На правах рукописи - Институт микробиологии РАН
реклама
На правах рукописи МИХАЙЛОВА Екатерина Михайловна БАКТЕРИИ РОДА GEOBACILLUS ИЗ ВЫСОКОТЕМПЕРАТУРНЫХ ЗАВОДНЯЕМЫХ НЕФТЯНЫХ ПЛАСТОВ И ГЕНЫ БИОДЕГРАДАЦИИ н-АЛКАНОВ (alkB) Специальность 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИМНИ РАН) Научный руководитель: доктор биологических наук Назина Тамара Николаевна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, зав. лабораторией гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН Бонч-Осмоловская Елизавета Александровна доктор биологических наук, в.н.с. кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова Семенов Александр Михайлович Ведущая организация: Российский химико-технологический университет Факультет биотехнологии и промышленной экологии. имени Д.И. Менделеева, Защита диссертации состоится “28“ мая 2012 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д002.224.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Автореферат диссертации разослан “ ”апреля 2012 г. Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Микроорганизмы нефтяных пластов служат объектом исследования с 1926 года. С использованием микробиологических, радиоизотопных и молекулярно-биологических методов в пластовых водах выявлены анаэробные бродильные, сульфат-, серо-, тиосульфат- и железоредуцирующие прокариоты, ацетогены и метаногены (Назина, Беляев, 2004; Magot et al., 2000; Bonch-Osmolovskaya et al., 2003). Аэробные бактерии обнаружены в заводняемых нефтяных пластах, куда они, вероятно, проникают с буровым раствором и нагнетаемой водой при разработке месторождения (Розанова, Кузнецов, 1974). Растворенный кислород поступает в пласт с нагнетаемой водой и способствует росту аэробных микроорганизмов (Кузнецова, Ли, 1964; Иванов и соавт., 1982; Розанова, Назина, 1982). Показано, что в заводняемом нефтяном пласте обитает аэробно-анаэробное микробное сообщество. Особый интерес представляют аэробные углеводородокисляющие бактерии, которые являются первым звеном трофической цепи, основанной на биодеградации нефти. Из нефтяных пластов выделен ряд мезофильных углеводородокисляющих бактерий. Термофильным аэробным бактериям посвящено немного работ. Выделенные из нефтяных пластов термофильные бактерии относятся к родам Bacillus, Geobacillus, Thermoactinomyces, Thermus и Petrobacter (Nazina et al., 2001, 2005; Hao et al., 2004; Salinas et al., 2004). Изучение углеводородокисляющих бактерий актуально для решения фундаментальных и прикладных задач. При окислении углеводородов бактерии образуют поверхностно-активные вещества (ПАВ), способствующие проникновению углеводородов в клетку. ПАВ существенно изменяют реологические свойства нефти, что обусловливает использование этих бактерий в технологиях повышения нефтеотдачи (Беляев и соавт., 2004; Youssef et al., 2009). По геохимическим данным, температура залежей деградированной нефти не превышает 80°C (Head et al., 2004). Однако аэробные и анаэробные микроорганизмы, осуществляющие окисление нефти при столь высокой температуре, пока не выделены. Кроме того, не исследованы генетические аспекты биодеградации углеводородов термофильными прокариотами. У мезофильных аэробных бактерий хорошо изучены гены alkB, кодирующие фермент алкан-монооксигеназу, который вводит атом кислорода в концевой атом н-алкана. Сведений о генах биодеградации углеводородов термофильных микроорганизмов практически нет. К началу 3 настоящей работы в Генбанке было лишь два фрагмента последовательностей alkB генов термофильных бактерий рода Geobacillus. Геобациллы неоднократно выделяли из нефтяных пластов, но молекулярными методами геобациллы выявляли лишь однажды (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003). Методы анализа генов 16S рРНК, выявленных во фракции ДНК микроорганизмов пластовой воды, направлены на выявление последовательностей всех присутствующих прокариот, но не позволяют оценить степень их активности в пласте. Подобные исследования микробных сообществ выполнены на высокотемпературных нефтяных пластах США (Orphan et al., 2000; Gieg et al., 2010), Западной Сибири (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003), Китая (Назина и соавт., 2006; Shestakova et al., 2011; Li et al., 2006 и др.). Известно, что в растущей клетке существенно возрастает количество рибосом, поэтому анализ фракции рРНК, выделенной из исследуемой пробы, позволяет выявить метаболически активные компоненты сообщества (Poulsen et al., 1993). Данный подход не применялся для изучения микроорганизмов нефтяных пластов, что свидетельствует об актуальности этих исследований. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение разнообразия микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов (на примере нефтяного месторождения Даган) и выявление метаболически активных прокариот, выделение аэробных термофильных углеводородокисляющих бактерий и поиск генов ферментативной системы окисления н-алканов у представителей рода Geobacillus и в подземном микробном сообществе. Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи. 1. Определить численность и распространение микроорганизмов основных метаболических групп в пластовых водах месторождения Даган. 2. Выделить доминирующие термофильные углеводородокисляющие бактерии, определить их таксономическое положение и метаболические свойства, способствующие распространению и деятельности в нефтяных пластах. Исследовать рост выделенных штаммов на углеводородах нефти и индивидуальных н-алканах. 3. Осуществить поиск генов ферментативной системы биодеградации налканов у бактерий рода Geobacillus. 4. Определить филогенетическое разнообразие прокариот и выявить метаболически активные группы путем создания библиотек клонов генов 16S рРНК и alkB и 16S крДНК (комплементарной 16S рРНК) на основе тотальных ДНК и РНК, выделенных из пластовой воды призабойной зоны нагнетательной скважины в период биотехнологического воздействия. 