Новые достижения в эмбриологии (2,1 МБ)
реклама
Новые достижения в эмбриологии Кайхонг M.A., дипломированный врач, к.м.н. Бейджинг, Китай Устная сессия 40: эмбриональный метаболизм Влияние ГМ-КСФ на развитие мышиных эмбрионов, анеуплоидию, фрагментацию ДНК и морфокинетические параметры, полученные при помощи Эмбриоскопа™ Аиша Элайми и соавт. Институт женского здоровья Центр университетского колледжа Лондона по ПГД Лондон, Великобритания Введение Влияет ли добавление гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора (ГМКСФ) в культуральную среду на потенциал развития, хромосомный состав, фрагментацию ДНК и морфокинетические параметры мышиных эмбрионов по данным Эмбриоскопа™ на преимплантационном этапе ? Elaimi et al. ESHRE 2013. Oral 147 Введение • В одних исследованиях показано, что ГМ-КСФ стимулирует развитие эмбрионов, а в других работах не было выявлено какого-либо эффекта • В двух исследованиях было показано, что ГМ-КСФ не влияет на анеуплоидию человеческих и мышиных эмбрионов • В 2011 г. на рынке появилась культуральная среда, содержащая 2 нг/мл ГМ-КСФ, которая, как было заявлено, улучшает развитие бластоцист и снижает частоту апоптоза • Покадровая съемка кинетических параметров эмбрионов позволяет проводить непрерывный анализ их развития, включая временные интервалы каждого деления Elaimal. ESHRE 2013. Oral 147 Методы • Двухклеточные мышиные эмбрионы культивировали индивидуально в Эмбриоскопе™ до стадии бластоцисты в присутствии ГМ-КСФ различных концентраций • Для выявления какого-либо влияния ГМ-КСФ оценивали развитие эмбрионов, сроки деления, анеуплоидию и фрагментацию ДНК Elaimi et al. ESHRE 2013. Oral 147 Результаты Формирование бластоцисты (%) Развитие мышиных эмбрионов • Двухклеточные мышиные эмбрионы культивировали по отдельности в Эмбриоскопе до стадии бластоцисты в присутствии различных концентраций ГМ-КСФ 120 Концентрация ГМКСФ (нг/мл) 100 80 * 60 40 20 0 0 1 2 5 10 0 1 2 5 10 Частота формирования бластоцист 97% 81% 89% 81% 64%* *P<0,01 в сравнении с контролем Концентрация ГМ-КСФ (нг/мл) Ключевой момент: развитие мышиных эмбрионов ухудшалось при добавлении ГМ-КСФ по сравнению с контролем, достигая значимых различий в группе с концентрацией 10 нг/мл Elaimi et al. ESHRE 2013. Oral 147 Результаты Анеуплоидия/мозаицизм Частота анеуплоидии Эмбрионы с анеуплоидией/ мозаицизмом Частота анеуплоидии (средняя) Процент анеуплоидных ядер 0 33% 18% 16% 1 41% 25% 17% 2 43% 20% 19% 5 40% 28% 20% 10 36% 24% 20% Концентрация ГМКСФ (нг/мл) Ключевой момент: отсутствие значимых различий по анеуплоидии/мозаицизму между контрольной группой и группами ГМ-КСФ Elaimi et al. ESHRE 2013. Oral 147 Результаты Количество клеток с фрагментацией ДНК Фрагментация ДНК Бластоцисты с фрагментацией ЛНК Частота фрагментации ДНК (средняя) Доля ядер с фрагментацией ДНК 0 85% 74% 75% 1 87% 86% 88%* 2 82% 74% 71% 5 80% 86% 90%* 10 64% 63% 69% Концентрация ГМ-КСФ (нг/мл) * P <0.01 Ключевой момент: выявлены значимые различия по количеству клеток с фрагментацией ДНК между контролем и некоторыми группами ГМ-КСФ Elaimi et al. ESHRE 2013. Oral 147 Выводы • Высокая концентрация ГМ-КСФ оказывает значимое отрицательное влияние на частоту образования бластоцист • ГМ-КСФ не влияет на анеуплоидию и фрагментацию ДНК • Результаты, полученные с помощью Эмбриоскопа™, свидетельствуют о том, что ГМКСФ не влияет на время первого клеточного деления (данные не представлены) • Необходимы дополнительные исследования, для изучения эффективности и рисков добавления факторов роста • Мышиные эмбрионы не идеальны с точки зрения изучения преимплантационного развития эмбрионов человека Elaimi et al. ESHRE 2013. Oral 147 Устная сессия 40: развитие эмбрионов Влияние гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора роста (ГМ-КСФ) на частоту наступления беременности у пациентов с неудачными попытками ЭКО Иоаннис Сфонтурис и