ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Д.Н. Федорин ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Учебно-методическое пособие для вузов Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета 2008 Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 14 февраля 2008 г., протокол № 6 Рецензент доктор биологических наук, профессор М.А. Наквасина Учебно-методическое пособие подготовлено на кафедре физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета. Рекомендуется для студентов 3 и 4 курсов дневного обучения биологопочвенного факультета. Для специальности 020201 – Биология 2 Оглавление Раздел 1. Методы работы с нуклеиновыми кислотами. .......................... 5 Глава I. Выделение и очистка нуклеиновых кислот. .............................. 6 Работа 1. Методика выделения РНК методом фенол-хлороформной экстракции в присутствии хлорида лития. .............................................. Работа 2. Методика выделения геномной ДНК с использованием СТАВ. .......................................................................................................... Работа 3. Методика быстрого выделения РНК из грамм (-) бактерий. Работа 4. Методика экстракции ДНК из агарозного геля с использованием наборов фирмы QIAEX II. ........................................ 9 11 12 13 Глава II. Определение качественных и количественных показателей нуклеиновых кислот. .................................................................................. 14 Работа 5. Определение концентрации ДНК или РНК. ........................... 15 Работа 6. Определение чистоты препарата ДНК или РНК. ................... 16 Работа 7. Методика электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле. ........................................................................................ 18 Раздел 2. Методы анализа нуклеиновых кислот. .................................... Глава I. Обратная транскрипция. ........................................................... 19 Работа 8. Методика проведения обратной транскрипции с использованием фермента M-MuLV Reverse Transcriptase. ............... 22 Глава II. Полимеразная цепная реакция. .................................................. 23 Работа 9. Методика проведения полимеразной цепной реакции. ......... 26 Глава III. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR). ......................................................................................... 28 Работа 10. Методика амплификации с использованием красителя SYBR Green. ............................................................................................... 34 Работа 11. Методика амплификации ДНК с применением зондов Taqman. ........................................................................................... 36 Работа 12. Обработка данных. .................................................................. 37 Глава IV. Гибридизация нуклеиновых кислот. ......................................... 41 3 Работа 13. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного мечения ДНК методом ПЦР .............................. Работа 14. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного мечения ДНК методом удлинения затравки. .......................................... Работа 15. Проведение гибридизации ДНК по Саузерну. ..................... Работа 16. Выявление меченых ДНК с образованием нерастворимого окрашенного продукта. ................................................. Работа 17. Дот-блот-гибридизация ПЦР-амплифицированной ДНК. ...... 44 45 46 48 49 Глава V. Клонирование ДНК в бактериальные системы. ...................... 49 Работа 18. Приготовление компетентных клеток. .................................. Работа 19. Трансформация бактериальных клеток методом «холодового шока». ................................................................................... Работа 20. Выделение плазмидной ДНК (лизис щелочью). .................. Работа 21. Выделение плазмидной ДНК методом фенол-хлороформной экстракции (экспресс-метод). ............................. Работа 22. Определение вставки ДНК в трансформированных клетках методом рестрикции. ................................................................... Работа 23. Идентификация вставки ДНК в трансформированных клетках методом ПЦР. ............................................................................... 4 56 57 58 60 61 61 Раздел 1. Методы работы с нуклеиновыми кислотами Исследования в области молекулярной биологии связаны с целенаправленным манипулированием фрагментами нуклеиновых кислот (НК) или целыми генетическими конструкциями, целью которых является получение с помощью лабораторных методов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введения этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и исследования его уровня экспрессии. В основе молекулярной биологии лежат современные методы физико-химической биологии. Данные методы позволяют получать в чистом виде генетический материал клетки, проводить с ним различные манипуляции, позволяющие идентифицировать как отдельные компоненты, так и целый геном организма. Важным в изучении функционирования живого организма является исследование функциональной активности генетического материала клетки. На первой стадии проведения анализа проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций и получение раствора ДНК или РНК, свободного от ингибиторов и готового для дальнейшей амплификации. Выбор методики выделения ДНК (РНК) в основном определяется характером используемого материала. В зависимости от типа биологического материала лизис клеток осуществляется различными способами. Клетки биоматериала разрушаются различными способами, наиболее часто используемым