Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук
реклама
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук на правах рукописи Лопатина Анна Васильевна Оценка разнообразия микроорганизмов поверхностного снега прибрежных зон Восточной Антарктиды Специальность 03.01.07 молекулярная генетика Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., проф. Северинов Константин Викторович Москва – 2015 2 Оглавление Список сокращений и условных обозначений ......................................................... 4 Введение ....................................................................................................................... 6 Актуальность работы ............................................................................................... 6 Цели и задачи исследования ................................................................................... 7 Научная новизна и практическая значимость работы .......................................... 8 Личный вклад соискателя........................................................................................ 9 Положения, выносимые на защиту ........................................................................ 9 Степень достоверности и апробация результатов .............................................. 10 Обзор литературы ...................................................................................................... 11 Методы исследования разнообразия микроорганизмов..................................... 11 Методы, основанные на сравнении последовательностей фрагментов ДНК11 Генотипирование штаммов бактерий с помощью CRISPR локусов ............. 17 Методы «омика» ................................................................................................. 19 Разнообразие микроорганизмов в холодных местах обитания ......................... 22 Микроорганизмы поверхностного снега и ледниковой толщи ...................... 22 Микроорганизмы в атмосфере .......................................................................... 27 Микроорганизмы полярных океанических вод и морского льда .................. 29 Микроорганизмы полярных озер ...................................................................... 31 Микроорганизмы полярных почв ..................................................................... 35 Материалы и методы ................................................................................................. 38 Характеристика районов исследования ............................................................... 38 Методика отбора проб ........................................................................................... 40 Первичная обработка проб в условиях лаборатории судна ............................... 42 ДНК экстракция ..................................................................................................... 42 РНК экстракция ...................................................................................................... 43 Реакция обратной транскрипции .......................................................................... 43 ПЦР .......................................................................................................................... 43 Праймеры для ПЦР ................................................................................................ 44 Электрофорез в агарозном геле ............................................................................ 45 Очистка фрагментов ДНК из агарозного геля ..................................................... 45 Конструирование библиотеки клонов гена 16S рРНК ....................................... 45 Приготовление химически компетентных клеток E. coli ................................... 45 Трансформация компетентных клеток E. coli ..................................................... 46 Питательные среды ................................................................................................ 46 Подсчет численности микроорганизмов.............................................................. 47 Измерение включения радиоактивно меченных тимидина и лейцина в клетки ................................................................................................. 48 3 Секвенирование ДНК фрагментов ....................................................................... 49 Предварительная обработка прочтений ............................................................... 49 Филогенетический анализ ..................................................................................... 50 Функциональный анализ ....................................................................................... 51 Внешние источники метагеномных данных........................................................ 51 Поиск последовательностей CRISPR-Cas ............................................................ 51 Анализ последовательностей спейсеров в CRISPR локусах.............................. 52 Статистический анализ .......................................................................................... 53 Результаты и обсуждение ......................................................................................... 55 Часть 1. Изучение разнообразия бактерий микробиологическими методами и методом молекулярного клонирования ............................................................... 55 Микробиологический анализ образцов талого снега в районе станций Ленинградская и Дружная ................................................................................. 55 Анализ таксономического состава микробного сообщества поверхностного снега в районе станций Ленинградская и Дружная......................................... 58 Анализ таксономического состава активно транскрибирующих бактерий .. 63 Определение скорости включения радиоактивномеченных тимидина и лейцина ................................................................................................................ 68 Часть 2. Изучение разнообразия антарктических микроорганизмов и особенностей их метаболизма анализом метагеномного секвенирования ....... 70 Анализ библиотек фрагментов генов 16S рРНК ............................................. 70 Метагеномный анализ сообществ антарктического снега ............................. 76 Анализ функциональных категорий генов в метагеномах поверхностного снега Антарктиды ............................................................................................... 80 Часть 3. Анализ разнообразия спейсеров в CRISPR локусах психрофильных антарктических бактерий Flavobacterium psychrophilum ................................... 86 Анализ типов CRISPR-Cas последовательностей в метагеномax антарктических микробных сообществ ............................................................ 86 Анализ разнообразия спейсеров F. psychrophilum, в трех различных областях Антарктики .......................................................................................... 88 Сравнительный анализ кластеров спейсеров антарктических F. psychrophilum с последовательностями в общедоступных базах данных ..... 93 Заключение ................................................................................................................. 96 Выводы ....................................................................................................................... 97 Список использованной литературы ....................................................................... 98 Приложение.………………………………………………………………………………….117 Благодарности .......................................................................................................... 126 4 Список сокращений и условных обозначений в.д. – восточной долготы; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; др. - другой; кл/мл – клеток в миллилитре; к.о.е. – колоне образующие единицы; мин. - минута; мл – миллилитр; об./мин. - обороты в минуту; ОРС - открытая рамка считывания; ОТЕ - операционная таксономическая единица; п.о. - пары оснований; ПЦР - полимеразная цепная реакция; РАЭ – Российская Антарктическая Экспедиция; РНК - рибонуклеиновая кислота; рРНК - рибосомальная РНК; с - секунда; тыс. - тысяча; т.е. - то есть; ТХУ – трихлоруксусная кислота; ю.ш. – южной широты; BLAST - Basic Local Alignment Search Tool, простое средство поиска локальных соответствий; COG - Clusters of Orthologous Groups, Кластеры ортологичных групп; DGGE - denaturing gradient gel electrophoresis, денатурирующий градиентный гель- электрофорез; 5 KEGG - Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Киотская энциклопедия генов и геномов; LB – среда Луриа-Бертрани; mQ - деионизованная вода; RDP - Ribosomal Database Project, проект “Рибосомальная База”; R2A – Reasoner's 2A agar (агар Ризонера). 6 Введение Актуальность работы Полярные области – это важные климатообразующие регионы планеты и источники полезных ископаемых, кроме того, они наиболее чувствительны к изменению климата [1]; интерес к полярным областям со стороны научного и экономического сообщества неуклонно растет [2]. В 2010 году была принята государственная долгосрочная программа «Стратегия развития деятельности Российской Федерации в Антарктике на период до 2020 года и на более отдаленную перспективу», поэтому развитие комплексных научных исследований в Антарктике и проведение мониторинга состояния компонентов природной среды является актуальной для нашей страны задачей [3]. Снежный покров – важнейшая климатическая и экологическая система нашей планеты. Снегами покрыто около 35% поверхности Земли [4]. Снежная экосистема находится в тесном взаимодействии с атмосферой, почвами, морской и талой водой, т.е., оказывает влияние на биосферу в целом [4]. Большую роль в этих глобальных процессах играет микробиологическая составляющая снежного покрова. Численность бактерий на поверхности снегов оценивается от 102 до 106 клеток на миллилитр (кл/мл) талой воды [5-7]. Микробиологические исследования снегов Арктики, Антарктики и высокогорных ледников показали присутствие в них жизнеспособных микроорганизмов, многие из которых являются облигатными психрофилами [4]. Эти данные описывают лишь минорную часть биологического разнообразия микроорганизмов поверхностных снегов, т.к. согласно современным данным, менее 1% культивированию [8]. всех бактерий, присутствующих в образце, поддается 7 Молекулярно-генетическими методами на поверхности снегов Арктики [9-11] и высокогорных ледников [12, 13] были обнаружены представители разнообразных филогенетически групп Alphaproteobacteria, микроорганизмов, Gammaproteobacteria, Bacilli например и Betaproteobacteria, Actinobacteria. Однако исследования микроорганизмов поверхностных снегов Антарктиды с помощью молекулярно-генетических методов начались сравнительно недавно и пока весьма немногочисленны. Всего два исследования описывают разнообразие бактерий поверхностных снегов на куполе Антарктиды в районе двух исследовательских станций США – Конкордия и Амундсен-Скотт [5, 14], однако данные о численности, составе и функциональных особенностях микроорганизмов на поверхности снега остальных частей территории Антарктиды, в том числе ее прибрежных районов, отсутствуют. Настоящая диссертационная работа посвящена изучению разнообразия микроорганизмов поверхностного снега прибрежных зон Восточной Антарктиды, а также попытке описания их функциональных особенностей и адаптационных стратегий. Согласно плану, принятому в 2014 г. на «Совещании по определению главных научных проблем исследований Антарктики и Южного океана на период до 2035 г», изучение живых организмов на территории Антарктиды является одним из шести приоритетных направлений полярных исследований, поэтому результаты, полученные нами в ходе настоящей работы, могут стать основой для дальнейших исследований и мониторинга микроорганизмов поверхностных снегов Антарктиды [15]. Цели и задачи исследования Целью настоящей работы было охарактеризовать сообщества микроорганизмов поверхностного снега прибрежных зон Антарктиды для получения знаний о структуре, динамике и, возможно, функционировании этих сообществ. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 8 1. Сбор образцов поверхностного снега в удалённых друг от друга областях Восточной Антарктиды, и выделение препаратов ДНК сообществ микроорганизмов снега. 2. Оценка распространения, численности и естественного видового разнообразия микроорганизмов в образцах поверхностного снега с применением молекулярно-генетических и микробиологических методов. 3. Идентификация функциональных категорий генов, характерных для сообществ микроорганизмов поверхностного снега Антарктиды. 4. Исследование штаммов Flavobacterium psychrophilum в образцах снега, собранных в удалённых друг от друга областях Антарктиды, с помощью генотипирования CRISPR локусов. Научная новизна и практическая значимость работы Главная научная ценность работы заключается в том, что в ней впервые методами молекулярной биологии проведен комплексный анализ микробного сообщества поверхностного снега прибрежных районов Антарктиды. Показано, что таксономический состав бактерий в образцах антарктического снега заметно отличается в удаленных друг от друга областях Антарктиды, и меняется в течение года. Впервые проведен функциональный анализ сообществ микроорганизмов антарктического снега, выявлена повышенная представленность функциональных групп генов, продукты которых вовлечены в адаптации к окислительному стрессу и устойчивости к тяжелым металлам. Наконец, впервые получены данные о разнообразии спейсеров CRISPR локусов психрофильных бактерий Flavobacterium psychrophilum, обнаруженных на поверхности снегов Антарктиды. Впервые разработана и апробирована новая методика оценки разнообразия штаммов микроорганизмов в природных образцах с помощью сравнения наборов амплифицированных спейсеров CRISPR кассет бактерий. Уникальный опыт и 9 практические навыки, полученные в ходе выполнения настоящей работы, могут быть использованы в планировании и осуществлении будущих исследований в Антарктике. Личный вклад соискателя Автором самостоятельно выполнен основной объем исследований. В ходе двух сезонных экспедиций в Антарктиду отработана методика асептического отбора образцов снега и их первичная обработка в условиях лаборатории НИС «Ак. Федоров». Показана метаболическая активность снежных микроорганизмов in situ. Получены библиотеки последовательностей ДНК и рибосомной РНК сообществ микроорганизмов, проведен биоинформатический анализ отсеквенированных последовательностей, выявлены функциональные категории генов, статистически значимо перепредставленные в сообществах микроорганизмов поверхностного снега Антарктиды. Изучено разнообразие спейсеров CRISPR-Cas системы психрофильных бактерий F. psychrophilum. Автором был проведен анализ и обработка полученных результатов, подготовлен материал для публикации в научных журналах. Положения, выносимые на защиту 1. Таксономический состав бактерий, находящихся на поверхности снега, заметно отличается в образцах из удаленных друг от друга областей Антарктиды, и изменяется со временем. 2. Таксономический состав антарктических бактерий, определенный по представленности их 16S рРНК и соответствующих им генов, существенно разнится. 3. Среди перепредставленных функциональных в сообществах категорий генов, микроорганизмов статистически значимо поверхностного снега Антарктиды, выявлены гены, кодирующие белки клеточного ответа на окислительный стресс, и гены устойчивости к тяжелым металлам. 10 4. Наборы спейсеров (вариабельных участков CRISPR кассет) в штаммах F. psychrophilum из географически удаленных областей Антарктиды существенно отличаются друг от друга. Степень достоверности и апробация результатов Результаты работы были представлены на трех научных конференциях и опубликованы в двух рецензируемых научных журналах. Публикации: 1. Lopatina A., Krylenkov V., Severinov K. Activity and bacterial diversity of snow around Russian Antarctic stations. // Research in Microbiology. – 2013. – T. 164. – № 9. – C. 949-958. 2. Пугач К.С., Лопатина А.В., Северинов К.В. CRISPR системы адаптивного иммунитета прокариот. // Молекулярная Биология. – 2012. – T. 46. – № 2. – C. 175– 182. Тезисы конференций: 1. Lopatina A. V., Popova A.V., Krylenkov V.A., Severinov K.V. Changes in bacterial community composition of surface snow around three sampling sites in East Antarctica. // CAREX conference on life in extreme environments. Dublin, Ireland, 2011, P.84. 2. Лопатина А.В., Крыленков В.А., Северинов К.В. Разнообразие бактерий поверхностного снега Восточной Антарктиды. // Конференция по созданию российской программы Международного полярного десятилетия. Сочи, Россия, 2010, С. 93. 3. Lopatina A.V., Krylenkov V.A., Severinov K.V. Bacterial diversity of surface snow around three different points in East Antarctica. // SCAR 4th Open Science Conference. Buenos-Aires, Argentina, 2010, P. 45. 11 Обзор литературы Методы исследования разнообразия микроорганизмов Методы, основанные на сравнении последовательностей фрагментов ДНК За более чем вековую историю изучения микроорганизмов появилось множество подходов для оценки и изучения их разнообразия в естественных сообществах. Долгое время разнообразие микроорганизмов в природных экосистемах оценивалось путем выделения чистых культур микроорганизмов из исследуемых образцов. Такой подход, помимо значительной трудоемкости, приводил к сильной недооценке истинного разнообразия, т.к., согласно современным данным, менее 1% бактерий, присутствующих в образце, поддается культивации [8]. Значительным шагом вперед стало применение молекулярных методов, которые основаны на исследовании и сравнении последовательностей ДНК отдельных генов или целых геномов организмов, находящихся в образце. Эти работы позволили выявить и описать новые филогенетические группы прокариот, для многих из которых до настоящего времени не получено культивируемых представителей. При описания таксономической филогенетического принадлежности разнообразия микроорганизмов для определения принято использовать последовательность ДНК одного из генов домашнего хозяйства микроорганизмов. На ранних этапах экологических исследований использовали ген rpoB, кодирующий фрагмент бета субъединицы РНК-полимеразы прокариот или ген фактора трансляции Ef-Tu. Оба эти гена присутствуют в геномах всех бактерий и являются высоко консервативными, по-видимому, не подвержены горизонтальному переносу, и поэтому удобны для анализа таксономического состава сообществ [16]. Тем не менее, начиная с середины 90-х годов гораздо более широкое распространение получила 12 оценка разнообразия, основанная на сравнении последовательностей фрагментов генов 16S рРНК бактерий [17]. С развитием технологий высокопродуктивного секвенирования без типирования бактерий по последовательности генов 16S рРНК не обходится ни одно метагеномное исследование. В настоящее время все биоинформатические ресурсы и базы данных для филогенетического анализа используют в качестве филогенетического маркера именно эти последовательности. Самые распространённые биоинформатические ресурсы - это Ribosomal Database Project ресурс (или сокращенно RDP) [18] и Greengenes database ресурс [19]. Длина последовательности гена 16S рРНК составляет примерно 1500 п.о., и включает как строго консервативные, так и более вариабельные участки. Более консервативные участки обладают меньшей разрешающей способностью при определении филогенетической принадлежности. Поэтому для филогенетического анализа на уровне родов и видов используют вариабельные участки гена 16S рРНК. Многочисленные исследования были проведены для выявления участков 16S рРНК гена, обладающих наиболее высокой разрешающей способностью. Ими оказались участки V2, V3, V4, V5 и V6 [20], которые представлены на Рисунке 1. Рисунок 1. Вариабельные участки последовательности гена 16S рРНК бактерий. На графике изображены значения энтропии Шеннона (H’) для каждой позиции нуклеотида гена 16S рРНК, усредненные по 50-ти нуклеотидам. Значение энтропии Шеннона рассчиталось согласно формуле Σp(xi) log2 p(xi), где p(xi) определяет частоту нуклеотида i [21]. 13 Однако, имеется ряд ограничений интерпретации результатов анализа последовательностей гена 16S рРНК. Самое серьезное из них заключается в том, что в геноме одной бактерии может содержаться несколько копий рибосомальных генов (от 1 до 15, а в среднем - 4,2). Нуклеотидные последовательности этих копий могут различаться [22]. Хотя в большинстве геномов такие вариации составляют менее 1% [17], в геноме бактерии Aeromonas veronii имеются шесть копий генов 16S рРНК, последовательности которых различаются между собой до 1,5% [23], a в геноме Thermobispora bispora - две копии генов 16S рРНК различаются на 6,4% [24]. Таким образом, в некоторых случаях уровень отличий последовательностей гена 16S рРНК внутри одного генома сопоставим со значениями, характерными для разных видов или даже родов бактерий. Другим ограничением использования последовательностей гена 16S рРНК для оценки разнообразия сообществ является то, что идентичность двух сравниваемых последовательностей 16S рРНК гена вообще говоря не означает идентичность остальных частей геномов. Например, в двух штаммах Bacillus globisporus и B. psychrophilus гены 16S рРНК идентичны более чем на 99,7%, однако при определении родства методом ДНК-гибридизации, было показано, что геномные ДНК двух этих штаммов гибридизуются между собой лишь на 25-50%. Бактерии считаются принадлежащими к одному виду, если уровень гибридизации их ДНК равен или превышает 70% [23]. Аномально высокий уровень идентичности последовательностей гена 16S рРНК внутри одного рода (около 0,03% замен), также наблюдается у Streptococcus, Vibrio, Escherichia, Bacillus, Pantoea, Acinetobacter, Achromobacter, Stenotrophomonas и Actinomyces [23]. Другими словами, идентификация организмов по последовательности гена 16S рРНК может давать неточные результаты на уровне таксонов низких порядков. Таким образом, определение видовой принадлежности у бактерий по последовательностям гена 16S рРНК – не однозначный процесс. Изначально, порог уровня сходства для представителей одного вида определялся как >97% идентичности последовательности фрагментов гена 16S рРНК [25], затем его увеличили до 98,7-99% [26]. Позже, при оценке степени сходства последовательностей ДНК бактерий внутри 14 одного вида было предложено использовать порог в 99,3% идентичности последовательности гена 16S рРНК, а на уровне рода – 95,6% [22]. Для более высоких таксонов (семейство, класс, тип) границы еще более размыты и устанавливаются индивидуально в каждом конкретном случае. Пользуясь вышеописанными оценками уровня сходства в большинстве случаев (>90%) с помощью анализа последовательностей фрагментов гена 16S рРНК удается определить бактерию до рода, а в 65-83% случаев – до вида [23]. Точность определения филогенетической принадлежности микроорганизмов также зависит от длины анализируемой последовательности гена 16S рРНК: чем длиннее последовательность ДНК, тем с большей точностью можно определить таксономическую принадлежность бактерии [18], Рисунок 2. Рисунок 2. Зависимость доли классифицированных фрагментов генов 16S рРНК от длины фрагмента. Цифрами в столбцах показаны доли (%) фрагментов генов 16S рРНК, которые удалось отнести к определенному таксону на основании их сравнения с базой 15 данных RDP. На осях отложены длины фрагментов ДНК и названия таксонов бактерий [18]. Серьезная проблема, которая возникает при попытке определить филогенетическую принадлежность бактерий, – это различные ошибки, содержащиеся в последовательностях ДНК, депонированных в базах данных. Для 16S рРНК генов было показано, что около 3% последовательностей из баз данных являются артефактами –химерные последовательности, а около 2% - содержат ошибки секвенирования [23]. Кроме того, представленность разных таксонов в базе данных GenBank очень сильно варьирует, что вносит неточности в определение редких таксонов. Большинство доступных на сегодняшний день геномов бактерий принадлежат к филуму Proteobacteria (среди них, большая часть относится к Gammaproteobacteria, Actinobacteria. Alphaproteobacteria Напротив, такие и Betaproteobacteria), таксоны как Caldiserica, Firmicutes, и Elusimicrobia, Gemmatimonadetes, Ignavibacteria, и Thermodesulfobacteria представлены в базе данных только одним геномом [22]. Для установления последовательности ДНК генов 16S рРНК используются различные технологии секвенирования. Классический метод секвенирования – это капиллярное секвенирование по Сэнгеру. Этот метод позволяет определить последовательность ДНК фрагмента длиной до 1000 п.о., при этом требуется предварительное разделение ДНК фрагментов из смеси с помощью молекулярного клонирования. Большинство исследований таксономического состава сообщества с помощью капиллярного секвенирования ограничивались анализом не более чем сотни клонов, содержащих последовательность гена 16S рРНК [27]. Однако, разнообразие микроорганизмов в большинстве природных образцов многократно превышает возможности этого метода [28]. С развитием технологий высокоэффективного секвенирования появилась возможность более полного описания разнообразия микробных сообществ [27]. Существует несколько технологий секвенирования следующего поколения: 454 пиросеквенирование (Roche), секвенирование синтезом (Illumina), ионный полупроводник (Ion Torrent), секвенирование на основе лигирования (SOLiD) и другие 16 [28]. Все они могут быть с успехом использованы для анализа разнообразия микробных сообществ. На этапе, предшествующему собственно секвенированию, проводят реамплификацию ранее амплифицированных фрагментов генов 16S рРНК с праймерами, содержащими баркоды (короткие уникальные для каждого образца последовательности ДНК внутри последовательности праймеров) [29]. Это позволяет одновременно анализировать ДНК из нескольких сообществ, т.