соавт. Eugonia, отделение ВРТ Афины, Греция Введение Повышается ли частота клинической беременности (наличие плодного яйца с эмбрионом и сердцебиением на 7-й неделе гестации) при добавлении ГМКСФ в культуральную среду для культивирования эмбрионов у пациенток с многократными неудачными попытками ЭКО в анамнезе? Sfontouris et al. ESHRE 2013. Oral 150 Введение • Было показано, что ГМ-КСФ способствует формированию бластоцисты, снижает апоптоз внутренней клеточной массы, а также играет важную роль в формировании плаценты и росте плода • Было показано, что добавление ГМ-КСФ в культуральную среду значимо повышает частоту прогрессирующей имплантации у женщин с невынашиванием в анамнезе • Однако все еще неясно, являются множественные неудачные попытки ЭКО дополнительным показанием к использованию ГМ-КСФ Sfontouris et al. ESHRE 2013. Oral 150 Методы • Проспективное наблюдательное исследование у пациенток с 2 и более неудачными попытками ЭКО в анамнезе (отсутствие клинической беременности) • После оплодотворения ооциты были перенесены в культуральную среду Эмбриоген, содержащую 2 нг/мл ГМ-КСФ (группа Эмбриогена; n=37 пациенток) или универсальную среду IVF/ISM1/BlastAssist (контрольная группа; n=42 пациентки) • В обеих группах эмбрионы переносили на 2-й или 3-й день культивирования Sfontouris et al. ESHRE 2013. Oral 150 Результаты Контролируемая овариальная гиперстимуляция Эмбриоген N=37 Контроль N=42 25 28 Длинный протокол (n) 6 4 Короткий протокол (n) 2 2 Модифицированный натуральный цикл (n) 4 8 2250±1171,2 2115,2±1149,3 10,9±9,7 8,9±10,7 1309±926,4 1009,1±1587,7 0,7±0,3 0,6±0,4 Протокол с антагонистами (n) Общая доза ФСГ (МЕ) Кол-во фолликулов в день введения ХГЧ Эстрадиол в день введения ХГЧ (пг/мл) Прогестерон в день введения ХГЧ (нг/мл) Ключевой момент: параметры КОГ сопоставимы в группах Sfontouris et al. ESHRE 2013. Oral 150 Результаты Эмбриологические параметры Эмбриоген N=37 Контроль N=42 Кол-во полученных ооцитов 7,4±6,0 8,9±10,7 Кол-во зрелых ооцитов (у пациентов с ИКСИ) 4,6±41 4,0±4,7 5/32 5/37 4,2±4,1 3,9±4,3 34 35 21/13 25/10 Кол-во эмбрионов с хорошей морфологией в день ПЭ 2,6±2,0 2,8±3,8 Кол-во перенесенных эмбрионов 2,3±1,0 2,4±1,0 Кол-во криоконсервированных эмбрионов 4,3±1,3 4,7±2,0 Тип оплодотворения (n) (ЭКО/ИКСИ) Кол-во ооцитов с 2PN Кол-во пациенток, дошедших до ПЭ День ПЭ (n) (2-й/3-й) Ключевой момент: эмбриологические данные сопоставимы в группах Sfontouris et al. ESHRE 2013. Oral 150 Результаты Частота имплантации и клинической беременности 50 47.1% (16/34) 45 Частота (%) 40 35 30 ГМ-КСФ Контроль 38.2% (13/34) 28.6% (10/35) 22.9% (8/36) 25 30.8% (4/13) 26.5% (9/34) 25% (2/8) 17.1% (6/35) 20 15 20% 18.8% (2/10) (3/16) 19.4% 11.4% 10 5 0 Пол. ХГЧ Клиническая Прогрессирующая Частота беременность беременность 12 нед имплантации 7нед Биохимическая беременность Клинический выкидыш Ключевой момент: частота имплантации и клинической беременности в группе Эмбриогена выше, чем в контрольной группе (р=незначимо) Sfontouris et al. ESHRE 2013. Oral 150 Результаты Влияние возраста (≤39 лет и >39 лет) ≤39 лет >39 лет Эмбриоген Контроль Эмбриоген Контроль Кол-во пациенток 21 17 16 25 Кол-во пациенток, дошедших до ПЭ 19 16 15 19 12 (63,2) 7 (43,8) 4 (26,7) 3 (15,8) Клиническая беременность, n (%) 9 (52,6) 6 (37,5) 3 (20) 2 (10,5) Прогрессирующая беременность, n (%) 8 (42,1) 5 (31,2) 1 (6,7) 1 (5,3) 28,9±31,6 18,80±26,44 7,2±28,9 5,3±23 Биохимическая беременность, n (%) 2 (16,7) 1 (14,3) 1 (25) 1 (33,3) Клинический выкидыш, n (%) 1 (11,1) 1 (16,7) 2 (66,7) 1 (50) Положит. ХГЧ n (%) Частота имплантации Ключевой момент: у пациенток ≤39 лет эффект более выраженный, чем у тех, кто старше 39 лет (р=незначимо) Sfontouris et al. ESHRE 2013. Oral 150 Выводы • Параметры КОГ и эмбриологические показатели сопоставимы в группах • Частота клинической беременности, положительный ХГЧ и частота имплантации