления
половой зрелости. Аналогичная закономерность выявлена и у крысят обеих подопытных
67
групп (рис. 2). Обращает на себя внимание тот факт, что у подопытных крысят процент
активных тучных клеток выше, чем в контрольной группе.
к 70
о
90 •
I 60
—И
§ 50
к 40
контроль
— -••
' •••»
3
1°
опыт]
• опыт 2
§ 20
§
80 •
70 •
60 •
§ 50 •
40 •
а 30 •
1§
1
d\
30
15
45
60
20
10 •
0•
Возраст, сутки
15
30
45
60 Возраст, сутки
а
б
Рис. 2. Динамика изменения популяции неактивных (а) и активных (б) тучных клеток
у экспериментальных животных
Таким образом, у потомства животных с экспериментальным поражением печени
установлено увеличение числа тучных клеток в тимусе и изменение их популяционного
состава в сторону увеличения числа тучных клеток с высокой степенью гранулярного
насыщения и высокой степенью дегрануляции, что свидетельствует, на наш взгляд, об
увеличении функциональной активности мастоцитов.
Список литературы
1. Арташян, О. С. Изучение функциональной активности тучных клеток при иммобилизационном стрессе / О. С. Арташян, Б. Г. Юшков, Е. А. Мухлынина // Цитология.
2006. Т. 48, № 8. С. 665-668.
2. Линднер, Д. П. Морфометрический анализ популяции тучных клеток / Д. П. Линднер
[и др.] // Архив патологии. 1976. Т. 38, № 8. С. 3-14.
3. Фрейдлин, И. С. Клетки иммунной системы / И. С. Фрейдлин, А. А. Тотолян СПб •
Наука, 2001. 390 с.
4. Key role of mast cells and their major secretory products in inflammatory bowel disease
// World J. Gastroenterology. 2004. Feb. 1. Vol. 10, № 3. P. 309-318.
Д. Р. Жданова, О. В. Николина, К. В. Никушкина
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПОТОМСТВА САМОК КРЫС
С ХРОНИЧЕСКИМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ
Изучены морфофутционалъные особенности щитовидной железы потомства
самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени. Выявлено повышение функциональной активности щитовидной железы, о чем свидетелъствувЫС тЫтиР ЧШОвUduaMem
ТаТоТпГ
° °
P«»d*Pтирощтов,
на фоне повышения концентрации тироксина.
ОбО
68
*
-
у
1
наблюдающееся
3 а Ш Ш а ю т
б о л е з н и
*»*'Аие в координации и регуляции деятельности всех других
систем организма, позволяя последнему адекватно реагировать на постоянно изменяющиеся условия внешней и внутренней среды. Основную массу щитовидной железы образует
собственно тиреоидная паренхима, функция которой заключается в синтезе, накоплении
и выделении тиреоидных гормонов — трийодтиронина и тетрайодтиронина (тироксина). Тиреоидные гормоны являются одними из ведущих стимуляторов метаболизма, они
необходимы для обеспечения процессов роста и развития организма, дифференцировки
тканей, регуляции обмена веществ и энергии, поддержания определенного уровня активности функциональных систем организма, развития адаптационных реакций [1-4; 10].
В связи с этим целью данного исследования явилось изучение морфофункционального состояния щитовидной железы потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени матери.
Материал и методы. В эксперименте были использованы белые лабораторные крысы
(самки) и их потомство на 15-е (подсосный период) и 45-е (период полового созревания)
сутки. Экспериментальные животные были разделены на две группы. Первую составило
потомство интактных животных, вторую — животных с хроническим экспериментальным поражением печени.
Модель хронического поражения печени создавали путем внутрипеченочного введения 0,2 мл фильтрата 6-дневной культуры E.coli и последующим введением через сутки в
хвостовую вену того же фильтрата E.coli в количестве 0,3 мл/кг массы тела. Возникающие
при этом морфологические изменения, согласно данным литературы, соответствуют таковым при гепатите А [8].
Поражение гепатобилиарной системы экспериментальных животных верифицировали с помощью морфологических, биохимических и иммунологических методов исследования.
Серийные гистологические срезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилиномэозином. С помощью морфометрической программы Motic Images Plus, 2,0 подсчитывали среднюю высоту тироцитов и средний диаметр ядер тироцитов щитовидной железы.
В сыворотке крови с помощью иммуноферментного твердофазного метода [7] определяли концентрацию тиреотропного гормона (ТТГ) гипофиза и гормона щитовидной железы —тироксина. Статистическая обработка проводилась с помощью непараметрического
критерия Манна-Уитни.
Результаты исследования. В щитовидной железе животных обеих групп с возрастом
происходит снижение высоты тироцитов, однако в опытной группе данный показатель
выше контрольного на всех сроках исследования (табл. 1). Исследование среднего диаметра ядер тироцитов выявило аналогичную закономерность: с возрастом происходит
постепенное снижение изучаемого показателя в обеих группах, причем данный показатель также выше в опытной группе (табл. 1).
Таблица 1
Высота тироцитов и диаметр ядер тироцитов фолликулов щитовидной железы
экспериментальных животных
Диаметр ядер
тироцитов, мкм
Высота
тироцитов, мкм
Диаметр ядер
тироцитов, мкм
Контрольная
Опытная
Различия значимы по сравнению с данными в контроле при Р<0,05.
•--"»
. * д •»
— 3— —
I
| I
I I
—
69
Установлено, что у животных опытной группы с возрастом происходит снижение уровня ТТГ, в то время как у интактных крысят, напротив, выявлено увеличение
концентрации ТТГ к периоду полового созревания. При этом содержание ТТГ у подопытных животных на всех сроках исследования снижено по сравнению с контролем (табл. 2).
Анализ содержания гормона тироксина показал, что у подопытных крысят с возрастом имеет место постепенное снижение концентрации тироксина, в то время как у
интактных животных уровень концентрации данного гормона не только не снижается,
а даже имеет тенденцию к увеличению. При этом у подопытных животных концентрация тироксина превышает таковую в контроле, особенно на 15-е сутки (табл. 2).
Таблица 2
Уровень ТТГ и тироксина в сыворотке крови экспериментальных животных
Группа животных
Контрольная
Опытная
15-е сутки
Тироксин,
ТТГ, мкМЕ/мл
мкМЕ/мл
19,255±0,41
0,148±0,05
27,832±3,46*
0,113±0,03
45-е сутки
ТТГ, мкМЕ/мл
0,180±0,09
0,007±0,01*
Тироксин,
мкМЕ/мл
19,655±1,85
20,472±1,71
* Различия значимы по сравнению с данными в контроле при Р<0,05.
Обсуждение полученных данных. Таким образом, анализ полученных результатов
позволяет сделать заключение о том, что у самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени, аналогичным гепатиту А, рождается потомство с усилением
функционального состояния щитовидной железы, о чем свидетельствует, прежде всего, повышение концентрации йодсодержащего гормона щитовидной железы — тироксина и увеличение средней высоты тироцитов и среднего диаметра ядер тироцитов.
