вакцины

Под
общим
названием
«вакцины» объединяют все
препараты, получаемые как из
самих
патогенных
микроорганизмов
или
их
компонентов, так и продуктов
их жизнедеятельности, которые
применяются для создания
активного
иммунитета
у
животных и людей.
 Живые
реплицирующиеся вакцины
 Убитые нереплицирующиеся
(инактивированные) вакцины
 вакцины, полученные с помощью
рекомбинантной ДНК или других новых
технологий
 Синтетические полипептидные вакцины
 Всегда
корпускулярные
(цельновирионные)
 Клеточно-ассоциированные
 Клеточно-свободными
 Жидкими
 Лиофилизированными
(сухими)
 из
-
аттенуированных вирусов возбудителя.
Аттенуация высокопатогенных штаммов
производится с помощью
последовательных пассажей на культурах
клеток,
через организм не восприимчивых
животных,
с помощью физического и химического
мутагенеза
 из
природно-ослабленных штаммов
возбудителя селекцией природноослабленных штаммов в условиях
латентных или атипично протекающих
инфекций
 из
апатогенных вирусов, серологически
близких определенному патогенному типу
вируса, против которого разрабатывается
вакцина, которые апатогенны для человека
или животных
 из
рекомбинантных апатогенных вирусов
создание вакцинных штаммов вирусов
производится путем рекомбинации генов
вирулентного и невирулентного штаммов
вирусов, протекающей после совместного
заражения ими культуры клеток или
куриных эмбрионов
 Согласно
современным международным
требованиям штаммы, применяемые для
изготовления живых вакцин, должны иметь
генетические маркеры, позволяющие
отличить их от полевых штаммов.
 Они
-
должны обладать
постоянством (константность) своих
биологических свойств,
слабой остаточной вирулентностью и
обеспечивать невосприимчивость к
инфекции большинства животных при
однократном применении вакцины.
 Вакцинный
вирус размножается в
организме хозяина и индуцирует
клеточный, гуморальный, секреторный
иммунитет, создавая защиту всех входных
ворот инфекции.
 Живые вакцины создают
высоконапряженный, прочный и
длительный иммунитет.
 Возможна
реверсия вируса (возврат к
дикому типу), то есть приобретение им
вирулентных свойств.
 Их трудно комбинировать, так как
возможна интерференция вирусов и одна
из вакцин становится неэффективной.
 Термолабильны.
 Естественно циркулирующий дикий вирус
может тормозить репликацию вакцинного
вируса и снизить эффективность вакцин.
 Применение живых вакцин может
спровоцировать повышение вирулентности
патогенного вируса
 корпускулярные
или цельновирионные
вакцины - их получают из цельных
вирусов, путем инактивации их
физическими или химическими методами
 субъединичные вакцины
- из расщепленных вирусов – получают
путем дезинтеграции их различными
способами с целью удаления либо
инактивации генетического материала
вируса
- из нативных вирусных субъединиц
 вакцины,
полученные путем делеции
гена (генов) или точечного мутагенеза
 вакцины на основе вирусных белков,
экспрессированных in vitro в клетках
эукариотов или прокариотов
 вакцины из вирусных белков, собранных
в вирусоподобные частицы
 вакцины, экспрессирующие вирусные
антигены с помощью вирусных векторов
 вакцины на основе вирусных химер
 ДНК-вакцины
 Относят
к разряду субъединичных
(эпитопных) вакцин
Обобщенный
мембраносвязанный
белок, внешние
эпитопы (1—5)
которого могут
индуцировать
иммунный ответ.
Эпитоп, использующийся для создания
эффективной пептидной вакцины, должен
представлять собой короткий, но непрерывный
участок белковой молекулы, а это бывает не
всегда.
 Конформация пептида должна быть такой же,
как у эпитопа в интактной вирусной частице.
 Изолированный эпитоп может не обладать
достаточной иммуногенностью.
 В будущем синтетические пептидные вакцины
могут стать высокоспецифичной, относительно
недорогой, безопасной и эффективной
альтернативой традиционным вакцинам, хотя
для зтого необходимо провести еще немало
исследований.