в группе Эмбриогена были выше, чем в контрольной группе – Эти различия не достигли статистической значимости • Добавление ГМ-КСФ в культуральную среду может повысить частоту наступления беременности и частоту имплантации у пациенток с многократными неудачными попытками ЭКО в анамнезе • Необходимо проведение РКИ по оценке эффективности ГМ-КСФ в этой категории пациенток Sfontouris et al. ESHRE 2013. Oral 150 P-099 Исходы витрификации бластоцист с использованием криопетель: клинические исходы 2924 циклов по сравнению с 2003 переносами в свежих циклах Юи Умекава и соавт. Клиника Киба Парк Япония Введение Является ли метод ультрабыстрой витрификации бластоцист с использованием криопетель безопасным и эффективным? Umekawa et al. ESHRE 2013. Poster 099 Введение • Перенос бластоцист стал перспективным методом, позволяющим получить более высокую частоту наступления беременности, чем при переносе эмбрионов на стадии дробления • Высокую частоту выживаемости после размораживания связывают с отсутствием кристаллов льда • Витрификация стала основным методом криоконсервации бластоцист Umekawa et al. ESHRE 2013. Poster 099 Методы • • • • • • Ретроспективный анализ 2924 циклов с переносом витрифицированныхразмороженных бластоцист и 2003 свежих циклов у женщин моложе <40 лет ЭКО и ИКСИ, культивирование в последовательных средах Бластоцисты витрифицированы с использованием техники криопетель и наборов VitriBlast™ В день переноса бластоцисты размораживали с использованием набора Thermoblast™ Выживаемость оценивали на основании морфологической целостности внутренней клеточной массы и трофэктодермы, а также расправлении бластоцеле После вспомогательного хэтчинга выжившие бластоцисты переносили в полость матки примерно через 5 ч после оттаивания Umekawa et al. ESHRE 2013. Poster 099 Результаты Частота имплантации и врожденных аномалий Витрифицирова нные Свежие P 34,6 ± 3,1 34,5 ± 3,2 Не значимо Кол-во циклов с ПЭ 2924 2003 - Кол-во перенесенных эмбрионов 4004 2923 - 1,4 ±0,5 1,5 ±0,6 <0,01 39,0% (1516/4004) 38,2% (1118/2923) Не значимо Частота клинической беременности (с сердцебиением эмбриона) в расчете на ПЭ 41,6% (1216/2924) 44,7% (895/2003) 0,0310 Частота родов в расчете на ПЭ 34,6% (1012/2924) 37,8% (757/2003) 0,0222 Средний рост при рождении (г) 3087,5 ±493,3 2988 ±441,3 <0,01 1,9% (17/900) 1,8% (12/657) Не значимо Возраст пациенток (годы) Среднее кол-во ПЭ Частота имплантации Частота врожденных аномалий в расчете на плод Ключевой момент: отсутствие различий по частоте имплантации и врожденных пороков развития между переносом витрифицированных и свежих бластоцист Umekawa et al. ESHRE 2013. Poster 099 Выводы • Метод ультрабыстрой витрификации бластоцист с помощью криопетель является простым в использовании, безопасным и эффективным • Исходы ультрабыстрой витрификации бластоцист с помощью криопетель сопоставимы с таковыми при переносе свежих бластоцист – По частоте имплантации и частоте врожденных пороков развития • Рекомендовано долгосрочное наблюдение за детьми, рожденными после ультрабыстрой витрификации бластоцист с помощью криопетель, включая их моторное и психическое развитие Umekawa et al. ESHRE 2013. Poster 099 P-164 Восстановление потенциала развития ооцитов, подвергшихся оксидативному стрессу, в результате переноса мейотического веретена деления Мамору Кобаяши и Атсуми Йошида Клинический исследовательский центр Киба Парк Япония Введение Можно ли изменить индуцированное оксидативное повреждение созревания и развитие созревающих ооцитов с помощью переноса веретена деления? Kobayashi & Yoshida. ESHRE 2013. Poster 164 Введение • Оксидативный стресс во время созревания ооцитов в условиях in vitro (IVM) может нарушить процесс созревания ооцитов • К тому же оксидативный стресс во время созревания ооцитов может играть роль в возрастной анеуплоидии ооцитов и бесплодии у человека • Пока не было проведено