к. баркоды дают возможность вычленить последовательности, относящиеся к разным образцам. В ходе дальнейшего биоинформатического анализа миллионов последовательностей ДНК, полученных выбраковка в результате высокопродуктивного последовательностей плохого секвенирования, качества и происходит объединение последовательностей в группы на основании степени сходства [29]. Стандартным является объединение последовательностей 16S рРНК, различающихся менее чем на 3%, в ОТЕ (операционные таксономические единицы, operational taxonomic unit – OTU). Помимо секвенирования фрагментов генов 16S рРНК существует множество альтернативных методик, позволяющих описать микробное разнообразие в образце. Например, метод рестрикционного анализа продуктов амплификации гена 16S рРНК (amplified ribosomal DNA restriction analysis, ARDRA), который был предложен в 1995 г. (Vaneechoutte, 1995). Метод основан на амплификации достаточно протяженных фрагментов генов 16S рРНК на матрице геномной ДНК чистых культур бактерий. Полученные ампликоны обрабатывают эндонуклеазами рестрикции, и продукты рестрикции затем разделяют с помощью гель-электрофореза. Различные бактерии обладают уникальным паттерном распределения длин ДНК фрагментов, что позволяет проводить быстрое типирование изолятов [30]. Для описания разнообразия сообществ микроорганизмов также используют метод электрофореза в денатурирующем геле (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) [31]. На матрице выделенной тотальной ДНК сообщества проводят амплификацию участка гена 16S рРНК. Полученные фрагменты затем разделяют с помощью высокоразрешающего денатурирующего градиентного гель-электрофореза. По полученным паттернам амплифицированных ДНК фрагментов можно судить о 17 сложности микробного сообщества, о динамике внутри сообщества, о различиях в структуре сообщества между образцами. Генотипирование штаммов бактерий с помощью CRISPR локусов CRISPR-Cas система (от clustered regularly interspaced short palindromic repeats, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) – это система адаптивного иммунитета прокариот, которая обеспечивает защиту клетки от чужеродных генетических элементов. В состав CRISPR-Cas системы входят CRISPR кассета, состоящая из коротких идентичных фрагментов ДНК (повторов), разделенных короткими уникальными участками ДНК (спейсерами), и cas (от CRISPR-associated) гены [32]. В общем виде, механизм защитного действия CRISPRCas систем представлен на Рисунке 3. CRISPR кассета транскрибируется, как единый РНК предшественник (пре-крРНК), который затем процессируется с образованием набора коротких фрагментов РНК (крРНК). Каждая крРНК содержит последовательность одного спейсера и двух неполных фрагментов повторов, прилегающих к спейсеру с обоих концов. крРНК в комплексе с Cas белками связывается с комплементарным участком чужеродной ДНК или РНК (такой участок связывания называют протоспейсер), что приводит к расщеплению чужеродной нуклеиновой кислоты [33]. Новые спейсеры вставляются в CRISPR кассету в ходе процесса, называемого адаптацией. 18 Рисунок 3. Схема работы CRISPR-Cas системы. (веб страница лаборатории Стэна Броунса https://www.wageningenur.nl/en/show/CRISPRCas-small-RNA-based-Adaptive- Immunity-in-Prokaryotes.htm). А. В левой части рисунка схематически представлен процесс CRISPR адаптации. При проникновении чужеродной ДНК внутрь клетки (1) происходит ее частичная деградация, в этот момент белки CRISPR-Cas системы Cas1 и Cas2 связываются с фрагментом чужеродной ДНК и встраивают его в CRISPR кассету (2). Таким образом, CRISPR кассета увеличивается в длину на один спейсер и дополнительную копию повтора (3). B. В нижней части рисунка схематически представлен процесс экспрессии и созревания крРНК. CRISPR кассета транскрибируется как единый РНК предшественник (пре-крРНК) (4). Затем белки комплекса Cascade связываются с пре-крРНК и гидролизуют его до коротких РНК (крРНК) (5), каждая из которых оказывается связанной с комплексом белков Cascade. C. В правой части рисунка схематически показан процесс CRISPR интерференции чужеродной ДНК. В случае повторного проникновения ДНК фага в клетку (6) происходит комплементарное связывание ДНК бактериофага с комплексом Cascade-крРНК, который привлекает нуклеазу Cas3 (7). Нуклеаза Cas3 вносит разрывы в ДНК фага, что приводит к ее деградации (8). 19 CRISPR-Cas системы присутствуют в геномах 40% бактерий и 90% архей [32]. Количество CRISPR кассет в одном геноме варьирует от 1 до 18; каждая кассета может содержать до нескольких сот (в среднем – 60) уникальных спейсеров [34]. Штаммы бактерий, принадлежащие к одному виду, часто несут уникальные наборы CRISPR спейсеров. Такая высокая вариабельность позволяет использовать наборы CRISPR спейсеров для типирования близкородственных штаммов бактерий. Такой подход широко применяется в эпидемиологических исследованиях для изучения распространения патогенных штаммов, таких как Mycobacterium tuberculosis, Yersinia pestis, Salmonella enterica и др. [35, 36]. Различные подходы на основе изучения вариативности CRISPR локусов были разработаны, включая сполиготайпинг (от spolygotyping, spacer oligonucleotide typing), CRISPR типирование (CRISPR typing), CRISPR-MVLST (multi-virulence-locus sequence typing; мультилокусное секвенирование генов вирулентности в сочетании с секвенированием CRISPR локусов) и др. [37]. Методы «омика» В последнее десятилетие появился ряд новых методов комплексного изучения микробных сообществ, включая такие как метагеномика, метатракскриптомика, метапротеомика и метаболомика. Часто в англоязычной литературе их объединяют термином «омика» на основании общей части названия [38]. Эти методы позволяют получить представление не только о таксономическом составе, но и о метаболических процессах, которые потенциально могут происходить в сообществе [39]. Метагеномика – анализ совокупной генетической информации сообщества микроорганизмов. Эра метагеномных исследований начались еще в 1985 году, когда для описания разнообразия микробных сообщества впервые применили метод создания библиотек клонов фрагментов генов 16S рРНК [40]. Впервые термин «метагеномика» был введен в 1998 году Хандельсманом при описании почвенного микробного сообщества [41]. Такой подход получил широкое распространение для 20 описания микробного разнообразия и динамики как природных экосистем микробиомов морской воды [42], почв [43], горячих источников [44], так и микробиомов человека [45]. Эти исследования позволили выявить тысячи новых таксонов микроорганизмов в природных экосистемах [42]. Действительно широкое распространение метагеномика получила в первом десятилетии 21-го века с появлением методов высокопродуктивного секвенирования. Этот технологический прорыв позволил исключить затратный процесс клонирования фрагментов ДНК в вектора и получать миллионы ДНК последовательностей в течение считанных дней [46]. Кроме того, методы высокопроизводительного секвенирования позволили секвенировать не только отдельные фрагменты генов 16S рРНК, но и случайные фрагменты тотальной ДНК сообщества (так называемое шотгансеквенирование, shotgut sequencing). Таким образом, современные метагеномные исследования позволяют получить информацию не только о таксономическом составе всех присутствующих в образцах микроорганизмах, но и оценить их функциональную роль, – через определение относительной представленности генов, кодирующих белки различных функциональных категорий [39]. К сожалению, у метагеномных исследований есть ряд недостатков: 1) не всегда удается отсеквенировать достаточное количество последовательностей ДНК для осуществления полной сборки геномов всех присутствующих в образце микроорганизмов 2) не всегда возможно охарактеризовать гены, кодирующие белки с пока еще неизвестными функциями 3) на основании метагеномных исследований зачастую невозможно установить, какой именно вид в сообществе участвует в том или ином метаболическом процессе [47]. Далеко не все гены, присутствующие в геномах микроорганизмов в сообществе, активно транскрибируются [46]. Mетатранскриптомика – это молекулярный метод, основанный на изучении активно транскрибирующихся рибосомальных и матричных РНК в сообществе. Для того, чтобы описать состав генных транскриптов сообщества, на матрице тотальной РНК сообщества проводят реакцию обратной транскрипции, после чего полученную кДНК используют для высокопроизводительного секвенирования [48]. У данного метода есть ряд ограничивающих факторов, которые вносят искажения в анализ метатранскриптомных данных: 1) РНК, в отличие от ДНК, 21 не стабильна и быстро деградирует в окружающей среде, поэтому частичные потери неизбежны при выделении тотальной РНК сообщества (особенно это касается мРНК т.к. рРНК несколько более стабильна) 2) уровень экспрессии гена и количество соответствующего белка в клетке могут не коррелировать, поэтому результаты метатранскриптомного анализа являются лишь косвенным указанием на возможное присутствие определенного белка в клетке [48, 49]. Наличие РНК транскриптов в клетках бактерий свидетельствует об экспрессии генов, кодирующих функциональные белки, однако не свидетельствует о реализации этих функций в сообществе. Информацию о том, какие именно белки, закодированные в геномах микроорганизмов, участвуют в реализации биохимической функции, позволяет получить метапротеомный анализ [38]. Для этого из биомассы микроорганизмов, присутствующих в образце, выделяют тотальный белковый препарат; затем разделяют белки с помощью гель-электрофореза и жидкостной хроматографии, и проводят их идентификацию методом высокоэффективной пептидной ионизации с помощью масс-спектроскопии [38]. Комбинация метагеномных, метатранскриптомных и метапротеомных методов позволяет наиболее полно охарактеризовать состав и функциональные особенности микроорганизмов в экосистеме [50]. Метаболомика – метод, основанный на характеристике метаболитов, которые производятся или потребляются в процессе биологической активности сообщества [51]. Mетаболиты – это вещества небольшой молекулярной массы, которые могут выполнять в сообществе микроорганизмов различные функции, такие как взаимодействие с другими микроорганизмами в сообществе (сигнальные молекулы и антибиотики), клеточный стресс-ответ (пигменты и осмопротекторы), повышение усвояемости питательных веществ (сидерофоры) и др. [51]. Анализ метаболитов проводится с помощью методов ядерно-магнитного резонанса и масс-спектрометрии [52]. Метаболомные исследования помогают физиологический потенциал микробных сообществ. лучше понять и описать 22 Разнообразие микроорганизмов в холодных местах обитания Микроорганизмы поверхностного снега и ледниковой толщи Примерно 35% поверхности Земли покрыто снегом, большая часть которого находится в полярных областях [4]. Снег содержит частицы пыли различного происхождения, попавшие в атмосферу в процессе ветровой эрозии почв и горных пород, вулканических извержений, образования аэрозолей над водными поверхностями или в результате антропогенного воздействия [4]. В химическом составе свежевыпавшего снега присутствуют, кроме собственно кристаллической воды, слабые органические кислоты, ионы натрия, хлора, калия, кальция, магния и других металлов, ионы аммония, сульфат- и нитрат-ионы [53]. Климатические условия в снежных экосистемах характеризуются низкими температурами (наименьшие температуры наблюдаются на территории Антарктиды, где среднегодовая температура воздуха внутренних районов достигает -57 °C), низкой влажностью, высокой солнечной радиацией (сменяемой длительными периодами полной темноты в полярных широтах), низкой доступностью воды в жидкой фазе и скудостью источников питательных веществ [4]. Естественное разнообразие живых организмов в столь суровых местах обитания представлено микроорганизмами: бактериями, простейшими, дрожжами, водорослями, микроскопическими грибами [54]. Содержание микроорганизмов в снежных сообществах варьирует в широких пределах, но в целом сравнительно не высоко и составляет от 102 до 106 клеток на мл талой воды. Антарктической снег содержит от 0.2×103 до 5×103 кл/мл [5, 6], арктический снег – примерно 6×104 кл/мл [55], высокогорный снег - 6×103–7,2×105 кл/мл [7]. Для сравнения, численность бактерий в одном грамме почвы достигает 109 клеток [56], а в морской воде - 105-106 кл/мл [57]. Рассмотрим подробнее состав бактериальных сообществ поверхностного снега в различных точках земного шара и начнем с Антарктического континента. Одна из первых работ, описывающих разнообразие бактерий поверхностного снега на Южном 23 полюсе Антарктиды и выполненных с помощью клонирования генов 16S рРНК, была опубликована в 2000-м году. Оказалось, что около 20% сообщества микроорганизмов снега было представлено бактериями из группы Thermus–Deinococcus, которые характеризуются повышенной устойчивостью к радиации и засушливому климату [57]. Другими обнаруженными представителями экосистемы снега на Южном полюсе были бактерии видов Alcaligenes sp., Cytophaga sp., и Bacteroides sp. Более полное описание состава микробного сообщества снега на поверхности ледникового купола Антарктиды было сделано с применением высокопроизводительного секвенирования [5, 14]. Снег для исследования был отобран в районе европейской антарктической исследовательской станции Конкордия, удаленной от побережья на 1100 км. Анализ порядка 14000 фрагментов генов 16S рРНК выявил большой спектр филогенетических групп бактерий: Proteobacteria (самыми многочисленными из которых оказались Alphaproteobacteria), Bacteroidetes, Cyanobacteria, и Verrucomicrobia. Как отмечают авторы, схожий состав бактерий был обнаружен ранее в экосистемах поверхностного снега высокогорных районов, ледников, морского льда и атмосферы [5, 14]. Всего одна публикация описывает состав микробного сообщества снега прибрежного района Антарктиды. Объектом исследования стал так называемый «красный снег», отобранный на территории Восточной Антарктиды. Красный оттенок снегу придает пигмент астаксантин, который накапливается в результате роста на поверхности снега фототрофных бактерий. Анализ библиотек клонированных фрагментов генов 16S рРНК выявил несколько преобладающих таксономических групп бактерий: Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, и Cyanobacteria. Самым многочисленным родом бактерий (24 из 86 проанализированных клонов) был Hymenobacter, относящийся к филуму Bacteroidetes. Авторы также отмечают, что последовательности, выявленные в ходе анализа, имели высокую степень сходства с последовательностями ДНК из других холодных мест обитания [58]. Самые богатые и разнообразные сообщества микроорганизмов на поверхности снега образуются в криоконитовых экосистемах [59]. Криоконитовые отверстия формируются, когда частицы пыли или кусочки горных пород темного цвета 24 попадают на поверхность снега и ускоряют его таяние вокруг себя за счет уменьшения эффекта альбедо. В результате таяния снега такие частицы буквально проваливаются в снег, формируя отверстия, заполненные водой. При анализе библиотек клонов фрагментов генов 16S рРНК в криоконитовых экосистемах на территории Сухих долин (западная часть Антарктики) были найдены представители филумов Acidobacteria, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia и Cyanobacteria [60]. Ближайшие гомологи найденных последовательностей были ранее обнаружены в различных холодных местах обитания. Кроме бактерий в криоконитовой экосистеме присутствовали эукариоты: Plectus aquatilis (нематода), Macrobiotus hufelandi (тихоходка), Philodina acuticornis (коловратка), Choiromyces meandriformis (трюфельный гриб), Pleurastrium insigne (зеленая водоросль). Таким образом, за счет уникальных локальных условий, более благоприятных, чем условия на поверхности окружающих снегов, в криоконитовых отверстиях, по-видимому, формируются более сложные микробные сообщества. В ряде высокогорных работ анализировали областей. Так, в биоразнообразие ходе анализа на поверхности таксономического снегов состава микроорганизмов на поверхности четырех ледников в Тибете были выявлены представители родов Bradyrhizobium, Sphingomonas, Polaromonas, Acinetobacter, Pseudomonas, Arthrobacter, Hymenobacter, Rhodoferax, Ralstonia, Bradyrhizobium, Acidovorax, Curvibacter, Brevibacterium и Kocuria [61]. В снегах на поверхности ледников в горах Японии самыми многочисленными были представители родов Variovorax, Cryobacterium и Janthinobacterium [7]. Как отмечают авторы этих исследований, последовательности фрагментов генов 16S рРНК найденных бактерий имели высокую степень сходства с последовательностями ДНК микроорганизмов из других холодных мест обитания. Не менее разнообразным оказался состав микробного сообщества на леднике арктического архипелага Свальбард (Норвегия) [55]. Свежевыпавший снег содержал представителей классов Alphaproteobacteria (среди них Brevundimonas, Sandarakinorhabdus, Chelatococcus), Betaproteobacteria (среди них Hydrogenophaga), Gammaproteobacteria (среди них Moraxella), Bacilli (среди них Bacillus, Paenibacillus) 25 и Actinobacteria (среди них Micromonospora, Agromyces). Все выявленные роды бактерий были ранее детектированы в холодных местах обитания, в частности, в паковых льдах обоих полюсов, ледниках, снегах или льдах высокогорных озер. Суммируя все вышесказанное можно заключить, что представители одних и тех же таксономических групп встречаются на поверхности снега в разных частях планеты. Чаще всего доминируют представители классов Betaproteobacteria, Alphoproteobacteria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, в некоторых случаях Bacteroides и Cyanobactera. Среди наиболее распространенных родов бактерий можно отметить Variovorax, Janthinobacterium Sphingomonas, Chryseobacterium, Polaromonas, Acinetobacter, Pseudomonas, Arthrobacter, а также Hymenobacter и Rhodoferax и др. Недавно был проведен первый и пока единственный метагеномный анализ микроорганизмов поверхностного снега архипелага Свальбард в Норвегии [62]. Самыми многочисленными оказались представители филогенетических групп Fungi, Proteobacteria, Bacteroidetes и Cyanobacteria. Анализ функциональных категорий генов в образцах снега выявил положительную корреляцию специфических групп генов с факторами внешней среды. Например, в образцах с более высоким содержанием ртути происходило увеличение детектируемого числа копий генов синтеза кобаламина, продукты которого участвуют в детоксификации ртути. Также был проведен сравнительный анализ функциональных категорий генов метагеномов арктического снега и нескольких умеренных экосистем. Оказалось, что гены, продукты которых обеспечивают защиту клетки от окислительного стресса, были перепредставлены в снежном метагеноме. Таким образом, было сделано предположение, что физико-химические и климатические факторы оказывают влияние на состав функциональных категорий генов бактерий поверхностного снега и по-видимому определяют необходимость увеличения доли генов различных защитных систем, таких как устойчивость к окислительному стрессу и др.. С другой стороны, разрешающая способность такого анализа, очевидно, не может быть велика и для более информативных сравнений необходимо привлекать данные не только и не столько по представленности фрагментов ДНК определенных функциональных групп 26 генов, но и по набору экспрессируемых генов, синтезируемых белков и метаболитов, продуцирующихся сообществом микроорганизмов снега [62]. До сих пор остается неразрешенным принципиальный вопрос о том, следует ли считать снежный покров действительным местом обитания микроорганизмов, где они способны делиться, расти и образовывать полноценные самовоспроизводящиеся сообщества. Впервые данные о метаболической активности бактерий на поверхности антарктического снега были получены в 2000 году Карпентером и соавторами [5-7]. С помощью эксперимента по in situ включению радиоактивно меченных тимидина и лейцина в состав клеточных биополимеров авторам удалось показать, что при температуре окружающего воздуха до -17 оC микроорганизмы, находящиеся в снегу центральных областей Антарктиды, способны синтезировать белки и ДНК. Однако, скорость включения радиоактивных изотопов была крайне низкой, и эти результаты были подвергнуты сомнению в работе [63], где был сделан вывод о том что доступной для жизнедеятельности бактерий воды при столь низкой температуре нет. Снежный покров полярных и высокогорных областей постоянно обновляется, более древние слои уходят все ниже, уплотняясь и постепенно формируя лед. Сравнительный анализ бактериальных сообществ поверхностного арктического снега на территории Канады и ледовой толщи под ним не выявил существенного сходства: образцы снега и льда, отобранные с разных глубин, имели различный таксономических состав бактерий [64]. Несмотря на то, что в процессе образования кристаллов льда клеточная стенка большинства находящихся в нем микроорганизмов повреждается, части бактерий удается сохранить жизнеспособность. В ходе пионерских работ по культивированию микроорганизмов ледникового щита Антарктиды удалось получить изоляты многих психрофильных бактерий [65]. Позже, из образцов ледника Эвереста, было выделено 1385 изолятов бактерий, большая часть которых принадлежала классам Proteobacteria, и Actinobacteria [66]. Firmicutes, Alpha-Proteobacteria, Gamma- 27 Микроорганизмы в атмосфере Как уже было сказано, на состав сообществ микроорганизмов поверхностного снега могут влиять несколько факторов, один из которых – эоловый перенос материала из близлежащих биотопов. Сотни миллионов тонн пыли, содержащей микроорганизмы, органические кислоты и неорганические соли, ежегодно перемещаются между континентами [67]. Многочисленные биотопы на поверхности Земли могут служить источником бактерий в атмосфере: поверхность почвы, растений, водная поверхность и, наконец, антропогенные объекты [68]. Микробные клетки могут пребывать в атмосфере в течение долгого времени сохраняя жизнеспособность и переноситься на огромные расстояния [69]. Различные факторы окружающей среды, такие как УФ радиация, окислительный стресс, обезвоживание и недостаток питательных веществ, оказывают влияние на микроорганизмы в атмосфере [70]. Численность микроорганизмов в атмосфере зависит от множества факторов, таких как время года, температура, топология местности, потоки тепла от земной поверхности, ветер и антропогенный фактор [71]. По некоторым оценкам, численность микроорганизмов в атмосфере может составлять от 102 до 105 бактерий в мл воздуха [72, 73]. Отдельный вопрос, которые возникает при изучении разнообразия микроорганизмов в атмосфере – это в каком метаболическом состоянии они находятся, и могут ли они принимать участие в атмосферных процессах [74]. Способность бактерий жить и размножаться на частицах пыли в атмосфере была показана еще в 1979 году [75]. Жизнеспособные бактерии были обнаружены на высоте до 60-70 км, где температура воздуха достигает -100 oC [76, 77]. Было показано, что атмосферные бактерии могут влиять на химический состав осадков [78] и даже вызывать их образование, способствуя конденсации воды и льда [79]. Самым известным примером бактерии, которая способствует образованию кристаллов льда на поверхности клетки – это Pseudomonas syringae [80]. На внешней мембране клеток P. syringae находятся белки, которые связывают молекулы воды из атмосферы и упорядочивают их структуру при замерзании, что приводит к образованию 28 регулярных кристаллов льда. Антарктический континент изолирован от других континентов антарктическим циркумполярным воздушным течением, которое практически не позволяет перемешиваться воздушным потокам над Антарктикой и более северными районами [81]. Другим важным фактором, ограничивающим транспорт веществ по воздуху к территории Антарктиды, являются стоковые ветра, которые снижают количество заносимого на побережье органического материала [82]. Стоковые ветра возникают вследствие охлаждения слоя воздуха у поверхности ледника, который под действием силы тяжести стекает вниз по куполообразному склону Антарктического континента. Основными источниками пыли, оседающей на территории Антарктики и Южного океана, являются территория Австралии, Южной Америки, Южной Африки, а также территории Северного полушария. Южно-американские потоки оседают главным образом в Атлантико-Индийском секторе Антарктики, австралийские – в секторе Тихого океана [83]. Несколько исследований были посвящены описанию разнообразия микроорганизмов в воздухе над Антарктикой. Микробиологическими методами были обнаружены споры мхов и грибов, пыльца, водоросли, бактерии и даже вирусы [84]. Молекулярно-генетическими цианобактерий, диатомовых методами удалось водорослей и детектировать актиномицетов представителей в воздухе над Антарктическим полуостровом [85]. Как отмечают авторы, ближайшие гомологи многих из них были ранее обнаружены в других холодных местах обитания, в том числе на территории Антарктики. С помощью методов высокопроизводительного секвенирования удалось описать состав сообщества микроорганизмов в воздухе над Сухой Долиной недалеко от американской исследовательской станции МакМердо [86]. Самым часто встречающимся филумом бактерий оказались Firmicutes, многие представители которых имели ближайших гомологов среди термофильных бактерий. Авторы предположили, что наибольший вклад в состав бактериального сообщества атмосферы над Сухими Долинами вносят термофильные бактерии геотермальных источников вулкана Эребус, который находится в 100 км от места отбора образцов. Возможно, консервации термофильных бактерий филума Firmicutes в атмосфере 29 способствовало то, что многие из них способны образовывать споры при неблагоприятных условиях. В остальном, состав сообщества бактерий воздуха над Сухими Долинами был схож с бактериальным составом аэрозолей над другими континентами, формируя таким образом специфическую экосистему бактерий, способных к транспортировке на дальние расстояния и обладающих повышенной устойчивостью к неблагоприятным условиям окружающей среды [86]. Микроорганизмы полярных океанических вод и морского льда 70% поверхности Земли покрыто водой, 90% которой имеет температуру ниже 5 °C [87]. На большей части территории Антарктики температура морской воды не превышает -1,8 oC [88]. Интерес научного сообщества к изучению разнообразия микроорганизмов в Южном океане значительно возрос за последние несколько лет, т.