4 Научная новизна работы. Впервые для анализа микробного сообщества нефтяного пласта применен комплексный подход, сочетающий микробиологические и радиоизотопные методы с молекулярно-экологическим методом, основанным на анализе генов 16S рРНК и alkB в библиотеках клонов, созданных на основе ДНК и РНК, выделенных из пластовой воды. Показано, что аэробные спорообразующие бактерии рода Geobacillus доминируют в посевах наибольших разведений пластовой воды на среды с н-алканами и сырой нефтью, что подтверждается выделением чистых культур (G. subterraneus, G. stearothermophilus) и доминированием генов 16S рРНК геобацилл в ДНК-библиотеке клонов микробного сообщества пластовой воды. Выделенные и коллекционные штаммы геобацилл окисляют н-алканы нефти с длиной цепи C12–C29-31 при температуре инкубации от 45 до 70–75°C. При исследовании 11 штаммов, принадлежащих к разным видам рода Geobacillus, впервые обнаружено 8 различных гомологов гена alkB (alkB-geo1 – alkB-geo8), кодирующего фермент алкан-монооксигеназу. В геноме каждого штамма геобацилл присутствовало от 3-х до 6-и гомологов гена alkB, из которых только alkB-geo1 и alkB-geo4 были универсальны для всех штаммов. Последовательности alkB-geo1 – alkB-geo6 гомологов геобацилл имеют 87.7-99.2% сходства с генами alkB бактерий рода Rhodococcus, что не позволяет использовать эти гены для детекции геобацилл в природном местообитании. Впервые выявлено доминирование последовательностей геобацилл в библиотеках клонов генов 16S рРНК и alkB, созданных на основе ДНК из пластовой воды призабойной зоны нагнетательной скважины высокотемпературного нефтяного пласта. Биодеградация нефти в пласте сопровождается увеличением содержания растворенных минеральных карбонатов, обогащенных изотопом 12С, и летучих кислот в пластовой воде. Выявлены последовательности 16S рРНК мезофильных и термофильных аэробных органотрофных и бродильных бактерий, а также микроорганизмов цикла серы, что свидетельствует о метаболической активности этих микроорганизмов в нефтяном пласте. Научно-практическая значимость работы. Выделенные бактерии рода Geobacillus могут использоваться в биотехнологиях очистки от нефти при высокой температуре, а также в биотехнологиях повышения нефтеизвлечения для интродукции в высокотемпературные нефтяные пласты. Метод анализа ДНК- и РНК-библиотек клонов генов 16S рРНК и 16S крДНК микроорганизмов пластовой воды, позволяющий полнее охарактеризовать микробное сообщество и выявить метаболически активные микроорганизмы, может быть рекомендован для выбора участков пласта, пригодных для применения биотехнологии повышения 5 нефтеизвлечения, основанной на активации пластовой микрофлоры. Результаты изучения генов биодеградации н-алканов у термофильных прокариот и экологии микроорганизмов нефтяных пластов могут быть использованы при чтении лекций по микробиологии в высших учебных заведениях. Исследования выполняли в 2002-2012 годах при поддержке РФФИ (гранты №№ 02-04-39002, 05-04-39029 и 06-04-49128), Китайской национальной нефтяной компании (контракт DFT04-122-IM-18-20RU), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF RBO-1364-MO и RBO-1364-MO-02) и Миннауки РФ (Ведущая научная школа академика РАН М.В. Иванова, 2006-РИ-112.0/001/367 и НШ-1189.2012.4). Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 3-м Московском Международном конгрессе “Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Москва, 2005), II и III Международной молодежной школе-конференции “Актуальные аспекты современной микробиологии” (Москва, 2006, 2007) и симпозиумах (International Symposium for Subsurface Microbiology) (Джексон-Холл, США, 2005; Шизуока, Япония, 2008). Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статей и 5 тезисов. Место проведения работы. Работа проводилась в ИНМИ РАН (лаборатория нефтяной микробиологии) под руководством д.б.н. Т.Н. Назиной и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ЦКП “Геном”) под руководством к.б.н. А.Б. Полтарауса. В отдельных этапах работы принимали участие Н.М. Шестакова, В.С. Ивойлов и Д.Ш. Соколова. Геносистематические работы проводили совместно с д.б.н. Т.П. Туровой, ДНК-ДНК гибридизацию – с к.б.н. А.М. Лысенко, жирные кислоты клеточной стенки анализировали под руководством д.б.н. Г.А. Осипова. Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. Т.Н. Назиной, профессору, д.б.н. С.С. Беляеву, к.б.н. А.Б. Полтараусу и д.б.н. Т.П. Туровой за помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Автор благодарит всех коллег, друзей и свою семью за полезные советы и поддержку. Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 144 страницах машинописного текста и включают 17 рисунков и 19 таблиц. Диссертация состоит их разделов: “Введение”, “Обзор литературы”, “Экспериментальная часть”, включающая “Объекты и методы исследования”, “Результаты”, “Обсуждение результатов”, “Выводы” и “Список литературы”, который содержит 54 отечественных и 215 зарубежное наименование. 6 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика нефтяного месторождения Даган. В работе исследовали микроорганизмы пластовой воды залежи Кондиан месторождения Даган, расположенного в провинции Хебей (КНР). Температура исследованных песчаных нефтеносных горизонтов составляла 59°C, глубина – 1206–1435 м. Нефть месторождения с плотностью 0.900 г/см3 содержала 53% насыщенных углеводородов, 20% ароматических соединений и 27% асфальтенов + смолы. Пластовые воды гидрокарбонатно-натриевого типа имели низкую минерализацию, рН 7.1–7.6. Отбор проб. Пробы пластовой воды и нефти из добывающих скважин и воду из остановленной нагнетательной скважины, переведенной в режим обратного излива, отбирали в стерильные герметично закрывающиеся бутыли. Посев пластовой воды для определения численности микроорганизмов, проводили в течение 4–6 часов после отбора. Пластовую воду (1 л), предназначенную для выделения нуклеиновых кислот, фиксировали спиртом (1:1) непосредственно в момент отбора, затем в лаборатории отделяли от нефти путем экстракции гексаном и декантации при комнатной температуре. Фиксированную воду хранили при 4°C до проведения молекулярно-биологических исследований. Микроорганизмы, использованные в работе, включали выделенные соискателем культуры и штаммы из коллекции лаборатории: G. stearothermophilus DSM 22T, G. thermoleovorans DSM 5366T, G. subterraneus 34T, Sam и B1023-2, G. jurassicus DS1T и DS2, G. thermocatenulatus VKM B-1259T, G. uzenensis UT и Х, G. gargensis GaT, G. toebii vw3-1n и B1024, G. thermoglucosidans 3Feng. Видовые названия геобацилл соответствуют списку валидно описанных видов Euze´by (2008) [http://www.bacterio.cict.fr/g/geobacillus.html], без учета ревизии этого рода, выполненной в конце 2011 г. (Coorevits et al., 2011). Состав питательных сред, условия культивирования и учёта микроорганизмов. Численность микроорганизмов определяли путем посева пластовой воды в жидкие среды методом десятикратных разведений в двух повторностях. Для