исследований по оценке возможности компенсации оксидативного повреждения ооцита за счет переноса в ооплазму веретена деления на стадии метафазы I (MI) Kobayashi & Yoshida. ESHRE 2013. Poster 164 Методы • Проведено сравнение морфологии веретена деления, потенциала митохондриальной мембраны (MMP), частоты созревания и потенциала развития между интактными ооцитами в метафазе-I (MI) и ооцитами, обработанными H202 • Из ооцитов, обработанных H202 было выделено веретено деления, которое было перенесено в интактные оопласты Kobayashi & Yoshida. ESHRE 2013. Poster 164 Результаты • По сравнению с интактными ооцитами после воздействия H202 наблюдалось: – Значимо более низкая частота созревания с MI до MII (79,4% против 51,7%; p<0,05) – Укорочение веретена деления у ооцитов, достигающих MII – Более низкий MMP в зрелых ооцитах • • Интактные ооциты достигали стадии бластоцисты (против 40% в контрольной группе) После переноса веретена деления у ооцитов, обработанных H202 наблюдалось: – – – – Восстановление созревания до MII (73,5%) Нормальная морфология веретена деления в MII Повышение MMP в зрелых ооцитах Более высокая частота формирования бластоцист MII spindle morphology of: (A) in vitro matured (control) oocytes (B) H202-treated oocytes (C) Reconstituted oocytes with H202treated spindle and intact cytoplast (D) Reconstituted oocytes with intact spindle and H202-treated cytoplast Ключевой момент: перенос в ооплазму веретена деления позволяет компенсировать оксидативное стрессиндуцированное повреждение ооцита Kobayashi & Yoshida. ESHRE 2013. Poster 164 Выводы • Оксидативный стресс нарушает мейотическое и митотическое развитие ооцитов млекопитающих, снижая митохондриальную активность и нарушая формирование веретена деления • Такие ооплазменные нарушения можно скорректировать за счет наполнения ооплазмы, что указывает на то, что веретено деления может играть важную роль в возрастной патологии ооцитов • Ограничения исследования: – Настоящее исследование было проведено на мышиных эмбрионах с искусственно индуцированным оксидативным стрессом – Следовательно, эти данные не могут напрямую отображать бесплодие у человека Kobayashi & Yoshida. ESHRE 2013. Poster 164 P-127 Влияние воздействия музыки на развитие эмбрионов при культивировании в условиях in vitro Каролина Кастелло и соавт. Институт Маркеса Барселона, Испания Введение Цель настоящей работы заключается в определении влияния музыки на частоту оплодотворения и качество эмбрионов при их культивировании в условиях in vitro Castelló et al. ESHRE 2013. Poster 127 Введение • Механическая микровибрация может изменить экспрессию некоторых молекул и нейрогенез • Было показано, что воздействие микровибрации 44 Гц/ч с интервалом в 5 сек на эмбрионы, культивируемые in vitro, может улучшить качество эмбрионов и их развитие • Однако ничего неизвестно о влиянии музыки как источника механической вибрации на человеческие эмбрионы, находящиеся в условиях in vitro до момента имплантации Castelló et al. ESHRE 2013. Poster 127 Методы • Были проанализированы 985 ооцитов от 114 пациенток • Инсеминированные ооциты от каждой пациентки случайным образом были разделены на две группы: культивирование с музыкой (n=497) и культивирование без музыки (n=488) • После размещения микрофона в стандартном инкубаторе было протестировано 3 музыкальных направления (поп, тяжелый металл и классическая) • Проведено сравнение таких показателей, как частота оплодотворения и качество эмбрионов (согласно морфологической категоризации, многоядерности и стадии дробления) Castelló et al. ESHRE 2013. Poster 127 Результаты Частота оплодотворения Частота (%) 100 80 С музыкой 76% Без музыки 71.1% 60 40 20 0 Ключевой момент: в группе «с музыкой» наблюдалось значимо более высокая частота оплодотворения по сравнению с группой «без музыки» (95% ДИ: 3,44%, 6,21%) Castelló et al. ESHRE 2013. Poster 127 