к. из-за роста температуры воды в ответ на повышение средней температуры атмосферы, происходит изменение состава микробного сообщества, что в свою очередь приводит к сдвигу в биогеохимических циклах [89]. Бактериопланктон является самой многочисленной группой организмов в полярных морских водах Арктики и Антарктики. Схожие филогенетические группы бактерий населяют моря низких широт. Среди них самыми многочисленными являются представители классов Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria и Bacteroides [90, 91]. Многие роды бактерий, такие как Pelagibacter, Roseobacter и Sulfitobacter были найдены в морях на обоих полюсах планеты, что указывает на важную роль, которую эти бактерии могут играть в экосистемах полярных морей. Кроме вышеуказанных родов, к характерным бактериям Южного океана можно отнести бактерии классов Alphaproteobacteria (Paracoccus, Roseobacter, Octadecabacter, Methylarcula и Ketogulonigenium), Gammaproteobacteria (Psychrobacter, Pseudoalteromonas) и Actinobacteria (Rhodococcus, Arthrobacter, Planococcus, Janibacter) [92]. 30 Таксономический состав бактерий в полярной морской воде изменяется с глубиной: ближе к поверхности воды преобладают Gammaproteobacteria (в основном порядки Oceanospirillales, Vibrionales и Alteromonadales), Bacteroidetes (в основном Polaribacter) и Alphaproteobacteria, в то время как на большей глубине (100 м) преобладают представители Archaea и Gammaproteobacteria [89]. Кроме того, таксономический состав поверхностных вод значительно отличается в удаленных друг от друга точках Южного океана (удаление до 500 км), т. е. в разных частях Антарктики, по-видимому, формируются отдельные независимые сообщества микроорганизмов морской воды [89]. Одно из самых заметных отличий полярных морей от других морских экосистем – это наличие морского льда на поверхности воды. Морской лед оказывает огромное влияние на микробные сообщества морской воды, так как препятствует прохождению света в верхние слои воды, а также способствует формированию особой экосистемы на нижней поверхности ледника [93]. Впервые присутствие бактерий в антарктическом морском льду было показано в 1966 [94]. Позже, Боуман и соавторы исследовали австралийской таксономических антарктической состав бактерий базы Дэйвис морского [94]. льда Среди недалеко них от самыми многочисленными были представители Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Flavobacterium и Bacteroidеs. Более детальный филогенетический анализ выявил представителей родов Colwellia, Shewanella, Marinobacter, Planococcus, а также представители новых филогенетических групп, близких к Colwellia и Alteromonas, либо не имеющих близких гомологов и определенных лишь с точностью до филума Bacteroidetes. При исследовании состава бактериальных сообществ, населяющих паковые льды Арктики и Антарктики, было показано, что 40% полученных в ходе исследования последовательностей 16S рРНК генов имели ближайших гомологов среди рибосомальных генов известных бактерий полярных и высокогорных снегов [95]. По утверждению авторов, преобладающими бактериальными таксономическими группами на обоих полюсах являются Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, а также Bacteroidetes. Исследования, проведенные Брауном и соавторами, подтверждают наличие в морском льду Арктики и Антарктики бактерий, 31 принадлежащих к Bacteroidetes, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Chlamidiales и Verrucomicrobia [96]. Кроме того, в библиотеках клонов 16S рРНК генов было обнаружено большое количество последовательностей хлоропласт диатомовых водорослей. Диатомовые водоросли играют большую роль в образовании первичной продукции полярных морских вод [97]. За время изучения микроорганизмов морского льда было охарактеризовано несколько населяющих его новых родов бактерий: род Octadecabacter, близкий к Roseobacter (Alphaproteobacteria) [98]; род Polaromonas (Betaproteobacteria), близкий к родам Variovorax и Rhodoferax [99]. Также предложено несколько новых родов, принадлежащих к филуму Bacteroidetes: Polaribacter (4 новых вида) [100], Psychroflexus (2 новых вида) [101] и Gelidibacter (1 новый вид) [102]. Несмотря на тесную взаимосвязь между морской водой и льдом, бактериальные сообщества, населяющие эти биотопы, различаются довольно существенно [103]. Микроорганизмы полярных озер Микроорганизмы населяют не только морские воды, но и пресные и соленые водоемы внутри Антарктического континента, рассмотрим подробнее некоторые из них. Полярные озера бывают разных типов: от пресноводных до очень соленых, от очень кислых до щелочных, от озер с высоким содержанием кислорода до бескислородных, от постоянно покрытых льдом до открытых водоемов [104]. Количество озер на территории Антарктики по последним оценкам составляет 379 [105]. Их расположение показано на Рисунке 4. 32 Рисунок 4. Карта расположения озер на территории Антарктиды. Цвета/фигуры содержат информацию от том, каким методом было обнаружено озеро: черные треугольники – эхолокация; красные круги – измерение изменения высоты поверхности ледника; черные квадраты – визуальная оценка рельефа ледника, желтый цвет – сейсмоакустические измерения, зеленый цвет – картирование гравитационного поля [105]. Считается, что подледниковые антарктические озера соединены между собой подледниковыми каналами (реками), которые переносят ежегодно сотни миллионов тонн воды [106]. Подледниковые озера крайне интересны, т. к. они могут хранить в себе уникальные микробные сообщества, скрытое под километрами льда и отделенное от атмосферы в течение последних 20-25 миллионов лет [107]. Самое известное подледниковое озеро – это озеро Восток, расположенное в центральной части Восточной Антарктиды. Оно является самым крупным озером на территории Антарктиды. Толщина льда над озером составляет около 3750 м [108]. Считается, что вода озера не имела связи с атмосферой около 15 млн. лет. Таким образом, озеро Восток представляет собой уникальный природный объект, и может 33 являться своего рода «капсулой времени» для микроорганизмов, оказавшихся в озере и адаптировавшихся к условиям обитания в нем. Богатая кислородом вода озера имеет температуру -2,65 °C и находится под давлением 350 бар. [108]. В 2012 году группе российских ученых удалось пробурить почти 4 км льда и достичь воды озера (прессрелиз от 10 марта 2012 года http://www.aari.nw.ru/main.php?lg=0). Отобрать воду из озера не удалось, однако для исследования стал доступен лед, намёрзший из воды озера на буровой снаряд. Численность микроорганизмов в воде озера крайне низка и оценивается в 5-38 кл/мл [109]. Несколько удачливее в отборе проб воды подледникового озера оказались американские исследователи. Их целью стало озеро Виллианс, которое находится в Западной Антарктиде и покрыто 800 м льда [110]. Глубина озера составляет всего около двух метров. Количество бактериальных клеток в воде озера оказалось гораздо более высоким (1,3×105 кл/мл). Анализ последовательностей гена 16S рРНК выявил представителей 3931 ОТЕ, большая часть из которых принадлежала классам Betaproteobacteria, Actinobacteria, Bacteroides, Gammaproteobacteria и Deltaproteobacteria. Более глубокий таксономический анализ показал присутствие микроорганизмов, потенциально способных окислять неорганические соединения: Sideroxydans lithotrophicus ES-1, Thiobacillus denitrificans, Methylobacter tundripaludum, Nitrotoga arctica. Таким образом, авторам удалось показать, что в экосистеме подледникового озера существует огромное разнообразие микроорганизмов. В отличие от подледниковых озер в Центральной части Антарктиды, толщина льда прибрежных озер не превышает нескольких метров, в редких случаях лед на поверхности озера и вовсе отсутствует. Исследования микробного разнообразия в озерах Антарктики выявили многочисленные (105-106 кл/мл) и разнообразные популяции бактерий, архей, эукариот и вирусов [74]. Интересная экосистема формируется в воде Глубокого Озера (Deep Lake), находящегося на территории Восточной Антарктиды недалеко от Австралийской станции Дэйвис. Это озеро ни разу не замерзало за весь период наблюдений, даже когда температура воздуха опускалась до -40 oC, а температура воды – до -20 oC [111]. Дело в том, что вода в озере представляет собой насыщенный соленый раствор 34 (соленость в 10 раз выше, чем в морской воде). Первые микроорганизмы из Глубокого Озера были выделены еще в 80-х годах – галофильная водоросль Dunaliella [112] и галофильная архея Halorubrum lacusprofundi [113]. Позже, были выделены еще три чистые культуры архей Halohasta litchfieldiae strain tADL, strain DL31 и strain DL1 [114]. Mолекулярно-генетический анализ показал, что большинство микроорганизмов, населяющих озеро, относятся к семейству архей Halobacteriales (преимущественно Halorubrum, Haloarcula, Haloferax, Natronobacterium). Остальные микроорганизмы относятся к бактериям (Marinobacter) и эукариотам (Dunaliella) [115]. Самое удивительное, что в Глубоком Озере происходит очень интенсивный горизонтальный перенос генов не только между видами, но и между разными родами архей [111]. Авторы предположили, что подобная «гомогенизация» популяции способствует сохранению важных для выживания генов и предохраняет их от накопления вредных мутаций. Недавнее метапротеомное исследование Глубокого Озера впервые показало присутствие белков литических фагов в биомассе микроорганизмов гиперсоленых озер [116]. Среди белков бактерий были найдены белки S-слоя и адгезины, обладавшие высокой вариативностью (от 27% до 77% сходства). Авторы предположили, что столь высокая вариативность белков поверхностных структур клетки возникает вследствие активной борьбой микроорганизмов с адсорбцией вирусных частиц на поверхность клеток. Также в протеоме Глубокого Озера были обнаружены белки иммунных систем прокариот: CRISPR-Cas система и BREX система (недавно открытая система иммунитета прокариот по отношению к вирусам, которая обнаружена в 10% геномов секвенированных бактерий и архей [117]). Озера в Антарктике поражают не только своим разнообразием, но и красотой. Одно из самых живописных мест на территории Антарктики - так называемые «водопады крови» (Blood Falls) в Сухой Долине. Потоки соленой воды, обогащенной железом (что и придает потоку красный оттенок), вытекают из-под ледника Тейлора из холодного соленого озера и окрашивают снег и лед в кирпично-красный цвет. Самыми многочисленными микроорганизмами в воде этого озера были представители классов Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria, и Gammaproteobacteria, а также Bacteroidetes. 46% идентифицированных ДНК последовательностей принадлежит 35 Thiomicrospira arctica, психрофильной морской автотрофной бактерии, способной к окислению серы [118]. Таким образом, в подледниковых озерах Антарктики можно обнаружить огромное разнообразие микроорганизмов. Однако еще более многочисленные и разнообразные микроорганизмы населяют полярные почвы. Микроорганизмы полярных почв Полярные почвы характеризуются низким количеством осадков, низкими среднегодовыми температурами и малой скоростью накопления органических остатков [81]. Довольно разнообразные микробные сообщества населяют полярные арктические почвы (почвы, которые формируются в пределах арктического пояса, в основном на островах Северного Ледовитого океана). Представители классов Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria и Gammaproteobacteria, Bacteroidetes были идентифицированы в арктических почвах [119]. Более полное описание состава микробного сообщества высокопроизводительного арктических почв секвенирования было [120]. сделано 83% с применением сообщества бактерий составляли представители классов Acidobacteria, Alphaproteobacteria, Actinobacteria, Betaproteobacteria и Bacteroidetes, небольшую долю сообщества составляли представители классов Gammaproteobacteria, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes, Deltaproteobacteria и TM7. Авторы и других работ отмечают, что структура микробного сообществ арктических почв сходна с таковой для экосистем почв более умеренного климата [120, 121]. На состав бактериальных сообществ арктических почв влияет множество факторов: характер подстилающей породы, содержание органических веществ, pH и др. [74]. Было показано, что при pH < 6 происходит заметное увеличение доли Acidobacteria в составе микробных сообществ почв финской Лапландии [119]. В ходе сравнения таксономического состава бактерий арктических почв с разным процентным содержанием органических веществ была выявлена тенденция к 36 повышению доли Actinobacteria в почвах с низких содержанием органических веществ (меньше 10% от массы сухого веса почвы) и повышению доли Proteobacteria в почвах с высоким содержанием органических веществ (более 10% от массы сухого веса почвы) [122]. Антарктика – самое холодное и засушливое место на Земле . Лишь от 1 до 3% площади поверхности континента свободно от снега и льда, и представлена выходами горных пород, не содержащими растительности [123]. Несмотря на суровые климатические условия, почвы Антарктики содержат множество бактерий. Численность микроорганизмов в одном грамме антарктических почв оценивается от 105-107 до 1010 клеток [123]. Первые микроорганизмы были выделены из почв Антарктиды еще в 30-х годах прошлого столетия [124]. Позже, множество представителей антарктических почвенных бактерий были культивированы в лабораторных условиях: Achromobacter, Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Planococcus, Pseudomonas, Streptomyces и Nocardia [81]. Многочисленные молекулярно-генетические исследования почв удаленных друг от друга областей Антарктиды выявили высокую гетерогенность таксономического состава микроорганизмов, однако некоторые филогенетические группы бактерий обнаруживаются в большинстве исследованных почвах: Actinobacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria, Gemmatimonadetes, Deinococcus-Thermus, и Cyanobacteria [124]. Методы высокопродуктивного секвенирования выявили еще более высокое филогенетическое разнообразие микроорганизмов в антарктических почвах [125]. Ближайшие гомологи многих выявленных микроорганизмов были ранее детектированы в холодных местах обитания, некоторые из них, например Psychrobacter, были найдены только на территории Антарктического континента. Таким образом, несмотря на суровые климатические условия, на территории антарктического континента могут формироваться различные микробные сообщества. Некоторые сообщества микроорганизмов Антарктиды, населяющие почвы, морские или пресные водоемы, достаточно подробно изучены, в то время как другие, например, экосистемы поверхностных снегов или ледниковой толщи, остаются малоизученными. Немногочисленные исследования микроорганизмов снежных 37 экосистем в основном касались снегов центральных районов Антарктиды и были выполнены на недостаточно высоком методологическом уровне. В то же время, до сих пор практически ничего не известно о микробном разнообразии поверхностных снегов прибрежной части антарктического континента. С появлением методов секвенирования нового поколения появилась возможность провести комплексные исследования таксономического состава и функционального потенциала сообществ снежных микроорганизмов Антарктиды, результаты которых представлены в настоящей работе. 38 Материалы и методы Характеристика районов исследования Образцы были отобраны в районе четырех прибрежных Российских антарктических станций: Дружная, Ленинградская, Мирный и Прогресс. Краткая характеристика климатических условий этих станций представлена в Таблице 1. Таблица 1. Основные климатические и географические показатели в районе антарктических станций Дружная, Ленинградская, Мирный и Прогресс. В таблице представлены основные метеорологические данные о четырех Российских антарктических станциях. На трех из четырех станций – Ленинградская, Мирный и Прогресс, осуществляются ежедневные метеорологические наблюдения, на станции Дружная метеорологические наблюдения не ведутся. Однако, она удалена на 150 км от станции Прогресс, поэтому по климатическим показателям эти две станции близки друг к другу. Станция Ленинградская характеризуется самыми низкими годовыми температурами, большим разнообразием направлений и скорости ветров (максимальная скорость достигает 52 м/с). Станция Мирный характеризуется сильными стоковыми ветрами в течение всего года. На станции Прогресс климатические условия наименее суровы, здесь наблюдается самая высокая среднегодовая температура, слабые ветра и наименьшее количество осадков (http://www.aari.aq/default_ru.html). Дружная Ленинградская Мирный Прогресс Географически е координаты 69°44' ю.ш. 72°42' в.д. 69°30' ю.ш. 159°23' в.д. 66°33' ю.ш. 93°01' в.д. 69°23'S ю.ш. 76°23' в.д. Высота над уровнем моря Нет данных 291 39,9 14,6 39 Средняя температура воздуха, oC Нет данных -14,6 -11,3 -9,2 Средняя температура поверхности земли, oC Нет данных -15,4 -11,7 -7,4 Среднее количество осадков, мм Нет данных 58,4 43,8 12,5 Средняя скорость ветра, м/с Нет данных 8,4 11,3 5,9 Станция Дружная является сезонной и посещается людьми каждый год в течение нескольких месяцев, станции Прогресс и Мирный работают круглогодично. Станция Ленинградская была законсервирована в 1991 году, после чего посещалась лишь один раз за два года до отбора проб снега, использованных в данной работе. Все четыре станции построены на выходах горных пород, которые в летний период частично освобождаются от снега. В районе станции Прогресс расположены несколько озер, свободных ото льда в летний период. Большую часть года станции отделены от открытой поверхности морской воды припайным льдом. Однако, в летние периоды на станциях Прогресс и Мирный припайный лед выносится из прилегающих бухт, таким образом частично или полностью открывая поверхность морской воды. Станция Дружная расположена на берегу моря в бухте Саннефьорд, которая вдается на сотни километров вглубь материка. Вся бухта постоянно покрыта многолетним морским льдом. Станция Ленинградская расположена на окраинной части Восточной Антарктиды на возвышенности (~300 м над уровнем моря). Берег Отса, на котором расположена станция Ленинградская, окружён многолетним льдом, который даже в летние месяцы простирается на сотни километров, таким образом отделяя станцию Ленинградская от открытой поверхности воды. 40 Расположение Российских антарктических станций, на которых проводился отбор снега, показано на Рисунке 5. Рисунок 5. Расположение четырех Российских антарктических станций, где были отобраны образцы поверхностного снега. Расстояние до открытой воды в период отбора проб на станции Мирный и Прогресс составляло несколько километров, на станции Дружная – около 150 км, на станции Ленинградская – 400 км. Методика отбора проб Образцы отбирали в ходе сезонной 54-ой Российской антарктической акспедиции (РАЭ) (декабрь 2008 г. - февраль 2009 г.) и 55-ой РАЭ (декабрь 2009 г. февраль 2010 г.). Во время первого сезона были отобраны образцы со станций Ленинградская и Дружная, во время второго сезона - в районе четырех станций Дружная, Прогресс, Мирный и Ленинградская. Образцы, собранные в ходе двух сезонов на станциях Дружная и Ленинградская, были взяты с одного и того же места с 41 точностью до нескольких метров. Контроль точности отбора проб производили с помощью GPS. Пробы отбирали на удалении нескольких километров от жилых помещений на станциях, в направлении противоположном господствующему направлению ветра [126]. Особые меры предосторожности принимались при отборе снега. Снег в количестве около 3 кг собирали с площадки 2х2 м в стерильные пакеты; стерильный костюм, перчатки, маска и очки использовались при каждом отборе образцов, как показано на Рисунке 6. Глубина отбора снега составляла 2-5 см. Основываясь на данных по среднегодовому количеству осадков (http://www.aari.aq/default_ru.html), возраст отбираемого снега составлял не больше одного года. Температура воздуха во время отбора образцов на каждой станции составляла от -5 до +1 оС. Для каждой станции снег собирали в трех повторностях с участков, находившихся на расстоянии около 50 м друг от друга. Собранные образцы смешивали, чтобы снизить вероятность случайных колебаний микроорганизмов из-за возможной неравномерности их распределения по поверхности снега. Рисунок 6. Отбор образцов снега. При отборе образцов использовали стерильный костюм, стерильные одноразовые перчатки, стерильную маску и очки для предотвращения попадания в образец биологического материала с поверхности кожи и одежды человека (на фото автор). 42 Первичная обработка проб в условиях лаборатории судна Образцы снега доставлялись на борт судна НИС «Академик Федоров» в течение не более, чем пяти часов после отбора. Снег растапливали в течение ночи при +4 oС (температура на палубе судна). Дальнейшая обработка проб велась в судовой лаборатории, где были установлены ультрафиолетовые лампы и оборудован стерильный микробиологический бокс. Концентрирование образцов талой воды производили в течение первых 24-х часов с момента отбора снега, чтобы избежать возможных количественных и качественных изменений в составе микроорганизмов. Растопленный снег содержал минимальное количество видимых частиц пыли, поэтому предварительно отфильтровывать образцы для отделения минеральных включений не требовалось. В качестве отрицательного контроля использовали деионизованную воду (в количестве 10 л). Образцы талой воды объемом около 10 л концентрировали до объема 10 мл путем прокачки перистальтическим насосом через систему тангенциальных фильтров Millipore Pellicon XL (Millipore, США) с диаметром пор 100 кДа. Полученный образец концентрированной талой воды дополнительно концентрировали до объема 2 мл с помощью Amplicon Ultra фильтров с диаметром пор 30 кДа (Millipore, США); половину объема полученного концентрированного препарата смешивали с глицерином до конечной концентрации 15% (о/о) и замораживали при -20 °С, а другую половину использовали для выделения тотальной ДНК и РНК. ДНК экстракция Выделение тотальной ДНК из образцов концентрированной талой воды проводили при помощи коммерческих наборов реактивов «DNA Blood&Tissue Kit» (Qiagen). 43 РНК экстракция Выделение тотальной РНК производили при помощи набора готовых реактивов «RNeasy Mini Kit» (Qiagen), следуя стандартному протоколу производителя, с модификациями, описанными в стандартном протоколе «RNeasy protect Bacteria Mini Kit» (Qiagen). Реакция обратной транскрипции 1 мкл тотальной РНК сообщества обрабатывали ДНКазой 1 (Invitrogen) и использовали как матрицу для постановки реакции обратной транскрипции с использованием набора готовых реактивов «SuperScript III One-Step RT-PCR System» (Invitrogen), следуя стандартному протоколу производителя. Праймер 27F (см. Таблица 2) использовали для наработки кДНК фрагмента генов 16S рРНК бактерий. ПЦР Реакционная смесь объёмом 20 мкл состояла из буферного раствора (20 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 10 мМ КСl, 10 мМ (NH4)2SO4, 2мМ MgSO4, 1% Triton X-100), дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (0,25 мМ), прямого и обратного праймеров (пo 0,5 мкМ), ДНК-матрицы (10 нг), Taq-ДНК-полимеразы (2,5 единицы активности). В качестве матрицы использовали плазмидную или геномную ДНК, либо колонии клеток, которые скалывали одноразовым наконечником автоматической пипетки и помещали в пробирку с реакционной смесью для ПЦР. Программа ПЦР включала 25-30 циклов, состоящих из 3-х этапов: 1) плавление ДНК (95 °С, 30 с.) 2) отжиг праймеров (50-65 °С – см. Таблицу 2, 30 с.) 3) амплификация ДНК фрагментов (72 °С, время определялось сообразно длине 44 фрагмента). Время амплификации в последнем цикле увеличивали до 5 – 10 мин. Полученные ПЦР-продукты хранили при -20 °С. Для определения таксономической принадлежности изолятов бактерий и клонирования случайных фрагментов генов 16S рРНК использовали праймеры 27F1492R [127], для создания библиотек фрагментов V3-V4 генов 16S рРНК для высокопроизводительного секвенирования использовали праймеры 341F-805R [128], для амплификации фрагментов генов 16S рРНК цианобактерий использовали праймеры CYA106F/CYA359F-CYA781R(a)/CYA781R(b) [129], для амплификации фрагментов генов 16S рРНК архей использовали праймеры 21F-958R [130], для амплификации вставки в плазмиде pGEM-T использовали праймеры М13F-M13R (pGEM-T easy vector kit, Promega), для амплификации фрагментов, содержащих последовательности спейсеров из CRISPR кассет Flavobacterium psychrophilum, использовали праймеры Flavo_F и Flavo_R. Праймеры для ПЦР Таблица 2. Последовательности праймеров для проведения ПЦР и реакции обратной транскрипции. В таблице дана расчетная температура отжига для каждого праймера. Название праймера Последовательность, п.