учета аэробных органотрофов использовали среду, содержащую (г/л): бакто-триптон (Difco) – 5.0, дрожжевой экстракт (Difco) – 2.5, глюкозу – 1.0, pH 7.0–7.2. Анаэробную технику Хангейта (Hungate, 1969) использовали для приготовления сред для анаэробных бактерий. Численность бактерий с бродильным типом метаболизма оценивали в среде с бакто-пептоном (4 г/л) и глюкозой (10 г/л) 7 по образованию H2 в конечных разведениях и микроскопированием (Postgate, 1984). Сульфатредуцирующие бактерии анализировали по образованию H2S в среде Постгейта (Postgate, 1984) с лактатом натрия (4 г/л). Метаногенов учитывали, оценивая образование CH4 в конечных разведениях в среде с ацетатом (2.2 г/л) или H2+CO2 (Zeikus et al., 1975). Посевы инкубировали при 30 и 60°C в течение 7–14 сут, отсутствие роста регистрировали после 30 сут инкубации. Рост аэробных термофильных бактерий на различных субстратах, н-алканах и нефти исследовали в модифицированной среде (Adkins et al., 1992) состава (г/л): K2HPO4 – 1.5; KH2PO4 – 0.75; NH4Cl – 1; MgSO4 – 0.2; CaCl2 – 0.02; KCl – 0.1; NaCl – 5, pH 6.8–7.2. Посевы инкубировали в течение 3 сут при температуре 60°C. Посевы с нефтью инкубировали при различных режимах аэрации при температуре 60, 65, 70 и 75°C в течение 10 сут. Прирост биомассы определяли по изменению оптической плотности культуральной среды и численности бактерий, определяемой микроскопированием. Аналитические методы. Содержание белка в микробной биомассе определяли колориметрическим методом Лоури (Lowry et al., 1951). Метан, водород и летучие кислоты определяли, используя газовый хроматограф. Для анализа использования алифатической фракции нефти деградированную и контрольную нефть экстрагировали хлороформом (Walker et al., 1975). Пробу нефти наносили на колонку с силикагелем для получения очищенной алифатической фракции. Содержание прямоцепочечных и разветвленных н-алканов определяли методом газожидкостной хроматографии. Скорости сульфатредукции и метаногенеза в пластовых водах определяли радиоизотопными методами, используя меченые Na235S04, 14CH3-COONa и NaH14CO3 (Беляев, Иванов, 1975; Лауринавичус, Беляев, 1978; Романенко, Кузнецов, 1974). Состав стабильных изотопов углерода нефти и растворенных карбонатов определяли методом стандарт-пробы на масс-спектрометре МИ-1201В, используя в качестве рабочего газа СО2 (Иванов и соавт., 1982). Степень фракционирования стабильных изотопов углерода выражали величиной δ13С (0/00) относительно международного стандарта PDB (Craig, 1953). Молекулярно-биологические методы. Содержание Г+Ц в ДНК-препаратах определяли с помощью кривых плавления, используя ДНК Escherichia coli K-12 в качестве стандарта (Методы исследования нуклеиновых кислот, 1970). ДНК-ДНК гибридизацию проводили по методу Де Лея (De Ley et al., 1970). ДНК выделяли с использованием наборов “DiatomtmDNAprep” (Биоком, Москва), QIAGEN (США) и “Wizard MiniPrep” (Promega, США). Тотальную РНК выделяли с использованием 8 тризола (“TRIzol Reagent”, Invitrogen) согласно протоколу. Синтез первой цепи кДНК (комплементарной ДНК) проводили с использованием набора для обратной транскрипции “Силекс” (Москва). Полученную кДНК сразу же использовали в качестве матрицы для ПЦР. Амплификацию генов 16S рРНК проводили с использованием универсальных архейных (A109f, A1041r) (Groβkopf et al., 1998; Колганова и соавт, 2002) и бактериальных (8-27f, 519r, pHr, Pla46f) праймеров (Edwards et al., 1989; Weisburg et al. 1991; Schmid et al., 2000). Амплификацию генов alkB проводили с помощью предложенных нами праймеров Alk-BFB, Alk-BRB. Выделение и очистку ПЦРпродуктов проводили с помощью набора для экстракции ДНК из геля (V-gene DNA Gel Extraction Kit; China). Очищенные фрагменты клонировали с помощью векторных систем pGEM-T (Promega) и pTZ57RT (Fermentas, США). Секвенирование проводили с использованием праймеров 8-27f, 519r, pHr, М13D и M13R на секвенаторе 3730 DNA Analyzer с использованием набора “BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits” (Applied Biosystems, США). Последовательности анализировали с использованием программы BLAST сервера NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Нуклеотидные последовательности и полученные с помощью компьютерной трансляции аминокислотные последовательности alkB генов выравнивали с помощью программы CLUSTAL W (Thompson et al., 1994). Филогенетические деревья конструировали по методу ближайших соседей (neighbor-joining). Полученные в ходе работы последовательности помещены в Генбанк под номерами: AY682096, AY682097, EF534128–EF534180. 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Распространение микроорганизмов в пластовой воде нефтяного месторождения Даган Нефтяное месторождение Даган эксплуатируется с применением заводнения более 30 лет. В период 2001–2006 гг. на двух участках применялась биотехнология, направленная на повышение нефтеотдачи. Она заключалась в нагнетании водновоздушной смеси или раствора перекиси водорода с солями азота и фосфора. Поступление растворенного кислорода с нагнетаемой водой стимулировало рост аэробных бактерий, осуществляющих биодеградацию нефти, и как следствие, рост анаэробных микроорганизмов, потребляющих продукты окисления нефти (табл. 1). 9 Нагнетание в пласт охлажденной воды приводит к снижению температуры в призабойной зоне нагнетательных скважин с 60 до 40-50°С, что способствует распространению как термофильных, так и мезофильных микроорганизмов (рис. 1). Численность мезофильных и термофильных микроорганизмов исследованных физиологических групп в воде из призабойной зоны нагнетательной скважины была существенно больше, чем в воде из добывающих скважин (рис. 1). Несмотря на обнаружение жизнеспособных мезофильных прокариот в пробах воды из добывающих скважин, скорости мезофильных процессов сульфатредукции и метаногенеза были низки или не регистрировались в этих пробах, тогда как в призабойной зоне нагнетательной скважины были выявлены термофильные и мезофильные процессы метаногенеза из ацетата и сульфатредукции (рис. 2а, б). На исследованном участке Северного блока залежи Кондиан пластовые воды гидрокарбонатно-натриевого типа были низко минерализованными (4.8–6.6 г/л), слабощелочными (рН от 7.1 до 7.6). Сульфаты отсутствовали в нагнетаемой воде и в исходной пластовой воде и появлялись в результате технологического воздействия, достигая концентрации 175 мг/л (табл. 1). Сероводород (менее 2 мг/л) был выявлен в воде из призабойной