Физиологические исследования

90
ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2013. Вып. 4
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Физиологические исследования
УДК 577.112.7
А.В. Сарских, О.С. Костарева, В.А. Балобанов, С.В. Тищенко
ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ НА ФОРМИРОВАНИЕ
И СТАБИЛЬНОСТЬ КОМПЛЕКСОВ РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1 С РНК
На формирование и стабильность РНК-белковых комплексов в разной степени влияют водородные связи, электростатические взаимодействия и силы Ван-дер-Ваальса. В рамках исследования влияния электростатических
взаимодействий на формирование и стабильность комплексов рибосомного белка L1 со специфическим фрагментом мРНК был проведён кинетический анализ L1-РНК комплексов при различных значениях рН и ионной
силы.
Ключевые слова: рибосомный белок L1, РНК-белковые взаимодействия, кинетический анализ, поверхностный
плазмонный резонанс, электростатические взаимодействия.
Специфические РНК-белковые взаимодействия важны для многих клеточных процессов, таких
как сборка и функционирование сплайсосом, рибосом, регуляция экспрессии генов и др. Несмотря на
то, что к настоящему времени известно множество пространственных структур РНК-белковых комплексов, поэтапный механизм РНК-белкового взаимодействия остается не ясным.
Рибосомный белок L1 является компонентом L1-выступа рибосомы, а также регулятором
трансляции своего оперона [1]. Известны пространственные структуры комплексов бактериального
белка L1 из Thermus thermophilus (TthL1) со специфическими фрагментами рРНК [2] и мРНК [3; 4].
TthL1-мРНК комплекс (рис.1) стабилизирован 32 водородными связями, стэкинг взаимодействиями
между F37 и H172 с сахарофосфатным остовом мРНК, и приблизительно 170 Ван-дер-Ваальсовыми
контактами [3]. Известно, что энергия водородных связей превышает на 1,0-1,5 порядка энергию других нековалентных взаимодействий, что свидетельствует об их важности для стабилизации РНКбелковых комплексов. Основную роль в TthL1-РНК взаимодействиях играют пять консервативных
недоступных для растворителя водородных связей. Структурно-кинетический анализ взаимодействия
мутантных форм белка L1 со специфическим фрагментом рРНК показал, что замены консервативных
аминокислотных остатков, образующих недоступные для растворителя водородные связи, приводят к
уменьшению времени жизни комплексов на несколько порядков, однако скорость их образования
меняется слабо [5] .
Рис. 1. Модель структуры комплекса L1-мРНК [3]
Мы провели кинетический анализ взаимодействия TthL1 со специфическим фрагментом мРНК
как в условиях с различными значениями рН (от 6,5 до 8,5), так и при увеличении ионной силы (от
150 мМ до 1М NaCl). Для изучения кинетики процесса взаимодействия был использован метод по-
Влияние электростатических взаимодействий на формирование…
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
91
2013. Вып. 4
верхностного плазмонного резонанса (ППР) [6], который позволяет исследовать взаимодействие молекул в реальном времени. Было показано, что изменение значения рН в равной степени (примерно в
5 раз) влияет как на скорость формирования комплексов, так и на их стабильность, а увеличение ионной силы значительно (более чем на 3 порядка) понижает скорость ассоциации молекул, стабильность комплексов при этом уменьшается в 5 раз.
Материалы и методы исследований
Выделение белка TthL1. Ген белка TthL1 экспрессировали в клетках Escherichia coli BL21(DE3) с
использованием системы Штудиера [7]. Выделение TthL1 проводили так же, как в работе [8].
ППР эксперименты. Взаимодействие между TthL1 и специфическим фрагментом мРНК было
исследовано методом ППР с использованием системы ProteOn XPR36 (Bio-Rad, USA). Фрагмент
мРНК Methanococcus vannielli длиной 48 нуклеотидов [4] был получен методом транскрипции in
vitro. Транскрипцию проводили с использованием Т7 РНК-полимеразы с лианеризованного вектора
pUC18, содержащего вставку, кодирующую фрагмент мРНК. Затем фрагмент РНК очищали от побочных продуктов реакции транскрипции, а также от компонентов транскрипционной смеси методом
электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с последующей хроматографией на ДЕАЕ-сефарозе. Для введения биотина в молекулу РНК присоединяли биотинилированный
олигонуклеотид (5’P- GCGCAGCGAG-биотин 3’) к гидроксилу 3’-конца фрагмента РНК с использованием РНК-лигазы. Модифицированные фрагменты мРНК очищали с помощью электрофореза в
полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Модифицированный биотином фрагмент РНК
впрыскивали в один из каналов ProteOn NLS сенсорного чипа с иммобилизованным авидином [5].