о. Температура отжига, oC 27F 1492R 341F 805R CYA106F CYA359F CYA781R(a) CYA781R(b) 21F 958R AGAGTTTGATCCTCCCTCAG ACGGCTACCTTGTTACGACTT CCTACGGGNGGCWGCAG GACTACHVGGGTATCTAATCC CGGACGGGTGAGTAACGCGTGA GGGGAATYTTCCGCAATGGG GACTACTGGGGTATCTAATCCCATT GACTACAGGGGTATCTAATCCCTTT TTCCGGTTGATCCYGCCGGA YCCGGCGTTGAMTCCAATT 53,5 56,1 60,1 51,3 63,5 57,9 55,5 55,4 62,6 56,6 45 M13F M13R Flavo_F Flavo_R TGTAAAACGACGGCCAGT AGGAAACAGCTATGACCA CAAAATTGTATTTTAGCTTATAATTACCAAC TACAATTTTGAAAGCAATTCACAAC 54,4 50,4 51,1 51,4 Электрофорез в агарозном геле ДНК пробы смешивали с буфером для нанесения, содержащего 50% глицерина и 0,025% бромфенолового синего, и наносили на гель (0,8-2,0% агарозы) под слой электрофорезного буфера ТАЭ (40 мМ Трис, 20 мМ уксусная кислота, 1мМ ЭДТА, рН 8,4). Электрофорез проводили при напряжении электрического тока 60-150 В. Очистка фрагментов ДНК из агарозного геля Полоску геля, содержащую необходимый фрагмент ДНК, вырезали с помощью стерильного скальпеля и помещали в стерильную пробирку. Для выделения ДНК из геля использовали набор "DNA Extraction Kit" (Qiagen), и точно следовали указаниям, приведенным в методическом руководстве к набору. Конструирование библиотеки клонов гена 16S рРНК Клонирование библиотек фрагментов генов 16S рРНК в вектор pGEM®-T Easy Vector System («Promega», США) проводили согласно рекомендациям производителя. Приготовление химически компетентных клеток E. coli 46 Для приготовления химически компетентных клеток использовался кальциевый метод [131]. В 100 мл теплого SOB инокулировали 500 мкл (1:200) ночной культуры. Клетки помещали на качалку и инкубировали при 37 oC до достижения оптической плотности 0,3-0,4. После этого клетки резко охлаждали на водяной бане со льдом и далее все операции проводили на льду. Охлажденную культуру переносили в заранее охлажденные центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 10 минут при 4 ºC, 3000 об./мин. Супернатант декантировали, осадок ресуспендировали в 45 мл холодного 0.1 М CaCl2 и инкубировали в течение 40 мин. Затем центрифугировали еще раз при тех же условиях. Осадки аккуратно ресуспендировали в 2 мл 0.1 М CaCl2 и затем добавляли стерильный 50%-ый раствор глицерина до конечной концентрации ~20-25%. Далее клетки разделяли на аликвоты по 200 мкл и переносили на -70 ºС. Трансформация компетентных клеток E. coli 200 мкл замороженной суспензии клеток E. coli dh5α размораживали во льду в течение 30 мин. Добавляли ДНК (5 мкл лигазной смеси). Инкубировали во льду 30 мин. Затем выдерживали клетки при 42 °С в течение 40 с. и сразу охлаждали во льду в течение 15 мин. Добавляли подогретую (37 oC) жидкую среду SOC до 0,5 мл и инкубировали при легком покачивании при 37°С 60 мин. На чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей соответствующий антибиотик, засевали по 100 мкл суспензии. Чашки Петри помещали в термостат на 37 °С на ночь. Питательные среды Аликвоты концентрированной талой воды (100 мкл) высевали на агаризованную питательную среду. Использовали два типа сред – R2A (дрожжевой экстракт - 0,05%, пептон – 0,05%, казаминовые кислоты – 0,05%, глюкоза – 0,05%, растворимый 47 крахмал – 0,05%, K2HPO4 – 0,03%, MgSO4x7H2O – 0,05%, пируват натрия – 0,03%) и LB (бактотриптон - 1%, дрожжевой экстракт - 0,5%, NaCl - 1%). Для получения твёрдых сред добавляли 1,5% агара. Чашки Петри инкубировали при трех температурах - +4 oC, +18 oC и +37 oC. Перед высевом на +4 и +18 oC, чашки охлаждали в холодильнике. Для приготовления компетентных клеток использовали среду SOB: 2% бактотриптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, после стерилизации среды автоклавированием добавляли 10 мМ MgSO4. Для приготовления питательной среды SOC использовали среду SOB с добавлением стерильного раствора глюкозы до конечной концентрации 20 мМ. Подсчет численности микроорганизмов Общую численность микроорганизмов определяли методом прямого счета с флуоресцентными красителями. Аликвоту образца концентрированного талого снега окрашивали красителем «LIVE/DEAD BacLight» (Invitrogen) согласно протоколу, указанному производителем. После окрашивания 10 мкл суспензии наносили на предметное стекло, растирали стерильной микробиологической петлей на площади 1 см2, подсушивали и накрывали покровным стеклом. Далее под микроскопом Carl Zeiss Axioskop 2 Plyus (Carl Zeiss, Германия) с люминесцентной приставкой производили учет количества клеток в поле зрения. Для каждого образца делали три препарата, для каждого препарата просматривали 30 полей зрения. Численность клеток микроорганизмов определяли по формуле: N = (x×S1×10k)/(S2×V), Где N – численность микроорганизмов (кл/мл), х – среднее число клеток в поле зрения, k – номер разведения (начиная с первого), S1 – площадь препарата на предметном стекле (мм), S2 – площадь поля зрения в микроскопе (мм), V – объем суспензии, наносимой на стекло. 48 Стандартную ошибку измерений рассчитывали по формуле: , где St – стандартное отклонение, М – среднее значение показателя, Xi – среднее арифметическое показателя, N – количество измерений. Измерение включения радиоактивно меченных тимидина и лейцина в клетки Измерение включения радиоактивно меченных тимидина и лейцина проводили по методике, описанной в работе Карпентера и соавторов [5]. Снег с глубины 1-5 см собирали в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 50 мл. Для внесения метки использовали стерильный шприц, иголку которого предварительно загибали книзу, чтобы струя жидкости разбрызгивалась в разные стороны и равномерно орошала снег. К образцу снега добавляли 0,5 мл [метил-3H]тимидина (молярная активность 55 Ки/ммоль) или 0,5 мл [3H]L-лейцина (молярная активность 35 Ки/ммоль). Пробирки оставляли непосредственно на месте сбора притопленными в снег на 90 мин., после чего к образцу добавляли несколько мл 50% ТХУ до конечной концентрации 5%. Образцы немедленно растапливали, после чего осаждали на нитроцеллюлозный мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Мембраны высушивали в течение нескольких часов и затем хранили при + 4 оC. В качестве отрицательного контроля использовали образец снега, к которому сразу перед внесения метки добавляли 50% ТХУ. Каждое измерение делалось в трех повторностях. Мембраны помещали в сцинцилляционный флакон, содержащий 10 мл толуольного сцинциллятора (4 г. 2,5-дифенилоксазола, 0,1 г. 1,4-ди-2(5- фенилоксазолин)бензола, 1 л. толуола), выдерживали 30 мин. при +4 oC и помещали в сцинцилляционный счетчик. Расчет интенсивности включения проводился по формуле: [methyl-3H-thymidine] пмоль/л×ч = k×(DPM/2200)×(1000/V)×(1/SA)×(60/T), где: 49 PM – количество включений в минуту (показания прибора), V – объем образца, SA – молярная активность, T – время инкубации, k - конвертирующий коэффициент, для образцов снега k = 2×1018 кл/моль. Стандартную ошибку измерений рассчитывали по формуле: , где St – стандартное отклонение, М – среднее значение показателя, Xi – среднее арифметическое показателя, N – количество измерений. Секвенирование ДНК фрагментов Последовательности ДНК клонированных фрагментов 16S рРНК гена и амплифицированных фрагментов генов 16S рРНК на матрице клеток бактерий, давших рост колоний на питательной среде, определяли на автоматическом 16-ти капиллярном секвенаторе Applied Biosystems 3130xl (Applied Byosistems, США) с набором реагентов наборы реактивов для проведения реакций BigDye v.3.1 (Applied Byosistems, США) в Институте Вирусологии им. Виноградского. Выходная длина прочтений составила 1000 п.о. Секвенирование библиотек фрагментов V3-V4 гена 16S рРНК, амплифицированных спейсеров CRISPR кассет Flavobacterium psychrophilum, а также метагеномное секвенирование случайных фрагментов ДНК проводили на платформе Illumina MiSeq с набором реагентов MiSeq reagent kit v.2 (Illumina, США) в лаборатории эволюционной геномики Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова. Секвенирование и предварительная очистка прочтений проводились согласно [132]. Выходная длина прочтений составила 250 п.о. Предварительная обработка прочтений 50 Прочтения, полученные в ходе секвенирования по Сэнгеру, в формате .ab1 обрабатывали с помощью программы 4Peaks (www.nucleobytes.com). Прочтения, полученные в ходе высокопроизводительного секвенирования, обрабатывали с помощью программы CLC Genomics Workbench 6 (CLC Bio-Qiagen, Aarhus, Дания). Прочтения подвергали обрезанию по качеству: все позиции начиная с 5' конца удаляли вплоть до первой высококачественной позиции, последовательности адаптеров удаляли с обоих концов чтений. Все прочтения, длина которых после фильтраций стала меньше 50 п.о., отсеивались. Далее прочтения с обоих концов соединяли в единые последовательности. Затем, последовательности фильтровали по длине – для амплифицированных фрагментов V3-V4 гена 16S рРНК отсеивали последовательности длиной менее 400 п.о., для последовательностей случайных фрагментов из метагеномных библиотек отсеивали последовательности длиной менее 50 п.о. Филогенетический анализ Оценку сходства последовательностей гена 16S рРНК изолятов бактерий проводили с помощью программы Blastn на веб-сервере NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Последовательности, содержащие клонированные фрагменты гена 16S рРНК фильтровали от химерных последовательностей с помощью инструмента «UCHIME» и анализировали с помощью пакета программ «RDP Classifier» [133]. Последовательности, содержащие амплифицированные фрагменты V3-V4 гена 16S рРНК, анализировали с помощью пакета программ «RDPipeline Classifier» по схеме «16S Supervised Workflow» [133, 134]. Последовательности, содержащие случайных фрагментов из метагеномных библиотек, анализировали с помощью пакета программ MG-RAST «Best hit Classification» [135]. 51 Функциональный анализ Чтения, содержащие случайных фрагментов из метагеномных библиотек, анализировали с помощью пакета программ MG-RAST «Hierarchical classification» [135]. Эта программа предсказывает гены на основе FragGeneScan, а затем проводит поиск их гомологов с помощью BLAT в собственной объединенной базе данных, которая интегрирует несколько внешних баз данных – GenBank, KEGG, COG, SEED и UniProt. Генам, имеющим совпадение в объединенной базе данных, были присвоены несколько функциональных категорий, соответствующих разным уровням подсистем [135]. Сравнение функциональных категорий генов в образцах из различных экосистем проводили с помощью биоинформатической программы статистической обработки данных STAMP [136]. Файлы в формате .biom, содержащие информацию о сравниваемых категориях генов между образцами, получали с помощью программы MG-RAST «Hierarchical classification» [135] и импортировали в STAMP. Статистически значимые отличия между двумя группами метагеномов мы определяли с помощью Welch's t-test, поправка (коррекция) на множественное тестирование проводилось с помощью FDR (Behjamimi Hochberg) [137]. Внешние источники метагеномных данных Для сравнительного анализа функциональных категорий генов были привлечены внешние данные по биоразнообразию микроорганизмов в природных экосистемах наборы фрагментов ДНК полногеномных чтений, находящиеся в общедоступной базе данных MG-RAST. Поиск последовательностей CRISPR-Cas 52 Поиск последовательностей CRISPR локусов в случайных фрагментах ДНК из метагеномных библиотек проводили с помощью программы CRASS с параметрами, установленными по умолчанию [138]. Поиск соответствий нуклеотидной базе данных GenBank последовательностей спейсеров и повторов осуществляли с помощью биоинформатической программы Blastn+, встроенной в биоинформатический интернет-ресурс Galaxy. Анализ последовательностей спейсеров в CRISPR локусах Последовательности фрагментов CRISPR кассет F. psichrophillum амплифицировали с праймерами Flavo_F и Flavo_R (см. Таблица 2), полученный препарат разделяли с помощью гель-электрофореза в агарозном геле, фрагменты длиной от 200 п.о. до 500 п.о. очищали из геля и подвергали высокопроизводительному секвенированию, как указано выше. Глубина прочтения для каждого образца составляла 500 000 пар прочтений. Предварительную обработку прочтений проводили с помощью программы CLC Genomics Workbench 6 (CLC BioQiagen, Aarhus, Дания) как указано выше. Последовательности спейсеров из ДНК фрагментов, содержащих CRISPR кассеты, извлекали биоинформатически с помощью пакета IRanges DNAStringSet в среде статистических вычислений R. Объединение схожих по последовательности спейсеров в кластера спейсеров проводили с помощью алгоритма кластеризации Kmean [139], диаметр кластеров (максимальное допустимое число замен между спейсерами внутри одного кластера) составлял 5 п.о., конечный набор кластеров для каждого образца не содержал идентичных кластеров. Для попарного сравнения сетов кластеров спейсеров между образцами создавали локальные базы данных из наборов спейсеров каждого образца с помощью биоинформатической программы blastmkdb пакета Blast+, установленной в виде пакета утилит для командной строки. Сравнение спейсеров из разных баз данных проводили с помощью биоинформатической программы blastn пакета Blast+ [140]. Поиск соответствий кластеров спейсеров с 53 последовательностями в базах данных nt и env_nt GenBank осуществляли с помощью биоинформатической программы blastn пакета Blast+, встроенного в биоинформатический интернет-ресурс Galaxy [141-143]. Поиск протоспейсеров проводили с помощью биоинформатической программы «CRISPRTarget online tool» [144]. Поиск PAM мотива проводили с помощью биоинформатической программы «WebLogo» [145]. Статистический анализ Коэффициент корреляции Пирсона рассчитывали по формуле: ; где r – коэффициент корреляции Пирсона, t – число связанных рангов в ряду двух сравниваемых множеств, n – число рангов. Оценка достоверности различий проводилась с помощью p-value. P-value рассчитывали с помощью tdist() функции в программе Microsoft exel [146]. Индекс видового разнообразия Шеннона (H) и индекс доминирования Симпсона (C) для сообществ микроорганизмов в каждом образце определяли с помощью пакета программ «Shannon and Chao1 index RDP» [133]. При оценке покрытия (отношение числа обнаруженных видов к истинному числу видов, составляющих сообщество) библиотек фрагментов генов 16S рРНК, использовали две непараметрические оценки. 1) Оценка покрытия, рассчитанная по формуле Гуда [147]: , где F1 – число последовательностей, принадлежащих к видам, встречающихся в библиотеках один раз; n – число всех последовательностей в библиотеке. 2) Оценка покрытия, рассчитанная по формуле Чао [148]: , 54 где F1 – число последовательностей, принадлежащих к видам, встречающихся в библиотеках один раз; – общее число последовательностей, принадлежащих к видам, встречающимся в библиотеке 10 раз или реже. Кривые насыщения были посчитаны и визуализированы с помощью пакета «vegan» (функция «rarecurve») в среде статистических вычислений R, количество итераций – 1000, все параметры - стандартные. 55 Результаты и обсуждение Часть 1. Изучение разнообразия бактерий микробиологическими методами и методом молекулярного клонирования Микробиологический анализ образцов талого снега в районе станций Ленинградская и Дружная Изучение микробных сообществ в образцах снега Антарктиды было начато с оценки количества микробных клеток. Оценивали количество микробных клеток в образцах, собранных со станций Ленинградская и Дружная в 54-м и 55-м сезонах Российской антарктической экспедиции (РАЭ). Так как эти станции находятся на удалении 3000 км друг от друга, параллельный анализ должен был дать представление о вариации численности бактерий в заведомо независимых образцах поверхностного снега Восточной Антарктиды. Снег в районе обеих станций был отобран дважды с разницей в один год. Таким образом, имелась возможность судить о вариациях в численности микроорганизмов в одном и том же месте от года к году. Методом прямого подсчета бактериальных клеток с помощью люминесцентной микроскопии было обнаружено 1,0×103 бактериальных клеток на мл (кл/мл) талого снега на станции Ленинградская и 4,6×104 кл/мл для станции Дружная (Таблица 3). Полученные данные находятся в пределах ранее опубликованных измерений для образцов поверхностного снега полярных широт и высокогорных вечных снегов, где обнаруживали от 102 до 106 клеток на мл талой воды [5-7, 55]. 56 Таблица 3. Результаты прямого микроскопического исследования образцов талого снега со станций Дружная и Ленинградская, отобранных в ходе 54-го и 55-го сезонов РАЭ. В правом столбце представлены результаты подсчета бактерий с указанием стандартной ошибки. Стандартную ошибку измерений рассчитывали согласно формуле, указанной в разделе «Материалы и методы». Станция (сезон) Дружная (54-й сезон) Ленинградская (54-й сезон) Дружная (55-й сезон) Ленинградская (55-й сезон) Подсчет клеток в световой микроскоп, кл/мл (4,6±0,47)×104 (3,7±0,46)×104 (5,6 ±,0,7)×103 (1,0±0,12)×103 Параллельно с микроскопическим анализом, изучалась способность бактерий из талой воды к росту в лабораторных условиях. Определяли способность к росту и образованию колоний на чашках с твердыми средами R2A (бедная по углероду среда) и LB (богатая по углероду среда) на трех температурах +4 oC, +18 oC, +37 oC. Количество культивируемых бактерий в образцах было крайне низким и соответствовало 0-1,2 к.о.е./мл талой воды. Бактерии из колоний, образовавшихся на +4 оС или +18 оС, также образовывали колонии при пересеве на +37 оС. Таким образом, ни один из культивируемых антарктических микробов не был облигатным психрофилом. Для морфологически таксономическую отличных принадлежность друг от образовавших друга их колоний бактерий определяли с помощью определения и анализа последовательности фрагмента гена 16S рРНК. Среди изолятов были представители классов Gammaproteobacteria (Stenotrophomonas sp., Pseudomonas sp.), Alphaproteobacteria (Phyllobacterium sp., Roseococcus sp.), Actinobacteria (Rhodococcus sp., Microbacterium sp.) и Bacilli (Bacillus sp.) . Как видно из Таблицы 4, наибольшее разнообразие культивируемых бактерий наблюдалось на станции Ленинградская. Интересно, что культивируемые бактерии в образцах, отобранных в одном и том же месте с разницей в один год, были совершенно различными. 57 Таблица 4. Таксономический анализ культивируемых бактерий из образцов поверхностного снега Антарктики. В таблице представлены бактерии, образовавшие колонии при инкубации на указанных температурах. Инкубация +4 oC Дружная 54-й сезон Bacillus sp. Инкубация +18 oC Bacillus sp. Дружная 55-й сезон Ленинградская 54-й сезон Ленинградская 55-й сезон Инкубация +37 oC Bacillus sp. Stenotrophomonas sp. Bacillus Bacillus sp., Microbacterium Bacillus sp., Microbacterium sp., Phyllobacterium Pseudomonas Pseudomonas myrsinacearum, fluorescens, fluorescens, Roseococcus Rhodococcus Rhodococcus Pseudomonas erythropolis erythropolis koreensis, Rhodococcus sp. Ochrobactrum Acinetobacter calcoaceticus, Ochrobactrum sp., Ochrobactrum sp., Comamonas Acinetobacter sp. Acinetobacter sp. Stenotrophomonas Methylobacterium Sphingomonas sp. sp., sp., sp., sp., sp., sp., sp., Для образцов со станции Дружная в ходе 54-й экспедиции детектировали рост Bacillus sp., а в ходе 55-й экспедиции - Stenotrophomonas sp. В образцах, собранных на станции Ленинградская в ходе 54-й экспедиции, были получены колонии, образованные восьмью различными видами бактерий, ни один из которых не был обнаружен в образце, собранном на следующий год. По-видимому, состав культивируемого микробного сообщества на поверхности снега в одном и том же месте может значительно изменяться от года к году. 58 Анализ таксономического состава микробного сообщества поверхностного снега в районе станций Ленинградская и Дружная Менее 1% бактерий, присутствующих в природных образцах, было получено в чистых культурах [8]. Поэтому для оценки разнообразия снежных бактерий Антарктиды были приготовлены использованы четыре библиотеки молекулярно-генетические клонов фрагментов методы. генов 16S Были рРНК, амплифицированных с препаратов ДНК, выделенных из талого снега, собранного на станциях Ленинградская и Дружная в ходе 54-й и 55-й РАЭ. Фрагменты генов 16S рРНК бактерий длиной примерно 1500 п.о. амплифицировали с помощью вырожденных бактериальных праймеров 27F и 1492R, широко используемых для изучения разнообразия микробных сообществ [127]. Амплифицированные фрагменты клонировали в плазмиду pGEM-T, а затем определяли последовательности вставок в случайно выбранных индивидуальных рекомбинантных плазмидных клонах. Всего было проанализировано около 450 клонов (Таблица 5). Таблица 5. Количественные показатели для сообществ бактерий в четырех образцах поверхностного снега. Для каждого образца, название которого указано в левой колонке, приведены основные статистические характеристики полученных библиотек клонов генов 16S рРНК. Название станции Дружная, 54-й сезон Ленинградская , 54-й сезон Дружная, 55-й сезон Ленинградская , 55-й сезон Число клонов Число родов бактерий Покрытие (C), % Покрытие (Cace), % Индекс Индекс Шеннона Симпсона (H) (C) 96 18 93 78,4 2,34 0,13 114 23 94,8 89,8 2,49 0,12 114 10 95,6 95,7 1,75 0,24 130 18 98,3 87,5 2,26 0,13 59 Для того, чтобы определить таксономическую принадлежность микроорганизмов в образцах мы сравнили последовательности вставок клонированных фрагментов 16S рРНК генов с последовательностями в базе данных RDP, как описано в «Материалах и методах». В библиотеках клонов, приготовленных из образцов со станции Дружная (54-й сезон), Ленинградская (54-й сезон), Дружная (55-й сезон) и Ленинградская (55-й сезон), обнаружили последовательности, соответствующие 18, 23, 10 и 18 различным родам бактерий, соответственно. Покрытие для библиотек клонов со станции Ленинградская по двум стандартным статистическим оценкам Гуда и Чао составляло 89,8% и 94,8% для 54-го сезона, и 98,3% и 87,5% для 55-го сезона; для станции Дружная – 78,4% и 93% для 54-го сезона, и 95,6% и 95,7% для 55-го сезона, т.е., было выше средних значений этих оценок, считающихся необходимыми для достоверной характеристики разнообразия в библиотеках [149]. Индекс Симпсона, который является мерой выровненности представленности таксонов внутри сообщества, для всех четырех библиотек был достаточно низким, т.е., ни одна из филогенетических групп не доминировала в образцах и, следовательно, не вносила серьезных искажений в общее разнообразие. Индекс Шеннона, который оценивает таксономическое разнообразие в образце с учетом вклада каждого таксона в сообщество, изменялся от 1,75 до 2,49 в образцах со станции Дружная 54-го сезона и Ленинградская 55-го сезона, соответственно. Полученные значения характерны и для других снежных и ледниковых сообществ [150, 151]. Для сравнения, в более сложных микробных сообществах, например, из почв, индекс Шеннона варьирует от 2,4 до 3,6 [152, 153]. Таким образом, микробные сообщества снегов гораздо более простые, чем почвенные сообщества. Как показано на Рисунке 7, в библиотеках клонов гена 16S рРНК были идентифицированы представители Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, восьми классов Gammaproteobacteria, бактерий: Deltaproteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Verrucomicrobiae и Firmicutes. Betaproteobacteria были самым многочисленным классом и составляли от 39,3% до 82,5% от общего числа клонов на станции Ленинградская (54-й сезон) и Дружная (55-й сезон), соответственно. В образце со станции Дружная 54-го сезона второй по численности 60 таксономической группой были Alphaproteobacteria, а в 55-го сезоне – Gammaproteobacteria. На станции Ленинградская 54-го сезона Alphaproteobacteria составляли треть всей библиотеки клонов, однако через год их доля в сообществе составила всего 13,8%, в то же время доля Gammaproteobacteria возросла с 12,3% до 22,3%. Рисунок 7. Процентные соотношения классов бактерий в образцах снега со станций Дружная и Ленинградская, отобранных в ходе 54-й и 55-й РАЭ. На диаграмме представлена частота встречаемости клонов, содержащих амплифицированные фрагменты генов 16S рРНК классов указанных бактерий, в образцах с обеих станций. Как видно из Рисунка 8, Janthinobacteria, Prosthecobacter, Sphingomonas и Caulobacter были самыми многочисленными родами в образцах со станции Дружная 54-го сезона и составляли, соответственно, 24,2%, 12,6%, 12,6% и 10,5%. Год спустя, в образце, собранном на том же месте, доля Janthinobacteria выросла до 36%, а три других наиболее многочисленных рода прошлого года не были детектированы. В 61 образцах со станции Ленинградская самыми многочисленными в 54-м сезоне были представители родов Novosphingobium (21,4%), Janthinobacteria (14,3%), Acidovorax (12,5%) и Pseudomonas (9,8%), однако в образце 55-го сезона эти роды практически не детектировались, уступив место представителям родов Comamonas (20,8%), Rhodoferax (18,5%) и Ralstonia (13,1%). Рисунок 8. Анализ таксономической принадлежности ДНК последовательностей из четырёх библиотек клонов фрагментов генов 16S рРНК. Представлена частота встречаемости клонов, содержащих амплифицированные фрагменты генов 16S рРНК родов указанных бактерий, в образцах со станций Ленинградская (верхняя панель) и Дружная (нижняя панель). Высота столбца отражает процент последовательностей ДНК, соответствующих указанному роду бактерий. Светло-серыми столбца указаны результаты анализа 54-й экспедиции, темно-серыми – 55-й экспедиции. Звездочки над столбцами 62 означают, что бактерии данного рода были также обнаружены культуральным методом. Скобками объединены роды бактерий, относящиеся к одному и тому же классу, название которого дано ниже скобки. Сравнительный анализ таксономического состава бактерий в образцах двух сезонов с помощью расчета коэффициента корреляции Пирсона выявил среднюю корреляцию на станции Дружная (r = 0,54, p-value < 0,05), и отсутствие корреляции на станции Ленинградская. Между образцами на станции Ленинградская и Дружная, собранными в ходе 54-й РАЭ, была получена средняя корреляция (r = 0,52, p-value < 0,05), однако для образцов 55-го сезона корреляции не было. Таким образом, микробные сообщества снега различаются как между двумя станциями, так в пределах одной станции, по крайней мере в течение 12 месяцев. Содержание питательных веществ на поверхности снега крайне мало. Автотрофные прокариотические организмы, способные синтезировать органические молекулы, могли бы играть важную роль в снежной экосистеме, выступая в качестве первого звена питательной цепи. Такими автотрофными организмами являются цианобактерии, представители которых ранее были неоднократно детектированы на поверхности снега Антарктиды [5, 14]. Однако последовательности 16S рРНК генов цианобактерий в полученных нами библиотеках клонов обнаружены не были. Это может указывать на их незначительное количество в наших образцах. Также возможно, что использованные вырожденные бактериальные праймеры к генам 16S рРНК были менее эффективны для амплификации генов цианобактерий. Для направленной амплификации фрагментов генов 16S рРНК цианобактерий мы использовали ранее описанные специфические праймеры [129]. С этими праймерами нам удалось получить незначительное количество ампликонов из образцов талой воды со станций Ленинградская и Дружная 54-го сезона. Большая часть клонированных последовательностей, амплифицированных с помощью специфических к генам цианобактерий праймеров, были сходны с последовательностями Phormidium и Anabaena. Остальные последовательности были сходны с последовательностями ДНК хлоропластов одноклеточной водоросли Chlorella sacchatophila. Ближайшие 63 родственники этой водоросли были найдены в леднике Миттиваккат в Гренландии и в поверхностном льду озера Вида в Антарктиде. В целом, результаты указывают на то, что количество цианобактерий или фотосинтезирующих водорослей в проанализированных образцах крайне незначительно. Препараты ДНК, выделенные из образцов поверхностного антарктического снега, были также исследованы на наличие гена 16S рРНК архей. В предыдущих работах наличие ДНК архей было показано в полярных морских водах [154] и в высокогорьях Арктики [155]. С другой стороны, последовательности архей не были обнаружены в библиотеках клонов в образцах поверхностного снега ледника Монт Бланк (Франция) [156]. ПЦР с праймерами, специфичными к гену 16 рРНК архей [130], не привела к получению продукта амплификации ни для одного из изученных нами образцов, что может означать их крайне незначительное количество или полное отсутствие. В образцах 54-го сезона не было найдено совпадений между бактериями, найденными в изолированными ходе анализа библиотек микробиологическим фрагментов методом. генов Единственным 16S рРНК, и исключением оказался род Pseudomonas со станции Ленинградская, который детектировался обоими методами. Напротив, для большинства выделенных из образцов 55-го сезона бактерий были обнаружены соответствия при анализе библиотек 16S рРНК этого сезона. Анализ таксономического состава активно транскрибирующих бактерий Препараты тотальной ДНК, приготовленные из образцов поверхностного антарктического снега, содержат генетический материал как живых активно размножающихся, так и покоящихся форм и мертвых клеток бактерий. Одним из показателей жизнеспособности бактериальных клеток может служить высокое содержание РНК, в частности, рибосомальной РНК. Чтобы выявить такие бактерии, мы создали и проанализировало библиотеку клонов кДНК, полученную с 16S рРНК 64 снежных бактерий. Для этого из тотальной РНК, выделенной из образцов со станций Дружная и Ленинградская 55-го сезона, синтезировали кДНК, используя праймер, специфический к консервативному участку 16S рРНК, а затем амплифицировали полученные последовательности. Покрытие кДНК библиотек для станций Дружной и Ленинградской составило, соответственно, 94,4% и 96,7%. В отличие от молекул геномной ДНК, которые присутствуют в клетке в количестве нескольких копий, в живых клетках могут содержаться тысячи рибосом и, соответственно, молекул 16S рРНК. Поэтому можно ожидать непропорциональное увеличение количества в библиотеках клонов кДНК последовательностей активных бактерий, находящихся на поверхности снега [157]. Из Рисунка 9 видно, что таксономический состав находящихся на поверхности снега бактерий, определенный по составу рДНК и рРНК библиотек, значительно различается и какие-либо корреляции не прослеживаются. Микроорганизмы, число которых невелико судя по анализу ДНК, могут доминировать в РНК библиотеках, таким образом, анализ последовательностей 16S рДНК не является надежным для выявления активно растущих микроорганизмов, которые могут быть выявлены путем анализа РНК. 65 Рисунок 9. Анализ таксономической принадлежности последовательностей фрагментов генов 16S рРНК, полученных после амплификации на матрицах ДНК или РНК бактерий. На диаграмме представлена частота встречаемости клонов, содержащих амплифицированные фрагменты генов 16S рРНК родов указанных бактерий, в образцах со станций Ленинградская (верхняя панель) и Дружная (нижняя панель) 55-го сезона РАЭ. Высота столбца отражает процент последовательностей ДНК, соответствующих указанному роду бактерий. Светло-серыми анализа последовательностей 16S столбцами рДНК, на обеих панелях темно-серыми указаны результаты столбцами – результаты анализа последовательностей 16S рРНК. Звездочки над столбцами означают, что бактерии данного род были также найден культуральным методом. Скобками объединены роды бактерий, относящиеся к одному и тому же классу, название каждого класса дано под скобками. Сводные результаты анализа образцов со станций Дружная и Ленинградская 55го сезона показаны в Таблице 6. 