зоны нагнетательной скважины 1098 (проба 8 м3), а в жидкости из добывающих скважин он отсутствовал. Нагнетание окислителей в пласт приводило к биодеградации нефти в призабойной зоне нагнетательных скважин. Продукты окисления нефти с нагнетаемой водой поступали в зону добывающих скважин, что подтверждается увеличением содержания ацетата (от 0–5 до 52.4 мг/л) и минеральных карбонатов (от 402–470 до 721–1243 мг/л) в пластовой воде и снижением величины δ13C суммы минеральных карбонатов (δ13С/∑СО2+НСО3-+ СО32-) пластовой воды с 6.4‰ до −5.6…−12.9‰. В 2006 г. в воде исследованных добывающих скважин Северного блока скорости анаэробных процессов были подавлены, вероятно, вследствие поступления H2O2 в пласт. Скорость сульфатредукции не превышала 4.62 мкг S2- л-1 сут-1, суммарная скорость метаногенеза не превышала 3.97 мкг CH4 л-1 сут-1 (табл. 1). Эти величины сравнимы со скоростями процессов в нефтяных пластах Западной Сибири, Китая и Аляски (Назина, Беляев, 2004; Gieg et al., 2010). В пластовой воде блока № 1 этой же залежи (скв. 1065-1) скорость образования метана была сравнима с таковой в водах Северного блока, тогда как скорость сульфатредукции была выше, достигая 22.4–67.04 мкг S2- л-1 сут-1 (данные не представлены). 10 Таблица 1. Физико-химическая характеристика пластовой воды, численность термофильных микроорганизмов (кл/мл) и скорости анаэробных процессов в воде залежи Кондиан нефтяного месторождения Даган Номер скважины, проба SO42(мг/л) HCO3- + CO32(мг/л) CH3СOO(мг/л) Аэробные органотрофы Бродильные Сульфатредуцирующие 10 10 Нагнета24 456 0 10 емая вода 104 1098*-8м3 24 503 1.4 103 104 1002 0 654 2.0 103 10 102 1002-1 0 551 2.8 10 <10 105 1012 12 402 5.2 <10 102 10 1012-1 35 441 2.0 <10 10 102 1017 0 442 52.4 Н.д. <10 <10 1032-1 Н.д 595 2.0 10 10 105 1050-1 6 621 1.4 102 103 <10 2 1050-2 42 436 1.2 <10 10 <10 2 1050-3 0 721 2.0 <10 10 104 1094 24 517 6.0 10 10 <10 ≥105 1094-1 0 1243 1.6 102 10 1065-1 175 470 1.0 102 10 ≥105 * Нагнетательная скважина, остальные – добывающие скважины. 4 3 Метаногены 11 Н2+ CO2 Ацетат 104 103 102 104 103 102 102 10 103 102 103 104 103 104 105 103 102 104 <10 10 <10 <10 <10 103 102 <10 102 10 Скорость сульфатредукции (мкг S2л-1 сут.-1) 20.79 0.212 0.002 0 4.62 0.107 Н.д. 0.019 0.7 0 Н.д. 0.009 22.4 Скорость метаногенеза (мкг CH4 л-1 сут.-1) из: NaH14- 14CH3CO3 COONa 0.46 0 0 0 0 0.216 0 0 0.19 0 3.964 0 3.51 0.013 0.086 0.017 0.001 0.021 0.117 0.064 0.002 0 0 0.001 0.064 0.001 7 lg(число кл/мл) 6 5 4 3 2 Брод Мет-Ац Мет-Н2 СРБ Аэробы 1 0 60°C 30°C 60°C 1098-8 м 3 30°C 1032-1 Рис. 1. Численность термофильных и мезофильных аэробных органотрофов (Аэробы), бродильных (Брод), сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) и метаногенов в средах с H2+CO2 (Мет-H2) и ацетатом (Мет-А) в воде из призабойной зоны нагнетательной скважины 1098 (8 м3) и из добывающей скважины 1032-1 (июнь 2002 г.). 300 250 200 150 100 50 0 1032-1 Скорости процессов, нг/л сут Скорости процессов, мкг/л сут 1098-8 м3 СР МГ-H2 МГ-Ац 60°C 700 600 500 400 300 200 100 0 СР МГ-H2 МГ-Ац 60°C 30°C 30°C . Рис. 2. Скорости термофильной (60°С) и мезофильной (30°С) сульфатредукции (СР) и метаногенеза из ацетата (МГ-Ац) и из H2+CO2 (МГ-H2) в воде из призабойной зоны нагнетательной скважины 1098 (8 м3) и из добывающей скважины 1032-1. 12 Таким образом, пластовые воды залежи Кондиан содержат метаболически разнообразное и геохимически активное микробное сообщество, включающее аэробные бактерии и анаэробные бродильные, сульфатредуцирующие и метанобразующие микроорганизмы. 2.2. Фенотипические, генотипические и метаболические характеристики аэробных термофильных бактерий из нефтяных пластов Из посевов наибольших разведений пластовой воды на селективные среды для аэробных органотрофных и углеводородокисляющих бактерий было выделено семь штаммов аэробных термофильных бактерий. Последовательности генов 16S рРНК штаммов 31, 32, 44, 45 и 47 практически совпадали с соответствующим геном G. subterraneus 34Т (99.8–100% сходства). Последовательности штаммов 46 и 49 были близки гену 16S рРНК G. stearothermophilus 22T (99.8 и 99.1 % сходства соответственно). Результаты определения содержания Г+Ц в ДНК, состава жирных кислот клеточной стенки и ДНК-ДНК гибридизации с филогенетически близкими типовыми штаммами подтвердили принадлежность штаммов 46 и 49 к виду G. stearothermophilus, а штаммов 31, 32, 44, 45 и 47 – к виду G. subterraneus. Исследованы диагностические признаки выделенных и коллекционных штаммов G. thermoglucosidans 3Feng, G. subterraneus B1023-2, G. toebii B1024 и vw31n из нефтяных пластов (табл. 2). Бактерии использовали широкий спектр субстратов, включающий углеводы, низшие спирты, летучие кислоты, н-алканы. Оптимум NaCl для роста составлял 2–3%. Выделенные бактерии росли в интервале температуры от 45 до 65–70°С с оптимумом при 55–65°С. Способность использовать н-алканы, расти при температуре пласта и солености пластовой воды, свидетельствует о приспособленности геобацилл к среде обитания. Использование н-алканов бактериями рода Geobacillus. В настоящей работе исследовали рост геобацилл (G. stearothermophilus DSM 22T, G. thermoleovorans DSM 5366T, G. subterraneus 34T, Sam и B1023-2, G. thermocatenulatus VKM B-1259T, G. uzenensis UT, G. gargensis GaT, G. toebii vw3-1n и B1024, G. thermoglucosidans 3Feng и штаммов 46 и 49) в среде с индивидуальными н-алканами с длиной цепи от С6 до С23. Все бактерии использовали С12–С23 н-алканы. Штамм G. thermocatenulatus VKM В-1259T рос также на н-декане, а G. gargensis GaT – на С6–С10 н-алканах. Рост на н-алканах сопровождался снижением рН среды с 7.0 до 6.0. Кроме того, исследовали рост этих штаммов на сырой нефти при температуре 13 Таблица 2. Диагностические признаки аэробных термофильных бактерий рода Geobacillus, исследованных в настоящей работе Признак, свойство B1023-2 G. subterraneus 99.0 2.5 – 6.0 0.7 – 1.3 B1024 G. toebii vw3-1n G. toebii Штаммы 3 Feng G. thermoglucosidans 100.0 2.4 – 5.8 0.7 – 1.0 46 49 22Т G. stearothermophilus 14 Сходство фрагментов генов 16S рРНК, % 99.3 99.6 98.2 99.1 100 Длина клетки, мкм 1.1 – 5.3 2.4 – 5.0 2.0 – 3.5 2.0 – 3.5 2.0 – 3.5 Ширина клетки, мкм 0.6 – 1.0 0.6 - 1.1 0.6 – 1.0 0.5 – 1.0 0.6 – 1.0 Образуют кислоту из: Арабиноза Галактоза + + + Рамноза + Используют: С12–С23 н-алканы + + + + + + + Ацетат + + + + + + V Пропионат Бутират + + + + + + + Малат + + + + + + + Лактат + + + + + Нд Бензоат Нд Аланин + Нд Этанол + + + + + Нд Интервал NaCl для роста, оптимум, % 0–5, 2 0–6, 3 0–5, 2 0-2 0-2 0–3 0- <5.0 45–65, 55 45–65, 55 45–65, 55 50–70, 65 45–70, 65 45–70, 60 37–65 Интервал температуры для роста, опт., °С Условные обозначения: “+” – наличие признака; “-” - отсутствие признака, W – слабый рост; V – признак варьирует у разных штаммов вида Нд – нет данных. 