Однако изменение секреторной активности щитовидной железы животных опытной
группы не обусловлено нарушением регулирующего влияния со стороны аденогипофиза, поскольку уровень ТТГ в этой группе животных снижен по сравнению с контролем. Данная клиническая картина характерна для так называемой «функциональной
автономии» щитовидной железы, при которой клетки органа выходят из-под контроля гипофиза и синтезируют гормоны в избыточном количестве. Причиной автономии
может быть все, что приводит к независимой от ТТГ активации тиреоидных клеток,
и прежде всего стимуляция тироцитов внутриклеточными активаторами роста [6; 8;
9]. Возможно, подобная стимуляция тиреоидных клеток определяется необходимостью более интенсивной регуляции метаболических процессов организма животных
опытной группы, поскольку патология печени вызывает в организме беременной самки нарушение различных видов метаболизма и как следствие — компенсаторно-приспособительные реакции в организме развивающегося потомства, сохраняющиеся и
в постнатальном периоде.
Список литературы
P
„ Jn^T
S ff
а Я СИСТШа И г о м е о с т а з
/ Б- В. Алешин // Гомеостаз / под
ред. П. Д. Горизонтова. М.: Медицина, 1981.
М. ^ д а ц Г н а , Ю83.
4
70
S
S
^
ГИШТаЛаМуС И щитови
Д н а я ^ л е з а / Б. В. Алешин, В. И. Губский.
А ЭНДОКРИНОЛОГИЯ /М - И - Балаболкин. М.: Медицина, 1989.
И
'
5. Брюхин, Г. В. Особенности формирования ГЗТ у потомства самок с хроническим
поражением печени при действии иммобилизационного стресса / Г. В. Брюхин, Г. И. Михайлова// Физиолог, журн. 1998. № 5-6. С. 18-20.
6. Быков, В. Л. Гистофизиология щитовидной железы в постнатальном онтогенезе
/ В. Л. Быков // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1979. Т. LXXVI, № з.
С. 80-92.
7. Карпищенко, А. И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика
/ А. И. Карпищенко. СПб.: Интермедика, 1999.
8. Саков, Б. А. Моделирование воспалительного процесса в печени / Б. А. Саков
[и др.] // Моделирование, методы изучения и экспериментальная терапия патологических процессов. М., 1967. Ч. 1.
9. Свириденко, Н. Функциональная автономия щитовидной железы / Н. Свириденко
//Врач. 2002. №7. С. 21-23.
10. Семененя, И. А. Функциональное значение щитовидной железы / И. А. Семененя.
Успехи физиол. наук. 2004. Т. 35, № 2. С. 41-56.
О. М. Малышева, Е. Н. Пашнина
МАСТОЦИТЫ КАК ОДИН ИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
МИКРООКРУЖЕНИЯ СЕЛЕЗЁНКИ ПОТОМСТВА САМОК КРЫС
С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ
Проведено изучение количественного и качественного популяционного состава тучных клеток селезенки потомства самок крыс с экспериментальным
D-галактозаминовым поражением печени. Установлено уменьшение числа тучных клеток, увеличение их функциональной активности, о чем свидетельствует
увеличение индекса гранулярного насыщения и дегрануляции.
Микроокружение селезенки играет важную роль в становлении ее функциональной
активности [5-7]. Структурными компонентами внутриселезеночного микроокружения
являются волокнистые (коллагеновые, эластические, ретикулярные волокна) и клеточные элементы (гранулоциты, макрофаги, плазмоциты, ретикулоциты, мастоциты). Цель
нашего исследования заключалась в изучении количественного и качественного состава
мастоцитов как одного из показателей специфического внутриорганного микроокружения селезенки потомства самок крыс с экспериментальным хроническим поражением
печени различного генеза.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования явилось потомство самок крыс с экспериментальным поражением печени в различные сроки постнатального
онтогенеза (на 1, 15, 30-й и 45-й дни жизни) согласно общепринятому подразделению
возрастных периодов [2]. Все экспериментальные животные были разделены на две группы: подопытную (животные от самок с экспериментальным поражением печени) и контрольную (животные от интактных родителей). Модель экспериментального поражения
печени создавали путем введения взрослым половозрелым животным гепатотропного
яда D(+) - галактозамина гидрохлорида однократно, внутрибрюшинно, по общепринятой методике согласно данным литературы (Н. П. Сугробова и др., 1992). Эта модель поРажения печени соответствует вирусному гепатиту В человека. С помощью морфологических (дистрофия гепатоцитов, гиперплазия клеток Купфера и другие), биохимических
(гипопротеинемия, гипербиллирубинемия, повышение АЛТ и ACT) и иммунологических
(повышение титра печеночных аутоантител) методов верифицировали поражение гепатобилиарной системы. Отпрепарированную селезенку фиксировали в 10 %-м нейтральном
формалине и фиксаторе Карнуа, затем заливали в парафин. Мастоциты определяли на
гистологических срезах толщиной 6-7 мкм, окрашивали ОД %-м раствором толуидинового синего, полихромной синькой и по методу Май-Грюнвальда. Определяли среднее
количество мастоцитов на единицу площади. Общепризнанная методика Д. П. Линднера
и соавторов (1980) использовалась нами при оценке функционального состояния мастоцитов селезенки экспериментальных животных. Клетки оценивались по четырем критериям: методу цитограмм, индексу насыщения гепарином, индексу дегрануляции, относительной частоте слабой, умеренной и сильной дегрануляции.
Результаты исследования и их обсуждение. По количеству гранул в тучной клетке и
за ее пределами можно судить о ее функциональной активности [1; 3]. При оценке структурно-функционального состояния мастоцитов в селезенке потомства экспериментальных животных нами установлено, что количество клеток значительно снижено в экспериментальной группе по сравнению с контрольной на всех сроках исследования. Оценка
функциональной активности мастоцитов селезенки с различной степенью гранулярного
насыщения цитоплазмы показала высокое содержание клеток с высокой и очень высокой
степенью гранулярного насыщения (темные и очень темные клетки) у интактных животных, в то время как содержание мастоцитов с низкой степенью гранулярного насыщения (светлые и очень светлые клетки) оказалось сниженным по сравнению с контролем.
У животных подопытной группы, наоборот, количество тучных клеток с низкой степенью гранулярного насыщения выше, чем мастоцитов с высокой степенью гранулярного
насыщения (табл. 1).
Таблица 1
Содержание в селезенке экспериментальных животных мастоцитов
различной степени гранулярного насыщения (М±т)
Группа
К
п=27
О
п=28
Степень
насыщения*
1
2
3
4
1
2
Количество клеток гранулярного насыщения цитоплазмы
1-е сут.
15-е сут
30-е сут
45-е сут.
40,19±2,13
34,47±2,33
30,01±2,17
28,93±1,56
25,41±1,03
20,80±2,38
27,04±2,71
23,79±1,14
20,08±1,43
20,79±1,02
21Д7±2Д?
23,4Ш,19
23,23±1,56
20,40±1,509
19,33±1,3
20,95±1,19
18,45±0,59**
20,28±1,58**
15,97±1,28**
20,99±1,89**
10,30±0,32*
18,40±0,98
14,74±0,97**
15,97±1,28**
з •
30,28±2,41**
32,75±2,51**
40,44±2Д9**
35,08±1,76**
4
36,09±1,08**
35,86±2,408**
28,43±1,53**
30,28±1,76**
* Степень гранулярного насыщения тучных клеток: 1 — очень темные клетки, 2 — темные
клетки, 3 — светлые клетки, 4 — очень светлые клетки.
** Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем.
Интенсивность дегрануляции является наиболее важным критерием, отражающим
функциональную активность мастоцитов. Нами установлено, что у интактных животных клетки со слабой степенью дегрануляции (неактивные и слабоактивные) преобладают над тучными клетками с умеренной и сильной степенью дегрануляции (активные).