66 Таблица 6. Анализ представленности клонов, содержащих амплифицированные фрагменты генов 16S рРНК родов указанных бактерий и представленности бактерий, найденных культуральным методом, в образцах поверхностного снега со станций Ленинградская и Дружная. Красным цветом выделены роды бактерий, которые были обнаружены в библиотеках клонов, полученных на матрицах ДНК и кДНК, синим цветом выделены роды бактерий, которые были обнаружены в библиотеках клонов, полученных на матрице кДНК. Плюсом отмечены роды бактерии, которые образовывали колонии на чашках с питательными средами. Achromobacter Acidovorax Acinetobacter Aquabacterium Aquaspirillum Arthrobacter Bacillus Burkholderia Caulobacter Comamonas Corynebacterium Duganella Flavisolibacter Janthinobacterium Methylobacterium Moraxella Phaselicystis Polaromonas Pseudomonas Ralstonia Rhizobium Rhodobacter Rhodoferax Sphingomonas Stenotrophomonas Variovorax В обоих Станция Ленинградская ДНК РНК культиви анализ анализ рование 0 0 1 0 4 3 + 0 1 1 0 0 0 1 0 5 0 10 4 27 15 + 0 2 0 0 0 2 2 0 0 2 + 1 0 0 0 5 0 9 2 17 0 1 0 1 0 24 0 6 28 + 15 11 + 0 2 образцах присутствовали роды Станция Дружная ДНК РНК культиви анализ анализ рование 0 1 0 0 0 0 0 0 5 3 3 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 3 41 5 0 2 0 0 0 0 1 0 13 7 37 0 0 0 0 0 0 0 0 7 4 0 + 0 8 бактерий, детектированные в библиотеках, полученных как на основе ДНК, так и кДНК: Acinetobacter, 67 Aquaspirillum, Caulobacter, Comamonas, Janthinobacterium, Pseudomonas, Sphingomonas и Stenotrophomonas. Роды Achromobacter, Aquabacterium, Corynebacterium, Methylobacterium и Variovorax были обнаружены при анализе библиотек клонов полученных на матрице кДНК, однако не были выявлены при анализе библиотек клонов, полученных на матрице ДНК в образцах с обеих станций. Бактерии, последовательности ДНК которых обнаруживались среди клонов из библиотек кДНК, согласно литературным источникам, часто ассоциированы с холодными местами обитания. Так, Variovorax paradoxus может расти при низких температурах и является постоянным представителем снежных экосистем [7]. Sphingomonas, Pseudomonas, Methylobacterium, Flavisolibacter, и Stenotrophomonas были многократно обнаружены на поверхности снегов и в толще ледников в Тибете [4, 7, 106, 150, 151, 158]. Представители Corynebacterium были обнаружены в вечной мерзлоте и в антарктических почвах [159, 160]. Aquabacterium, Aquaspirillum, Comamonas, Janthinobacterium, Acinetobacter, обнаруженные нами в обоих типах библиотек клонов были ранее детектированы в различных холодных экосистемах, например в тибетских ледниках и антарктических озерах [7, 150, 151, 158, 161]. Caulobacter, Ralstonia, Burkholderia, Curvibacter, Polaromonas, Bacillus, Pedobacter, Arthrobacter, Microbacterium и Flavobacterium, которые были обнаружены только в библиотеках клонов, полученных на матрице ДНК, ранее были детектированы на поверхности снегов и в толще ледников в Тибете и Японии [4, 7, 150, 151]. Mitsuria, Phaselicistis, Grimontella, и Arcicella, обнаруженные нами в библиотеках клонов, полученных на матрице ДНК, ранее не были найдены в холодных экосистемах. Таким образом, совместный анализ библиотек клонов, полученных на матрицах ДНК и кДНК, позволяет получить более детальное представление о разнообразии бактерий на поверхности снега и о трофических уровнях в снежной экосистеме по сравнению с анализом библиотек одного типа. Анализ ДНК библиотек клонов позволяет детектировать все находящиеся на поверхности снега бактерии, и таким образом дает полное представление о таксономическом составе микроорганизмов, включая мертвых бактерий, которые могут служить источником питательных веществ для активных снежных микроорганизмов. Анализ РНК позволяет детектировать 68 бактерии, которые, скорее всего, активны в снегу или сохраняли активность во момент депонирования из воздуха. Определение скорости включения радиоактивномеченных тимидина и лейцина Для описанного в предыдущем разделе выделения РНК снег растапливали при температуре +4 оС в течение суток. Теоретически такая обработка могла приводить к активации бактерий, которые неактивны на снегу при отрицательных температурах, но способны возобновлять жизнедеятельность при температуре около 0 оС. Чтобы убедиться, что активные бактерии присутствуют в антарктическом снеге in situ, мы провели опыт по включению [метил-3H]тимидина и [3H]лейцина (Таблица 7). Тимидин включается в состав вновь синтезированных цепей ДНК, а лейцин - в состав белков. Таблица 7. Измерение включения радиоактивно меченных изотопов в образцах снега со станций Дружная, Ленинградская, Мирный и Прогресс, отобранных в 55-й сезон РАЭ. Включение радиоактивно меченых изотопов измерялась in situ, инкубация проводилась в течение 90 мин., обсчеты проводились по формуле, указанной в «Материалах и методах», стандартную ошибку рассчитывали по трем повторностям, как описано в «Материалах и методах». В таблице представлены значения измерений для контрольных и опытных образцов. Станция Включение метил-тимидина, пмоль/ч×л Включение лейцина, пмоль/ч×л контроль опыт контроль опыт Дружная 0,55 ±0,003 4,4 ±0,03 1,25 ±0,06 33,1 ±1,27 Ленинградская 0,36±0,007 4,6 ±0,09 0,53 ±0,07 20,8 ±2,68 Мирный 3,16 ±0,84 158,1 ±30,25 3,45 ±0,48 365,9 ±51,23 Прогресс 0,45 ±0,09 7,6 ±1,58 1,83 ±0,18 64,9 ±6,99 69 Включение радиоактивных изотопов варьировало в пределах 4,4 – 158,1 пмоль/ч×л для тимидина, и в пределах 20,8 – 365,9 пмоль/ч×л для лейцина. Уровень включения радиоактивных изотопов, на станции Мирный, сопоставим с таковым для образцов снега на поверхности льда высокогорного озера в Пиренеях и Альпах (25 пмоль/л×час тимидина, 226 пмоль/л×час лейцина [162]). На станциях Дружная, Ленинградская и Прогресс скорость включения радиоактивно меченых изотопов была в 20-30 раз ниже чем на станции Мирный. Минимальный уровень активности наблюдался на станции Ленинградская, которая среди четырех рассматриваемых станций имеет самую низкую среднегодовую температуру и самую большую скорость ветров. Однако, даже уровень включения на Ленинградской существенно превышал значения, полученные с образцами снега, отобранного на куполе Антарктиды (0,13 пмоль/л×ч для тимидина и 0,31 пмоль/л×ч для лейцина). Таким образом, нам удалось показать присутствие активных бактерий на поверхности антарктического снега in situ. 70 Часть 2. Изучение разнообразия антарктических микроорганизмов и особенностей их метаболизма анализом метагеномного секвенирования Анализ библиотек фрагментов генов 16S рРНК В первой части настоящей работы мы провели исследование таксономического состава бактерий поверхностного снега Антарктиды анализом библиотек клонированных фрагментов генов 16S рРНК. Такой анализ позволяет выявить лишь доминантные группы бактерий. Для более подробного описания таксономического состава микробных сообществ снега библиотеки амплифицированных фрагментов генов 16S рРНК были проанализированы методом высокопроизводительного секвенирования на платформе Иллюмина. Для проведения анализа использовали препараты тотальной ДНК, выделенные из проб, отобранных на станциях Дружная, Прогресс, Мирный и Ленинградская в ходе 55-й РАЭ и описанные в предыдущих разделах. После амплификации с универсальными праймерами фрагментов ДНК, содержащих вариабельные участки V3-V4 генов 16S рРНК, было получено около 50000 последовательностей фрагментов генов 16S рРНК для каждого из образцов, количественные показатели представлены в Таблице 8. Таблица 8. Количественные показатели для библиотек фрагментов V3-V4 гена 16S рРНК сообществ бактерий в четырех образцах поверхностного снега. Для каждого образца, название которого указано в левой колонке, приведены основные статистические характеристики полученных методом высокопроизводительного секвенирования библиотек фрагментов V3-V4 гена 16S рРНК. 71 Количество Количество последовате родов льностей бактерий рДНК Станция Индекс Шеннона (H) Индекс Симпсона (C) Покрытие библиотек, % (C) Дружная 39483 179 2,66 0,87 93 Ленинградская 61231 200 2,82 0,90 93 Мирный 50135 181 2,57 0,83 90 Прогресс 46261 194 2,51 0,81 76 Покрытие составило 93% для образцов со станции Дружная и Ленинградская, 90% для образца со станции Мирный и 76% для образца со станции Прогресс, что выше средних значений, необходимых для достоверной характеристики разнообразия в библиотеках [149]. Сравнивали результаты филогенетического анализа последовательностей генов 16S рРНК из образцов со станций Дружная и Ленинградская, полученных с помощью высокопроизводительного секвенирования, с полученными ранее данными анализа библиотек клонированных фрагментов этих генов. Оба метода давали сходные результаты на уровне классов: коэффициент корреляции представленности таксономических групп, полученных двумя методами для станции Дружная составил 0,99 (p-value < 0,05), для станции Ленинградская – 0,95 (p-value < 0,05). Однако, как видно из сравнения двух первых колонок рисунка 10А и 10Б, по результатам высокопроизводительного малопредставленных секвенирования классов, таких как произошло Flavobacteria, увеличение доли Alphaproteobacteria, Sphingobacteria, Cytophaga, и Actinobacteria, за счет уменьшения доли доминирующих Betaproteobacteria. 72 Рисунок 10. Анализ филогенетического разнообразия бактерий в образцах антарктического снега на уровне классов. А. На диаграмме представлена частота встречаемости клонов, содержащих амплифицированные фрагменты генов 16S рРНК классов указанных бактерий в образцах на станциях Дружная и Ленинградская. Б. На диаграмме представлена частота встречаемости последовательностей ДНК, содержащих амплифицированные фрагменты генов 16S рРНК классов указанных бактерий, в 73 образцах на станциях Дружная, Ленинградская, Мирный и Прогресс по результатам высокопроизводительного секвенирования. В. Тепловая карта, демонстрирующая результаты попарного сравнения представленности классов бактерий в образцах из четырех станций, по данным высокопроизводительного секвенирования. Степень сходства оценивали при помощи расчета коэффициента корреляции Пирсона, значение которого показано цветом для каждой из пар сравниваемых образцов. В соответствии с приведенным градиентом цвета, наименьшему значению коэффициента корреляции Пирсона на тепловой карте присваивается желтый цвет, наибольшему – красный. Значение p-value для всех полученных значений коэффициента Пирсона составило менее 0,05. Далее сравнили таксономический состав бактерий в образцах со станций Дружная, Ленинградская, Мирный и Прогресс, отобранных в ходе 55-ой РАЭ (Рисунок 10Б). Согласно анализу, проведенному с помощью пакета программ RDP Classifier в образцах были найдены последовательности, соответствующие 34 классам бактерий. Около 4% последовательностей в каждом образце не определялись на уровне классов, но, тем не менее, входили в домен Prokaryota. Эти последовательности могут принадлежать к еще неописанным классам бактерий. Самыми многочисленными классами во всех четырех образцах были: Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Sphingobacteriia, Flavobacteriia, Cytophagia, Actinobacteria, Cyanobacteria и Chloroplast (хлоропластны эукариотических организмов; происходят от цианобактерий [163] и содержат гены 16S рРНК, которые амплифицируются универсальными бактериальными праймерами). Согласно литературным данным, представители филума Proteobacteria преобладают в составе микробных сообществ снегов на поверхности ледникового щита Гренландии [9], ледников Арктики [11] и ледников в Альпах [13]. Также недавно было показано, что Proteobacteria обладают повышенной адаптивной способностью к выживанию при отрицательных температурах [50]. В образцах со станций Ленинградская, Дружная и Мирный преобладали Betaproteobacteria (43, 68.5, и 43%, соответственно) а Flavobacteriia были самыми многочисленными (40%) в образце на станции Прогресс. Попарное сравнение 74 таксономического состава бактерий в образце со станции Прогресс с остальными тремя образцами при помощи расчета коэффициента корреляции Пирсона показало значительное отличие микробного разнообразия этой станции от трех других станций (Рисунок 10В). Результаты анализа таксономического состава бактерий на уровне рода представлены на Рисунке 11А. В образцах со станции Дружная самыми многочисленными были последовательности представителей родов Janthinobacterium (27%), Ralstonia (15%) и Pseudomonas (11%), в образцах со станции Ленинградская – Caulobacter (12%), Acinetobacter (10%) и Comamonas (9%). На уровне родов бактерий результаты анализа фрагментов генов 16S рРНК, полученных в ходе высокопродуктивного секвенирования, хорошо коррелировали с результатами, полученными при анализе библиотек клонированных последовательностей. Коэффициент корреляции Пирсона для образцов с Дружной и Ленинградской составил 0,8 и 0,9, соответственно (p-values < 0,05). В образце со станции Мирный самыми многочисленными родами бактерий были Ralstonia (31%), Bacilariophyta (24%) и Rudaea (8%), на Прогрессе – Flavobacterium (39%), Hydrogenophaga (14%) и Ralstonia (7%). Представителей родов Janthinobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Caulobacter, Acinetobacter и Comamonas, как отмечено выше, часто находят в холодных местах обитания. Bacilariophyta – это диатомовая водоросль с обширным ареалом, включающим Южный океан [164]. Rudaea была ранее обнаружена в небольшом количестве в ледовых кернах Гренландии [165]. Род Flavobacterium является повсеместным и встречается во множестве экосистем, в том числе в почвах, пресной воде и др. Некоторые из представителей этого рода, например F. psychrophilum, являются паразитами рыб, живущих в полярных морях [166]. Наконец, род Hydrogenophaga, недавно выделенный в отдельный род из Pseudomonas, встречается в водных экосистемах по всему миру. Некоторые его представители, например Hydrogenophaga pseudoflava, были обнаружены молекулярными методами в холодных водоемах [167]. Таким образом, все высокопредставленные на поверхности антарктического снега роды микроорганизмов были ранее детектированы в холодных местах обитания. 75 Рисунок 11. Разнообразие бактерий в образцах антарктического снега на уровне родов. A. На диаграмме представлена частота встречаемости последовательностей фрагментов 16S рРНК, полученных в ходе высокопроизводительного секвенирования (указаны 20 самых многочисленных родов бактерий). Б. Тепловая карта, демонстрирующая попарное сравнение представленности родов бактерий в образцах из четырех станций, согласно данным высокопроизводительного секвенирования. Степень сходства оценивали при помощи расчета коэффициента корреляции Пирсона, значение которого показано цветом для каждой из пар сравниваемых образцов. В соответствие представленному градиенту цвета, наименьшему значению коэффициента корреляции Пирсона на тепловой карте присваивается желтый цвет, наибольшему – красный. Значения p-value для всех полученных значений коэффициента Пирсона составляли менее 0,05. Несмотря на то, что состав бактерий на уровне классов был сходен для образцов со станций Дружная, Ленинградская и Мирный, корреляции на уровне родов между проанализированными образцами не наблюдалось: коэффициент корреляции Пирсона варьировал от 0,1 для Прогресса и Ленинградской до 0,4 для Мирного и Дружной (Рисунок 11Б). 76 Как было описано в первой части данной работы, цианобактерии отсутствовали в библиотеках клонов 16S рРНК в образцах со станций Ленинградская и Дружная, и с трудом детектировались только при амплификации специфическими праймерами. Анализ ДНК образцов методом высокопроизводительного секвенирования также показал почти полное отсутствие таких последовательностей в образцах со станций Ленинградская (0,04%) и Дружная (0,6%). Однако, 24% последовательностей со станции Мирный и 7% со станции Прогресс относились к филуму Cyanobacteria/Chloroplast. Как видно из Рисунка 6, станции Мирный и Прогресс, в которых наблюдается большая доля цианобактериальных и хлоропластных последовательностей, находятся всего в нескольких километрах от открытой поверхности морской воды, в то время как Дружная и Ленинградская, где такие последовательности практически отсутствуют – на расстоянии ~150 км и ~400 км, соответственно. Логично предположить, что источником цианобактериальных и хлоропластных последовательностей на поверхности снега близких к воде станций являются воды Южного океана, где цианобактерии и диатомовые водоросли, содержащие хлоропласты, присутствуют в значительном количестве [168]. Цианобактерии и диатомовые водоросли могут попадать на поверхность снега из аэрозоля, который образуется над открытой поверхностью воды. Оказываясь на поверхности снега, они могут или выступать первичными продуцентами в близких к воде снежных сообществах или использоваться в качестве источника питательных веществ для снежных бактерий-резидентов. Метагеномный анализ сообществ антарктического снега Анализ библиотек фрагментов генов 16S рРНК позволяет описать таксономический состав бактерий, но не позволяет получить информацию о других микроорганизмах, находящихся на поверхности снега (эукариот, вирусов), а также не дает полного представления о наличии специфических адаптаций снежных микробов. Для более полного описания таксономического состава антарктического снежного сообщества мы провели метагеномное секвенирование случайных фрагментов ДНК в 77 полученных образцах. ДНК сообществ снега четырех станций использовалась в качестве матрицы для высокопроизводительного секвенирования на платформе Иллюмина с покрытием около 500000 парных прочтений на каждый образец. Полученные прочтения фильтровали по качеству, длине, затем совмещали парные прочтения, как описано в «Материалах и методах». К настоящему времени получен значительный массив данных, собранных методом высокопроизводительного секвенирования метагеномомных библиотек из различных экосистем. Эти данные объединены в общедоступной базе MG-RAST [135]. Данные метагеномного секвенирования, полученные в настоящей работе, также были добавлены в эту базу данных. Краткое описание образцов и номера, присвоенные им базой данных MG-RAST, указаны в Таблице 1 Приложения. Поиск генов в полученных ДНК последовательностях и определение их таксономической принадлежности проводили на сервере MG-RAST с помощью пакета «Best hit Classification» (Таблица 9). Таблица 9. Результаты таксономического анализа последовательностей случайных фрагментов ДНК, полученных в ходе метагеномного секвенирования. В таблице представлены доли (%) каждой филогенетической группы в четырех образцах поверхностного снега. Станция Bacteria, % Eukaryota, % Viruses, % Archaea, % Дружная 98,29 1,41 0,06 0,10 Ленинградская 99,04 0,77 0,06 0,06 Мирный 84,65 14,97 0,14 0,17 Прогресс 98,38 1,22 0,04 0,31 Как видно из Таблицы 9, большинство метагеномных последовательностей принадлежали представителям домена Bacteria, и лишь небольшая доля последовательностей относилась к другим доменам жизни. Это означает, что полученные нами данные по секвенированию амплифицированных библиотек 78 фрагментов генов 16S РНК достаточно полно описывают разнообразие сообществ снежных микроорганизмов. Действительно, коэффициент корреляции Пирсона между соотношениями таксономических групп, выявленными при анализе метагеномнымных библиотек и библиотек фрагментов генов 16S РНК для каждой станции составил 0,97-0,99 (p–value<0,05) на уровне классов (Рисунок 12) и 0,68-0,86 (p–value<0,05) на уровне родов. Рисунок 12. Анализ наборов таксономических групп бактерий, полученных при анализе метагеномных библиотек и библиотек фрагментов генов 16S РНК для станций Дружная и Ленинградская. На диаграмме представлена частота встречаемости последовательностей ДНК указанных классов бактерий. Менее 1% случайных метагеномных последовательностей содержали фрагменты генов 16S рРНК. Мы экстрагировали эти последовательности из метагеномных данных и провели их таксономический анализ с помощью пакета программ RDP. Сравнивали соотношение таксономических групп, полученных в ходе этого анализа, с соотношением таксономических групп, определенным при анализе библиотек 79 амплифицированных фрагментов генов 16S рРНК. Коэффициент корреляции Пирсона составил 0,94-0,98 (p–value<0,05) для образцов со всех станций. Таким образом, ПЦР амплификация фрагментов V3-V4 гена 16S рРНК с использованными вырожденными праймерами не внесла существенного смещения в пропорции таксономических групп микроорганизмов, присутствующих в образце. Последовательности ДНК эукариот были лучше всего представлены в образце со станции Мирный, где их доля составила 15% (Таблица 9). Большинство из них относилось к диатомовым водорослям Bacilariophyta, что, скорее всего, было связано с выбором места отбора образцов снега – снег на этой станции отбирали непосредственно над последовательностей морским рода льдом. Как Bacillariophyta в было показано библиотеках выше, доля амплифицированных фрагментов генов 16S рРНК составила 24%. Образцы из остальных трех станций содержали около 1% эукариотических последовательностей (Таблица 9). Самыми распространёнными из них были последовательности Streptophita (Растения), Chordata (Хордовые), Arthropoda (Членистоногие), Ascomycota (Аскомицеты) и Аpicomplexa (эндопаразитические простейшие животных), представители которых не являются эндогенными обитателями поверхностного снега Антарктиды. Учитывая гораздо большие (по сравнению с бактериальными) размеры геномов этих эукариот, можно заключить, что примеси чужеродного для антарктических снежных сообществ генетического материала в образцах были минимальны. Помимо прокариотических и эукариотических последовательностей, мы обнаружили около 400 последовательностей ДНК из вирусных геномов. Интересно, что 70% вирусных последовательностей на станции Прогресс и до 50% на станции Дружная принадлежали эукариотическим вирусам. Большая их часть соответствовала фрагментам генома гигантского вируса амебы Pandoravirus sp. Некоторые из обнаруженных последовательностей имели 100% сходство с изолированным из австралийского озера в 2013 году Pandoravirus dulcis [169]. Пандоравирусы были обнаружены в различных морях по всему миру [170], а совсем недавно – в антарктическом озере и почве Сухой Долины [171, 172]. Другой гигантский вирус, 80 Pithovirus sibericum, был недавно обнаружен в образцах вечной мерзлоты в Сибири [173]. Остальные вирусные последовательности соответствовали фрагментам геномов бактериофагов – вирусов бактерий. Большинство из них относились к семейству хвостатых фагов Caudovirales, которые доминируют в природных экосистемах с преобладанием бактерий [174]. На станции Прогресс самыми многочисленными были последовательности, сходные с последовательностями бактериофага 6H, заражающего флавобактерии. Это представляется логичным, т.