60°С в стационарных условиях. Все исследованные бактерии использовали С10–С27 н-алканы нефти и не окисляли н-алканы с длиной углеродной цепи выше С27, за исключением штамма G. gargensis GaT, который практически полностью окислял С10–С31 н-алканы. Бактерии окисляли в основном средне- и длинно-цепочечные налканы с неразветвлённой цепью; изоалканы и короткоцепочечные неразветвленные н-алканы использовали в меньшей степени. Для всех штаммов оптимальная температура роста составляла 60–65°С. На примере бактерии G. subterraneus 34T показано, что при повышении температуры с 65 до 75°С биодеградация н-алканов снижалась (рис. 3). Таким образом, верхняя температура биодеградации н-алканов нефти для исследованных бактерий составляет 70–75°С. 2.3. Гены ферментативной системы биодеградации н-алканов у бактерий рода Geobacillus Гены, ответственные за деградацию н-алканов, подробно изучены у мезофильных бактерий родов Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Alkanivorax, Burkholderia, Rhodococcus, Nocardia, Mycobacterium и Prauserella (Smits et al., 2002; Vomberg et al., 2000; van Beilen et al., 2002). Сведений о генетических аспектах процесса окисления н-алканов у термофильных прокариот крайне мало. В настоящей работе гены, кодирующие алкан-монооксигеназу (alkB-гены), были исследованы у бактерий рода Geobacillus (11 штаммов, табл. 3) методом молекулярного клонирования. С помощью сконструированных праймеров Alk-BFB и Alk-BRB были амплифицированы и клонированы 226 последовательностей (длиной около 459 п.н.), которые имели 69.8–99.2% сходства с соответствующим участком alkB-генов различных бактерий, взятых из базы данных Генбанк. Таким образом, клонированные фрагменты принадлежали к этому семейству генов. При анализе полученных последовательностей было обнаружено, что среди них имеется восемь различных гомологов – alkB-geo1 – alkB-geo8 (59.7–96.7% сходства между гомологами), которые распределялись между исследованными штаммами в различных сочетаниях (табл. 3). Впервые для термофильных бактерий показано, что в геноме каждого штамма присутствует не одна последовательность alkB-гена, а набор из 3-6 гомологов. Последовательности alkB-geo1 и alkB-geo4 встречались в геноме всех исследованных штаммов геобацилл. Наиболее редкие – alkB-geo7 и alkB-geo8, обнаружены лишь у двух и одного исследованных штаммов соответственно. Сравнительный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей и полученных с помощью компьютерной трансляции аминокислотных 15 Относительное содержание, % а 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 С11 С13 С15 С17 С19 С21 С23 С25 С27 С29 С31 С27 С29 С31 С27 С29 С31 Количество атомов углерода Относительное содержание, % б 28,0 24,0 20,0 16,0 12,0 8,0 4,0 0,0 С11 С13 С15 С17 С19 С21 С23 С25 Количество атомов углерода Относительное содержание, % в 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 С11 С13 С15 С17 С19 С21 С23 С25 Количество атомов углерода Рис. 3. Состав н-алканов стерильной нефти (а) и нефти, деградированной штаммом G. subterraneus 34T за 10 сут. инкубации в стационарных условиях при температуре 65°С (б) и 75°С (в). Обозначения: – неразветвленные н-алканы, – разветвленные н-алканы. 16 Таблица 3. Разнообразие последовательностей alkB-генов у бактерий рода Geobacillus Гомолог гена alkB alkB-geo1 alkB-geo2 alkB-geo3 alkB-geo4 alkB-geo5 alkB-geo6 alkB-geo7 Ближайшая алкан-1монооксигеназа у культивируемой бактерии согласно BLAST-анализу alkB4 ген Rhodococcus erythropolis NRRL B-16531 alkB4 ген R. erythropolis NRRL B-16531 alkB3 ген Nocardia sp. H17-1 alkB3 ген R. erythropolis NRRL B-16531 alkB2 ген R. erythropolis 50-V alkB2 ген R. erythropolis NRRL B-16531 alkB ген, природный клон alkG4-35k alkB1 ген Rhodococcus sp. Q15 Сходство нуклеотидных последовательностей*, % 99.2 Сходство аминокислотных последовательностей**, % 100 Штаммы, содержащие ген*** 90.0 98.6 1-8, 10, 11 87.7 96.7 89.7 96.6 1-6, 9-11 1-11 95.4 99.0 100 100 3, 4, 6, 9-11 4, 7, 9 69.8 71.2 6, 11 1-11 alkB-geo8 70.0 67.4 1 Число клонов 226 *Между ближайшим alkB-геном из генбанка и фрагментами alkB-генов геобацилл. ** Между транслированными последовательностями ближайшего alkB-гена из генбанка и фрагментом alkB-генов геобацилл. ***1 – G. stearothermophilus 22T; 2 – G. thermocatenulatus VKM B-1259T; 3 – G. thermoglucosidans 3Feng; 4 – G. thermoleovorans DSM 5366T; 5 – G. gargensis DSM 15378T; 6 – G. uzenensis DSM 13551T, 7 – G. uzenensis VKM B-2228; 8 – G. subterraneus DSM 13552T; 9 – . jurassicus DSM 15726T, 10 –G. toebii B1024, 11 – G. toebii vw3-1n. последовательностей выявил сходство шести вариантов alkB-гомологов геобацилл с генами alkB4, alkB3 и alkB2, обнаруженными ранее у штаммов Rhodococcus erythropolis NRRL B-16531 и Q15 (Whyte et al., 2002) (рис. 4). Аминокислотные последовательности всех транслированных фрагментов имели 58.2–100% сходства между собой и содержали характерные для алкан-гидроксилаз структурные гистидиновые мотивы, необходимые для формирования активного центра, поэтому можно предположить, что они являются частью генов, кодирующих функционально активный фермент. В нашем исследовании впервые показана многокопийность генов деградации налканов у термофильных бактерий. Необходимы дальнейшие исследования генов, кодирующих алкан-гидроксилазы термофильных бактерий, для выяснения их роли и функциональных различий. 