У животных опытной группы, наоборот, преобладают клетки с высокой степенью дегрануляции на всех сроках исследования (табл. 2). Вместе с изменением субпопуляционного
состава тучных клеток с различной степенью дегрангуляции меняется и индекс дегрануляции, который у животных опытной группы больше, чем в контроле.
Таблица 2
Содержание в селезенке экспериментальных животных мастоцитов
различной степени дегрануляции (М±т)
Группа
Степень
дегрануляции*
К
0
1
2
3
0
1
2
3
п=27
0
п=28
Количество клеток с различной степенью дегрануляции
1-е сут
15-е сут
30-е сут
45-е сут
11,30±0,96
18527±0,97
10,30±0,32
13,55±0,91
24,98±1,43
25,41±1,03
29,66±1,38
28,43±1,53
23,59±1,43
28,43*1,53
20Д5±1,81
24,98*1,43
19,33±1,3
13,55±0,91
21,17±2,19
19,47±0,91
11,86±0,78
10,07*1,09
15,97±1,28
12,45±0,48
23,79*1,14
20,28±1,58
24,98±1,43
20,99±1,89
40,01±1,20**
36,56±1,69** 36,09±1,08** 34,47±2,33
25,19*1,46**
18,40±0,98
20,28±1,58
12,45±0,48
* Степень дегрануляции тучных клеток: 0 — неактивные клетки, 1 — слабая дегрануляция,
2—умеренная дегрануляция, 3 — сильная дегрануляция.
** Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем.
Мастоциты — резидентные клетки соединительной ткани [4]. Их основная функция — синтез и накопление в гранулах разнообразных биологически активных веществ,
медиаторов, ферментов. Основным компонентом гранул тучных клеток является отрицательно заряженный сульфатированный гликозаминогликан гепарин, синтезируемый
и запасаемый исключительно тучными клетками. Гепарин регулирует клеточную пролиферацию, стимулирует как фагоцитоз, так и пиноцитоз, но угнетает действие комплемента, участвует в реакции ГЗТ (М. Frieri, 1984). И. С. Фрейдлин и А. А. Тотолян (2001)
считают, что медиатором гиперчувствительности немедленного типа является гистамин, который также выступает компонентом гранул тучных клеток. Он подавляет гуморальный иммунитет, так как угнетает дифференцировку В-лимфоцитов и продукцию
иммуноглобулинов. Гистамин снижает продукцию С2- и СЗ-компоненты комплемента
через Н2-рецепторы клеток-мишеней, но стимулирует продукцию СЗ-компонента комплемента через Н1-рецепторы соответственно. Кроме того, выработка цитокинов контролируется гистамином: стимулируется секреция ИЛ-6, а угнетается ИЛ-1, ИЛ-2, TNF.
При активации тучных клеток (наряду с секрецией содержимого гранул) образуются
метаболиты арахидоновой кислоты — простагландины, тромбоксан ХГА-2 и леикотриены. Мастоциты имеют высокоаффинные поверхностные рецепторы к Fc-фрагментам
IgE. Связывание Аг (аллергена) с молекулой IgE на поверхности тучных клеток сопровождается экзоцитозом содержимого гранул, образованием метаболитов арахидоновой
кислоты [4]. Активация и дегрануляция тучных клеток опосредована IgE. В результате
Дегрануляции мастоциты теряют специфические гранулы.
•
Таким образом, полученные результаты изучения функциональной активности мастоцитов селезенки потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени свидетельствуют об изменении численного состава тучных клеток и их функционального
состояния! ч т о ! можетТе сказаться на нарушении внутриорганного микроокружения
(снижение процессов пролиферации и дифференцировки л и м ^ ^ н к п и о н а л ь н о г о
Логично предположить что изменение числа тучных клеток и их функционального
^
^
^
М
Ш
компонентом внутриорганного микроокружения,
73
может обусловить нарушения гемопоэтических процессов в селезенке потомства самок
крыс с хроническим экспериментальным D-галактозаминовым поражением печени.
Список литературы
1. Автандилов, Г. Г. Медицинская морфометрия / Г. Г. Автандилов. М. : Медицина,
1990. 384 с.
2. Западнюк, И. П. Лабораторные животные, их разведение, содержание и использование в эксперименте / И. П. Западнюк [и др.]. Киев : Вища шк., 1983.383 с.
3. Линднер, Д. П. Морфометрический анализ популяции тучных клеток / Д. П. Линднер [и др.] // Архив патологии. 1980. № 6. С. 60-64.
4. Улумбеков, Э. Г. Гистология : учебник / Э. Г. Улумбеков; под ред. Э. Г. Улумбекова,
Ю. А. Челышева. 2-е изд., перераб. и доп. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002. 672 с.
5. Фрейндлин, И. С. Клетки иммунной системы / И. С. Фрейндлин, А. А. Тотолян.
СПб.: Наука, 2001. 390 с. (Т. 3, 5,44).
6. Хаитов, Р. М. Иммунология / Р. М. Хаитов, Г. А. Игнатьева, И. Г. Сидорович. М.:
Медицина, 2000. 432 с.
7. Ярилин, А. А. Основы иммунологии / А. А. Ярилин. М.: Медицина, 1999. 608 с.
О. В. Николина,Д. Р. Жданова, А. А. Федосов, Е. Н. Пашнина
ХАРАКТЕРИСТИКА ПАРАФОЛЛИКУЛЯРНЫХ КЛЕТОК
ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПОТОМСТВА САМОК КРЫС
С ХРОНИЧЕСКОЙ НАРКОТИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИЕЙ
НА РАЗНЫХ СРОКАХ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучено морфофункционалъное становление парафолликулярных клеток
(С-клеток) щитовидной железы потомства самок крыс с хронической наркотической интоксикацией. Выявление парафолликулярных клеток проводилось с помощью иммуногистохимической реакции — стрептовидин-биотиновым методом
(с моноклоналъными антителами к калъцитонжу). Установлено, что хроническая
наркотическая интоксикация самок крыс приводит к увеличению количества парафолликулярных клеток в щитовидной железе потомства.
В настоящее время большое внимание уделяется изучению так называемого специфического микроокружения различных органов человека, в том числе и микроокружения
щитовидной железы. Такой интерес обусловлен регулирующим влиянием компонентов
микроокружения на дифференцировку, функциональную и пролиферативную активность
основных компонентов паренхимы органов, иммунной, эндокринной и других систем [3].
Неотъемлемым компонентом щитовидной железы являются С-клетки, которые наряду с гемокапиллярами, тучными клетками, макрофагами, фибробластами и симпатическими нервными сплетениями входят в состав микроокружения тиреоцитов щитовидной
железы [3].
Парафолликулярные клетки (С-клетки) вырабатывают большой спектр биологически активных веществ, среди которых главную роль выполняет кальцитонин [1; 6; 7].
Кальцитонин усиливает функциональную активность тиреоцитов и влияет также на процесс образования тиреоидных гормонов за счет регуляции содержания ионов кальция в
цитоплазме тиреоцитов [5; 6].
74
В связи с этим целью нашего исследования явился анализ морфологических и функциональных особенностей парафолликулярных клеток щитовидной железы потомства
самок крыс с хронической наркотической интоксикацией.