Второй канал чипа оставляли для сравнения неспецифической сорбции белков с авидином. Раствор
белка пяти различных концентраций: 50 нМ, 25 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 2,5 нМ (фаза ассоциации), пропускали по каналам в режиме вычета ППР сигнала свободного канала из сигнала модифицированного
канала. ППР сигнал выражается в резонансных единицах ответа (РЕ) и прямо пропорционален количеству молекул белка, связанных с РНК. Затем проводили впрыск буфера (фаза диссоциации), содержащего 5 мM MgCl2, 50 мM Tрис–HCl, NaCl (концентрацию варьировали от 150 мМ до 1М) и 0,005%
(v/v) Tween-20, при изменении значения pH от 6,5 до 8,5. В том случае, если мы меняли значение рН,
NaCl присутствовал в буфере в концентрации 350 мМ, а в тех экспериментах, где менялась ионная
сила, значение рН было 7,5.
Результаты измерений были обработаны с помощью программы BIAevaluation, в качестве теоретической модели использовали простую бимолекулярную модель (1:1).
Результаты и их обсуждение
Многие РНК-связывающие белки положительно заряжены, предполагается, что важную роль в
образовании и стабильности комплексов с РНК играют электростатические взаимодействия между
аминокислотными остатками лизина, гистидина и аргинина и сахарофосфатным остовом РНК [9].
Для изучения вклада электростатических взаимодействий в стабильность и формирование комплекса
L1-мРНК был проведен кинетический анализ РНК-белковых взаимодействий, варьируя концентрацию соли и значения рН.
Рис. 2. Сенсограммы взаимодействия TthL1 со специфическим фрагментом мРНК при различных
концентрациях NaCl
92
А.В. Сарских, О.С. Костарева, В.А. Балобанов, С.В. Тищенко
2013. Вып. 4
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Влияние ионной силы. ППР эксперименты (рис. 2) показали, что при изменении концентрации
NaCl от 150 до 1000 мМ константа скорости ассоциации уменьшается в 206 раз, а константа скорости
диссоциации увеличивается всего в 5 раз (табл. 1). Аналогичное влияние изменения концентрации
соли на константы скорости ассоциации РНК-белковых комплексов было описано в работах [6; 10].
Таблица 1
Кинетический анализ взаимодействия белка TthL1 со специфическим фрагментом мРНК
при различной концентрации NaCl в растворе
Концентрация
NaCl
в растворе, мМ
150
250
350
430
500
700
1000
Константа скорости
ассоциации ka
(1х104 1/Ms)
16,5
2,8
1,2
0,6
0,5
0,2
0,08
Константа скорости
диссоциации kd
(1х10-4 1/s)
2,0
3,0
4,1
5,2
6,7
7,8
10,1
Равновесная константа
диссоциации KD (нМ)
1,2
10,7
33,2
85,8
147,0
453,0
1320,0
Рибосомный белок TthL1, как большинство других рибосомных белков, имеет изоэлектрическую точку в щелочной области рН. Хотя изменение ионной силы влияет на распределение зарядов и
на белке, и на РНК, однако в большей степени влияние оказывается на заряд РНК. Молекула РНК
представляет собой полианион, высокий отрицательный заряд которого приводит к появлению окружения из связанных ионов Na+. Чем выше ионная сила раствора, тем больше ионное окружение молекулы РНК. Взаимодействие белка с молекулой РНК приводит к вытеснению этих катионов в окружающий раствор. Таким образом, увеличение концентрации соли препятствует связыванию белка,
значительно уменьшая скорость ассоциации [11] как при специфическом, так и неспецифическом
взаимодействии. Для изучения влияния рН раствора на формирование и стабильность комплекса белка L1-мРНК мы варьировали значения рН от 6,5 до 8,5. Результаты кинетических экспериментов были проанализированы, и определены константы скоростей ассоциации и диссоциации комплексов, а
также равновесная константа их диссоциации. Данные представлены в табл. 2. Показано, что изменение значения рН влияет в равной степени как на константу ассоциации, так и на константу диссоциации. Данное влияние может быть связано с изменением заряда боковых групп аминокислотных остатков, расположенных на участке взаимодействия с РНК. Так, при изменении значения рН могут
протонироваться или депротонироваться боковые группы следующих аминокислотных остатков: K5,
R6, Y7, K36, E42, H44, D166, K167, H172. Однако в исследованном диапазоне рН от 6,5 до 8,5 могут
изменять заряд только боковые группы аминокислотных остатков гистидина (рис. 3) (Н44 и Н172).