17 Geobacillus thermoglucosidasius TR2 alkB (AJ781294) Rhodococcus sp. PT18 alkB (DQ182295) Rhodococcus erythropolis NRRL B-16531 alkB2 (AJ297269) Rhodococcus sp. Q15 alkB2 (AF388182) 99 alkB-geo6 Rhodococcus erythropolis 23-D alkB (AJ301868) 100 alkB-geo5 Rhodococcus erythropolis 50-V alkB (AJ301866) Rhodococcus erythropolis 42-O alkB (AJ301867) Rhodococcus sp. SoF clone 20 alkB (DQ437535) Gordonia sp. Cg clone 33 alkB (DQ437538) Rhodococcus sp. SoD alkB (DQ437536) Rhodococcus sp. 1BN alkB (AJ401611) Rhodococcus erythropolis NRRL B-16531 alkB1 (AJ009586) 100 Rhodococcus erythropolis 35-O alkB (AJ301871) Rhodococcus sp. Q15 alkB1 (AF388181) alkB-geo8 Rhodococcus fascians 154-S alkB (AJ301873) Nocardia sp. H17-1 alkB (AY625606) Rhodococcus erythropolis NRRL B-16531 alkb4 (AJ301877) Rhodococcus sp. Q15 alkB4 (AF388180) 100 alkB-geo1 100 Rhodococcus erythropolis 23-D alkB (AJ301869) alkB-geo2 alkB-geo3 99 100 Rhodococcus sp. NTU1 alkB (DQ173199) Rhodococcus erythropolis 62-O alkB (AJ301874) Pseudomonas frederiksbergensis alkB (AY452488) 100 Rhodococcus erythropolis NRRL B-16531 alkb3 (AJ301876) Rhodococcus sp. Q15 alkB3 (AF388179) Geobacillus thermoleovorans T70 alkB (AJ781293) alkB-geo4 100 Mycobacterium austroafricanum IFP 2015 alkB (DQ226999) Nocardioides sp. CF8 alkB (AF350429) Prauserella rugosa NRRL B-2295 alkB (AJ009587) Pseudomonas fluorescens CHA0 alkB (AJ009579) Burkholderia cepacia ATCC 25416 alkB (AJ293344) alkB-geo7 100 100 100 Alcanivorax borkumensis SK2 alkB2 (AB110226) Xanthomonas melonis dO alkB (AF451155) Acinetobacter venetianus 6A2 alkMa (DQ009004) Acinetobacter venetianus 6A2 alkMb (DQ009005) Ralstonia sp. PT11 alkB (DQ182293) Oleiphilus messinensis ME102 alkB (AJ295155) Thalassolituus oleivorans MIL-1 alkB (AJ431700) Xanthobacter flavus ZL5 alkB (AJ418063) Acidisphaera sp. C197 alkB (AY817739) Alcanivorax borkumensis SK2 alkB1 (AB110225) Pseudomonas putida P1 alkB (AJ233397) 0.1 Рис. 4. Положение фрагментов alkB-генов Geobacillus на филогенетическом дереве, построенном на основе анализа нуклеотидных последовательностей. Последовательности, полученные в ходе работы, выделены полужирным шрифтом. Последовательности геобацилл из Генбанка подчеркнуты. 18 2.4. Разнообразие генов 16S рРНК и alkB в библиотеках клонов, созданных на основе ДНК и РНК, выделенной из пластовой воды призабойной зоны нагнетательной скважины в период биотехнологического воздействия В 2006 году на залежи Кондиан проводили пилотные испытания биотехнологии повышения нефтеизвлечения, основанной на активации пластовой микрофлоры. В нефтяной пласт через нагнетательные скважины вносили раствор K(NH4)2PO4 в сочетании с раствором H2O2 в качестве акцептора электронов. Пластовую воду из призабойной зоны нагнетательной скважины 1098, переведенной в режим обратного излива (проба 8 м3), использовали для выделения ДНК и РНК. С использованием широкого набора праймеров были созданы библиотеки клонов гена 16S рРНК архей, генов 16S рРНК и alkB бактерий, а также библиотеки клонов крДНК бактерий (комплементарной 16S рРНК). В ходе работы было проанализировано 578 клонов. Разнообразие генов 16S рРНК представителей домена Archaea в ДНКбиблиотеке клонов. Гены 16S рРНК архей были обнаружены только в препаратах ДНК, выделенной из пластовой воды, и отсутствовали в препаратах РНК. ДНКбиблиотека включала 113 клонов со вставками гена 16S рРНК архей. Клонированные последовательности формировали 10 групп, одна из которых относилась к филуму Crenarchaeota (0.9%), остальные – к филуму Euryarchaeota. В библиотеке клонов численно преобладали гены 16S рРНК мезофильного метилотрофного метаногена Methanomethylovorans sp. (38% от общего количества клонов). Выявлены также последовательности термофильных (Methanoculleus receptaculi, 30%, и Methanolinea tarda, 14%) и мезофильных водород-использующих метаногенов (Methanocalculus pumilus, 6%, и Methanococcus maripaludis, 1%), термофильных ацетат-использующих (Methanosaeta thermophila, 6%) метаногенов и архей с бродильным типом метаболизма (Thermococcus litoralis, 2%). Большинство выявленных последовательностей принадлежат археям, приспособленным к обитанию в заводняемых высокотемпературных нефтяных пластах, и неоднократно выделявшимся из этих местообитаний. Разнообразие генов 16S рРНК и 16S крДНК представителей домена Bacteria в ДНК- и РНК-библиотеках клонов. В ДНК-библиотеке доминировали последовательности термофильных бактерий рода Geobacillus (100 из 154 клонов в библиотеке, рис. 5). Выявленные последовательности принадлежали мезофильным и термофильным бактериям различных метаболических групп: аэробным органотрофам (роды Geobacillus, Pseudomonas, Methylibium, Tepidimonas, Thermaerobacter), бродильным (Thermosipho, Bellilinea, Fervidobacterium, Flexistipes, 19 Cedecea, Soehngenia, Lactococcus, Thermoanaerobacterium), сульфатредуцирующим (Syntrophobacter, Desulfomicrobium, Thermodesulfovibrio), денитрифицирующим (Hydrogenophilus, Thauera), сероокисляющим (Thiobacter, Thiofaba) и сероредуцирующим (Desulfurivibrio, Desulfuromonas) бактериям. 100 90 Число клонов 80 70 60 50 40 30 20 10 Geobacter Desulfuromonas Desulfurivibrio 2 1 Thiofaba Hydrogenophilus Denitromonas Calditerrivibrio Geobacillus Pseudomonas Petrobacter Tepidimonas Thermosipho Belilinea Fervidobacterium Flexistipes Syntrophobacter Desulfomicrobium Azoarcus 0 Рис. 5. Разнообразие филотипов бактерий в РНК- (1) и ДНК-библиотеках (2) клонов генов 16S рРНК микроорганизмов пластовой воды из призабойной зоны нагнетательной скважины 1098 (8 м3). Филотипы, представленные одним клоном, не приведены на рисунке. Большинство последовательностей генов 16S рРНК бактерий в ДНКбиблиотеке (98 клонов), полученной с помощью праймеров Pla46f-519r, принадлежало некультивируемой бактерии “Candidatus Cloacamonas acidaminovorans” (сходство 99%) филума-кандидата WWE1. Протеомный анализ выявил присутствие ключевых ферментов метаболизма аминокислот у этой бактерии, а также способность к синтрофному росту. Кроме того, были выявлены последовательности некультивируемых бактерий филума Planctomycetes (сходство 97%) и бактерий филума Lentisphaerae с низким процентом сходства генов 16S рРНК (84-87%). РНК-библиотека содержала 170 клонов. Наибольшее количество клонированных последовательностей принадлежало денитрифицирующей бактерии Azoarcus totulyticus (27.9%), растущей на галобензоатах и хемолитогетеротрофной 20 бактерии Tepidimonas arfidensis (23.8%), филотип которой был выявлен также в ДНК-библиотеке. Состав библиотек во многом перекрывался: 8 из 14 филотипов РНК-библиотеки (64%) были обнаружены также в ДНК-библиотеке. Помимо филотипа Tepidimonas, последовательности, общие для двух библиотек принадлежали аэробным органотрофным (Pseudomonas), бродильным (Bellilinea и Flexistipes), сульфатредуцирующим (Desulfomicrobium), сероокисляющим (Thiofaba) и сероредуцирующим (Desulfurivibrio и Desulfuromonas) бактериям. Последовательности некоторых метаболически активных бактерий были выявлены только в РНК-библиотеке. Они принадлежали органотрофным бактериям родов Petrobacter и Acinetobacter, неоднократно выделявшимся из нефтяных пластов, а также