Результаты Качество эмбрионов Ключевой момент: отсутствие статистически значимых различий между группами по качеству эмбрионов Castelló et al. ESHRE 2013. Poster 127 Выводы • Рутинное включение музыки внутри инкубатора: – Повышает частоту оплодотворения – Не влияет на качество эмбрионов, оцениваемое по наличию многоядерности, стадии дробления (на 2й/3-й день) и морфологической категоризации • В настоящее время проводится все больше исследований по оценке влияния музыки на развитие эмбрионов к 5-му дню культивирования Castelló et al. ESHRE 2013. Poster 127 Устная сессия 40: эмбриональный метаболизм Метаболический профиль эмбрионов человека и его связь с хромосомными аномалиями Айкатерини Чатзимелетиу и соавт. Медицинская школа при университете Аристотеля Первое отделение акушерства и гинекологии Больница Пападжорджиу Тессалоники, Греция Введение Отличается ли метаболомический профиль эмбрионов человека с хромосомными аномалиями от метаболомического профиля здоровых эмбрионов? Chatzimeletiou et al. ESHRE 2013. Oral 146 Введение • Считается, что определение метаболомического профиля позволяет выделить эмбрионы, которые потенциально могут дозреть до бластоцисты и имплантироваться • В одном исследовании сравнивали профили эмбрионов третьего дня развития с трисомией/моносомией по 21-й хромосоме и здоровыми эмбрионами – Была выявлена различная экспрессия генов некоторых метаболитов • Исследования, в которых бы подробно исследовался метаболомический профиль эмбрионов с другими анеуплоидиями в сравнении со здоровыми эмбрионами, отсутствуют Chatzimeletiou et al. ESHRE 2013. Oral 146 Методы • У эмбрионов третьего дня развития была выполнена биопсия для преимплантационной генетической диагностики (ПГД)/скрининга (ПГС) – Во время ПГД/ПГС был выполнен генетический анализ • С помощью газовой хроматографии/массспектрометрии до биопсии (1-3-й день) и после биопсии (3-5-й день) был определен состав эмбриональной культуральной среды – В судмедэкспертной токсикологической лаборатории был выполнен метоболомический анализ использованной культуральной среды 3-го и 5-го дней Chatzimeletiou et al. ESHRE 2013. Oral 146 Результаты Метаболомический анализ использованной культуральной среды 3-го дня Ключевой момент: эмбрионы с хромосомными аномалиями обладают характерным биомолекулярным профилем использованной культуральной среды 3-го дня • В использованной культуральной среде 3-го дня: – Уровень молочной кислоты, аспаргиновой кислоты и глицина у здоровых эмбрионов значимо выше, чем у эмбрионов с хромосомными аномалиями (p<0,05) – Уровень пирувата, глицина и глутамина в эмбрионах с хаотичным кариотипом был значимо ниже, чем в эмбрионах с конституциональной аномалией (p<0,05) Chatzimeletiou et al. ESHRE 2013. Oral 146 Результаты Метаболомический анализ использованной культуральной среды 5-го дня Abnormal Tyrosine Day 5 culture medium Normal Abnormal 1,000,000 900,000 800,000 700,000 600,000 500,000 400,000 300,000 200,000 100,000 0 0.0 Normal 1,000,000 900,000 800,000 700,000 600,000 500,000 400,000 300,000 200,000 100,000 0 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 Methionine Day 5 culture medium 1,000,000 900,000 800,000 700,000 600,000 500,000 400,000 300,000 200,000 100,000 0 0.0 Lysine Day 5 culture medium 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 0.0 1.0 2.2 0.0 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.0 2.2 Aspartic acid Day 5 culture medium 1,000,000 900,000 800,000 700,000 600,000 500,000 400,000 300,000 200,000 100,000 0 2.0 1.2 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Ключевой момент: анализ использованной культуральной среды 5-го дня также выявил различия по уровню аспаргиновой кислоты, глутаминовой кислоты, метионина, лизина, тирозина и цистина между эуплоидными и анеуплоидными эмбрионами (p<0,05) Chatzimeletiou et al. ESHRE 2013. Oral 146 Результаты