В
состав вакцин помимо
аттенуированных микроорганизмов
или антигенов, обеспечивающих
развитие специфической
невосприимчивости, входят и другие
компоненты. Их можно разделить на
две группы.
К
первой относятся вещества, вносимые в
препарат с целью обеспечения
стабильности его антигенных свойств
(стабилизаторы), поддержания
стерильности (консерванты), повышения
иммуногенности (адъюванты).
 Вторая группа включает вещества,
присутствие которых в вакцинах
обусловлено технологией их производства
(гетерологичные белки субстрата
культивирования, антибиотики, вносимые
в культуру клеток при производстве
вирусных вакцин, компоненты питательной
среды, вещества, используемые для
инактивации).
В
качестве стабилизаторов
используются исключительно
вещества, на которые имеются
фармакопейные статьи: сахароза,
лактоза, альбумин человека, бычий
сывороточный альбумин, овальбумин,
натрия глютамат.
 Наличие их в препарате не оказывает
какого-либо влияния на его
реактогенность.
 Назначение
консервантов, - химических
веществ, обладающих бактерицидным
действием, состоит в обеспечении
стерильности инактивированных вакцин,
выпущенных стерильными.
 Исходная стерильность может быть
нарушена в результате образования
микротрещин в отдельных ампулах,
несоблюдения правил хранения
препарата во вскрытой ампуле (флаконе)
при проведении процедуры вакцинации.
 ВОЗ
рекомендует использование
консервантов прежде всего для
сорбированных вакцин, а также
препаратов, выпускаемых в
многодозовой расфасовке.
 Наиболее распространенным
консервантом как в России, так и во всех
развитых странах мира являлся
мертиолят (тиомерсал), представляющий
собой органическую соль ртути, не
содержащую, естественно, свободную
ртуть.
Поскольку
мертиолят
неблагоприятно влияет на
антигены некоторых
инактивированных вирусов.
то в таких вакцинах в
качестве консерванта
используют 2-феноксиэтанол.

Идеальная вакцина должна обеспечивать
длительную защиту от инфицирования после
одной или нескольких инъекций. Это
положение обычно относится к живым
аттенуированным вакцинам.

Когда для изготовления вакцины
используются инактивированные вирусы или
материалы, выделенные из них, то в
отношении образования антител обычно
отмечается слабая реакция. Этот недостаток
исправляется добавлением к вакцине
компонента, так называемого адъюванта,
обладающего свойствами стимулировать
иммунные реакции.
 1.
Соли аммония.
 2.
Масляные эмульсии.
 3.
Сапонин.
В
качестве минеральных
сорбентов, обладающих
адъювантными свойствами,
используют алюминия
гидроксид, алюминия фосфат,
N- оксидированное производное
поли-1,4-этиленпиперазина полиоксидоний, холерный
токсин и лабильный токсин
E.coli, стимулирующие
образование секреторных IgA
антител.
В
качестве масляных адъювантов
используют полный и неполный
адъювантов Фрейнда, содержащих
взвесь вазелинового масла, ланолина,
инактивированных клеток вакцины BCG
или мурамилдипептид
В
настоящее время проходят
испытания и другие виды
адъювантов. Их практическое
использование позволяет снизить
антигенную нагрузку препарата и тем
самым уменьшить его
реактогенность.
Особую
группу носителей
составляют липосомы и
микрокапсулы
 Липосомы
получают путем эмульгирования
липидного компонента в водной фазе или
наоборот. Они обеспечивают создание
дискретных частиц, содержащих антиген.
 Липосомы
повышают стабильность
антигена, что делает возможным создание
препаратов для перорального введения,
снижант токсичность препарата.
 Микрокапсулы
образуются в результате
процесса коацервации полиэлектролита и
отвердителя в процессе замораживания
 Микрокапсулы
обеспечивают стабильность
антигена, позволяют создавать препараты,
содержащие несколько антигенов, снизить
число вакцинаций, получить препараты для
перорального применения.
 Вариантом
способа создания вакцинного
препарата на твердом носителе является
разработка технологии изготовления
вирусной вакцины орального применения
против ньюкаслской болезни птиц в виде
гранул.
В
основе иммуностимулирующего действия
полиэлектролитов лежит их способность
активизировать клетки иммунной системы
– лимфоциты и фагоциты – вследствие
взаимодействия полиэлектролита с
клеточной мембраной
 Практическое применение нашел
полиоксидоний, на основе которого
создана вакцина Гриппол, содержащая
гемагглютинин и нейраминидазу трех
вирусов гриппа: А (H1N1 и H3N2) и В.
 по
требованиям ВОЗ при производстве
вирусных вакцин запрещено
использовать антибиотики, обладающие
выраженными сенсибилизирующими или
токсическими свойствами (пенициллин и
его производные, стрептомицин,
тетрациклины).
 ВОЗ
рекомендует применять канамицин
или мономицин
 Вакцина
должна создавать надежный
иммунитет, но случаются прорывы
иммунитета
 Применение вакцины не препятствует
инфицированию патогенными штаммами
 В одной и той же клетке могут
параллельно реплицироваться как
вакцинный, так и «полевой» штамм
вируса