денитрифицирующим бактериям родов Calditerrivibrio, Denitromonas и железоредуцирующей бактерии рода Geobacter. Присутствие в РНК-библиотеке последовательностей 16S крДНК аэробных и анаэробных бактерий цикла серы свидетельствует об их метаболической активности. Ранее было показано, что сульфаты отсутствовали в пластовой воде залежи и появлялись в концентрации 12-72 мг/л в период нагнетания окислителей в пласт (Назина и соавт., 2007б). С нагнетаемой водой в пласт поступает растворенный кислород или H2O2, что приводит к созданию градиента окислительно-восстановительных условий. Сульфиды железа, присутствующие в нефтеносных породах, подвергаются химическому и биологическому окислению с образованием сульфата (24 мг/л), отсутствующего в оригинальной пластовой воде (табл. 1). Доминирующий в ДНК-библиотеке филотип бактерий рода Geobacillus в РНКбиблиотеке не был выявлен, что может свидетельствовать о подавлении роста геобацилл в результате нагнетания раствора H2O2. и снижения температуры в призабойной зоне нагнетательной скважины. Статистический анализ полученных ДНК- и РНК-библиотек клонов показал, что выборки клонов были репрезентативными; покрытие (Good, 1953) в суммарной ДНК-библиотеке клонов бактерий (252 клона) составляло 93%, в РНК-библиотеке клонов бактерий (170 клонов) – 95% и в ДНК-библиотеке клонов архей (113 клонов) – 96% (рис. 6). Таким образом, сравнительный анализ ДНК- и РНК-библиотек клонов микробного сообщества пластовой воды из призабойной зоны нагнетательной скважины позволил охарактеризовать общее геномное разнообразие и выявить компоненты микробного сообщества, которые остаются неизвестными при анализе 21 только тотальной ДНК сообщества. Детекция генов alkB в пластовой воде. Впервые при исследовании микробного сообщества нефтяных пластов был выполнен поиск функционального гена alkB, кодирующего алкан-монооксигеназу. Специфическая наработка фрагментов гена alkB обнаружена только в случае использования в качестве матрицы тотальной ДНК из пластовой воды. В библиотеке клонов генов alkB (43 клона) выявлены последовательности генов alkB-geo1 (22 клона) и alkB-geo6 (5 клонов) и новые последовательности (22 клона), имеющие 80% сходства с геном alkB Nocardioides sp. Обнаружение генов 16S рРНК геобацилл и отсутствие последовательностей родококков в библиотеке клонов генов 16S рРНК позволяет предположить, что выявленные гомологи alkB-geo1 и alkB-geo6 принадлежат геобациллам. 40 Количество филотипов 1 30 2 20 10 3 Количество клонов 0 80 160 240 Рис. 5. Кривая распределения, основанная на результатах сравнения количества выявленных генов 16S рРНК и филотипов в ДНК-библиотеке бактерий (кривая 1, 252 клона), в РНК-библиотеке бактерий (кривая 2, 170 клонов) и в ДНК-библиотеке клонов архей (кривая 3, 113 клонов). Клоны сгруппированы в филотипы на уровне 97% сходства генов 16S рРНК. 3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Микроорганизмы пластовой воды высокотемпературных горизонтов нефтяного месторождения Даган были проанализированы с применением микробиологических, радиоизотопных и молекулярно-биологических методов исследования. Основное внимание уделяли аэробным термофильным бактериям, изучению их роли в биодеградации н-алканов и генетическим аспектам этого процесса. 22 Показано, что в пласте обитает разнообразное, геохимически активное микробное сообщество. В зоне нагнетания охлажденных поверхностных вод, содержащих кислород, где температура пласта снижается с 60 до 40–50°С, обитают микроорганизмы разных физиологических групп и протекают мезофильные и термофильные процессы сульфатредукции и метаногенеза. В зоне добывающих скважин доминируют термофильные процессы метаногенеза и сульфатредукции, несмотря на обнаружение культивируемых мезофильных прокариот. Аэробные спорообразующие бактерии рода Geobacillus доминируют в посевах наибольших разведений пластовой воды на среды с н-алканами и нефтью. Семь штаммов были выделены в чистую культуру, и с использованием методов полифазной таксономии определена их принадлежность к видам G. stearothermophilus (штаммы 46 и 49) и G. subterraneus (штаммы 31, 32, 44, 45, 47). Показано, что выделенные и коллекционные штаммы геобацилл растут в интервале температуры от 45 до 70–75°С, используют широкий спектр субстратов, включая органические кислоты, углеводы, спирты и С10–С29-31 н-алканы алифатической фракции нефти. Способность образовывать споры, расти в интервале температуры и солености, свойственных местообитанию, а также использовать широкий спектр субстратов и н-алканы, обусловливает распространение этих бактерий в пласте. Впервые у бактерий рода Geobacillus выявлено восемь гомологов гена alkB (alkB-geo1 – alkB-geo8, 59.7–96.7% сходства между гомологами), кодирующего фермент алкан-монооксигеназу. Показано, что в геноме каждого штамма присутствует набор из 3-6 гомологов alkB-гена. Последовательности alkB-geo1 и alkB-geo4 встречались в геноме всех исследованных 11-и штаммов геобацилл и имели 87.7-99.2% сходства с генами alkB бактерий рода Rhodococcus, что не позволяет использовать эти гены для детекции геобацилл в природном местообитании. Принадлежность генов alkB геобациллам может быть установлена только при условии обнаружения генов 16S рРНК геобацилл и отсутствия генов 16S рРНК родококков в библиотеке клонов исследуемого микробного сообщества. Впервые при изучении микробных сообществ нефтяных пластов выполнен сравнительный анализ генов 16S рРНК и alkB, а также 16S рРНК в библиотеках клонов, созданных на основе ДНК и РНК, выделенных из пластовой воды призабойной зоны нагнетательной скважины в период биотехнологического воздействия. В составе ДНК- и РНК-библиотек клонов выявлены как общие, так и различающиеся последовательности термофильных и мезофильных аэробных органотрофов, сероокисляющих, бродильных, сульфат- и сероредуцирующих бактерий, что свидетельствует о преимуществах использования данного метода. 