к. Flavobacterа были самым многочисленным родом бактерий, найденным в образце с этой станции. Однако в образцах из других станций нам не удалось выявить корреляции между детектируемыми бактериями и бактериофагами. Например, среди наиболее представленных групп фагов на станции Ленинградская можно выделить фаг AcaML1 Acidithiobacillus, а на станции Мирный – фаг HTVC008M Pelagibacter. Однако бактерии родов Acidithiobacillus и Pelagibacter в соответствующих образцах обнаружены не были. Содержание ДНК последовательностей архей было крайне низким во всех четырех метагеномных библиотеках (менее 0,2%), что согласуется с отсутствием продуктов амплификации фрагментов генов 16S рРНК архей (см. Часть 1 «Результатов»). Анализ функциональных категорий генов в метагеномах поверхностного снега Антарктиды Была проведена автоматическая аннотация метагеномных последовательностей для выявления функциональных категорий генов с помощью классификатора «SEED subsystems» сервера MG-RAST [135]. «SEED subsystems» объединяет гены, аннотированные базами данных FIG, UniPlot, KEGG или NCBI, в семейства генов на основании участия кодируемых ими белков в одном и том же биологическом процессе или структурном комплексе [175]. Как видно из Таблицы 10, большинство метагеномных последовательностей в образцах включали части открытых рамок считывания (ОРС), кодирующие белки с известной функцией. Самыми 81 многочисленными функциональными категориями генов были «clustering-based subsystems» (14-16%), «carbohydrate metabolism» (9%), «amino acids and derivatives» (8%), «miscellaneous» (8%) и «protein metabolism» (6.5–8.5%). Все эти категории объединяют белки с известными функциями, за исключением категории «clusteringbased subsystems». В нее входят белки с неизвестной функцией, гены которых часто объединены в характерные кластеры в геномах различных бактерий. Все перечисленные выше функциональные категории генов доминируют во многих ранее изученных сообществах, включая почвенные, пресные и морские экосистемы [176]. Таблица 10. Результаты автоматического поиска фрагментов ОРС в метагеномных последовательностях с помощью сервиса MG-RAST. В таблице приведены размеры метагеномных библиотек и количество ДНК последовательностей, которые содержат фрагменты ОРС, кодирующие белки с известной или неизвестной функцией, или содержат последовательности генов рРНК. Станция Число Число предсказанных Число генов последова белков с известными рРНК тельностей функциями Число предсказанных белков с неизвестными функциями Дружная 101717 799 71125 20320 Ленинградская 315145 1713 229753 64599 Мирный 273540 1862 88170 154242 Прогресс 104834 331 64187 31495 На сегодняшний день единственным опубликованным источником информации о функциональных особенностях микроорганизмов поверхностного снега является метагеномное исследование образцов снега Арктики [62]. В этой работе авторы показали путем сравнения представленности функциональных категорий генов в образцах снега (9 образцов), почв (8 образцов), морских вод (6 образцов) и антарктических микробных матов (3 образца), что некоторые функциональные категории генов статистически значимо перепредставлены в образцах исследованных 82 ими снежных экосистем. Мы провели сравнение представленности функциональных категорий генов в наших образцах и образцах, использованных при анализе сообществ снега Арктики [62]. Было выявлено 89 категорий генов, значимо различающихся между проанализированными экосистемам. При этом 40 из них были перепредставлены в антарктических метагеномах (см. Таблицу 2 Приложения). Некоторые из этих категорий генов подробнее рассмотрены ниже. В метагеномах сообществ микроорганизмов антарктического снега оказались перепредставлены функциональные категории генов «probably organic hydroperoxide resistance related hypothetical protein» и «stress response». В последней категории самыми многочисленным были гены, кодирующие бактериальный гемоглобин (Рисунок 13А и 13Б). Белки устойчивости к органическим пероксидам и белки бактериального гемоглобина участвуют в клеточном ответе на кислородное голодание и окислительный стресс [177, 178]. Перепредставленность указанных генов может отражать адаптацию микроорганизмов полярных снегов к постоянному окислительному стрессу, вызванному жестким ультрафиолетовым излучением. Также считается, что окислительный стресс усиливается при понижении температуры [4], т.к. при понижении температуры увеличивается растворимость кислорода и снижается скорость его потребления, что приводит к повышению уровня свободных радикалов. 83 Рисунок 13. Анализ представленности двух функциональных категорий генов в образцах из различных экосистем. На диаграмме представлена частота встречаемости последовательностей, содержащих фрагменты ОРС, кодирующих белки определенной функциональной категории в образцах из пяти различных экосистем. Голубые столбцы – антарктический снег, оранжевые столбцы – антарктический микробный мат, зеленые столбцы – прибрежная морская вода, фиолетовые столбцы – толща морской воды, красные столбцы – почва. Высота столбца отражает процент метагеномных последовательностей, содержащих гены определенной функциональной категории: (А) «probably organic hydroperoxide resistance related hypothetical protein», (Б) «bacterial hemoglobin». Среди функциональных категорий генов, перепредставленных в метагеномах микроорганизмов снега, но не кодирующих белки стресс-ответа, обнаруживались гены, контролирующие подвижность клеток, и гены, необходимые для хемотаксиса («motility and chemotaxis») (Рисунок 14А). Белки, обеспечивающие подвижность клеток и хемотаксис, были также хорошо представлены в протеомах образцов вечной мерзлоты [50]. 84 Рисунок 14. Анализ представленности четырех функциональных категорий генов в образцах из различных экосистем. На диаграмме представлена частота встречаемости последовательностей, содержащих фрагменты ОРС, кодирующие белки определенной функциональной категории в образцах из пяти различных экосистем. Голубые столбцы – антарктический снег, оранжевые столбцы – антарктический микробный мат, зеленые столбцы – прибрежная морская вода, фиолетовые столбцы – толща морской воды, красные столбцы – почва. Высота столбца отражает процент метагеномных последовательностей, содержащих гены определенной функциональной категории: (А) «motility and chemotaxis», (Б) «iron acquisition and metabolism» (В) «programmed cell death and toxin-antitoxin systems», (Г) «resistance to antibiotics and toxic compounds». 85 На недостаток питательных веществ и микроэлементов может указывать и перепредставленность в геномах антарктических снежных микроорганизмов генов категории «iron acquisition and metabolism» (Рисунок 14Б). Снег – одна из самых бедных экосистем планеты, количество микроэлементов в нем во много раз ниже, чем в море или почве [179]. По-видимому, снежные бактерии испытывают недостаток железа, и это заставляет их искать способы эффективного извлечения железа из окружающей среды, такие как синтез сидерофоров и транспортеров железа. Следующая функциональная категория генов, перепредставленная в антарктических метагеномах, это «programmed cell death and toxin-antitoxin systems» (Рисунок 14В). Ранее было показано, что системы токсин-антитоксин системы могут участвовать в стресс-ответе, препятствовать заражению клетки бактериофагами, участвовать в формировании биопленок или каскадах реакций, приводящих к программируемой клеточной смерти [180]. В условиях стресса некоторые системы токсин-антитоксин оказывают бактериостатический эффект на клетку, помогая ей пережить неблагоприятные условия. В других случаях, системы токсин-антитоксин убивают клетку при углеводном голодании и недостатке аминокислот, освобождая питательные вещества для окружающих клеток [181]. Согласно проведенному анализу в микробных сообществах антарктического снега также перепредставлена функциональная категория «resistance to antibiotics and toxic compounds» (Рисунок 14Г). Самыми многочисленными в этой категории были гены, кодирующие белки устойчивости к кобальту, цинку и кадмию («cobalt-zinccadmium resistance proteins», до 1,5% от общего числа генов в метагеномах). Перепредставленность генов устойчивости к тяжелым металлам в метагеномах антарктического снега может быть связана с тем, что клетки, растущие на снегу, практически лишены богатых источников питательных веществ. Возможно, единственным источником питания становятся частицы пыли, которые, помимо питательных веществ, могут содержать значительное количество побочных и возможно ядовитых элементов, таких как тяжелые металлы. Чтобы получать питательные вещества из таких пылевых частиц, клеткам, растущим на снегу, могут быть необходимы гены устойчивости к тяжелым металлам. 86 Часть 3. Анализ разнообразия спейсеров в CRISPR локусах психрофильных антарктических бактерий Flavobacterium psychrophilum Анализ типов CRISPR-Cas последовательностей в метагеномax антарктических микробных сообществ CRISPR кассеты, входят в состав CRISPR-Cas систем адаптивного иммунитета прокариот, обеспечивающих защиту от вирусов и плазмид. CRISPR кассета состоит из коротких повторяющихся участков (повторов), разделённых уникальными последовательностями (спейсерами) [32]. Первичный транскрипт CRISPR кассеты, (пре-крРНК) процессируется с образованием CRISPR РНК (крРНК), каждая из которых содержит последовательность одного спейсера и фланкирующих фрагментов повторов. При комплементарном взаимодействии комплекса Cas белков с крРНК с мишенью – как правило, участком ДНК бактериофага – происходит деградация чужеродной ДНК. Последовательность ДНК бактериофага, комплементарная спейсеру, называется протоспейсером. Кроме комплементарного взаимодействия спейсера крРНК и протоспейсера мишени в случае CRISPR-Cas систем первого и второго типов к протоспейсеру должен примыкать дополнительный мотив, состоящий из двух-трех нуклеотидов, называемый PAM (protospacer adjacent motif), последовательность которого различается для CRISPR-Cas систем из различных микроорганизмов. Около 40% отсеквенированных геномов бактерий и около 90% отсеквенированных геномов архей содержат CRISPR кассеты [32]. В среднем, в одной CRISPR кассете насчитывается около 60 спейсеров. Повторы, соответствующие CRISPR-Cas системе одного типа, как правило являются специфичными для одного вида бактерий, тогда как наборы спейсеров часто уникальны для отдельных штаммов одного вида [33]. Таким образом, анализ набора спейсеров в CRISPR кассетах 87 является чувствительным инструментом для выявления отличий между штаммами внутри одного рода или вида для широкого спектра микроорганизмов. Мы провели биоинформатический поиск CRISPR кассет в метагеномных последовательностях микроорганизмов антарктического снега с помощью программы поиска CRISPR кассет CRASS (от CRISPR assembler, «сборщик CRISPR»). Эта программа проводит поиск не менее трех повторяющихся участков ДНК длиной от 23 до 47 нуклеотидов, расположенных на удалении 26–50 нуклеотидов друг от друга, т.е. ищет участки, содержащие как минимум три повтора, разделенные двумя спейсерами [138]. Нам удалось найти фрагменты CRISPR кассет в метагеномах всех четырех станций. Последовательности повторов из этих кассет и количества спейсеров в CRISPR кассетах, ассоциированных с каждым из найденных типов повторов, представлены в Таблице 3 Приложения. Лишь малая часть из найденных нами последовательностей повторов соответствовала повторам в уже известных CRISPR кассетах, доступных в базе данных GеnBank. Среди известных повторов был обнаружен 46-нуклеотидный повтор из CRISPR кассеты Flavobacterium psychrophilum (CRISPR-Cas система подтипа II-C) [182]. Фрагменты кассет, содержавших этот повтор, были найдены в образцах снега, собранного на станциях Прогресс, Дружная и Ленинградская. Другой повтор, найденный в образцах со станций Ленинградская и Прогресс, был идентичен 36 нуклеотидному повтору кассеты F. columnare (CRISPRCas подтипа II-B) [182]. Как указано выше, Flavobacterium был самым многочисленным родом в образцах со станции Прогресс (40% от всех найденных последовательностей ДНК) и был менее представлен на станциях Дружная (4%), Ленинградская (0,1%) и Мирный (0,1%). 570 спейсеров, найденных в метагеномных библиотеках четырех образцов, сравнили с базой данных спейсеров CRISPR [183], однако соответствий найдено не было. Сравнение этого же набора спейсеров с нуклеотидной базой данных GenBank выявило соответствие одного спейсера из образца станции Прогресс, ассоциированного с 36-нуклеотидным повтором F. columnare, с последовательностью фрагмента генов 16S рРНК Flavobacterium sp. 136G. Такое совпадение может 88 указывать на участие CRISPR-Cas системы в предотвращении генетического обмена между родственными штаммами/видами флавобактерий. Последовательность PAM для CRISPR-Cas системы подтипа II-С F. columnare (с 36-нуклеотидным повтором) ранее не была определена. Мы проанализировали 43 спейсера F. columnare, находящиеся в базе данных CRISPR [183] и нашли четыре соответствия участкам генома флавобактериофага FCL-2. Выравнивание последовательностей, прилегающих к 3'-концу идентифицированных протоспейсеров, выявило консервативный мотив TAA, расположенный в пяти нуклеотидах от 3'-конца протоспейсера (Рисунок 15). Возможно, что данная последовательность является PAM мотивом CRISPR-Cas системы F. columnare. Единственный протоспейсер, выявленный в ходе анализа антарктических спейсеров (см. выше), не содержал такого тринуклеотидного мотива, и, следовательно, не должен узнаваться CRISPR-Cas системой. TAA 5′ 8 5 4 2 1 GC 7 AA A 0 C 6 1 3 bits 2 3′ weblogo.berkeley.edu Рисунок 15. Лого предполагаемой последовательности PAM для CRISPR-Cas системы F.columnare. Лого получено методом выравнивания с помощью программы WebLogo четырех восьминуклеотидных последовательностей, прилегающих к 3' концам протоспейсеров флавобактериофага FCL-2. Анализ разнообразия спейсеров F. psychrophilum, в трех различных областях Антарктики При сравнении выявленных CRISPR спейсеров между образцами было обнаружено три одинаковых спейсера в последовательностях кассет из образцов, 89 собранных на станциях Прогресс и Дружная. Эти спейсеры принадлежат CRISPR кассетам с 46-нуклеотидным повтором, идентичным повтору CRISPR кассеты F. psychrophilum. Последовательности с таким повтором были найдены в образцах трех станций: Прогресс, Дружная и Ленинградская (см. выше). Чтобы провести более полное сравнение спейсеров из CRISPR кассет F. psychrophilum мы разработали подход, который позволяет проанализировать разнообразие спейсеров из кассет с одинаковой последовательностью повтора. Была подобрана пара праймеров, частично комплементарных последовательности повтора CRISPR кассеты F. psychrophilum. Праймеры использовали для амплифицикации находящихся между повторами спейсеров, с использованием в качестве матрицы ДНК из снежных образцов, как показано на Рисунке 16. Рисунок 16. Схема эксперимента по амплификации спeйсеров из CRISPR кассеты. На рисунке схематически показана CRISPR кассета, зелеными прямоугольниками изображены повторы, белыми прямоугольниками –спейсеры. Синие стрелки под и над CRISPR кассетой обозначают места гибридизации праймеров для ПЦР. Черные полоски с указание длины (в нуклеотидах) схематически изображают фрагменты ДНК, которые получались при проведении амплификации с использованием праймеров, специфичных к повторам F. psychrophilum. Продукты амплификации были получены для трех образцов ДНК, со станций Прогресс, Дружная и Ленинградская. Отсутствие продуктов амплификации для образца со станции Мирный согласуется с отсутствием CРISPR повторов F. psychrophilum в метагеномных последовательностях из этого образца. 90 Амплифицированные последовательности были секвенированы на платформе Иллюмина. После процедуры фильтрации было получено около 850000 спейсеров длиной 29+/-4 п.о.. Схожие спейсеры было объедены в кластеры. Один кластер объединяет спейсеры, последовательности которых различаются друг от друга менее чем на 5 нуклеотидов. В результате кластеризации было получено 8196 уникальных кластеров в трех образцах, количество кластеров варьировало от 2584 (станция Дружная), до 3822 (станция Прогресс) (Таблица 11). Как было сказано ранее, в одной CRISPR кассете в геноме бактерии в среднем содержится 60 спейсеров [33]. Следовательно, в образцах трех станций может содержатся 40-60 различных штаммов F. psychrophilum с различными CRISPR кассетами. Таблица 11. Статистические данные по спейсерам F. psychrophilum в образцах из трех антарктических станций. В таблице приставлены количества последовательностей ДНК, экстрагированных последовательностей спейсеров, кластеров спейсеров и кластеров самокомплементарных спейсеров, найденных в каждом их образцов (со станций Дружная, Ленинградская и Прогресс). Самокомплементарные кластеры Количество % Количество Количество последователь % уникальных спейсеров Количество самокомпле ностей ДНК уникальных самокомпле кластеров ментарных кластеров ментарных кластеров кластеров Кластеры Станция Дружная 284286 273255 2584 65,6 70 8,6 Ленинградская 321550 313241 2759 92,2 85 63,5 Прогресс 263548 255447 3822 79,6 60 18,3 На станции Прогресс, где представленность Flavobacterium в библиотеках фрагментов генов 16S рРНК была самой высокой, наблюдалось наибольшее разнообразие кластеров спейсеров Flavobacterium. Библиотека кластеров спейсеров на станции Прогресс была далека от насыщения (Рисунок 17). Таким образом, найденные нами 3822 кластера составляли лишь часть истинного разнообразия спейсеров в этом 91 образце. Кривые насыщения библиотек кластеров со станций Ленинградская и Дружная были близки к насыщению. Рисунок 17. Оценка степени насыщения библиотек спейсеров в образцах со станций Дружная, Ленинградская и Прогресс. Кривые насыщения описывают зависимость количества кластеров спейсеров от количества спейсеров. Результаты сравнения кластеров спейсеров между станциями представлены в виде диаграммы Венна на Рисунке 18. Лишь 58 кластеров были найдены во всех трех библиотеках спейсеров. Процент кластеров, уникальных для каждой станции, варьировал от 66 для станции Дружная, до 92 для станции Ленинградская. Таким образом, набор спейсеров (а следовательно и штаммов) F. psychrophilum в каждой из трех исследованных точек Антарктиды в значительной степени уникален. Попарные пересечения кластеров спейсеров составили от 29% для образцов со станции Дружная и Прогресса, 7% для Дружной и Ленинградской и 3% для Прогресса и Ленинградской. Т.е. станции, расположенные ближе друг к другу (Прогресс и Дружная, расстояние 150 км) обладают более схожим составом популяции внутри вида F. psychrophilum. На уровне родов бактерий мы наблюдали противоположную картину при анализе фрагментов 16S рРНК генов – станция Прогресс была наиболее отличной от других 92 станцией, а сообщества Ленинградской и Дружной были наиболее похожи друг на друга. Рисунок 18. Сравнение набора кластеров спейсеров в образцах со станций Дружная, Прогресс и Ленинградская. Синим, розовым и желтым кругом показаны кластеры спейсеры из станций Прогресс, Ленинградская и Дружная соответственно. Цифры, расположенные ближе к внешним сторонам кругов, показывают количества уникальных кластеров спейсеров для каждой станции; цифры в местах пересечения кругов – количества совпадающих между двумя или тремя выборками кластеров. Скобки показывают удаленность станций друг от друга. Около 1% кластеров, содержали спейсеры, последовательности которых были комплементарны спейсерам из кластеров с большим весом (большим количеством содержащихся в них спейсеров) из того же образца (Таблица 11). Наличие комплементарных пар спейсеров в CRISPR кассетах было ранее продемонстрировано в экспериментах по адаптации (встраивании новых спейсеров) в CRISPR кассету E. coli [184]. Присутствие самокомплементарных спейсеров в наших данных указывает 93 на то, что встраивания новых спейсеров в системах I-E E. coli и II-C F. psychrophilum протекает по сходному механизму. Сравнительный анализ кластеров спейсеров антарктических F. psychrophilum с последовательностями в общедоступных базах данных Коллекцию спейсеров F. psychrophilum сравнили с нуклеотидной базой данных GenBank. Ни один из кластеров не имел соответствий сo 117-ю спейсерами, присутствующими в отсеквенированных геномах F. psychrophilum. Лишь три кластера спейсеров соответствовали фрагментам геномов флавобактериофагов FCL-2 и 6H. Кроме того, еще два кластера спейсеров соответствовали последовательностям ДНК в хромосоме Flavobacterium (Таблица 4 в Приложении). Интересно, спейсеры из одного из кластеров соответствовали множественным последовательностям в хромосомах различных флавобактерий, а именно: 22 последовательностям в геноме F. indicum, пяти последовательностям в геноме F. psychrophilum, и уникальным последовательностям в геномах F. columnare и F. branchiophilum. Дополнительный анализ геномного контекста этих необычных протоспейсеров выявил, что они являются частью несовершенных палиндромных некодирующих повторов длиной 125 п.о., разбросанных по геномам F. indicum и F. psychrophilum. Функция этих повторов неизвестна. Они имеют тенденцию располагаться в межгенных областях, и генетическое окружение таких областей часто состоит из генов транспозаз, систем рестрикции-модификации, и систем абортивной инфекции. Координаты и численность таких повторов отличаются в разных изолятах флавобактерий. Ранее проведенный сравнительный анализ геномов флавобактерий показал потерю соответствий в порядке генов между разными штаммами ввиду присутствия большого количества повторяющихся IS и rhs элементыов [185]. 125-ти нуклеотидный повтор, найденный в ходе нашего анализа, отличается от IS или rhs элементов, однако может играть сходную роль в обеспечении пластичности генома флавобактерий. Соответствие этого повтора спейсеру CRISPR-Cas системы возможно означает 94 участие CRISPR-Cas в контроле распространения подобных элементов по геному флавобактерий. Обнаружение протоспейсеров для некоторых кластеров спейсеров позволило провести поиск PAM мотивов CRISPR-Cas системы F. psychrophilum. Мы сравнили полученный нами набор спейсеров (8196 кластеров спейсеров) и 117 уникальных спейсеров F. psychrophilum из базы данных с последовательностями фагов и плазмид флавобактерий, находящимися в базе данных Genbank. Было получено 24 соответствий с последовательностями бактериофагов, причем для антарктических спейсеров было найдено только четыре соответствия, а остальные 20 – для спейсеров из базы данных. Этот неожиданный результат можно объяснить тем, что изоляты F. psychrophilum, также как и фаги флавобактерий, последовательности которых находятся в базе данных, были выделены на территории Северного полушария. Поиск новых PAM мотивов для CRISPR-Cas систем II типа позволяет увеличить количество доступных мишеней при разработке методов редактирования геномов эукариот на основе CRISPR/Cas9 технологии [186]. С помощью Weblogo сервиса сравнивали последовательности, прилегающие к 3' концам обнаруженных протоспейсеров. Таким образом выявили консервативную последовательность ATAТ в двух нуклеотидах от конца протоспейсера (Рисунок 19), которая, возможно, является PAM мотивом II-C CRISPR-Cas системы F. psychrophilum. Этот мотив отличен от известных PAM последовательностей CRISPR/Cas9 систем. 95 Рисунок 19. Предполагаемая PAM последовательность CRISPR-Cas системы F. psychrophilum. Лого получено методом выравнивания с помощью программы WebLogo последовательностей, прилегающих к 3'-концам 24-х обнаруженных протоспейсеров. Мы также сравнили набор кластеров спейсеров с метагеномными последовательностями, полученными в настоящем исследовании, и метагеномными последовательностями из образцов умеренных экосистем, которые собраны в env_nt базе данных GenBank. В ходе анализа было получено 435 соответствий с антарктическими метагеномными последовательностями, и всего 247 соответствий с последовательностями из базы данных env_nt. Это может означать, что CRISPR-Cas система антарктических флавобактерий обеспечивает защиту бактериальных клеток от эндогенных антарктических вирусов или плазмид, последовательности геномов которых пока еще не определены. Подобное наблюдение большего соответствия последовательностей спейсеров метагеномных последовательностям из того же образца, но не из образцов из общедоступных баз данных, было ранее сделано для экосистемы слива кислотных шахтных вод [187]. 96 Заключение В данной работе было подробно исследовано разнообразие микроорганизмов поверхностного снега прибрежных зон Восточной Антарктиды. Показало, что таксономический состав бактерий на поверхности снега различается в удаленных друг от друга областях Антарктиды и варьирует от года к году. Выявлены функциональные категории генов, статистически значимо перепредставленные в сообществах микроорганизмов поверхностного снега Антарктиды. Также показано, что на поверхности снега прибрежных районов Антарктиды присутствуют бактерии, способные расти и делиться в период антарктического лета. Наконец, методом сравнительного анализа наборов спейсеров в CRISPR кассетах обнаруженных на поверхности снега бактерий Flavobacterium psychrophilum установлено, что штаммы этого вида бактерий заметно различаются в образцах из географически удаленных областей Антарктиды. 97 Выводы 1. Анализом последовательностей фрагментов генов 16S рРНК определён состав микробных сообществ в образцах поверхностного снега в районе четырех антарктических станций. Установлено, что наиболее многочисленными являются представители классов Betaproteobacteria, Alphaproteobacteria и Gammaproteobacteria. Показано, что таксономический состав бактерий, находящихся на поверхности снега, заметно отличается в образцах из удаленных друг от друга областей Антарктиды, и изменяется со временем. 2. Впервые показано, что таксономический состав антарктических бактерий поверхностного снега, определенный по представленности их 16S рРНК и соответствующих им генов, существенно разнится. 3. Впервые для микроорганизмов антарктического снега проведено масштабное метагеномное секвенирование. Выявлены функциональные категории генов, статистически значимо перепредставленные в сообществах микроорганизмов поверхностного снега Антарктиды, среди них – гены, кодирующие белки клеточного ответа на окислительный стресс, и гены устойчивости к тяжелым металлам. 4. Продемонстрировано значительное разнообразие спейсеров CRISPR кассет антарктических бактерий на примере Flavobacterium psychrophilum. Показано, что наборы спейсеров (вариабельных участков кассет) в штаммах F. psychrophilum из географически Антарктиды существенно отличаются друг от друга. удаленных областей 98 Список использованной литературы 1. Doran P. J., Priscu J. C., Lyons W. B., Walsh J. E., Fountain A. G., McKnight D. M., Moorhead D. L., Virginia R. A., Wall D. H., Clow G. D., Fritsen C. H., McKay C. P., Parsons A. N. Antarctic climate cooling and terrestrial ecosystem response // Nature ‒ 2002. ‒ T. 415. ‒ C. 517–520. 