В эксперименте были использованы белые лабораторные крысы и их потомство в различные сроки постнатального онтогенеза (1,15,30,45,60-е сутки). Экспериментальные животные были разделены на две группы. В первую группу вошли животные от интактных
матерей, во вторую — от матерей с хронической героиновой интоксикацией. Хроническая
героиновая интоксикация у взрослых животных (самок) моделировалась путем внутрибрюшинного введения 0,0037 %-го раствора героина в возрастающей концентрации [4].
Выявление парафолликулярных клеток проводили с помощью иммуногистохимической реакции — стрептовидин-биотиновым методом (с моноклональными антителами к
кальцитонину). Для проведения данного исследования использовали готовые реактивы
фирмы «Новокастра».
По итогам нашего исследования были получены следующие результаты. Количество
парафолликулярных клеток на единицу площади у однодневных животных контрольной
группы составляет 4±0,7, а в опытной группе этот показатель почти в два раза оказался
выше и составил 7,3±0,5. К 15-м суткам количество парафолликулярных клеток возрастает в обеих группах: так, в контрольной группе оно составляет 8,8±1,4, а в опытной —
15±1,9. На 30-й день и в контроле, и в опыте показатель резко увеличился и составил соответственно 20,9±1,3 и 42,5±5,6. Наибольшее значение в обеих группах изучаемый показатель достигает на 45-е сутки. В частности, в контрольной группе содержание С-клеток
составило 24,2±2,0, в то время как в опытной группе — 50,8±1,9 на единицу площади.
Обращает на себя внимание, что к 60-м суткам количество С-клеток снижается и в контроле, и в опыте и составляет соответственно 16±2,9 и 24,4±3,2. Следует отметить, что
количество парафолликулярных клеток в экспериментальной группе животных значительно превышает количество этих клеток в контрольной группе животных на всех сроках исследования (см. рисунок).
Л'
60 50 •
40 30 "
20 •
10 0-
в
а
есут '15-есут 'зо-есут' 45-есут 60-есут °*Р ™
——— контроль
"-"* "*" оп Ь 1 Т
Количество С-клеток щитовидной железы на единицу площади (37 500 мкм2)
* Результаты статистически достоверны.
Кроме того, при изучении С-клеток, выявленных иммуногистохимическим методом,
нами наблюдались их крупные скопления (более 6 клеток) и цепочки вокруг фояяикулов
что свидетельствуетовыраженнойгиперплазиишпуляции парафолликулярных клеток
ТГГбр^^роническая нар—кая ин_циясам»
£ £ £
Увеличению количества парафолликулярных клеток (С-клеток) в
ДО""""""
потомства Возможно повышение количества С-клеток является компенсаторным про-
нарушенной функции тиреоцитов, так как по данным литературы и проведенным ранее
исследованиям при хронической наркотической интоксикации матери происходит структурно-функциональное изменение щитовидной железы потомства [2]. Кальцитонин же
оказывает индуцирующее влияние на функциональный статус тиреоидного эпителия,
повышая чувствительность тиреоцитов к действию ТТГ. Помимо «главного» действия
кальцитонин также выполняет функцию стресс-лимитирующего фактора, ограничивая
активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы при действии на организм стрессовых раздражителей, подавляет выработку тиротропина, пролактина, инсулина, ускоряет процессы регенерации тканей, ингибирует воспалительные процессы и
другое [5; 6].
Исходя из вышеизложенного, можно сделать заключение, что хроническая героиновая интоксикация матери приводит к нарушению структурно-функционального состояния компонентов микроокружения, в том числе и С-клеток.
Список литературы
1. Алешин, Б. В. Гипоталамус и щитовидная железа / Б. В. Алешин, В. И. Губский.
М.: Медицина, 1983. 184 с.
2. Брюхин, Г. В. Структурно-функциональное становление щитовидной железы потомства самок крыс с хронической наркотической интоксикацией / Г. В. Брюхин,
О. В. Николина // Актуальные проблемы медицинской науки, технологий и профессионального образования. Челябинск, 2005. С. 32-34. .
3. Виноградов, С. Ю. Функциональная морфология нейромедиаторного биаминового обеспечения щитовидной железы в процессе беременности / С. Ю. Виноградов,
Ю. В. Погорелов, И. Ю. Торшилова//Вестн. Иван. мед. акад. 1996. Т. 1, № 1. С. 23-26.
4. Казарцев, В. В. Влияние острой кровопотери на выраженность синдрома отмены
при героиновой зависимости у крыс / В. В. Казарцев, Е. Е. Щерба // Лазерные технологии
в медицине / под ред. А. И. Козеля. Челябинск, 2003. С. 344-354.
5. Семеня, И. Н. Функциональное значение щитовидной железы / И. Н. Семеня // Успехи физиол. наук. 2004. Т. 35, № 2. С. 41-56.
6. Федченко, Н. П. Некоторые проблемы структурной организации щитовидной
железы / Н. П. Федченко // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1986. Вып. 6.
С. 82-89.
7. Хмельницкий, О. К. Цитологическая и гистологическая диагностика заболеваний
щитовидной железы / О. К. Хмельницкий. СПб.: СОТИС, 2002. 288 с.
А. А. Федосов, С. В. Барышева, О. В. Николина, Е. Н. Пашнина
ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНОГО ГОМЕОСТАЗА ТИМУСА
ПОТОМСТВА САМОК КРЫС
С ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРОИНОВОЙ ИНТОКСИКАЦИЕЙ
Изучены показатели готовности к апоптозу и пролиферации лимфоцитов
тимуса и периферической крови у потомства самок крыс с хронической героиновой интоксикацией в различные сроки постнаталъного онтогенеза. Оценка
пролиферативной активности проводилась по методу J. Crocker, P. Nar [14] с
H шслого се е
а
nv,-nohor,an^
' Р °Р Готовность к Fas-зависимому апоптозу
определялась с помощью моноклональных антител к CD95 в реакции непрямой
иммунофлюоресценцж. Выявлено изменение количества «NORs-активированных»
тимоцитов и лимфоцитов периферической крови и уменьшение их готовности
к Fas-зависимому апоптозу. В специальной серии исследования проведен сравнительный анализ количественных и функциональных особенностей тучных клеток в тимусе потомства самок крыс с хронической героиновой интоксикацией.
Установлено уменьшение общего количества мастоцитов и изменение их секреторной активности.
По данным официальной статистики, в России за последнее десятилетие проблема
наркомании приобрела характер эпидемии. По мнению большинства экспертов, прогрессивная наркотизация населения представляет угрозу не только здоровью, но и национальной безопасности. При этом демографическая ситуация в стране характеризуется как крайне негативная: снижается средняя продолжительность жизни, растет смертность, падает рождаемость, увеличивается заболеваемость инфекционными заболеваниями. Ухудшение показателейзоспроизводства населения тесно коррелирует с невысоким
уровнем репродуктивного здоровья, высокой материнской смертностью, увеличением
числа осложнений во время беременности и родов. Одной из причин, объясняющих негативные тенденции в обществе, в том числе высокий уровень перинатальных потерь,
является существенный рост числа женщин среди лиц, употребляющих наркотические
вещества. Вызывает настороженность и тот факт, что среди употребляющих наркотики
очень высока доля женщин фертильного возраста и беременных [3; 13].
По данным клинических наблюдений, в России широкое распространение получили
наркотики опийной группы, в том числе героин. Помимо общепризнанного воздействия на центральную нервную систему доказано токсическое влияние героина на многие
внутренние органы и системы организма [8]. Кроме того, данные клинических и экспериментальных исследований свидетельствуют об иммунотоксическом действии наркотика, что нашло свое отражение в нарушении клеточного и гуморального иммунитета
У данной категории больных. Опийная наркомания сопровождается снижением общего содержания Т-лимфоцитов, изменением их субпопуляционного состава, нарушением
пролиферативной активности, что позволяет сделать вывод о формировании вторичного
иммунодефицита [5].