Мета-анализ биопсированных эмбрионов после анализа всего эмбриона Классификация эмбрионов на основании ПГС одного бластомера(n) Анеуплоидные 152 Гаплоидные 3 С хаотичным кариотипом 32 Полиплоидные Диплоидные Всего Повторная классификация эмбрионов на основании анализа всего эмбриона и мета-анализа всех ядер, n (%) С констимуциональной анеуплоидией С мозаичным кариотипом >50% аномальные С мозаичным кариотипом <50% аномальные С хаотичным кариотипом Смешанные полиплоиди ные/ гаплоидные 92 (60,5) 34 (22,4) 16 (10,5) 9 (5,9) 1 (0,7) 1 (33,3) 2 (66,7) 4 (12,5) 1 (3,1) 11 2 (18,2) 2 (18,2) 7 2 (28,6) 5 (71,4) 42 (20,5) 24 (11,7) 205 2 (6,2) 94 (45,8) 25 (78,1) 7 (63,6) 35 (17,1) Ключевой момент: мета-анализ всех ядер отбракованных эмбрионов подтвердил выявленные аномалии Chatzimeletiou et al. ESHRE 2013. Oral 146 10 (4,9) Выводы • Настоящее исследование позволило определить характерный биомолекулярный профиль культуральных сред 3-го и 5-го дня, в которых культивировали эмбрионы с хромосомными аномалиями по данным ПГД/ПГС – Эти данные были подтверждены мета-анализом всех ядер отбракованных эмбрионов 5-го дня • Были выявлены различия между эмбрионами, остановившимися в развитии, с конституциональной аномалией (с одним типом хромосомной аномалии во всех бластомерах) и с хаотичным кариотипом (когда разные бластомеры имеют различные варианты хромосомных нарушений) и здоровыми эмбрионами, которые на 5-е сутки достигли стадии бластоцисты и привели к наступлению жизнеспособной беременности • В настоящее время проводится дальнейший анализ полученных данных (LC-MSMS) Ограничение исследования: у здоровых эмбрионов, перенос которых не привел к наступлению беременности, нельзя исключить мозаицизм на основании биопсии одного бластомера Chatzimeletiou et al. ESHRE 2013. Oral 146 Устная сессия 39: парамедицинская приглашенная сессия – лаборатория Экспрессия генов в клетках кумулюса маркеры компетентности ооцитов Мари Луиза Грендаль и соавт. Больница госпиталя Копенгагена, клиника по лечению бесплодия Герлев, Дания Введение Цель настоящего исследования описать результаты классификации качества ооцитов на основании профиля экспрессии генов в соответствующих клетках кумулюса и гранулезы Groendahl. ESHRE 2013. Oral 144 Введение • В ряде исследований были выявлены гены, связанные с потенциалом развития ооцитов • Однако отсутствует консенсус по предложенным генам-маркерам – Отсутствие единого стандарта оценки компетентности ооцитов – Различия в технике выделения Groendahl. ESHRE 2013. Oral 144 Методы • 16 детей, родившихся после ЭКО/ИКСИ – Из 16 фолликулов были получены клетки кумулюса – Также были получены клетки кумулюса из 16 фолликулов, сопоставимых по возрасту пациенток и морфологии, где беременность не наступила • Экстракция РНК • Амплификация, маркировка, гибридизация, профиль экспрессии • Анализ данных • На основании 48-генной сигнатуры был разработан “классификатор экспрессии генов”, позволяющий отличить профили экспрессии, при которых беременность наступает и не наступает Groendahl. ESHRE 2013. Oral 144 Результаты: классификация профиля экспрессии генов в клетках кумулюса 48-генная сигнатура позволила разделить профили. при которых беременность наступает (рождается ребенок) и не наступает Groendahl. ESHRE 2013. Oral 144 В 84% классификатор успешно справился с прогнозированием наступления беременности (с использованием профиля экспрессии 32 генов Классификатор был успешно валидизирован и при использовании внешнего набора данных (в 92%) Выводы: идеальный маркер компетентности ооцитов • • • • • Объективный Четкая грань между Простой и быстрый Дешевый Не инвазивный и Пока нет • Несмотря на то, что мы близки к цели, пока отсутствует идеальный маркер компетентности развития ооцитов, который можно было бы использовать в клинической практике Groendahl. ESHRE 2013. Oral 144 P-118 Белковые биочипы обратной фазы (RPPA): новый подход в определении биомаркеров клеток кумулюса для оценки качества ооцитов Винсент Пуар и соавт. CHRU Tours - Hôpital Bretonneau, Médecine et Biologie de la Reproduction, Tours Cedex 1, France. 