2. Копылов С. М. Международно-правовые аспекты предупреждения негативных экологических последствий хозяйственной деятельности в Антарктиде: Дис. канд. эконом. наук. Москва, 2011. ‒ 199 с. 3. Стратегия развития деятельности Российской Федерации в Антарктике на период до 2020 года и на более отдаленную перспективу // Собрание законодательства Российской Федерации. ‒ 2010. ‒ T. 45, № 5914. ‒ C. 12664-12678. 4. Miteva V. Bacteria in snow and glacier ice // Psychrophiles: from biodiversity to biotechnology / Margesin R., Schinner F., Marx J.-C., Gerday C. ‒ Berlin, Heidelberg, Germany: Springer Verlag, 2008. ‒ C. 31–50. 5. Carpenter E. J., Lin S., Capone D. G. Bacterial activity in South Pole snow // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2000. ‒ T. 66. ‒ C. 4514-4517. 6. Garrison D. L., Sulivan C. W., Ackley S. F. Sea ice microbial communities in Antarctica // BioScience. ‒ 1986. ‒ T. 36. ‒ C. 243-250. 7. Segawa T., Miyamoto K., Ushida K., Agata K., Okada N., Kohshima S. Seasonal change in bacterial flora and biomass in mountain snow from the Tateyama Mountains, Japan, analyzed by 16S rRNA gene sequencing and real-time PCR // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2005. ‒ T. 71. ‒ C. 123-130. 8. Amann R. I., Ludwig W., Schleifer K. H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. ‒ 1995. ‒ T. 59. ‒ C. 143169. 9. Cameron K. A., Hagedorn B., Dieser M., Christner B. C., Choquette K., Sletten R., Crump B., Kellogg C., Junge K. Diversity and potential sources of microbiota associated 99 with snow on western portions of the Greenland Ice Sheet // Environ. Microbiol. ‒ 2015. ‒ T. 17, № 3. ‒ C. 594-609. 10. Choudhari S., Lohia R., Grigoriev A. Comparative metagenome analysis of an Alaskan glacier // J. Bioinform. Comput. Biol. ‒ 2014. ‒ T. 12, № 2. ‒ C. 1441003. 11. Hell K., Edwards A., Zarsky J., Podmirseg S. M., Girdwood S., Pachebat J. A., Insam H., Sattler B. The dynamic bacterial communities of a melting High Arctic glacier snowpack // ISME J. ‒ 2013. ‒ T. 7. ‒ C. 1814-1826. 12. Yun J., Ju Y., Deng Y., Zhang H. Bacterial community structure in two permafrost wetlands on the Tibetan Plateau and Sanjiang Plain, China // Microbiol. Ecol. ‒ 2014. ‒ T. 68, № 2. ‒ C. 360-9. 13. Simon C., Wiezer A., Strittmatter A. W., Daniel R. Phylogenetic diversity and metabolic potential revealed in a glacier ice metagenome // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2009. ‒ T. 75, № 23. ‒ C. 7519-7526. 14. Michaud L., Giudice A., Mysara M., Monsieurs P., Raffa C, Leys N., Amalfitano S., Van Houdt R. Snow surface microbiome on the High Antarctic Plateau (Dome C) // PLoS One. ‒2014. ‒ T. 9, № 8. ‒ C. e104505. 15. Kennicutt M. C., Chown S. L., Cassano J. J., Liggett D., Massom R., Peck L. S., Rintoul S. R., Storey J. W. V., Vaughan D. G., Wilson T. J., Sutherland W. J. Polar research: Six priorities for Antarctic science // Nature. ‒ 2014. ‒ T. 512. ‒ C. 23-25. 16. Adékambi T., Drancourt M., Raoult D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists // Trends Microbiol. ‒ 2009. ‒ T. 17, № 1. ‒ C. 37-45. 17. Pei A. Y., Oberdorf W. E., Nossa C. W., Agarwal A., Chokshi P., Gerz E. A., Jin Z., Lee P., Yang L., Poles M., Brown S. M., Sotero S., Desantis T., Brodie E., Nelson K., Pei Z. Diversity of 16S rRNA genes within individual prokaryotic genomes // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2010. ‒ T. 76, № 12. ‒ C. 3886-97. 18. Wang Q., Garrity G. M., Tiedje J. M., Cole J. R. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2007. ‒ T. 73, № 16. ‒ C. 5261-5267. 19. DeSantis T. Z., Hugenholtz P., Larsen N., Rojas M., Brodie E. L., Keller K., Huber T., Dalevi D., Hu P., Andersen G. L. . Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database 100 and workbench compatible with ARB // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2006. ‒ T. 72. ‒ C. 5069-72. 20. Shah N., Tang H., Doak T. G., Ye Y. Comparing bacterial communities inferred from 16S rRNA gene sequencing and shotgun metagenomics // Pac. Symp. Biocomput. ‒ 2011. ‒ C. 165-76. 21. Andersson A. F., Lindberg M., Jakobsson H., Backhed F., Nyren P., Engstrand L. Comparative analysis of human gut microbiota by barcoded pyrosequencing // PLoS One. ‒ 2008. ‒ T. 3. ‒ C. e2836. 22. Větrovský T., Baldrian P. The variability of the 16S rRNA gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community analyses // PLoS One. ‒ 2013. ‒ T. 8, № 2. ‒ C. e57923. 23. Janda J. M., Abbott S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls // J. Clin. Microbiol. ‒ 2007. ‒ T. 45, № 9. ‒ C. 2761–2764. 24. Wang Y., Zhang Z., Ramanan N. The actinomycete Thermobispora bispora contains two distinct types of transcriptionally active 16S rRNA genes // J. Bacteriol. ‒ 1997. ‒ T. 179, № 10. ‒ C. 3270–3276. 25. Stackebrandt E., Goebel B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. ‒ 1994. ‒ T. 44. ‒ C. 846-849. 26. Stackebrandt E., and J. Ebers. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards. // Microbiol. Today. ‒ 2006. ‒ T. 2006. ‒ C. 153-155. 27. Sanschagrin S., Yergeau E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons // J. Vis. Exp. ‒ 2014. ‒ T. 90. ‒ C. e51709. 28. Shokralla S., Spall J. L., Gibson J. F., Hajibabaei M. Next-generation sequencing technologies for environmental DNA research // Mol. Ecol. ‒ 2012. ‒ T. 21, № 8. ‒ C. 17941805. 29. Sinclair L., Osman O., Bertilsson S., Eiler A. Microbial community composition and diversity via 16S rRNA gene amplicons: evaluating the Illumina platform // PLoS One. ‒ 2015. ‒ T. 10, № 2. ‒ C. e0116955. 101 30. Ingianni A., Petruzzelli S., Morandotti G. Pompei R. Genotypic differentiation of Gardnerella vaginalis by amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) // FEMS Immunol. Med. Microbiol. ‒ 1997. ‒ T. 18. ‒ C. 61-66. 31. Muyzer G., Dewaal E., Uitterlinden A. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 1993. ‒ T. 59, № 3. ‒ C. 695-700. 32. Bhaya D., Davison M., Barrangou R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation // Annu. Rev. Genet. ‒ 2011. ‒ T. 45. ‒ C. 273-297. 33. Brouns S. J., Jore M. M., Lundgren M., Westra E. R., Slijkhuis R. J., Snijders A. P., Dickman M. J., Makarova K. S., Koonin E. V., van der Oost J. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes // Science. ‒ 2008. ‒ T. 321. ‒ C. 960-964. 34. Marraffini L. A., Sontheimer E. J. CRISPR interference: RNS-directed adaptive immunity in bacteria and archaea // Nature Rev. Gen. ‒ 2010. ‒ T. 11. ‒ C. 181-190. 35. Gori A., Bandera A., Marchetti G., Esposti A. D., Catozzi L., Nardi G. P., Gazzola L., Ferrario G., Embden J. D. A., Soolingen D., Moroni M., Franzetti, F. Spoligotyping and Mycobacterium tuberculosis // Emerging Infectious Diseases. ‒ 2005. ‒ T. 11, № 8. ‒ C. 1242-1248. 36. Fabre L., Zhang J., Guigon G., Le Hello S., Guibert V., Accou-Demartin M., Romans S., Lim C., Roux C., Passet V., Diancourt L., Guibourdenche M., Issenhuth-Jeanjean S., Achtman M., Brisse S., Sola C, Weill F.-X. CRISPR typing and subtyping for improved laboratory surveillance of Salmonella infections // PLoS One. ‒ 2012. ‒ T. 7, № 5. ‒ C. e36995. 37. Shariat N., Dudley E.G. CRISPRs: molecular signatures used for pathogen subtyping // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2014. ‒ T. 80, № 2. ‒ C. 430-439. 38. Maron P.-A., Ranjard L., Mougel C., Lemanceau P. Metaproteomics: a new approach for studying functional microbial ecology // Microbiol. Ecol. ‒ 2007. ‒ T. 53. ‒ C. 486-493. 39. Segata N., Boernigen D., Tickle T.L., Morgan X.C., Garrett W.S., Huttenhowera C. Computational meta'omics for microbial community studies // Mol. Syst. Biol. ‒ 2013. ‒ T. 9. ‒ C. 666. 102 40. Pace N. R., Stahl D. A., Lane D. J., Olsen G. J. Analyzing natural microbial populations by rRNA sequences // ASM News. ‒ 1985. ‒ T. 51. ‒ C. 4–12. 41. Handelsman J. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products // Chemistry & biology. ‒ 1998. ‒ T. 5. ‒ C. 245-249. 42. Venter J. C. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea // Science. ‒ 2004. ‒ T. 304, № 5667. ‒ C. 66-74. 43. Knietsch A., Waschkowitz T., Bowien S., Henne A., Daniel R. Metagenomes of complex microbial consortia derived from different soils as sources for novel genes conferring formation of carbonyls from short-chain polyols on Escherichia coli // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. ‒ 2003. ‒ T. 5. ‒ C. 46-56. 44. Blank C. E., Cady S.L., Pace N.R. Microbial composition of near-boiling silicadepositing thermal springs throughout Yellowstone National Park // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2002. ‒ T. 68. ‒ C. 5123–35. 45. Maccaferri S., Biagi E., Brigidi P. Metagenomics: key to human gut microbiota // Dig Dis. ‒ 2001. ‒ T. 29. ‒ C. 525-30. 46. Neelakanta G., Sultana H. The use of metagenomic approaches to analyze changes in microbial communities // Microbiol. Insights. ‒ 2013. ‒ T. 6. ‒ C. 37-48. 47. Sharpton T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data // Front. Plant. Sci. ‒ 2014. ‒ T. 5. ‒ C. 209. 48. Carvalhais L. C., Dennis P.G., Tyson G.W., Schenk P.M. Application of metatranscriptomics to soil environments // J. Microbiol. Methods. ‒ 2012. ‒ T. 91, № 2. ‒ C. 246-51. 49. Logue J. B., Bürgmann, H., Robinson C.T. Progress in the Ecological Genetics and Biodiversity of Freshwater Bacteria // BioScience. ‒ 2008. ‒ T. 58, № 2. ‒ C. 103-113. 50. Hultman J., Waldrop M.P., Mackelprang R., David M.M., McFarland J., Blazewicz S.J., Harden J., Turetsky M.R., McGuire A.D., Shah M.B., VerBerkmoes N.C., Lee L.C., Mavrommatis K., Jansson K.J. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes // Nature Letter research. ‒ 2015. ‒ T. 521. ‒ C. 208-212. 51. Breitling R. C., A., Jankevics A., Takano E. Metabolomics for Secondary Metabolite Research // Metabolites. ‒ 2013. ‒ T. 3. ‒ C. 1076-1083. 103 52. Tang J. Microbial Metabolomics // Curr. Genomics. ‒ 2011. ‒ T. 12, № 6. ‒ C. 391-403. 53. Tranter M., Jones H. G. The chemistry of snow: Processes and nutrient cycling // Snow ecology: an interdisciplinary examination of snow-covered ecosystems / Jones H. G. ‒ New York: Cambridge Univ. Press, 2001. ‒ C. 127-167. 54. Antarctic Microbiology. / Friedmann E. I. ‒ New York: Wiley-Liss, 1993. 55. Amato P., Hennebelle R., Magand O., Sancelme M.,, Delort A.-M. B. C. Bacterial characterization of the snow cover at Spitzberg, Svalbard // FEMS Microbiol. Ecol. ‒ 2007. ‒ T. 59. ‒ C. 255-264. 56. Roesch L. F., Fulthorpe R. R., Riva A., Casella G., Hadwin A. K., Kent A. D., Daroub S. H., Camargo F. A., Farmerie W. G., Triplett E. W. Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity // ISME J. ‒ 2007. ‒ T. 1, № 4. ‒ C. 283-290. 57. Zweifel U. L., Hagstro A. M. Total counts of marine bacteria include a large fraction of non-nucleoid-containing bacteria (ghosts) // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 1995. ‒ T. 61. ‒ C. 2180-2185. 58. Fujii M., Takano Y., Kojima H., Hoshino T., Tanaka R., Fukui M. Microbial community structure, pigment composition, and nitrogen source of red snow in Antarctica // Microb. Ecol. ‒ 2010. ‒ T. 59, № 3. ‒ C. 466-75. 59. Säwström C., Mumford P., Marshall W., Hodson A., Laybourn-Parry J. . The microbial communities and primary productivity of cryoconite holes in an Arctic glacier (Svalbard 79 degrees N) // Polar Biol. ‒ 2002. ‒ T. 25. ‒ C. 591-596. 60. Christner B. C., Kvitko B. H., Reeve J. N. Molecular identification of bacteria and Eukarya inhabiting an Antarctic cryoconite hole // Extremophiles. ‒ 2003. ‒ T. 7, № 3. ‒ C. 177-83. 61. Liu Y., Yao T., Jiao N., Kang S., Xu B., Zeng Y., Huang S., Liu X. Bacterial diversity in the snow over Tibetan Plateau Glaciers // Extremophiles. ‒ 2009. ‒ T. 13. ‒ C. 411-423. 62. Maccario L., Vogel, T.M., Larose, C. Potential drivers of microbial community structure and function in Arctic spring snow // Front. Microbiol. ‒ 2014. ‒ T. 5. ‒ C. 413. 63. Warren S. G., Hudson S. R. Bacterial activity in South Pole snow is questionable // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2003. ‒ T. 69, № 10. ‒ C. 6340-6341. 104 64. Bhatia M., Sharp M., Foght J. Distinct bacterial communities exist beneath a high arctic polythermal glacier // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2006. ‒ T. 72. ‒ C. 5838–5845. 65. Abyzov S. S. Microorganisms in the Antarctic ice // Antarctic microbiology / Friedman E. I. ‒ New York, N.Y.: Wiley-Liss, 1993. ‒ C. 265-295. 66. Shen L., Yaoa T., Xu B., Wang H., Jiao N., Kang S., Liu X., Liu Y. Variation of culturable bacteria along depth in the East Rongbuk ice core, Mt. Everest // Geoscience Front. ‒ 2012. ‒ T. 3, № 3. ‒ C. 327-334. 67. Griffin D. W. Atmospheric Movement of Microorganisms in Clouds of Desert Dust and Implications for Human Health // Clin. Microbiol. Rev. ‒ 2007. ‒ T. 20, № 3. ‒ C. 459-477. 68. Burrows S. M., Elbert W., Lawrence M.G., Poschl U. Bacteria in the global atmosphere Part 1: review and synthesis of literature data for different ecosystems // Atmos. Chem. Phys. ‒ 2009. ‒ T. 9. ‒ C. 9263-9280. 69. Hara K., Zhang D. Bacterial abundance and viability in long-range transported dust // Atmos. Environ. ‒ 2012. ‒ T. 47. ‒ C. 20-25. 70. Womack A. M., Bohannan B., Green J. Biodiversity and biogeography of the atmosphere // Phil. Trans. R. Soc. B. ‒ 2010. ‒ T. 365. ‒ C. 3645-3653. 71. Lighthart B. An hypothesis describing the general temporal and spatial distribution of alfresco bacteria in the Earth’s atmospheric surface layer // Atmos. Environ. ‒ 1999. ‒ T. 33. ‒ C. 611-615. 72. Amato P., Parazols M., Sancelme M., Laj P., Mailhot G., Delort A. M. Microorganisms isolated from the water phase of tropospheric clouds at the Puy de Dome: major groups and growth abilities at low temperatures. // FEMS Microbiol. Ecol. ‒ 2007. ‒ T. 59. ‒ C. 242254. 73. Lighthart B., Shaffer, B.T. Airbourne bacteria in the atmosphere surface-layer temporal distribution above a grass seed field // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 1995. ‒ T. 61. ‒ C. 14921496. 74. Margesin R., Miteva V. Diversity and ecology of psychrophilic microorganisms // Res. Microbiol. ‒ 2011. ‒ T. 162. ‒ C. 346-361. 75. Dimmick R. L., Wolochow H., Chatigny M. A. Evidence that bacteria can form new cells in airborne particles // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 1979. ‒ T. 37. ‒ C. 924-927. 105 76. Griffin D. W. Non-spore forming eubacteria isolated at an altitude for 20,000 m in Earth’s atmosphere: extended incubation periods needed for culture-based assays // Aerobiologia. ‒ 2008. ‒ T. 24. ‒ C. 19-25. 77. Imshenetsky A. L. S., Kazakov G. Upper boundary of the biosphere // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 1978. ‒ T. 35, № 1. ‒ C. 1-5. 78. Deguillaume L., Leriche M., Amato P., Ariya P.A., Delort A.-M., Po ̈schl U., Chaumerliac N., Bauer H., Flossmann A.I., Morris C.E. Microbiology and atmospheric processes: chemical interactions of primary biological aerosols // Biogeosciences ‒2008. ‒ T. 5. ‒ C. 1073-1084. 79. Hamilton W. D., Lenton T.M. Spora and Gaia how microbes fly with their clouds // Ethol. Ecol. Evol. ‒ 1998. ‒ T. 10. ‒ C. 1-16. 80. Christner B. C., Cai R., Morris C.E., McCarter K.S., Foreman C.M., Skidmore M.L., Montross S.N., Sands D.C. Geographic, seasonal, and precipitation chemistry influence on the abundance and activity of biological ice nucleators in rain and snow // Proc. Natl. Acad. Sci. ‒ 2008. ‒ T. 105. ‒ C. 18854-18859. 81. Polar microbiology: the ecology, biodiversity and bioremediation potential of microorganisms in extremely cold environments / Bej A. K. Aislabie J., Atlas R. M. ‒ CRC Press: Taylor and Francis Group, 2009. 82. Scarchilli C. Precipitation and sublimation impact on snow accumulation over Antarctica; University of Siena. ‒ Siena, Italy, 2007. 83. Li F. G. P., Ramaswamy V. Distribution, transport, and deposition of mineral dust in the Southern Ocean and Antarctica: Contribution of major sources // J. Geophys. Res. ‒ 2008. ‒ T. 113. ‒ C. D10207. 84. Pearce D. A., Bridge P. D., Hughes K. A., Sattler B., Psenner R., Russell N. J. Microorganisms in the atmosphere over Antarctica // FEMS Microbiol. Ecol. ‒ 2009. ‒ T. 69. ‒ C. 143-157. 85. Hughes K. A., McCartney H. A., Lachlan-Cope T. A., Pearce D. A. A preliminary study of airborne microbial biodiversity over peninsular Antarctica. // Cell Mol. Biol. ‒ 2004. ‒ T. 50. ‒ C. 537-542. 106 86. Bottos E., Woo A., Zawar-Reza P., Pointing S., Cary S. Airborne bacterial populations above desert soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica // Microb. Ecol. ‒ 2014. ‒ T. 67, № 1. ‒ C. 120-128. 87. Herbert R. A. The ecology and physiology of psychrophillic microorganisms // Microbes in extreme environments / Herbert R. A., Codd G.A. ‒ London: Academic Press, 1986. ‒ C. 1-23. 88. Tracers in the sea. / Broecker W. S., Peng T.-H., Beng Z. ‒ Lamont-Doherty Geological Observatory, Columbia University: Eldigio Pr, 1982. ‒ 690 с. 89. Signori C. N., Thomas F., Enrich-Prast A., Pollery R.C.G., Sievert, S.M. Microbial diversity and community structure across environmental gradients in Bransfield Strait, Western Antarctic Peninsula // Front. Microbiol. ‒ 2014. ‒ T. 5. ‒ C. 647. 90. Bano N., Hollibaugh J.T. Phylogenetic composition of bacterioplankton assemblages from the Arctic Ocean // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2002. ‒ T. 68. ‒ C. 505-518. 91. Murray A. E., Grzymski J.J. Genomics and diversity of Antarctic marine microorganisms // Phil. Trans. R. Soc. B. ‒ 2007. ‒ T. 362. 92. Michaud L., Cello F. D., Brilli M., Fani R., Guidice A.L., Bruni V. Biodiversity of cultivable psychrotrophic marine bacteria isolated from Terra Nova Bay (Ross Sea, Antarctica) // FEMS Microbial. Lett. ‒ 2004. ‒ T. 230. ‒ C. 63-71. 93. Hollibaugh J. T., Lovejoy C., Murray A.E. Microbiology in Polar Oceans // Oceanography. ‒ 2007. ‒ T. 20, № 2. ‒ C. 140-145. 94. Sea-ice microbial communities. Biology of the Southern Ocean, Second Edition. / Knox G. A. ‒ CRC Press: Taylor and Francis Group, 2007. Biology of the Southern Ocean, Second Edition. 95. Brinkmeyer R., Knittel K., Jürgens J., Weyland H., Amann R., Helmke E. Diversity and structure of bacterial communities in Arctic versus Antarctic pack ice // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2003. ‒ T. 69, № 11. ‒ C. 6610-9. 96. Brown M. V., Bowman J.P. A molecular phylogenetic survey of sea-ice microbial communities (SIMCO) // FEMS Microbiol. Ecol. ‒ 2001. ‒ T. 35. ‒ C. 267-275. 97. Lizotte M. The contributions of sea ice algae to Antarctic marine primary production // Amer. Zool. ‒ 2001. ‒ T. 41, № 1. ‒ C. 57-73. 107 98. Gosink J., Herwig R. P., Staley J. T. Octadecobacter arcticus, gen. nov., sp. nov. and O. antarcticus, sp. nov., nonpigmented, psychrophilic gas vacuolated bacteria from polar sea ice and water // Syst. Appl. Microbiology. ‒ 1997. ‒ T. 20. ‒ C. 356-65. 99. Irgens R. L., Gosink J., Staley J. T. Polaromonas vacuolata, nov. gen. et sp., gas vacuolated bacteria from sea waters of Antarctica // Int. J. Syst. Bacteriol. . ‒ 1998. ‒ T. 46. ‒ C. 822-826. 100. Gosink J. J., Woese C. R., Staley J. T. . Polaribacter gen. nov., with three new species, P. irgensii, sp. nov., P. franzmanni sp. nov., and P. filamentus, sp. nov., gas vacuolated polar marine bacteria of the Cytophaga/Flavobacterium/Bacteroides Group and reclassification of “Flectobacillus glomeratus” as Polaribacter glomeratus. // Int. J. Syst. Bacteriol. ‒ 1998. ‒ T. 48. ‒ C. 223-35. 101. Bowman J. P., McCammon S. A., Lewis T., Skerrat J. H., Brown J. L. . Psychroflexus torques gen. nov., sp. nov., a psychrophilic species from Antarctic sea ice, and reclassification of Flavobacterium gondwanense as Psychroflexus gondwanense gen. nov. comb // Nov. Microbiol. ‒ 1998. ‒ T. 144. ‒ C. 1601-9. 102. Bowman J. P., McCammon S. A., Brown J., Nichols P. D., McMeekin T. A. Psychroserpens burtonensis gen. nov., sp. nov. and Gelidibacter algens gen. nov., sp. nov.: psychrophilic bacteria from Antarctic lacustrien and sea ice habitats // Int. J. Syst. Bacteriol. ‒ 1997. ‒ T. 47. ‒ C. 670-677. 103. Bowman J. R. S., Blom N., Deming J., Rysgaard S., Sicheritz-Ponten T. Microbial community structure of Arctic multiyear sea ice and surface seawater by 454 sequencing of the 16S RNA gene // ISME J. ‒ 2012. ‒ T. 6. ‒ C. 11-20. 104. Vincent W. F., Hobbie J.E., Laybourn-Parry J. Introduction to the limnology of highlatitude lakes and river ecosystems // Polar lakes and rivers: limnology of Arctic and Antarctic aquatic ecosystems / Laybourn- Parry J.Oxford University Press, 2008. ‒ C. 1-24. 105. Wright A., Siegert M. A fourth inventory of Antarctic subglacial lakes // Antarctic Science. ‒ 2012. ‒ T. 24, № 6. ‒ C. 659-664. 106. Christner B. C., Skidmore M.L., Priscu J.C.,Tranter M., Foreman C.M. Bacteria in subglacial environments // Psychrophiles: from biodiversity to biotechnology / Margesin R., Schinner F., Marx J.-C., Gerday C. Springer, Berlin, 2008. ‒ C. 51-71. 108 107. Priscu J. C., Christner B.C. Earth’s icy biosphere // Microbial diversity and bioprospecting / Bull A. ‒ Washington, D.C.: ASM Press, 2004. ‒ C. 130-145. 108. Petit J. R., Alekhina I., Bulat S. Lake Vostok, Antarctica: exploring a subglacial lake and searching for life in an extreme environment // Lectures in Atrobiology / M. Gargaud ‒ Berlin Heidelberg Springer-Verlag, 2005. 109. Bulat S., Khilchenko M., Karlov D., Demchenko L., Doronin M., Marie D., Lipenkov V., Lukin V. Ambiguous microbial life in the drillbit and borehole frozen water of the subglacial lake Vostok, East Antarctica: Тез. докл. 10th International Congress on Extremophiles ‒ Saint-Petersburg, 2014. ‒ C. 86. 110. Christner B. C., Priscu J.C., Achberger A.M., Barbante C., Carter S.P., Christianson K., Michaud A.B., Mikucki J.A., Mitchell A.C., Skidmore M.L., Vick-Majors T.J., the WISSARD Science Team. A microbial ecosystem beneath the West Antarctic ice sheet // Nature Letter Research. ‒ 2014. ‒ T. 512. ‒ C. 310-315. 111. DeMaere M. Z., Williams T.J., Allen M.A., Brown M.V., Gibson J.A.E., Richa J., Lauro F.M., Dyall-Smith M., Davenport K.W., Woyke T., Kyrpides N.C., Tringe S.G., Cavicchioli R. High level of intergenera gene exchange shapes the evolution of haloarchaea in an isolated Antarctic lake // Proc. Natl. Acad. Sci. ‒ 2013. ‒ T. 110, № 42. ‒ C. 16939– 16944. 112. Wright S. W., Burton H. R. The biology of antarctic saline lakes // Hydrobiologia. ‒ 1981. ‒ T. 82. ‒ C. 319-338. 113. Franzman P. D., Stackebrandt E., Sanderson K., Volkman J.K., Cameron D.E., Stevenson P.L., Mcmeekin T.A., Burton H.R. Halobacterium lacusprofundi sp. nov., a halophilic bacterium isolated from Deep Lake, Antarctica // System Appl. Microbiol. ‒ 1988. ‒ T. 11. ‒ C. 20-27. 114. Mou Y. Z., Qiu X. X., Zhao M. L., Cui H. L., Oh D., Dyall-Smith M. L. Halohasta litorea gen. nov. sp. nov., and Halohasta litchfieldiae sp. nov., isolated from the Daliang aquaculture farm, China and from Deep Lake, Antarctica, respectively // Extremophiles. ‒ 2012. ‒ T. 16. ‒ C. 895-901. 109 115. Bowman J. P., McCammon S. A., Rea S. M., McMeekin T. A. The microbial composition of three limnologically disparate hypersaline Antarctic lakes // FEMS Microbiol. Lett. ‒ 2000. ‒ T. 183. ‒ C. 81-88. 116. Tschitschko B., Williams T.J., Allen, M.A., Páez-Espino, D., Kyrpides, N., Zhong, L., Raftery, M.J., Cavicchioli R. Antarctic archaea–virus interactions: metaproteomeled analysis of invasion, evasion and adaptation // ISME J. ‒ 2015. ‒ C. 1-14. 117. Goldfarb T., Sberro H., Weinstock E., Cohen O., Doron S., Charpak-Amikam Y., Sorek R. BREX is a novel phage resistance system widespread in microbial genomes // EMBO J. ‒ 2015. ‒ T. 34. ‒ C. 169–183. 118. Mikucki J. A., Priscu J. C. Bacterial diversity associated with blood falls, a subglacial outflow from the Taylor Glacier, Antarctica // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2007. ‒ T. 73, № 12. ‒ C. 4029-4039. 119. Mannisto M., Haggblom M.M. Characterization of psychrotolerant heterotrophic bacteria from Finnsish Lapland // Syt. Appl. Microbiol. ‒ 2006. ‒ T. 29. ‒ C. 229-243. 120. Chu H., Fierer N., Lauber C., Caporaso J., Knight R., Grogan P. Soil bacterial diversity in the Arctic is not fundamentally different from that found in other biomese // Environ. Microbiol. ‒ 2010. ‒ T. 12, № 11. ‒ C. 2998-3006. 121. Neufeld J., Mohn W. Unexpectedly high bacterial diversity in Arctic Tundra relative to boreal forest soils, revealed by serial analysis of ribosomal sequence tags // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2005. ‒ T. 71, № 10. ‒ C. 5710-5718. 122. Bell T. H., Yergeau E., Maynard C., Juck D., Whyte L. G., Greer C. W. Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance // ISME J. ‒ 2013. ‒ T. 7, № 6. ‒ C. 1200-10. 123. Bottos E., Scarrow J., Archer S., McDonald I., Cary S. Bacterial community structures of Antarctic soils // Antarctic Terrestrial Microbiology / Cowan D. ‒ The University of Waikato, Hamilton, New Zealand, 2014. 124. Darling C. A., Siple P. A. Bacteria of Antarctica // J. Bacteriol. ‒ 1941. ‒ T. 42. ‒ C. 83–98. 125. Cary S., McDonald I., Barrett J., Cowan D. On the rocks: the microbiology of Antarctic Dry Valley soils // Nature Rev. Microbiol. ‒ 2010. ‒ T. 8. ‒ C. 129-138. 110 126. Геоморфологический атлас. Антарктика. ‒ Санкт-Петербург: Карта, 2011. ‒ 236 С. 127. Lane D. J. 16S/23S rRNA sequencing // Nucl. Acid Tech. Bact. System. / Stackebrandt E., Goodfellow M. ‒ UK: John Wiley and Sons, Chichester, 1991. ‒ C. 115–147. 128. Klindworth A., Pruesse E., Schweer T., Peplies J., Quast C., Horn M., Glockner F. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and nextgeneration sequencing-based diversity studies // Nucl. Acids. Res. ‒ 2012. ‒ T. 41, № 1. ‒ C. e1. 129. Nuebel U., Gagcia-Pichel F., Muyzera G. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from Cyanobacteria // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 1997. ‒ T. 63. ‒ C. 3327-3332. 130. Cytryn E., Minz D., Oremland R.S., Cohen Y. Distribution and diversity of Archaea corresponding to the limnological cycle of a hypersaline stratified lake (Solar Lake, Sinai, Egypt) // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2000. ‒ T. 66. ‒ C. 3269-3276. 131. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. ‒ 1990. ‒ T. 96, № 1. ‒ C. 23-8. 132. Caporaso J. G., Lauber C. L., Walters W. A., Berg-Lyons D., Lozupone C. A., Turnbaugh P. J., Fierer N., Knight R. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample // Proc. Natl. Acad. Sci. ‒ 2011. ‒ T. 108. ‒ C. 4516-4522. 133. Cole J. R., Wang Q., Fish J. A., Chai B., McGarrell D. M., Sun Y., Brown C. T., Porras-Alfaro A., Kuske C. R., Tiedje J. M. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis // Nucl. Acids. Res. ‒ 2014. ‒ T. 42(Database issue). ‒ C. D633-D642. 134. Woo Jun Sul J. R. C., Ederson da C. Jesus, Qiong Wang, Ryan J. Farris, Jordan A. Fish, and James M. Tiedje. Bacterial community comparisons by taxonomy-supervised analysis independent of sequence alignment and clustering // PNAS. ‒ 2011. ‒ T. 108, № 35. ‒ C. 14637-14642. 135. Meyer F., Paarmann D., D'Souza M., Olson R., Glass E.M., Kubal M., Paczian T., Rodriguez A., Stevens R., Wilke A., Wilkening J., Edwards R.A. The metagenomics RAST server – a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes // BMC Bioinformatics. ‒ 2008. ‒ T. 9. ‒ C. 386. 111 136. Parks D. H., Tyson G. W., Hugenholtz P., Beiko R. G. STAMP: Statistical analysis of taxonomic and functional profiles // Bioinformatics. ‒ 2014. ‒ T. 30. ‒ C. 3123-3124. 137. Benjamini Y., Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing // J.R.Statist.Soc. ‒ 1995. ‒ T. 57. ‒ C. 289-300. 138. Skennerton C. T., Imelfort M., Tyson G. W. Crass: identification and reconstruction of CRISPR from unassembled metagenomic data // Nucl. Acids. Res. ‒ 2013. ‒ T. 41, № 10. ‒ C. e105. 139. MacQueen J. Some methods for classification and analysis of multivariate observations. Proceedings of the Fifth Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability // Statistics. ‒ Berkeley, Calif.: University of California Press, 1967. ‒ C. 281297. 140. Camacho C., Madden T., Ma N., Tao T., Agawala R., Morgulis A. BLAST® Command Line Applications User Manual. ‒ National Center for Biotechnology Information (US), 2008. 141. Goecks J., Nekrutenko A., Taylor J., The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences // Genome Biol. . ‒ 2010. ‒ T. 11, № 8. ‒ C. R86. 142. Blankenberg D., Von Kuster G., Coraor N., Ananda G., Lazarus R., Mangan M., Nekrutenko A., Taylor J. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists // Current Protocols in Molecular Biology. ‒ 2010. ‒ T. 19, № 19.10. ‒ C. 1-21. 143. Giardine B., Riemer C., Hardison R. C., Burhans R., Elnitski L., Shah P., Zhang Y., Blankenberg D., Albert I., Taylor J., Miller W., Kent W. J., Nekrutenko A. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis // Genome Res. ‒ 2005. ‒ T. 15, № 10. ‒ C. 1451-5. 144. Biswas A., Gagnon J.N., Brouns S.J., Fineran P.C., Brown C.M. . CRISPRTarget: Bioinformatic prediction and analysis of crRNA targets // RNA Biol. ‒ 2013. ‒ T. 10, № 5. ‒ C. 817–827. 145. Crooks G. E., Hon G., Chandonia J. M., Brenner S. E. WebLogo: A sequence logo generator // Genome Res. ‒ 2004. ‒ T. 14 ‒C. 1188-1190. 112 146. Introduction to Statistics for Biology, Third Edition / McCleery M. R., Watt T. A., Hart T. ‒ Chapman and Hall/CRC, 2007. 147. Good I. L. The population frequencies of species and the estimation of population parameters // Biometrika. ‒ 1953. ‒ T. 40. ‒ C. 237-264. 148. Chao A. Estimating the population size for capture-recapture data with unequal catchability // Biometrics. ‒ 1987. ‒ T. 43. ‒ C. 783-791. 149. Paul F. Kemp J. Y. Bacterial diversity in aquatic and other environments: what 16S rDNA libraries can tell us // FEMS Microbiol. Ecol. ‒ 2004. ‒ T. 47. ‒ C. 161-177. 150. An L. Z., Chen Y., Xiang S.-R., Shang T.-C., Tian L.-De. Differences in community composition of bacteria in four glaciers in western China // Biogeosciences. ‒ 2010. ‒ T. 7. ‒ C. 1937-1952. 151. Liu Y., Yao T., Kang S., Jiao N., Zeng Y., Shi Y., Luo T., Jing Z., Huang S. Seasonal variation of snow microbial community structure in the East Rongbuk glacier, Mt. Everest. // Chin. Sci. Bull. ‒ 2006. ‒ T. 51. ‒ C. 1476-1486. 152. Behrendt L., Larkum A.W.D., Trampe E., Norman A., Sørensen S.J., Kuhl M. Microbial diversity of biofilm communities in microniches associated with the didemnid ascidian Lissoclinum patella // ISME J. ‒ 2012. ‒ T. 6. ‒ C. 1222-1237. 153. Fierer N., Jackson B.J. The diversity and biogeography of soil bacterial communities // Proc. Natl. Acad. Sci. ‒ 2006. ‒ T. 103. ‒ C. 626-631. 154. Alonso-Sáez L., Andersson A., Heinrich F., Bertilsson S. High archaeal diversity in Antarctic circumpolar deep waters // Environ. Microbiol. ‒ 2011. ‒ T. 3, № 6. ‒ C. 689-697. 155. Høj L., Olsen R.A., Torsvik V.L. Archaeal communities in High Arctic wetlands at Spitsbergen, Norway (78 degrees N) as characterized by 16S rRNA gene fingerprinting. // FEMS Microbiol. Ecol. ‒ 2005. ‒ T. 53. ‒ C. 89-101. 156. Chuvochina M. S., Alekhina I.A., Normand P., Petit J.-R., Bulat S.A. Three events of Saharan dust deposition on the Mont Blanc Glacier associated with different snow colonizing bacterial phylotypes // Microbiol. ‒ 2011. ‒ T. 80. ‒ C. 125-131. 157. Campbell B. J., Yu L., Heidelberg J. F., Kirchmana D. L. Activity of abundant and rare bacteria in a coastal ocean // Proc. Natl. Acad. Sci. ‒ 2011. ‒ T. 108, № 31. ‒ C. 1277612781. 113 158. Xiang S. R., Yao T. D., An L. Z., Li Z., Wu G. J., Wang Y. Q., Xu B. Q., Wang J. X. Change of bacterial community in the Malan Ice Core and its relation to climate and environment // Chin. Sci. Bull. ‒ 2009. ‒ T. 49. ‒ C. 1869-1875. 159. Cherbunina M., Filippova S., Surgucheva N., Brouchkov A., Griva, G., Galchenko, V. Corynebacteria from Relict Permafrost // Geophisical research Abstracts ‒ 2011. ‒ T. 13. ‒ C. EGU2011-268-1. 160. Horowitz N., Cameron R., Hubbard J. Microbiology of the Dry Valleys of Antarctica // Science. ‒ 1972. ‒ T. 176. ‒ C. 242-245. 161. Gentile G., Giuliano L., D’Auria G., Smedile F., Azzaro M., De Domenico M., Yakimov M. M. Study of bacterial communities in Antarctic coastal waters by a combination of 16S rRNA and 16S rDNA sequencing // Environ. Microbiol. ‒ 2006. ‒ T. 8, № 12. ‒ C. 2150-2161. 162. Felip M., Sattler B., Psenner R., Catalan J. Highly active microbial communities in the ice and snow cover of high mountain lakes // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 1995. ‒ T. 61. ‒ C. 2394-2401. 163. Koonin EV M. K., Aravind L. Horizontal gene transfer in Prokaryotes: quantification and classification // Annual Rev. Microbiol. ‒ 2001. ‒ T. 55. ‒ C. 709-742. 164. Van de Vijvera B., Cocquyt C., Haan M., Kopalováb K., Zidarova R. The genus Surirella (Bacillariophyta) in the sub-Antarctic and maritime Antarctic region // Diatom Research. ‒ 2013. ‒ T. 28, № 1. ‒ C. 93-108. 165. Miteva V., Rinehold K., Sowers T., Sebastian A., Brenchley J. Abundance, viability and diversity of the indigenous microbial populations at different depths of the NEEM Greenland ice core // Polar Res. ‒ 2015. ‒ T. 34. ‒ C. 25057. 166. Castillo D., Christiansen R.H., Dalsgaard I., Madsen L., Middelboe М. Bacteriophage resistance mechanisms in the fish pathogen Flavobacterium psychrophilum: Linking genomic mutations to changes in bacterial virulence factors // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2014. ‒ T. 81, № 3. ‒ C. 1157-67. 167. Nedwell D. B., Rutter M. Influence of temperature on growth rate and competition between two psychrotolerant Antarctic bacteria: low temperature diminishes affinity for substrate uptake // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 1994. ‒ T. 60, № 6. ‒ C. 1984-92. 114 168. Wilkins D., Yau S., Williams T.J., Allen M.A., Brown M.V., Matthew Z. DeMaere M.Z., Lauro F.M., Cavicchioli, R. Key microbial drivers in Antarctic aquatic environments // FEMS Microbiol. Rev. ‒ 2013. ‒ T. 37. ‒ C. 303–335. 169. Philippe N., Legendre M., Doutre G., Couté Y., Poirot O., Lescot M., Arslan D., Seltzer V., Bertaux L., Bruley C., Garin J., Claverie J.-M, Abergel C. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes // Science. ‒ 2013. ‒ T. 341, № 6143. ‒ C. 281-286. 170. Abrahão J. S., Dornas F.P., Silva L.C.F, Almeida G.M., Boratto P.V.M., Colson P., La Scola B., Kroon E. G. Acanthamoeba polyphaga mimivirus and other giant viruses: an open field to outstanding discoveries // Virology. ‒ 2014. ‒ T. 11, № 120. 171. Kerepesi C., Grolmusz V. Nucleotide Sequences of Giant Viruses Found in Soil Samples of the Mojave Desert, the Prairie, the Tundra and the Antarctic Dry Valleys // arxiv.org ‒ 2015. ‒ arXiv:1503.05575. 172. Yau S., Lauro F.M., DeMaere M.Z., Brown M.V., Thomas T., Raftery M.J., AndrewsPfannkoch C., Lewis M., Hoffman J.M., Gibson J.A., Cavicchiolia R. Virophage control of antarctic algal host–virus dynamics // Proc. Natl. Acad. Sci. ‒ 2011. ‒ T. 108, № 15. ‒ C. 6163–6168. 173. Legendre M., Bartoli J., Shmakova L., Jeudy S., Labadie K., Adrait A., Lescot M., Poirot O., Bertaux L., Bruley C., Couté Y., Rivkina E., Abergel C., Claverie J. M. Thirtythousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology // Proc. Natl. Acad. Sci. ‒ 2014. ‒ T. 111, № 11. ‒ C. 4274-9. 174. Ackermann H. W. Tailed bacteriophages: the order Caudovirales // Adv. Virus. Res. ‒ 1998. ‒ T. 51. ‒ C. 135-201. 175. Overbeek R., Begley T., Butler R. M., Choudhuri J. V., Chuang H. Y., Cohoon M., de Crécy-Lagard V., Diaz N., Disz T., Edwards R., Fonstein M., Frank E. D., Gerdes S., Glass E. M., Goesmann A., Hanson A., Iwata-Reuyl D., Jensen R., Jamshidi N., Krause L., Kubal M., Larsen N., Linke B., McHardy A. C., Meyer F., Neuweger H., Olsen G., Olson R., Osterman A., Portnoy V., Pusch G. D., Rodionov D. A., Rückert C., Steiner J., Stevens R., Thiele I., Vassieva O., Ye Y., Zagnitko O., Vonstein V. The subsystems approach to genome 115 annotation and its use in the project to annotate 1000 genomes // Nucl. Acids. Res. ‒ 2005. ‒ T. 33, № 17. ‒ C. 5691-5702. 176. Mohan A. M., Bibby K.J., Lipus D., Hammack R.W., Gregory K.B. The functional potential of microbial communities in hydraulic fracturing source water and produced water from natural gas extraction characterized by metagenomic sequencing // PLoS One. ‒ 2014. ‒ T. 9, № 10. ‒ C. e107682. 177. Cussiol J. R., Alegria T. G., Szweda L. I., Netto L. E. Ohr (organic hydroperoxide resistance protein) possesses a previously undescribed activity, lipoyl-dependent peroxidase // J. Biol. Chem. ‒ 2010. ‒ T. 285, № 29. ‒ C. 21943-50. 178. Frey A. D., Farrés J., Bollinger C.J., Kallio P.T. Bacterial hemoglobins and flavohemoglobins for alleviation of nitrosative stress in Escherichia coli // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2002. ‒ T. 68. ‒ C. 4835-4840. 179. Thamban M. T. R. C. Trace metal concentrations of surface snow from Ingrid Christensen Coast, East Antarctica—spatial variability and possible anthropogenic contributions // Envir. Monit. Assess. ‒ 2013. ‒ T. 185. ‒ C. 2961-2975. 180. Ghafourian S., Raftari M., Sadeghifard N., Sekawi Z. Toxin-antitoxin Systems: Classification, Biological Function and Application in Biotechnology // Curr. Issues Mol. Biol. ‒ 2013. ‒ T. 16. ‒ C. 9-14. 181. Aizenman E., Engelberg-Kulka H., Glaser G. An Escherichia coli chromosomal "addiction module" regulated by guanosine corrected 3',5'-bispyrophosphate: a model for programmed bacterial cell death // Proc. Natl. Acad. Sci. ‒ 1996. ‒ T. 93, № 12. ‒ C. 605963. 182. Chylinski K., Makarova K.S., Charpentier E., Koonin E.V. Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems // Nucl. Acids. Res. ‒ 2014. ‒ T. 42, № 10. ‒ C. 6091-6105. 183. Grissa I. V. G., Pourcel C. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats // BMC Bioinformatics. ‒ 2007. ‒ T. 8. ‒ C. 172. 184. Shmakov S., Savitskaya E., Semenova E., Logacheva M.D., Datsenko K.A., Severinov K. Pervasive generation of oppositely oriented spacers during CRISPR adaptation // Nucl. Acids. Res. ‒ 2014. ‒ T. 42, № 9. ‒ C. 5907-16. 116 185. Touchon M., Barbier P., Bernardet J.-F., Loux V., Vacherie B., Barbe V., Rocha E. P. C., Duchaud E. Complete Genome Sequence of the Fish Pathogen Flavobacterium branchiophilum // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2011. ‒ T. 77, № 21. ‒ C. 7656–7662. 186. Hsu P. D., Lander E.S., Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering // Cell. ‒ 2014. ‒ T. 157. ‒ C. 1262-1278. 187. Andersson A. F., Banfield J.F. Virus population dynamics and acquired virus resistance in natural microbial communities // Science. ‒ 2008. ‒ T. 320, № 5879. ‒ C. 1047–1050. 188. Delmont T. O., Robe P., Clark I., Simonet P., Vogel T. M. Metagenomic comparison of direct and indirect soil DNA extraction approaches // J. Microbiol. Methods. ‒ 2011. ‒ T. 86. ‒ C. 397-400. 189. Varin T., Lovejoy C., Jungblut A. D., Vincent W. F., Corbeil, J. Metagenomic analysis of stress genes in microbial mat communities from Antarctica and the High Arctic // Appl. Environ. Microbiol. ‒ 2012. ‒ T. 78. ‒ C. 549-559. 117 Приложение Таблица 1. Образцы из общедоступной базы данных MG-RAST, использованные в сравнительном анализе функциональных категорий генов методом главных компонент. В таблице представлена сводная информация о количестве последовательностей для каждого метагеномного образцах, и даны номера, присвоенные базой данных каждому образцу. Номер метагенома в базе данных MGRAST Экосистема Название метагенома в базе данных MG-RAST Количество последовательност ей Ссылка 4624083.3 снег Druzhnaja 1.01E+06 настоящее исследование 4624084.3 снег Leningradskaja 2.37E+06 настоящее исследование 4624085.3 снег Mirnii 3.15E+06 настоящее исследование 4624086.3 снег Progress 1.04E+06 настоящее исследование 4446892.3 почва RothE1 1.05E+06 [188] 4446896.3 почва RothE41 1.23E+06 [188] 4446895.3 почва RothE4B 1.02E+06 [188] 4446894.3 почва RothE4A 1.22E+06 [188] 4446902.3 почва RothF47 1.24E+06 [188] 4446903.3 почва RothF48 1.06E+06 [188] 4446904.3 почва RothL01 8.60E+05 [188] 4446153.3 почва Puerto_Rico_Soil 7.82E+05 [188] 4443697.3 открытый океан open_ocean_P1 2.93E+05 [135] 4443725.3 открытый океан open_ocean_NA1 2.57E+05 [135] 4443729.3 открытый океан open_ocean_NA2 2.89E+05 [135] 118 4443713.3 прибрежный океан coast_ocean_MB1 2.22E+05 [135] 4443714.3 прибрежный океан coast_ocean_MB2 1.89E+05 [135] 4443716.3 прибрежный океан coast_ocean_MB3 2.23E+05 [135] 4445126.3 антарктический микробный мат Polar_Microbial_Ma t_MIS 2.57E+05 [189] 4445129.3 антарктический микробный мат Polar_Microbial_Ma t_WHI 3.36E+05 [189] 4445845.3 антарктический микробный мат Polar_Microbial_Ma t_MM 8.33E+04 [189] Таблица 2. Функциональные категории генов в метагеномах антарктического снега, антарктического микробного мата, почвы и морской воды. Сравнение проводилось по критерию p-value<0,05, антарктические образцы выделены жирным шрифтом. Функциональ ные категории, 1 уровень Virulence, Disease and Defense Cell Wall and Capsule Iron acquisition and metabolism Stress Response Phages, Prophages, Transposable elements, Plasmids Membrane Transport Clusteringbased subsystems Функциональ ные категории, 2 уровень Resistance to antibiotics and toxic compounds Gram-Negative cell wall components Iron acquisition and metabolism Periplasmic Stress Transposable elements Protein secretion system, Type III Probably organic hydroperoxide resistance related hypothetical protein p-values Антаркт ический снег Антаркти ческий микробн ый мат Морская вода, побережь е Морская вода, толща Почва 1,029E-08 3,649 2,329 1,003 0,822 2,935 2,880E-08 1,245 0,815 0,903 0,720 0,840 3,564E-08 1,411 0,668 0,691 0,644 0,458 6,726E-08 0,112 0,057 0,080 0,072 0,056 2,943E-07 0,173 0,159 0,052 0,050 0,131 4,284E-06 0,034 0,013 0,002 0,001 0,019 8,347E-06 0,044 0,024 0,011 0,019 0,021 119 Stress Response Clusteringbased subsystems Potassium metabolism Virulence, Disease and Defense Virulence, Disease and Defense Regulation and Cell signaling Cofactors, Vitamins, Prosthetic Groups, Pigments Membrane Transport Membrane Transport Regulation and Cell signaling Clusteringbased subsystems Motility and Chemotaxis Respiration Iron acquisition and metabolism Membrane Transport Clusteringbased subsystems Secondary Metabolism Membrane Transport Stress Response DNA polymerase III epsilon cluster Potassium metabolism Bacteriocins, ribosomally synthesized antibacterial peptides Virulence, Disease and Defense Programmed Cell Death and Toxin-antitoxin Systems Biotin Protein secretion system, Type VIII Membrane Transport Regulation of virulence TldD cluster Motility and Chemotaxis Electron accepting reactions Siderophores Protein and nucleoprotein secretion system, Type IV recX and regulatory cluster Aromatic amino acids and derivatives - #1 Sugar Phosphotransfe rase Systems, 1,027E-05 0,285 0,243 0,138 0,150 0,246 2,134E-05 0,095 0,061 0,080 0,066 0,043 2,234E-05 0,443 0,334 0,213 0,170 0,403 3,318E-05 0,016 0,008 0,001 0,001 0,011 3,387E-05 0,352 0,246 0,193 0,193 0,326 5,983E-05 0,120 0,107 0,015 0,013 0,068 6,667E-05 0,423 0,289 0,267 0,260 0,368 6,776E-05 0,030 0,007 0,015 0,009 0,010 7,596E-05 1,013 0,678 0,678 0,608 0,603 1,178E-04 0,201 0,188 0,182 0,146 0,151 2,918E-04 0,117 0,091 0,088 0,084 0,067 5,204E-04 0,415 0,275 0,031 0,042 0,233 5,588E-04 0,859 0,559 0,562 0,599 0,747 5,717E-04 0,114 0,016 0,006 0,014 0,048 8,417E-04 0,384 0,215 0,156 0,135 0,162 1,045E-03 0,040 0,035 0,039 0,026 0,028 1,189E-03 0,033 0,010 0,014 0,010 0,031 1,227E-03 0,110 0,080 0,035 0,021 0,083 120 PTS Clusteringbased subsystems Membrane Transport Membrane Transport Clusteringbased subsystems Fatty Acids, Lipids, and Isoprenoids Carbohydrates Metabolism of Aromatic Compounds Virulence, Disease and Defense Phages, Prophages, Transposable elements, Plasmids Fatty Acids, Lipids, and Isoprenoids Respiration Clusteringbased subsystems Secondary Metabolism Amino Acids and Derivatives Motility and Chemotaxis Putative GGDEF domain protein related to agglutinin secretion Protein secretion system, Type VII Protein secretion system, Type V 1,344E-03 0,016 0,003 0,006 0,001 0,006 1,352E-03 0,017 0,000 0,000 0,000 0,005 2,181E-03 0,029 0,006 0,002 0,001 0,005 DNA metabolism 2,622E-03 0,010 0,009 0,000 0,002 0,004 Triacylglycerol s 3,871E-03 0,031 0,012 0,007 0,001 0,022 7,407E-03 0,063 0,036 0,014 0,011 0,043 7,780E-03 0,957 0,640 0,703 0,584 0,900 7,842E-03 0,029 0,014 0,002 0,004 0,005 Plasmid related functions 1,104E-02 0,037 0,028 0,001 0,006 0,015 Phospholipids 1,110E-02 0,530 0,475 0,413 0,437 0,457 Respiration 1,267E-02 0,825 0,640 0,588 0,614 0,769 1,659E-02 0,057 0,052 0,047 0,053 0,066 2,037E-02 0,009 0,004 0,002 0,000 0,005 Proline and 4hydroxyproline 2,222E-02 0,361 0,349 0,329 0,202 0,317 Flagellar motility Prokaryota 2,428E-02 0,975 0,637 0,473 0,586 0,615 Glycoside hydrolases Peripheral pathways for catabolism of aromatic compounds Invasion and intracellular resistance Pyruvate kinase associated cluster Lipid-derived mediators in Таблица 3. Результаты биоинформатического поиска CRISPR кассет среди случайных ДНК последовательностей в метагеномах образцов со станции Дружная, 121 Ленинградская, Мирный и Прогресс. В таблице представлены последовательности повторов предсказанных в метагеномных последовательностях CRISPR локусов, количество спейсеров в каждом типа CRISPR локусов. Последовательность повтора Количеств о спейсеров Гомологичный повтор в кассете из базы данных GenBank Дружная ATTTCAATTCCAAAATGGTACGATTAGAAG 7 Runella slithyformis CCTCCGAGAACACCATCCAATACAACAAGGATTAAGACAATA 3 no GTTGTGAATTGATTTCAAAATTGTATTTTTATAGACTAATTCCAAC 12 Flavobacterium psychrophilum GTCTCTTTTAATAGGGGCAAACAGTTGAATGGAAAC 4 no ATTGCGGTCGCTCTTCGGGGCGATCGAGGATTGGAAC 3 Chamaesiphon minutus ATCGCAATTGATTGGATTCCCTTTTAGGGATTGAAAC 7 no AGTTTTAGAGCTGTGTTGTTTCGAATGGTTCCAAAACTATTG 3 Streptococcus thermophilus [G/A]TTCACTGCCGCACAGGCAGCTCAGAAA 6 Yersinia pseudotuberculosis GAACAAATACCAGCCCTGAATTCAAAGGGATTAAGAC 26 Candidatus Accumulibacter GGTTCGCCCGTCAGCGATGACGGGCGCGGATTGAAAC 25 no GCAGGGACCATCCCCGCGTGTGCGGGGGAGCC 3 Streptomyces glaucescens GTTCACTGCCGCATAGGCAGCTTAGAAA 9 Yersinia pseudotuberculosis ATTTCTGAGCTGCCTATGCGGCAGTGAAC 6 Desulfurispirillum indicum AATATCGTGTTTTCTAATCTTTAATCAAACCACAAC 4 Flavobacterium columnare GTTGTGAATTGATTTCAAAATTGTATTTTTATAGACTAATTCCAAC 3 Flavobacterium psychrophilum GAAAAGTATCGGCATCATCGCCGGAAATGAAAA 4 no GCAGGAGGCACCTTCGCCGCCGATGCCATA 3 no Ленинградская Мирный 122 AAGTTCGCTGCCGCACACGCAGCTTAGAAA 3 Marinomonas mediterranea AAAAGAAGCCATAAGTCCCCCTAATATTAGA 3 no GATGCGCTAGCCGACAAGGGTCTCGC 3 no GCAGAGAGCCATCGTCGGAGATTACGGC 3 no TCCATAGAGGACTTATTGTCTATATTCCTTCTTAGATATTTCTTAAA 3 no GCGATCAGCGCTTTAGCCAGGGACCAGGGTGCAACA 4 no GCAAATAATTTTAGAGTCTTTATTGAC 3 no AACCAAAGCCCAAGTAGAGATATACGAATGTCGTACTTCCACGAG 3 no ATATTGAGTTGTAATCTCATAACAAGCTGTTCTGAGCTTCCACAT 3 no AATTACAAAACAACAAAAAACAACTACACAACAACTC 4 no ATCGTTTCAATCCGCGCGCCCCGTGTGGGGCGCGACG 3 Selenomonas sputigena ATTTCAATTCCAAAATGGTACGATTAGAAG 95 Runella slithyformis GGATCGCCCGGCTTCAACGCCGGGCGTGGATTGAAAC 42 no GTCGCAATCCCCAAATCCCGGTCTACGGGACTGAAAC 3 Cyanothece sp. CCAGCAAACCAACTTCCAGTAGAATAAGGATTAAGAC 45 no GTTGTGAATTGATTTCAAAATTGTATTTTTATAGACTAATTCCAAC 109 Flavobacterium psychrophilum Прогресс GCTTCAATGGAGCCGCCCACCGAAGTGAGCGGAATGGAC 3 no AATATCGTGTTTTCTAATCTTTAATCAAACCACAAC 36 Flavobacterium columnare ATTTCAATTCCTCAATGGTGCGATTAAAAG 12 Niastella koreensis GGGCCTATCCCCGCTCGCGCGGGGGAACC 6 Cronobacter sakazakii ATTGCATAAAAGCATCATCCATTAAAACAAGGATTAAGAC 3 Prevotella denticola GTTGTGATTTGCTTTCAATTTCTGATCGGACGATCTTTGATAACAAC 9 TTAAACCTGAAACAAAATTTCAAACCTGAAACAAA 3 123 CTTAAAAATCAACTTCCATTAAAATAAGGATTGAAAC 10 Clostridium clariflavum GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTCAGAAA 4 Yersinia pseudotuberculosis GCTTCAAAGCCTCTGAAACCCTTTTAGGGATTGAAAC 5 GACGAGTCGCAATCCTGCTTTTAACTGGAATATGCTTTTCTATA 3 no GTTGTGACTGCTCTTATTTTGAAGGGTATAAACAAC 4 Flavobacterium branchiophilum ATTCTTAAACATCATCCACAAGAATAAGGATTGAAAC 9 no CTCGTTGTGGTTTGGTGACAGTCAGACCTAAGTACGTTCTTTGCAA 3 no Таблица 4. Соответствие кластерам спейсеров фрагментов ДНК из базы данных GenBank. В таблице представлены кластеры спейсеров из метагеномных образцов библиотек спейсеров антарктических снежных бактерий, которые имели соответствие последовательностям геномов бактериофагов или хромосом Flavobacterium. В четвертой колонке даны фланкирующие протоспейсеры 3’ последовательности, которые были использованы для поиска PAM мотива. Назвнаие кластера Размер кластера Гомолог Фланкирующая последовательно сть на 3' конце Название гена druzhnaja_178 30 Flavobacterium phage FCL-2 GGGGGTAA hypothetical protein druzhnaja_178 30 Flavobacterium phage 6H GGTGGTAA hypothetical protein progress_1356 2 Flavobacterium phage FCL-2 ATTACGAA hypothetical protein leningradskaja_779 12 Flavobacterium phage FCL-2 AATATTGC hypothetical protein leningradskaja_747 87 Flavobacterium branchiophilum FL-15 CGCTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium columnare ATCC 49512 CACTAAGA intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TGTTAAAG Transposase leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TATCAAAG intergenic region 124 leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TATCAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TATCAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TGCTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TATCAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TATCAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TATCAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TGTTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TGTTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TGTTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TGTTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TATCAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TATCAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TATCAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TGCTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TATCAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TATCAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TGTTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TGCTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TATCAAAG intergenic region 125 leningradskaja_747 87 Flavobacterium indicum GPTSA100-9 TGTTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium psychrophilum strain CSF259-93 TATTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium psychrophilum strain CSF259-93 TATTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium psychrophilum strain CSF259-93 TATTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium psychrophilum strain CSF259-93 TGTTAAAG intergenic region leningradskaja_747 87 Flavobacterium psychrophilum strain CSF259-93 TGTTAAAG intergenic region leningradskaja_779 12 Flavobacterium columnare ATCC 49512, complete genome AATATTGC hypothetical protein 126 Благодарности Автор хотел бы высказать большую признательность своему научному руководителю Константину Викторовичу Северинову за интересные проекты, ценные критические замечания и широкие возможности для саморазвития. Автор также выражает благодарность Валерию Владимировичу Лукину, Вячеславу Александровичу Крыленкову, Евгению Абакумову и экипажу НИС «Академик Федоров» за возможность побывать в Антарктиде и отобрать необходимые для исследования образцы; своим коллегам Софии Медведевой, Сергею Шмакову, Екатерине Савицкой, Анфисе Поповой за помощь при анализе и интерпретации результатов высокопроизводительного секвенирования; Марии Логачевой и Алексею Прилипову за проведение секвенирования образцов ДНК; Любови Вячеславовне Лысак за помощь в проведении прямого подсчета бактериальных клеток; Инне Зухер, Илье Кубланову, Летарову Андрею Викторовичу, Майе Петровой, Ольге Бантыш, Сергею Борухову, Светлане Дубилей, – за ценные замечания при обсуждении результатов и моральную поддержку, a также всему коллективу Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ИБГ РАН и Лаборатории регуляции экспрессии мобильных элементов прокариот ИМГ РАН. Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (договор No14.B25.31.0004) и Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (номер государственной̆ регистрации: 01201355171).