Цикл размножения состоит из нескольких стадий:
- прикрепление (адсорбция) вируса на поверхности клетки;
- проникновение вируса в клетку;
- освобождение вируса от белковой оболочки (раздевание),
что приводит к эклипсу, при котором происходит
транскрипция специфических последовательностей
родительской вирусной ДНК или РНК с образованием мРНК;
- трансляция мРНК и появление кодируемых вирусом
ферментов и других ранних вирусных белков;
- репликация вирусной ДНК или РНК;
- дальнейшая транскрипция дочерней и родительской
нуклеиновой кислоты;
- трансляция образующихся при этом поздних мРНК и
накопление структурных и других кодируемых
вирусом белков, часть которых обладает регуляторными
функциями;
- самосборка вирусных белков вокруг генома вируса;
- выход новых вирионов из клетки.
А - вирион без оболочки;
В - вирион с оболочкой
1 ряд – реальные потери
2 ряд – предполагаемые потери среди невакцинированной птиц
сложный многоступенчатый процесс.
 Сначала в лабораторных условиях готовится
посевной материал (как клеточный, так и
вирусный).
 Затем следуют стадии основного процесса:
- последовательное накопление клеточного
материала (культивирование клеток),
- ресуспендирование клеток в свежей
питательной среде и
- культивирование вирусов.