Вместе с тем, согласно немногочисленным литературным данным, дети матерей с
хронической наркотической интоксикацией отстают в физическом и психическом развитии, предрасположены к инфекционным заболеваниям [13]. В связи с вышеизложенным представляется весьма актуальным изучение морфофункционального становления
тимуса как центрального органа клеточного иммунитета у потомства матерей с наркотической интоксикацией.
„
ч
Ранее нами было установлено, что у самок крыс с хронической наркотической интоксикацией рождается физиологически незрелое потомство, что проявляется в снижении
его жизнеспособности; уменьшении накопления массы тела, задержке сроков исчезновения имматурантности, гипотрофичности. Интересными, на наш взгляд, являются данные,
свидетельствующиеобувеличенииуноворожденныхкрысятмассытимусаиего весового
индекса, а в последующие сроки постнатального развития эти показатели у подопытных
крысят оказываются сниженными по сравнению с контролем. Принимая во внимание
иммунных, цитокринных и эндокринных функций органа. Вместе с тем известно, что
поддержание и регуляция клеточного (тканевого) гомеостаза осуществляется двумя противоположными процессами: пролиферативной активностью и апоптозом [6; 7; 10]. В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение показателей готовности к
апоптозу и пролиферативной активности тимоцитов и лимфоцитов периферической крови
потомства самок крыс с хронической наркотической интоксикацией.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования явилось потомство самок крыс «Vistar» с хронической героиновой наркотизацией в различные сроки постнатального периода (на 1, 15, 30, 45-й и 60-й день жизни). Модель хронической наркотизации создавалась у взрослых половозрелых крыс массой 180-220 граммов путем внутрибрюшинного введения 0,0037 %-го раствора героина в возрастающей концентрации. Весь
период индукции наркотической зависимости занимал 16 дней. О развитии синдрома
отмены судили на основании общепринятых показателей: пилоэрекция, поиск, скрежет
зубами (груминг), поза «сидя на стуле», симптом отряхивания «мокрой собаки», частота
писка, диарея. Через трое суток после последней инъекции героина к подопытным крысам-самкам подсаживались здоровые самцы [2].
Все работы со взрослыми животными и потомством велись в соответствии с
«Правилами проведения работ с использованием лабораторных животных». Для оценки
пролиферативной активности тимоцитов и лимфоцитов периферической крови использовалась методика с применением азотнокислого серебра, которая основана на выявлении активных ядрышковых организаторов (AgNORs) [14]. Часть выделенного тимуса
гомогенизировали, полученную клеточную суспензию центрифугировали в среде 199
и готовили мазки. Лимфоцитарно-моноцитарная клеточная суспензия периферической
крови получалась нами по общепринятой методике с использованием градиента фиколла-верографина (1,077) [12]. Готовые зафиксированные по Карнуа мазки помещали в инкубационный раствор, состоящий из водного раствора нитрата серебра и раствора желатины на 1 %-м водном растворе муравьиной кислоты. Инкубированные высушенные
мазки подвергали микроскопии. Учет реакции осуществлялся в 100 клетках с использованием зелёного светофильтра, редуцирующего хроматические аберрации. Готовность
к запрограммированной клеточной гибели определяли методом непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции с моноклональными антителами серии ИКО-160
для выявления FAS/APO-1 антигена (CD95), опосредующего апоптоз. При этом на стекле подсчитывали 300 клеток с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-ИЗ
при увеличении объектива х 90, окуляра х 10 с использованием светофильтров БС-8-3,
СС-15-4, СЗС-24-4. Определяли процент светящихся клеток. Для контроля использовали
препараты, обработанные фосфатным буфером.
Учитывая тот факт, что в регуляции клеточного гомеостаза паренхиматозного компартмента вилочковой железы принимают активное участие компоненты стромы органа,
в специальной серии исследований мы провели оценку количественных и функциональных особенностей тучных клеток как одного из важнейших компонентов специфического внутриорганного микроокружения. С этой целью после выделения тимус фиксировали в 10 %-м нейтральном формалине и фиксаторе Карнуа. Серийные гистологические
срезы толщиной 6-7 мкм окрашивали толуидиновым синим и метиленовым синим —
эозином по Май-Грюнвальду. Морфометрический анализ проводился с помощью сетки
Г. Г. Автандилова [1]. При анализе содержания и функционального состояния тучных
клеток мы руководствовались общепринятыми критериями их оценки [4]. Оценивалось
5
2
общее содержание мастоцитов из расчета на условную площадь (10 мкм ) и количество
клеток с разной степенью гранулярного насыщения и дегрануляции.
78
Данные обрабатывали с помощью программы «ЗТАТТЯТтгдчч „ f t
ного и дисперсионного анализа.
«ЫАШТГСА» методами вариационРезультаты исследования и их обсуждение. В результате проведённого исследования
пролиферативнои активности лимфоцитов тимуса нами выявлено, что на б о л Г Г н ™
сроков исследования количество «NORs-активированных» клеток у потомсГаТамок с
хронической героиновой интоксикацией снижено по сравнению с интактГшиТвот
ньши (рис. 1). Исключение составили новорождённые и 60-дневные крысята у ™ Г х
зарегистрировано повышение пролифератившй активности. Выявленное нами с н и ^ ш е
количества «NORs-активированных» тимоцитов скорее всего обусловлено у г н ™ м
транскрипционной и пролиферативной активности клеток, что в конечном итоге не может не повлиять на активность Т-лимфоцитопоэза в центральном компартменте.
Количество «NORsактивированных»
клеток, %
60,00 Щ контроль
50,00 -
Q опыт
40,00 30,0020,00 10,000,00
1-е
15-е
30-е
45-е
60-е
' Возраст, сутки
Рис. 1. Характеристика пролиферативной активности тимоцитов
потомства экспериментальных о/сивотных в различные сроки постнаталъного онтогенеза
* Результаты статистически достоверны (р< 0,05).
Угнетение пролиферативной активности тимоцитов потомства животных с хронической героиновой интоксикацией сопровождается снижением и количества «NORsактивированных» лимфоцитов в периферической крови (табл. 1). Исключение составили
новорождённые и 60-дневные крысята, у которых количество «NORs-активированных»
клеток превышает таковое по сравнению с интактными животными соответствующего
возраста.
Таблица 1
Характеристика пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови
потомства экспериментальных животных (М±т)
Количество «NORs-активированных» клеток, %
Группа
45-е сут
60-е сут
ЖИВОТНЫХ
30-е сут.
15-е сут
1-е сут
42,40±2,400
48,86±1,752
52,80±1,241
Контрольная 48,00± 1,517 54,75± 1,702
п=б
п=8
п=6
— (К)
Опытная
51>60±0,510 44,25±1,109* 41,80±2,538* 39,29±1,672* 51,80±1,28Р
п=б
п-8
(О)
п=6
* Здесь и в табл. 2-3 р<0,05 по сравнению с контролем.
Адекватное равновесие в иммунной системе поддерживается благодаря еще одноМ
У важному явлению — генетически запрограммированной гибели клетки — апоптозу.