23 Около 65% филотипов, выявленных в РНК-библиотеке, присутствовали также в ДНК-библиотеке. В ДНК-библиотеке клонов генов 16S рРНК последовательности бактерий рода Geobacillus составляли большинство, кроме того, выявлены гены alkB, вероятно, принадлежащие геобациллам. В период отбора пробы для молекулярнобиологического анализа геобациллы, по-видимому, не были метаболически активными, о чем свидетельствует отсутствие этого филотипа в РНК-библиотеке. Выявление генов 16S рРНК и alkB в библиотеках клонов и выделение чистых культур свидетельствует о потенциальной активности аэробных углеводородокисляющих бактерий в пласте, тогда как реальная функциональная активность подтверждается обнаружением увеличения содержания растворенных минеральных карбонатов, обогащенных изотопом 12С, и летучих кислот в пластовой воде. Таким образом, сочетание микробиологических и радиоизотопных методов с методами молекулярного клонирования генов 16S рРНК и alkB позволило полнее охарактеризовать микробное сообщество высокотемпературных нефтяных пластов и расширить представления о генах биодеградации н-алканов у термофильных прокариот. 4. ВЫВОДЫ 1. Бактерии рода Geobacillus являются наиболее многочисленной группой культивируемых аэробных термофильных прокариот в высокотемпературном заводняемом нефтяном пласте. Представители рода Geobacillus (G. stearothermophilus, G. subterraneus, G. thermoglucosidans, G. toebii), выделенные из пластов, приспособлены к среде обитания, используют широкий спектр органических субстратов и C10-С29-31 н-алканы нефти в интервале температуры от 45 до 65–75°С. 2. У бактерий рода Geobacillus обнаружено 8 различных гомологов гена alkB (alkB-geo1 – alkB-geo8), кодирующего фермент алкан-монооксигеназу. Впервые у термофильных бактерий показано наличие 3–6 гомологов в геноме одного штамма. Последовательности шести alkB-гомологов геобацилл имеют 87.7-99.2% сходства с генами alkB бактерий рода Rhodococcus, что позволяет использовать эти гены для детекции геобацилл в природном местообитании только совместно с анализом генов 16S рРНК. 3. Впервые выявлено доминирование последовательностей геобацилл в 24 библиотеках клонов генов 16S рРНК и alkB, созданных на основе ДНК из пластовой воды призабойной зоны нагнетательной скважины высокотемпературного нефтяного пласта. Биодеградация нефти в пласте сопровождается увеличением содержания растворенных минеральных карбонатов, обогащенных изотопом 12С, и летучих кислот в пластовой воде. 4. Впервые на основе тотальных ДНК и РНК, выделенных из пластовой воды, выявлены последовательности гена 16S рРНК и 16S крДНК мезофильных и термофильных аэробных органотрофных и сероокисляющих бактерий, бродильных, сульфат-, серо- и железо-редуцирующих бактерий, что свидетельствует о метаболической активности этих микроорганизмов в нефтяном пласте. 5. Геохимическая активность микроорганизмов цикла серы в нефтяном пласте, изначально лишенном сульфатов, подтверждается появлением сульфатов в пластовой воде и регистрацией термофильных и мезофильных процессов сульфатредукции в призабойной зоне нагнетательных скважин. Термофильный метаногенез доминирует в зоне добывающих скважин нефтяного пласта. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные статьи 1. Назина Т.Н., Соколова Д.Ш., Шестакова Н.М., Григорьян А.А., Михайлова Е.М., Бабич Т.Л., Лысенко А.М., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Циньсян Фенг, Фангтиан Ни, Беляев С.С. Филогенетическое разнообразие аэробных органотрофных бактерий из высокотемпературного нефтяного месторождения Даган // Микробиология. 2005. Т. 74. № 3. С. 401-409. 2. Nazina, T.N., Sokolova, D.Sh., Grigoryan, A.A., Shestakova, N.M., Mikhailova, E.M., Poltaraus, A.B., Tourova, T.P., Lysenko, A.M., Osipov, G.A., Belyaev, S.S. 2005. Geobacillus jurassicus sp. nov., a new thermophilic bacterium isolated from a hightemperature petroleum reservoir, and the validation of the Geobacillus species // Syst. Appl. Microbiol. 28. 43-53. 3. Назина Т.Н., Шестакова Н.М., Григорьян А.А., Михайлова Е.М., Турова Т.П., Полтараус А. Б., Циньсян Фен, Фангтиан Ни, С.С. Беляев. Филогенетическое разнообразие и активность анаэробных микроорганизмов высокотемпературных горизонтов нефтяного месторождения Даган (КНР) // Микробиология. 2006. Т. 75. № 1. С. 70-81. 4. Турова Т.П., Назина Т.Н., Михайлова Е.М., Родионова Т.А., Екимов А.Н., Машукова А.В., Полтараус А.Б. Гомологи alkB гена термофильных бактерий рода 25 Geobacillus // Молекулярная биология. 2008. № 2. С. 247-257. 5. Назина Т.Н., Михайлова Е.М., Шестакова Н.М., Соколова Д.Ш., Ивойлов В.С., Коршунова А.В., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Беляев С.С., Иванов М.В. Биодеградация нефти и гены alkB аэробных термофильных бактерий из нефтяных пластов. Труды Института микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН. Вып. 16. Термофильные микроорганизмы. / Ин-т микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Отв. редактор В.Ф. Гальченко. М.: МАКС Пресс, 2011. С. 193-216. Тезисы конференций 6. Михайлова Е.М., Соколова Д.Ш., Григорьян А.А., Гавура М.А., Павлова Н.К., Ивойлов В.С., Божонг Му, Назина Т.Н. Биодеградация нефти и образование биосурфактантов термофильными аэробными бактериями. Материалы третьего московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва, Россия, 14-18 марта 2005 г. ч. 2. с. 239. 7. Nazina T.N., Grigoryan A.A., Shestakova N.M., Sokolova D.S., Babich T.L., Mikhailova E.M., Feng Q., Ni F., Poltaraus A.B., Belyaev S.S., Ivanov M.V. From microbial ecology to the microbial enhancement of oil recovery (MEOR) of hightemperature petroleum reservoirs. 1. Characterization of a microbial community from the Dagang high-temperature oil field (P.R. China) by culture-based, radioisotopic and molecular methods. // Abstracts of the Joint International Symposia for Subsurface Microbiology (ISSM 2005) and Environmental Biogeochemistry (ISEB XVII). P. 121. Jackson Hole, Wyoming, August 14-19, 2005. P. 121. 8. Михайлова Е.М., Турова Т.П., Назина Т.Н., Родионова Т.А., Екимов А.Н., Машукова А.В., Полтараус А.Б. Гомологи алкан-гидроксилаз термофильных бактерий рода Geobaсillus. Тезисы III Международной молодежной школыконференции “Актуальные аспекты современной микробиологии”, 22-23 ноября 2007 г., Москва: Макс-Пресс. С. 77-78. 9. Михайлова Е.М., Соколова Д.Ш., Ивойлов В.С., Назина Т.Н., Полтараус А.Б. Биодеградация нефти и гены биодеградации углеводородов у термофильных бактерий рода Geobacillus. Тезисы II Международной молодежной школыконференции “Актуальные аспекты современной микробиологии” (1-3 ноября 2006 г., г. Москва). М.: Макс-Пресс. С. 98-99. 10. Mikhailova E.M., Shestakova N.M., Rodionova T.A., Mashukova A.V., Tourova T.P., Nazina T.N., Poltaraus A.B. Alkane hydroxylase homologues and its localization in thermophilic bacteria of the genus Geobacillus. In Abstract Book: 7th Int. Symp. for Subsurface Microbiology. Shizuoka, Japan, November 16-21, 2008. P. 172. 26