 На
-
-
заключительных стадиях
приготовления препарата проводят:
очистку,
концентрирование,
инактивацию и
сушку (при необходимости),
расфасовку,
упаковку и
контроль.
В
течение всего процесса производства
проводятся разнообразные мероприятия,
обеспечивающие сохранение чистоты
культуры на всех этапах
технологического цикла - от хранения
пробирки с эталонным штаммом в
лаборатории и промышленного
выращивания вирусов в биореакторах,
до получения готовой лекарственной
формы биопрепарата.
 Прежде
чем приступить к производству
какого-либо вида вирусной вакцины,
необходимо получить определенное
количество вирусного материала.
 При
использовании целостных организмов
для накопления вирусов возникают
немалые сложности. Каждый живой
организм обладает спектром
индивидуальных свойств, зависящих от
самых различных причин, но все они
влияют на успех заражения.
 Выбор
животного того или иного вида и
возраста зависит от применяемого вида
вируса.
 Наиболее широко используют белых
мышей (альбиносов серой домашней
мыши), крыс (альбиносов серой крысы),
хомяков (сирийский золотой хомяк),
морских свинок, кроликов.
 Не так часто используют хорьков, собак,
обезьян и кур.
 При
использовании в качестве живой
системы куриных эмбрионов применяют
различные пути их заражения вирусом: в
полость амниона, хорионаллантоисную
оболочку, полость аллантоиса, желточный
мешок.
 Но куриные эмбрионы не совсем
универсальны - есть вирусы, которые в них
не размножаются.
В
современном производстве вирусных
вакцин культуры клеток являются
основной системой для репродукции
вирусов. Это идеальная, относительно
однородная популяция клеток, которая при
использовании разных возможностей
размножения антигена представляет
наилучшие предпосылки для
количественно неограниченного,
качественного, высокоценного,
поддающегося стандартизации и
достаточно надежно контролируемого
производства вакцин.
В
настоящее время вакцины, получаемые в
культурах клеток, отличаются большим
разнообразием: в больших количествах
выпускаются вакцины против ящура,
ньюкаслской болезни, болезни Марека,
бешенства, чумы собак, гепатита собак,
чумы крупного рогатого скота, оспы овец,
птиц, энцефалитов лошадей и т.п.
После накопления вирусов в
клетках, следующим этапом в
производстве вакцин является
индикация, идентификация и
определение титра
вирусного материала.
 Прямое
непосредственное выявление
вирусов возможно лишь с помощью
электронного микроскопа при условии, что
в пробе содержится не менее 10 - 100 тыс.
вирионов в 1 мл. Этот метод применяют на
стадии контроля приготовления матровых
расплодок вируса.
 При
заражении лабораторных животных,
куриных эмбрионов наличие вируса
обычно определяют по специфическим
патологическим изменениям, которые он
вызывает внутри организма.
 Репродукция
вируса в клеточных
культурах может сопровождаться
цитопатогенным действием вируса на
клетки культуры.
 Метод подсчета локальных повреждений
(бляшек, или негативных колоний)
используется в основном для титрования
вирусов, вызывающих деструкцию
(лизис) клеток.
 Но
чаще о вирусах в материале судят
опосредовано, через взаимодействие
вирусов с антителами, эритроцитами путем проведения реакций
гемагглютинации и серологических
реакций различных модификаций.
 Индикацию и идентификацию вирусов
проводят также методом полимеразной
цепной реакции
 После
накопления, индикации,
идентификации и титрования вирусов
проводят выделение и очистку
вирусного материала от балластных
примесей, ибо в каком бы субстрате его
ни накапливали, на одну вирусную
частицу приходятся миллионы никак с
ней не связанных, а относящихся к
среде, где этот вирус репродуцировался.
 1.
Осветление клеточного лизата.
 2. Концентрирование и очистка вирусной
суспензии.
 3. Полная очистка концентрированной
суспензии.
 а)
Седиментация.
 б)
Центрифугирование.
 в)
Фильтрация.
 а)
Методы преципитации
 б)
Адсорбция-элюирование
 в)
Ультрафильтрация
 а)
Очистка центрифугированием в
градиенте плотности
 б)
Аффинная хроматография вирусов
 в)
Хроматография вирусов по размерам
 1.
Наличие одного компонента на
седиментационной диаграмме
 2. Наличие одного компонента при
исследовании препаратов методом
аналитического электрофореза
 3. При исследовании в электронном
микроскопе репарат должен содержать
только вирусные частицы при полном
отсутствии неспецифических агрегатов
балластных веществ.
 4.
Исследование вирусного препарата
методом центрифугирования в
градиенте плотности позволяет
обнаружить присутствие примесей,
отличающихся по величине плавучей
плотности от вирусного нуклеопротеида.
Таким образом было показано, что
препараты ряда вирусов негомогенны по
плотности (состоят из нескольких
компонентов, различающихся по
содержанию нуклеиновой кислоты).
 5.
Контроль степени чистоты вирусного
препарата с помощью иммунохимических
или серологических методов. Для этих
целей используется антисыворотка к
выделенному вирусу и антисыворотка к
антигенам здорового хозяина.
-
электронно-микроскопические
 - иммунологические
 - биологические
 - определение концентрации вируса по
сухому весу
 - определение содержания вирусной
нуклеиновой кислоты
 - спектрофотометрический метод
Последовательность
следующих
этапов
при
производстве вакцин будет
зависеть от того, какой тип
вакцины производят.
 Проблема
получения живых вакцин
решается довольно успешно. Однако при
их производстве требуется надежный
контроль биологических систем,
используемых для репродукции, а также
генетический контроль и использование
методов поддержания живых вакцин в
первозданном виде.
В
принципе, выделенный, очищенный,
сконцентрированный и проверенный
аттенуированный вирусный материал это и есть вакцина.
 Далее его консервируют в жидком
состоянии (обычно применяют ДМСО или
50 % глицерин) или методом лиофильного
высушивания, расфасовывают во флаконы
или ампулы.
Применяют:
 формальдегид, глицидальдегид - для
инактивации вирусов ящура, энцефалитов
лошадей, чумы собак, трансмиссивных
гастроэнтеритов;
 ацетилэтиленимин, этиленимин - в
основном для инактивации вируса ящура;
 пропиолактон - для инактивации вирусов
ящура, болезни Ньюкасла, бешенства, чумы
свиней;
 гидроксиламин - для вирусов гриппа
свиней, чумы птиц;