Усиление или подавление апоптоза всегда вызывает изменение гомеостаза и, как следствие, способствует развитию патологических состояний, в том числе и в иммунной системе [Ю]. Общепризнанным является тот факт, что для реализации внутриклеточного
79
сценария смерти клетки необходим какой-то стимул (антиген, цитокины, митогены и
др.). Для восприятия этого стимулирующего сигнала лимфоциты, как и многие другие клетки, несут на своей поверхности специальные рецепторы, в том числе Fas/APO-1
(CD95) [6; 7; 10].
Во второй серии исследования нами изучена готовность тимоцитов и лимфоцитов периферической крови к генетически запрограммированной гибели потомства самок крыс
с хронической наркотической интоксикацией. Установлено, что у интактных животных в исследуемые сроки постнатального развития число тимоцитов, экспрессирующих
Fas-рецептор, меняется незначительно с некоторым увеличением исследуемого показателя к периоду половой зрелости (рис. 2). Иная закономерность была выявлена в опытной группе животных: после рождения отмечается тенденция к снижению количества
Fas-позитивных тимоцитов, достигающее минимального уровня к периоду полового созревания.
Количество Fasположительных
тимоцитов, %
60,00
] контроль
50,00 40,0030,00 20,00 10,00 -I
0,00
1-е
15-е
30-е
45-е
60-е
'
Возраст,
р , сутки
у
Рис. 2. Содероюание СВ95-позитивных тимоцитов у потомства
экспериментальных животных в различные сроки постнатального онтогенеза
* Результаты статистически достоверны (р< 0,05).
При этом на всех сроках исследования у потомства животных с хронической героиновой интоксикацией готовность тимоцитов к Fas-зависимому апоптозу снижена по
сравнению с аналогичными показателями в контроле.
Иммунофлюоресцентный анализ готовности лимфоцитов периферической крови к
Fas-зависимому апоптозу позволил выявить аналогичную закономерность (табл. 2).
Таблица 2
Характеристика экспрессии CD95 на лимфоцитах периферической крови
потомства экспериментальных животных (М±т)
Группа
ЖИВОТНЫХ
Контрольная
(К)
Опытная
(О)
1-е сут.
46,00±1,160
п=8
42,30±1,200
Количество Fas-положительных клеток, %
15-е сут
30-е сут
45-е сут
47,50±1,270 51,20±4,020 49,00±2,610
п=7
п=9
п=8
42,50±1,040* 48,50±1,870 34,50±2,660*
п=8
п=б
п=7
60-е сут
53,ЗО±2,16О
п=7
37,30±2,940*
п=8
_
Таким образом, проведенный анализ пролиферативной активности и готовности к
Fas-зависимому апоптозу лимфоцитов центрального и периферического компартментов
свидетельствует об изменении количества «NORs-активированных» лимфоцитов тимуса
и периферической крови и уменьшении содержания клеток, экспрессирующих на своей
поверхности СЬ95-рецептор. Одной из возможных причин выявленных нами нарушений
80
клеточного гомеостаза в центральном и периферическом компартментах иммунной сие
темыможетбыть нарушение созреваниярецепторного аппарата л и м ф о ц и т о Т ш ~ "
в свою очередь, может быть следствием нарушения с п е ц и ф и ч е с к о г ^ н у ™ ™
микроокружения, включающего в себя стромальные компоненты, т у ч н ы е З к и м а Х
рофаги, плазмоциты, гранулоциты и др. Поэтому в специальной серии исследований
нами проведен сравнительный анализ количественных и функциональных о с о б е Г о ™
и н Г с с и ^ ц ™ Ш П У Л Я Ц И И В ТИМУС6 ШТ0МСТВа С а Ш К КРЫС С Х Р О Н И Ч е с к о й
г
е
Р ™
Нами установлено, что у интактных крысят наибольшее количество тучных клеток
в тимусе регистрируется в период новорождённости (рис. 3). В дальнейшем отмечается
постепенное снижение количества мастоцитов, достигающее минимального уровня к
периоду половой зрелости. У потомства подопытных животных выявлена аналогичная
закономерность. Обращает на себя внимание, что на большинстве сроков исследования
у крысят опытной группы количество мастоцитов в условной площади вилочковой железы снижено по сравнению с контролем.
п
7,00-|
6,00^ контроль
5,00-
PJ опыт
4,003,002,001,000,00
1-е
'
15-е
'
30-е
'
45-е
'
60-е
' Возраст, сутки
Рис. 3. Содержание тучных клеток в тимусе потомства экспериментальных животных
в различные сроки постнаталъного онтогенеза
* Результаты статистически достоверны (р< 0,05).
Анализ субпопуляционного состава тучных клеток с различной степенью гранулярного насыщения цитоплазмы показал, что у интактных крысят на всех сроках исследования
количество тучных клеток с высокой степенью гранулярного насыщения (очень темных
и темных) существенно выше, чем количество клеток с низкой степенью гранулярного
насыщения (светлых и очень светлых). Аналогичная закономерность была выявлена и у
животных опытной группы (табл. 3). Вместе с тем у подопытных крысят на всех сроках
исследования количество мастоцитов с высокой степенью гранулярного насыщения существенно превышает аналогичный показатель в контроле. В то же время количество
тучных клеток с низкой степенью гранулярного насыщения у подопытных животных значительно снижено по сравнению с интактными крысятами соответствующего возраста.
Вместе с тем у подопытных животных наблюдается изменение популяции тучных
клеток по степени дегрануляции. Нами установлено, что у крысят опытной группы количества неактивных тучных клеток и мастоцитов со слабой степенью дегрануляции
снижено по сравнению с контролем. Исключение составили 60-дневные животные, у
которых исследуемый показатель оказался выше по сравнению с контролем (рис. 4).
Одновременно у подопытных животных наблюдается увеличение числа тучных клеток
с
Умеренной и сильной дегрануляцией. Исключение составили 60-дневные крысята, у
которыхвыявлеио снижение количества мастоцитов с умеренной и сильной дегрануляЧией (рис. 5).
81
Таблица 3
Содержание в тимусе экспериментальных животных тучных клеток
различной степени насыщения (М+т)
Группа
К
п=30
О
п=27
Степень
насыщения
Высокая**
Количество клеток различной степени
гранулярного насыщения цитоплазмы, %
45-е сут
30-е сут
15-е сут
1-е сут
56,09±3,355 78,94*10,076 60,94±4Д22 65,00±ЗД10
43,91±4,150 21,06±3,054
81,10±5,125* 90,91±7Д20
Низкая
Высокая
18,90±8,012*
Низкая
60-е сут.
68,27±4Д35
39,06±3,031 35,00±4,056 31,73±3,312
83,66±3,015* 90,77±7,260* 93,63±10,577
9,09±2Д87* 16,34±5,040*
9,23±ЗД50*
6,37±0Д12
** Высокая степень насыщения: суммарное содержание очень темных и темных клеток; низкая
степень насыщения: суммарное содержание светлых и очень светлых клеток.
100,0080,00 60,00 -
Щ контроль
40,00 -
Цопыт
20,00 0,00
1-е
15-е
30-е
45-е
60-е
Возраст, сутки
Рис. 4. Содержание неактивных тучных клеток и мастоцитов
со слабой степенью дегрануляции в тимусе потомства экспериментальных животных
в различные сроки постнаталъного онтогенеза
* Результаты статистически достоверны (р< 0,05).