При сравнении изменения заряда гистидина и констант скорости ассоциации и диссоциации видно,
что они изменяются синхронно. При рН 8,0 и 8,5 заряд гистидина практически не изменяется, так же
как не меняются значения констант скоростей ассоциации и диссоциации комплекса белка L1 с мРНК
(рис. 4). На основании полученных результатов можно заключить, что основной причиной изменения
скорости образования и стабильности комплекса в данном диапазоне значений рН является изменение зарядов аминокислотных остатков Н44 и Н172.
В работе Дж.Д. Баллина и соавторов [12] было показано, что изменение заряда боковой группы
аминокислотного остатка гистидина в составе короткого пептида не влияет на неспецифические взаимодействия между гистидином и сахарофосфатным остовом РНК. Таким образом, разницу в кинетических константах, которая наблюдается при специфическом связывании молекул TthL1 и фрагмента
мРНК можно объяснить дополнительными нековалентными взаимодействиями, стабилизирующими
протонированую форму гистидина. В структуре комплекса L1-мРНК данные аминокислотные остатки
располагаются на молекуле белка рядом и входят в малый желобок молекулы мРНК, и, контактируя с
основаниями нуклеотидов A31, A32, U65, C66 (нумерация в соответствии с [4]), участвуют в специфическом узнавании РНК. Депротонирование боковых групп аминокислотных остатков Н44 и Н172 (при
повышении значения рН), вероятно, приводит к изменениям в электростатических взаимодействиях
между аминокислотными остатками гистидина и нуклеотидами мРНК, что приводит к увеличению
времени ассоциации комплекса L1 и мРНК, а также к уменьшению его стабильности.
Влияние электростатических взаимодействий на формирование…
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
93
2013. Вып. 4
Таблица 2
Кинетический анализ взаимодействия белка TthL1 со специфическим фрагментом мРНК
при различных значениях рН
pH раствора
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
Константа скорости
ассоциации ka
(1х104 1/Ms)
Константа скорости диссоциации kd
(1х10-4 1/s)
Равновесная константа
диссоциации KD (нМ)
0,9
0,7
0,4
0,2
0,2
2,1
3,7
7,0
13,3
13,2
24,0
54,0
162,0
580,0
599,0
Рис. 3. Кривые титрования аминокислотных остатков, находящихся на поверхности контакта белка
TthL1 и мРНК. Отмечен диапазон рН, в котором были проведены кинетические исследования
Рис. 4. Зависимость константы скорости ассоциации (А) и константы скорости диссоциации (Б)
TthL1-мРНК комплекса от заряда боковых групп аминокислотных остатков гистидина
94
А.В. Сарских, О.С. Костарева, В.А. Балобанов, С.В. Тищенко
2013. Вып. 4
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Выводы
1. Электростатические взаимодействия играют значительную роль на первом этапе формирования L1-РНК комплекса.
2. Изменение заряда боковых групп гистидинов Н44 и Н172 уменьшает не только скорость ассоциации комплекса, но и его стабильность. Вероятно, такой эффект является следствием изменения
специфических нековалентных взаимодействий между Н44 и Н172 и нуклеотидами A31, A32, U65,
C66 мРНК.
Благодарности
Авторы выражают благодарность за предоставленную возможность провести кинетические эксперименты на приборе ProteOn XPR36 и помощь в работе С.А. Мошковскому и А.М. Сычевой (ЦКП
ФГБУ РАМН «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича»).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gourse R.L., de Boer H.A., Nomura M. DNA determinants of rRNA synthesis in E. coli: growth rate dependent
regulation, feedback inhibition, upstream activation, antitermination // Cell. 1986. Vol. 17. P. 197-205.
2. Tishchenko S., Gabdulkhakov A., Nevskaya N., Sarskikh A., Kostareva O., Nikonova E., Sycheva A., Moshkovskii
S., Garber M., Nikonov S. High-resolution crystal structure of the isolated ribosomal L1 stalk // Acta Crystallogr D
Biol Crystallogr. 2012. Vol. 68. P. 1051-1057.