2INRA, UMR85 Physiologie de la Reproduction et des Comportements Назилли, Франция Введение Целью настоящего исследования стало исследование возможности использования белковых биочипов обратной фазы (RPPA) в выявлении и анализе потенциальных биомаркеров компетентности развития ооцитов с помощью неинвазивной процедуры оценки отдельных клеток кумулюса человека Puard et al. ESHRE 2013. Poster 118 Введение • Морфологические критерии, которые используются в большинстве лабораторий ВРТ, не позволяют с высокой точностью прогнозировать потенциал развития эмбрионов • Были предложены другие многочисленные подходы, включая транскриптомику, протеомику и метаболомику эмбрионов и их клеточного и неклеточного окружения • RPPA является чувствительным количественным методом, позволяющим выявить даже очень низкие концентрации специфических протеинов в биологических образцах, что используется в онкологии Puard et al. ESHRE 2013. Poster 118 Методы RPPA Adapted from Dupuy et al. Proteomics 2009;9:5446–54 • Были изучены антитела к VCL, ERK2 и SRC, измеренные с помощью «эффекта гашения» малыми интерферирующими РНК (миРНК) и вестерн-блота/RPPA • 13 отдельных клеток кумулюса от 4 пациенток в программе ИКСИ • Пул из 16 клеток кумулюса от 2 пациенток использовали для определения чувствительности и специфичности RRPA Puard et al. ESHRE 2013. Poster 118 Результаты • Во всех клетках кумулюса (n=13) были выявлены VCL, ERK2 и SRC Ключевой момент: RPPA с красителем ближней инфракрасной частью спектра позволяет выявить и измерить содержание белков в отдельных клетках кумулюса человека Puard et al. ESHRE 2013. Poster 118 Выводы • RPPA является высоко чувствительным и материально-экономически эффективным методом с высокой пропускной способностью, который в будущем можно будет использовать для прогнозирования потенциала развития эмбрионов и их имплантации, а также для снижения частоты многоплодных беременностей при переносе одного эмбриона • Следующий шаг: выделить потенциальные биомаркеры компетентности развития ооцитов на белковом уровне с использованием RPPA • Ограничение исследования: валидизация антител остается актуальной проблемой RPPA Puard et al. ESHRE 2013. Poster 118 P-422 Материнский возраст влияет на ангиогенные факторы и инсулиновый сигнальный путь клеток кумулюса человека зрелых ооцитов в метафазе II Тамадир Аль Эдани и соавт. Университет Монпелье, CHRU Монпелье Институт по исследованиям в области биотерапии, INSERM U1040 Mонпелье, Франция Введение Целью настоящего исследования стало изучение качества и потенциала развития ооцитов в зависимости от возраста матери. Нарушается ли также экспрессия в клетках кумулюса зрелых ооцитов в метафазе II? Al Edani et al. ESHRE 2013. Poster 422 Введение • Ранее сообщалось о влиянии возраста матери на метаболизм и посттранскрипционные процессы в клетках кумулюса человека • Однако все еще мало известно о влиянии возраста на ангиогенные факторы и инсулиновый сигнальный путь Al Edani et al. ESHRE 2013. Poster 422 Методы • Было проведено сравнение профиля экспрессии генов клеток кумулюса зрелых ооцитов, полученных у пациенток моложе 30 лет (n=43), с профилем пациенток старше 30 лет (n=42) • Были использованы биочипы Human Genome U133 Plus 2.0 • Все клетки кумулюса от каждого зрелого ооцита были получены механическим путем и проанализированы по отдельности Al Edani et al. ESHRE 2013. Poster 422 Результаты: молекулярная сигнатура клеток кумулюса человека в зависимости от возраста матери • Экспрессия генов ангиогенных факторов, играющих ключевую роль в преовуляторных процессах и обуславливающих компетентность ооцитов у женщин старше 30 лет снижается – Например, SPP1 и хемокины