60,00 50,00 40,00
30,00-
контроль
20,00-
опыт
10,000,00
<лллл
<лл<л
1-е
15-е
30-е
45-е
60-е
—
Возраст, сутки
Рис. 5. Содержание тучных клеток с умеренной и сильной степенью дегрануляции
в тимусе потомства экспериментальных животных
в различные сроки постнатального онтогенеза
* Результаты статистически достоверны (р< 0,05).
Таким образом, анализ тучных клеток в тимусе потомства самок крыс с хронической
наркотической интоксикацией свидетельствует об уменьшении числа тучных клеток,
Г
Г Г Г Ф ° Н е ШТГШЯ
ИХ с е к
Р е т °Р Н 0 Й активности, что отражается на про-
* e ™ P ° B K e лимфоцитов и уровне их генетически запро. Анализируя полученные результаты, показывающие нарушения
клеточного (тканевого) гомеостаза в тимусе потомства самок крыс с хронической героиновой интоксикацией, можно предположить следующий механизм. Угнетение пролиферативной активности и готовности к Fas-зависимому апоптозу лимфоцитов тимуса и
периферической крови у потомства на большинстве сроков исследования, по всей видимости, является следствием нарушения условий внутриутробного развития при патологическом воздействии героина на организм матери. Присутствие опиоидных рецепторов
обнаружено на многих клетках, воздействие опиатов может приводить к нарушению их
деятельности [11]. Вместе с тем в ряде исследований было показано, что при опийной
наркомании в сыворотке крови наркозависимых появляются антитела к опиатам и повышается уровень специфических иммуноглобулинов к опиоидным пептидам и катехоламинам. Следствием этого может явиться нарушение деятельности опиоидергической
системы, что в последующем может отразиться на функциональной активности многих
органов и систем матери, в том числе дыхательной, пищеварительной, сердечно-сосудистой, эндокринной и иммунной. В свою очередь, изменённые условия внутриутробного
развития неблагоприятным образом отражаются на структурно-функциональном становлении различных органов и функциональных систем плода, в том числе тимо-лимфатической. Логично предположить, что антенатально повреждённая тимо-лимфатическая
система у потомства самок крыс с хронической наркотической интоксикацией в последующем онтогенезе не сможет поддерживать необходимый уровень иммунологической
реактивности.
Список литературы
1. Автандилов, Г. Г. Медицинская морфометрия / Г. Г. Автандилов. М.: Медицина,
1990.384 с.
2. Казарцев, В. В. Влияние острой кровопотери на выраженность синдрома отмены
при героиновой зависимости у крыс / В. В. Казарцев, Е. Е. Щерба // Лазерные технологии
в медицине / под ред. А. И. Козеля. Челябинск, 2003. С. 344-354.
3. Кошкина, Е. А. Основные тенденции распространенности наркологических расстройств в Российской Федерации в 2002 году / Е. А. Кошкина, В. В. Киржанова // Психиатрия и психофармакотерапия. 2002. Т. 5, № 4. С. 140-142.
4. Линднер, Д. П. Морфометрический анализ тучных клеток / Д. П. Линднер [и др.]
//Архив патологии. 1980. № 6. С. 60-64.
5. Лунькова, Л. К. Морфология органов иммунной системы при наркомании
/ Л. К. Лунькова [и др.]. // Архив патологии. 2002. Т. 64, № 4. С. 21-25.
6. Лушников, Е. В. Гибель клетки (апоптоз) / Е. В. Лушников. М.: Медицина, 2001.
192 с.
7. Никонова, М. Ф. Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа
Т-лимфоцитов на стимуляцию / М. Ф. Никонова [и др.] // Иммунология. 1999. № 2. С. 2023.
8. Пиголкин, Ю. И. Морфологические изменения внутренних органов при опиишй
наркомании / Ю.И. Шишкин. Д.В. Богомолов // Архив патологии. 2002. X 64, №1. С 3-5.
9. Робинсон, М. В. Апоптоз и цитокины / М. В. Робинсон, В. А. Труфакин // Успехи
совр. биологии. 1999. Т. 119, № 4. С. 359-367.
Гепшштвили
v
Ю. Сепиашвили, Р. И. Апоптоз в иммунологических процессах / Р. И. Сепиашвили
[и ДР.] // Аллергология и иммунология. 2000. Т 1 № L СЛ5-21
м ш п е н ь
П. Филоненко, М. А. Опиоидергическая система как Ф * Р ™ Л
наркотиков типа морфина и ее модуляция ^овишгориотш/
М А. Филоненко,
О- В- Дичаковская // Успехи совр. биологии. 2004. Т. 124, № 5. С. 489-500.
83
12 Фримель, Г. Иммунологические методы / Г. Фримель. М., 1987.
13 Шибанова, Н. И. Негативные последствия, связанные с употреблением алкоголя,
наркотических и сильнодействующих веществ / Н. И. Шибанова [и др.] // Рос. мед. журн.
2005. № 4. С. 9-13.
14. Crocker, J. Nucleolar organizer regions in lymphomas / J. Crocker, P. Nar // J. Pathol.
1987. Vol. 151. P. 111-118.
А. С. Романов
ХАРАКТЕРИСТИКА МИГРАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ
СПЕРМАТОЗОИДОВ У ПОТОМСТВА САМОК КРЫС
С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ХРОНИЧЕСКИМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ
В данной работе проводилось изучение миграционной активности сперматозоидов у потомства самок крыс с экспериментальным хроническим поражением
печени. На основании полученных данных сделано заключение о том, что у животных с экспериментальным хроническим поражением печени рождается потомство с нарушенным «стартом здоровья», в том числе репродуктивного.
Актуальность настоящего исследования определяется изучением репродуктивного
здоровья населения в связи с демографическим кризисом в Российской Федерации [3].
В свою очередь, репродуктивное здоровье женщин выделяется своей значимостью, так
как оно напрямую связано со здоровьем детей, В последние годы отмечается рост заболеваемости гепатобилиарной системы, в том числе у женщин детородного возраста.
Вместе с тем многочисленными клиническими наблюдениями и экспериментальными
исследованиями установлено, что у матерей с хроническим поражением гепатобилиарной системы рождается физиологически незрелое потомство, для которого характерно
нарушение морфофункционального становления ряда систем жизнеобеспечения, в том
числе иммунной, эндокринной, кроветворной и репродуктивной функций. В связи с этим
целью настоящего исследования явился анализ содержания и подвижности мужских половых клеток во взвеси сперматозоидов половозрелого потомства от самок крыс с хроническим поражением печени различного генеза.
Материалы и методы исследования. Эксперименты были проведены на белых крысах Вистар (самцы и самки) массой 120-230 г. Для достижения поставленной цели у
взрослых крыс-самок моделировалось хроническое поражение печени с помощью галактозамина.
D-галактозамин использовался нами для моделирования у экспериментальных животных морфофункциональных изменений в печени, соответствующих таковым при гепатите
В. Картина гепатита В'(опытная группа) создавалась путем введения экспериментальным
животным гепатотропного яда D-галактозамина гидрохлорида («Sigma-G0500», США)
по общепринятой методике однократно, внутрибрюшинно [2]. Морфологические изменения в печени соответствуют таковым при вирусном гепатите В человека. Поражение
печени верифицировали с помощью биохимических, морфологических методов.