3. Nevskaya N., Tishchenko S., Volchkov S., Kljashtorny V., Nikonova E., Nikonov O., Nikulin A., Köhrer C., Piendl
W., Zimmermann R., Stockley P., Garber M., Nikonov S. New insights into the interaction of ribosomal protein L1
with RNA // J. Mol.Biol. 2006. Vol. 355. P. 747-759.
4. Tishchenko S., Nikonova E., Nikulin A., Nevskaya N., Volchkov S., Piendl W., Garber M., Nikonov S. Structure of
the ribosomal protein L1-mRNA complex at 2.1 A resolution: common features of crystal packing of L1-RNA complexes // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006. Vol. 62. P. 1545-1554.
5. Kostareva O., Tishchenko S., Nikonova E., Kljashtorny V., Nevskaya N., Nikulin A., Sycheva A., Moshkovskii S.,
Piendl W., Garber M., Nikonov S. Disruption of shape complementarity in the ribosomal protein L1-RNA contact
region does not hinder specific recognition of the RNA target site // J Mol Recognit. 2011. Vol. 24. P. 524-532.
6. Katsamba P.S., Bayramyan M., Haworth I.S., Myszka D.G., Laird-Offringa I.A. Complex role of the beta 2-beta 3
loop in the interaction of U1A with U1 hairpin II RNA // J Biol Chem. 2002. Vol. 277(36). P. 33267-33274.
7. Studier F., Rosenberg A., Dunn J., Dubendorff J. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes //
J. Methods Enzimol. 1990. Vol. 185. P. 60-89.
8. Nikonov S., Nevskaya N., Eliseikina I., Fomenkova N., Nikulin A., Ossina N., Garber M., Jinsson B., Briand C., AlKaradaghi S., Svensson A., Evarsson A., Liljas A. Crystal structure of the RNA binding ribosomal protein L1 from
Thermus thermophilus // EMBO J. 1996. Vol. 15(6). P. 1350-1356.
9. Ahmad S., Sarai A. Analysis of electric moments of RNA-binding proteins: implications for mechanism and prediction // BMC Struct Biol. 2011. Vol. 11. P. 8.
10. Auweter S.D., Oberstrass F.C., Allain F.H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for
recognition? // Nucleic Acids Res. 2006. Vol. 34(17). P. 4943-495.
11. GuhaThakurta D., Draper D.E.. Contributions of basic residues to ribosomal protein L11 recognition of RNA //
J. Mol Biol. 2000. Vol. 295(3). P. 569-80.
12. Ballin J.D., Prevas J.P., Ross C.R., Toth E.A., Wilson G.M., Record M.T. Jr. Contributions of the histidine side
chain and the N-terminal alpha-amino group to the binding thermodynamics of oligopeptides to nucleic acids as a
function of pH // Biochemistry. 2010. Vol. 49(9). P. 2018-30.
Поступила в редакцию 03.09.13
Влияние электростатических взаимодействий на формирование…
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
95
2013. Вып. 4
A.V. Sarskikh, O.S. Kostareva, V.A. Balobanov, S.V. Tishchenko
Influence of electrostatic interactions on assembling and stability of L1-mRNA complex
Association and stability of RNA-protein complexes depend on H-bonds, electrostatic interactions and Van der Waals
bonds. The influence of electrostatic interactions on formation and stability of complex of ribosomal protein L1 with
specific fragment of mRNA was tested with using kinetic experiments at different pH and ionic strength.
Keywords: L1 protein, RNA-protein interaction, kinetic analysis, surface plasmon resonance (SPR), electrostatic interactions.
Сарских Алена Витальевна, аспирант
E-mail: carckih@rambler.ru
Костарева Ольга Сергеевна,
кандидат биологических наук
E-mail: zelle@rambler.ru
Балобанов Виталий Александрович,
кандидат физико-математических наук
E-mail: uralm62@rambler.ru
Тищенко Светлана Викторовна,
кандидат биологических наук
E-mail: sveta@vega.protres.ru
Sarskikh A.V. postgraduate student
E-mail: carckih@rambler.ru
Kostareva O.S.,
candidate of biology
E-mail: zelle@rambler.ru
Balobanov V.A.,
candidate of physics and mathematics
E-mail: uralm62@rambler.ru
Tischenko S.V.,
candidate of biology
E-mail: sveta@vega.protres.ru
ФГБУ РАН «Институт белка»
142290, Россия, г. Пущино, ул. Институтская, 4
Institute of Protein Research
142290, Russia, Puschino, Institutskaya st., 4