CCL2, CCL20 и CXCL5 • Экспрессия генов, связанных с инсулиновым сигнальным путем, у женщин старше 30 лет повышается – Например, INSR, IGFBP3, IGFBP5 и IRS1 Красным цветом отмечены гены, экспрессия которых снижена, а зеленым цветом - повышена Ключевой момент : материнский возраст влияет на молекулярную сигнатуру клеток кумулюса человека Al Edani et al. ESHRE 2013. Poster 422 Выводы • Результаты настоящего исследования показали, что материнский возраст влияет на экспрессию генов, обуславливающих инсулиновый сигнальный путь и выработку ангиогенных факторов в клетках кумулюса – Эти гены участвуют в реализации основной биологической функции клеток кумулюса • Полученные данные позволяют выделить маркеры и понять молекулярные механизмы, связанные с процессом старения и сопутствующим снижением фертильности • Для подтверждения полученных результатов необходимо проведение новых исследований с большой выборкой Al Edani et al. ESHRE 2013. Poster 422 P-125 Эмбриональный хорионический гонадотропин человека (чХГ) в использованной культуральной среде может свидетельствовать о жизнеспособности эмбриона в программе ЭКО-ПЭ: многоцентровое исследование Джи Ли и соавт. Первый госпитальный филиал университета Сан Йат-Сен Гуанчжоу, Китай Введегние Целью настоящего исследования стала изучение возможности использования эмбрионального бета-чХГ в качестве биомаркера при отборе эмбрионов для переноса в программе ЭКО Li et al. ESHRE 2013. Poster 125 Введение • чХГ был выявлен одним из первых среди веществ, секретируемых эмбрионом, и был выделен различными методами и в разных концентрациях в израсходованной культуральной среде • По данным более ранних исследований для выявления бета-чХГ в культуральной среде можно использовать высокочувствительный электрохемилюминесцентный иммуноанализ (ECLIA), обладающий высокой воспроизводимостью, эффективностью и стабильностью Li et al. ESHRE 2013. Poster 125 Методы • Поперечное исследование в 6 центрах ЭКО Китая, проведенное с ноября 2011 г. по октябрь 2012 г. – Всего было собрано 719 образцов культуральной среды от отдельных эмбрионов 3-го (n=300) и 5-го (n=419) дня развития – Они включали среды свежих эмбрионов (n=161), замороженных-оттаявших эмбрионов(n=55) и эмбрионов, культивирование которых после размораживания продолжили до стадии бластоцисты (n=203), от 382 женщин • Культивирование в последовательных средах проводили от стадии 2PN и до стадии бластоцисты • Образцы получали отдельно от каждого эмбриона и хранили при температуре -80ºC до момента определения бета-чХГ методом ECLIA Li et al. ESHRE 2013. Poster 125 Результаты В бластоцистах с экспандированной полостью и трофэктодермой высокого качества была выявлена более высокая концентрация бета-чХГ (р<0,001) У забеременевших пациенток уровень бета-чХГ оказался значимо выше как на 3-й день (р=0,042), так и на 5-й день (р<0,05) Наблюдалась положительная корреляция между концентрацией бета-чХГ и частотой имплантации в свежих циклах на 3-й день и в криоциклах на 5-й день При прогрессирующей беременности концентрация бета-чХГ была значимо выше, чем при невынашивании беременности в свежих циклах на 5-й день (р=0,030) и в криоциклах на 5-й день (p=0,050). Однако различия отсутствовали на 3-й день и в криоциклах на 5-й день Li et al. ESHRE 2013. Poster 125 Результаты Корреляция между чХГ и частотой имплантации на 3-й день (в свежем цикле) r=0,52, р=0,03 Ключевой момент: наблюдалась положительная корреляция между концентрацией бета-чХГ и частотой имплантации на 3-й день (в свежем цикле) Выводы • У эмбрионов с лучшей морфологией, более высокой категорией и потенциалом к имплантации был выявлен более высокий уровень бета-чХГ • Бета-чХГ может служить предиктором жизнеспособности эмбриона, особенно при ПЭ на стадии бластоцисты • Ограничение исследования: поперечное исследование, а не РКИ Li et al. ESHRE 2013. Poster 125 Вопросы и ответы