Одним из показателей фертильности мужского организма является содержание в
эякуляте сперматозоидов и их подвижность. Нами установлено, что у потомства подопытных животных количество сперматозоидов во взвеси снижено по сравнению с. контролем. Так, если общее количество сперматозоидов у интактных животных составило
76±2,3-1О6 млн/мл, то у подопытных животных с экспериментальным поражением печени
этот показатель составил 54±1/7-10б млн/мл (опытная группа). В эксперименте использовались крысы-самцы 70-дневного возраста [9], потомство от контрольных и опытных
групп крыс-самок. Выбор белых крыс в качестве модели для изучения мужской половой
системы объясняется тем, что этот вид животных обладает высокой плодовитостью и
круглогодично размножается в условиях вивария.
Для оценки подвижности сперматозоидов экспериментальных животных проводилось микроскопическое исследование взвеси сперматозоидов обычным микроскопом с
увеличением 400 (объектив 40, окуляр 10), при комнатной температуре (не ниже + 20 °С).
Для получения зрелых сперматозоидов из эпидидимиса путем его растирания в 1 мл
5 %-го раствора глюкозы в течение 2 минут. Подсчет сперматозоидов осуществлялся в
камере Горяева в пяти больших квадратах через 1, 15, 30, 45, 60, 90,120, 150, 180, 210 и
240 минут [8]. Оценка подвижности производилась по 4-балльной системе: 0 — отсутствие движения; 1 — «дергающиеся» на месте сперматозоиды; 2 — вялое, почти не прогрессирующее движение; 3 — очень быстрое целесообразное движение [4], с последующим определением индекса подвижности сперматозоидов. Результаты выражались в
процентах.
Результаты и обсуждение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у подопытных половозрелых животных во взвеси имеет место снижение суммарного числа
мужских половых клеток. Так, если у интактных животных содержание сперматозоидов
составило 76±2,3-106 млн/мл взвеси, то у подопытных животных этот показатель составил 54±1,740б млн/мл взвеси. Наиболее важным показателем фертильности сперматозоидов является их подвижность. Анализ подвижности сперматозоидов позволил выявить
следующую закономерность. У интактных половозрелых крыс-самцов количество неподвижных сперматозоидов на первой минуте исследования существенно снижено по
сравнению с опытными животными (рис. 1). Как видно из рисунка, в динамике исследования у интактных животных отмечается постепенное увеличение числа неподвижных
сперматозоидов в клеточной взвеси, достигающее максимального значения на 240-й минуте. У подопытных животных наблюдается та же закономерность, однако на всех сроках
исследования (с 1-й до 240-й минуты) количество неподвижных сперматозоидов превышает данный показатель в контроле. Вместе с тем среди подвижных сперматозоидов в
эякуляте принято выделять три типа клеток: прогрессивноподвижные, слабоподвижные
и «дергающиеся». Нами установлено, что по мере исследования подвижности мулсских
половых клеток количество сперматозоидов с различной степенью подвижности уменьшается у экспериментальных животных интактной и опытной групп.
100-
неподвижные
сперматозоиды
(интактная группа)
8060-
неподвижные
сперматозоиды
(подопытная группа)
. 40-
гоо
' ' 6 0 ' ' 90
180 210 240
Время, мин
Рис. 1. Динамика изменения числа неподвижных
• получетой из придатка семенника интактных и подопытных крыс
85
При этом обращает на себя внимание (рис. 2-4), что на всех сроках исследования
количество сперматозоидов с различной степенью подвижности у подопытных животных снижено по сравнению с контролем. Кроме того, у интактных животных в
клеточной взвеси обнаруживаются подвижные сперматозоиды до 240-й минуты, в то
время как у опытных животных единичные дергающиеся клетки встречаются на 210-й
минуте.
5040-
«дергающиеся»
сперматозоиды
(интакгная группа)
3020-
«дергающиеся»
сперматозоиды
(подопытная группа)
100
1
' 30
'60
1
90
Ы
1^0
18b
2ld
240
Время, мин
Рис. 2. Динамика изменения числа «дергающихся» сперматозоидов во взвеси,
полученной из придатка семенника интактных и подопытных крыс
161412108-
слабоподвижные
сперматозоиды
(интактная группа)
64-
слабоподвижные
сперматозоиды
(подопытная группа)
20
30 ' 60 ' <ИГ~12О ' 150 ' 180 ' 210 ' 240 '
Время, мин
Рис, 3. Динамика изменения числа слабоподвижных сперматозоидов во взвеси,
полученной из придатка семенника интактных и подопытных крыс
12,4
12,2
прогрессивноподвижиые
сперматозоиды
(интакгная группа)
11,6
11,4
прогрессивноподвижные
сперматозоиды
(подопытная группа)
11,2
И
Рис 4
86
п
V
Р°гРес™»оподвижных сперматозоидов во взвеси,
из придатка семенника интактных и подопытных крыс
Таким образом, анализ полученных результатов позволяет сделать заключение о
том, что у потомства самок крыс с хроническим поражением печени рождается потомство с измененным репродуктивным здоровьем, что проявляется, прежде всего, в фертильности сперматозоидов, в том числе их подвижности. Выявленное угнетение подвижности мужских половых клеток у подопытных животных от матерей с патологией
печени обусловлено, на наш взгляд, нарушением процессов морфогенеза и гистогенеза
различных органов и систем, в том числе репродуктивной системы. Дисморфогенез,
как нам представляется, обусловлен поступлением через гематоплацентарный барьер
из организма матери в кровь плода токсических продуктов метаболизма, в том числе
остаточного азота, креатинина, кетоновых тел, накапливающихся в организме матери
в результате нарушения функций печени.
В целом полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что у животных с экспериментальным хроническим поражением печени рождается потомство с нарушенным «стартом здоровья», в том числе репродуктивного.
Список литературы
1. Брюхин, Г. В. Характер морфологических изменений семенников новорожденного потомства самок крыс с хроническим токсическим поражением печени / Г. В. Брюхин,
М. Л. Сизоненко // Актуальные проблемы медицинской науки, технологий и профессионального образования : юбил. вып., посвящ. 25-летию УГМАДО. Челябинск, 2005. Т. 2.
С. 34.
2. Влияние убихинона-10 на развитие D-галактозаминового гепатита у крыс
/ Н. П. Сугробова [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1992. Т. 114, № И.
С. 504-506.
3. Кулаков, В. И. Репродуктивное здоровье: проблемы, достижения и перспективы
/ В. И. Кулаков // Проблемы репродукции. 1999. № 2. С. 6-10.
4. Молнар, Е. Общая сперматология / К Молнар. Будапешт, 1969. 393 с.
5. Саков, Б. А. Моделирование воспалительного процесса в печени / Б. А. Саков,
А. И. Поляк // Моделирование, методы изучения и экспериментальная терапия патологических процессов. М., 1967. С. 119-123.
6. Саноцкий, И. В. Отдаленные последствия влияния химических соединений на
организм / И. В. Саноцкий, В. Н. Фоменко. М.: Медицина, 1979.232 с.
7. Сизоненко, М. Л. Сравнительная характеристика морфофункциональных изменений семенников потомства матерей, подвергнутых хроническому поражению печени
в условиях эксперимента / М. Л. Сизоненко // Молодые ученые в медицине : X Всерос науч,практ. конф.9 посвящ. 1000-летию Казани и 60-летию Победы в Великой Отеч.
войне. Казань : Меддок, 2005. С. 233.
8. Тиктинский, О. Л. Андрология / О. Л. Тиктинский. СПб. : Медиа Пресс, 1999.
464 с
9.' Gaytan, E Morphometric aspects of rat testis development / E Gaytan // J. Anat. 1986.
Vol. 145, № 3. P. 155-159.
87