кристалвиолет, ионы аммония чаще применяют в
комбинации с другими инактивирующими
агентами;
ультрафиолетовое облучение (как
инактивирующий агент) использовалось в
сочетании с пропиолактоном для получения
вакцин на основе вирусов ящура и болезни
Ньюкасла;
рентгеновское и гамма облучение - для
инактивации вируса гриппа;
тепловое воздействие на вирусы в целях
уничтожения их инфек-ционности при сохранении
иммуногенности крайне ограничено (в основном
температуру учитывают как критический фактор
при инактивации вирусов с применением
химических средств).

Основное различие между вакцинами из
живых атгенуированных и инактивированых
вирусов заключается в количестве вирусного
материала, входящего в иммунизирующую
дозу. Инактивированные вакцины должны
содержать в дозе достаточное количество
вирусного материала, чтобы стимулировать
иммунную систему организма. Лишь при
таком условии реципиент сможет получить
защиту от возможного инфицирования.
Главная проблема технологии производства
инактивированных вакцин и состоит в том,
чтобы в дозу было включено достаточное
количество вирусного антигена.
 Термин
«рецептура» подразумевает
исчерпывающее количественное и
качественное описание химических
компонентов, составляющих конечный
продукт. В рецептуре должны указываться
стабилизаторы, состав буфера, все
дополнительные электролиты, а также
информация по вопросам приготовления
соответствующих композиций
непосредственно перед их хранением и
распределением между потребителями.
Среда, в которой
суспендируют вирусную
культуру перед
замораживаниемвысушиванием, должна
обладать определенными
свойствами
1. Действовать как компонент-наполнитель,
обладающий способностью удерживать
продукт внутри флакона и предотвращать его
улетучивание с сублимируемыми водяными
парами.
 2. Быть инертной по отношению к продукту,
не вызывать потери биологической
активность материала как в жидком, так и в
высушенном состоянии.
 3. Не обладать вредными для организма
свойствами.
 4. Способствовать высокому уровню
сохранения активности продукта в процессе
хранения.

 1.
На чистоту (отсутствие каких-либо
контаминантов).
 2. На безвредность.
 3. На реактогенность (то есть иммунную и
специфичную активность).
 4. На эпизоотическую безопасность и
эффективность.
 5. Стабильность при хранении.
Приготовление вирусных диагностикумов
имеет свои особенности.
 Диагностические антигены готовят, используя
органы зараженных животных, то есть в таком
случае речь идет об органных антигенах.
 Если такие антигены готовят с использованием
культур клеток, то получают культуральные
антигены.
 Основным их недостатком является
содержание в своем составе балластных
белков, в том числе белков других вирусов,
которые могут быть в исходном сырье. Это
влияет на специфичность и активность
антигенов.