из которых является механическое разрушение. Часто (в случае работы с растительными и 5 бактериальными клетками) возникает необходимость применения дополнительных компонентов для избавления от клеточной стенки (лизирующие ферменты, детергенты и т. д.). После разрушения образца возникает необходимость очистки нуклеиновых кислот от других компонентов клеток. Для этого существуют различные методы, основанные на специфических свойствах нуклеиновых кислот. Наиболее часто используется очистка НК методом фенолхлороформной экстракции, основанной на различной растворимости НК в растворителях разной природы. Кроме того, применяются методы, основанные на способности НК адсорбироваться на специфических носителях с последующей их элюцией. Глава I. Выделение и очистка нуклеиновых кислот Метод стал широко использоваться для выделения НК из биологических образцов различных источников. Данный метод позволяет выделять в чистом виде не только суммарною вытяжку НК, но и разделить между собой ДНК и РНК. Принципиальная основа метода заключается в том, что НК имеет высокую растворимость в водной фазе, в то время как большая часть белков, углеводов и других компонентов клетки растворяются в органических растворителях. На первой стадии происходит суммарное выделение РНК и ДНК, в присутствии гуанидин изотиоционата, ацетата натрия и других компонентов. Гуанидин изотиоционат – один из самых мощных денатурантов белка. Очень эффективен при очистке РНК из-за его способности быстро проникать в клетки и подавлять активность РНКаз. Гуанидин изотиоционат, используемый комбинации со смесью фенол-хлороформ и осаждением спирта, что обеспечивает получение качественной неповрежденной РНК. Кроме того, вместо гуанидин изотиоцианата часто используется додецилсуль6 фат натрия, также вызывающий лизис клеток и ингибирование клеточных нуклеаз. Применение фенола и хлороформа при выделении НК способствует созданию двухфазной системы. Фенол отделяет белки от ДНК. Хлороформ денатурирует белок и липиды и помогает поддерживать разделение органической и водной фазы, а также делает ДНК менее растворимой в феноле. При pH 7–8, происходит растворение ДНК и РНК в водной фазе, в то время как белки образуют непрозрачный слой между фазами. В кислых условиях (рН < 5), суммарная РНК остается в верхней водной фазе, в то время как большая часть ДНК и белков остается или в интерфазе, или в органической фазе. Суммарная РНК впоследствии может быть выделена осаждением с изопропиловым спиртом. Регулируя содержание фенола и его pH, можно добиться разделения ДНК и РНК между собой, при этом ДНК будет находиться в органической фазе, в то время как РНК будет в водной фазе. На данной стадии возможно добавление изоамилового спирта, чтобы предотвратить вспенивание. Добавление одновалентных катионов (K, Na, NH4) при выделении НК приводит к формированию соли с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Добавление спирта (этанол или изопропиловый спирт) приводит к обратимой денатурации нуклеиновых кислот. LiCl часто использовался, чтобы денатурировать РНК, хотя осаждение со спиртом и одновалентным катионом типа натрия или иона аммония намного более широко используется. Осаждение LiCl имеет преимущества перед другими методами осаждения РНК, в которых не происходит эффективного удаления ДНК, белок или углеводы. Другое преимущество состоит в том, что литиевое осаждение эффективно удаляет несвязанные нуклеотидфосфаты, которые учитываются при количественном анализе концентрации методом спектрофотометрии. 7 Рис. 1. Схематичный процесс выделения нуклеиновых кислот методом фенол-хлороформной экстракции Существует и иной способ экстракции нуклеиновых кислот, в основе которого лежит способность ДНК и РНК сорбироваться на различного рода носителях (пористое стекло, силикагель, смолы и др.). Принцип данного метода заключается в сорбции НК на носителе за счет слабых связей (водородные связи, электростатические силы, бисульфидные мостики и т. д.), и последующей их элюцией солевыми растворами с высокой ионной силой. На основе использования магнитных частиц или других сорбентов на поверхности которых имеются ковалентно связанные poly-Т олигонуклеотидные последовательности разной длины, можно выделять чистые препараты мРНК для исследования экспрессионной активности генома образцов. 8 Рис 2. Схема выделения нуклеиновых кислот с использованием различного рода сорбентов Работа 1. Методика выделения РНК методом фенол-хлороформной экстракции в присутствии хлорида лития 1. Растворить образец ткани в буфере D (4M гуанидин изотиоционат, 30 мM цитрат натрия, 30 мM β-меркаптоэтанол, pH 7.0–7.5). 9 2. Поместить пробирку на лёд. Добавить один объём фенола и перемешать. Добавить 1/5 объёма смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1) и перемешать образец. Перемешать на вортексе ещё 4 раза по 1 мин. Между перемешиваниями пробирки инкубировать на льду. 3. Открутить на максимальной скорости при 4 °С в течение 30 мин. Верхнюю (водную) фазу перенести в новую пробирку. 4. Добавить 1 мкл соосадителя и 2 объёма 96 % этанола. Перемешать на вортексе и немедленно открутить на максимальной скорости при RT в течение 10 мин. 5. Промыть осадок 80 % этанолом и высушить на воздухе до исчезновения следов спирта. Не пересушивать!!! 6. Растворить осадок в 100 мкл деионизованной воды. Добавить равный объём 12М LiCl и охладить раствор в течение 30 мин при –20 °С. 7. Открутить на максимальной скорости 15 мин при комнатной температуре. Промыть осадок 0.8 мл 80 % этанола. 8. Осадок высушить, как описано ранее, и растворить в 40 мкл деионизованной воды, свободной от РНКаз. 9. Определить концентрацию и чистоту полученного препарата РНК. Комментарии к методике: 1) Объем ткани не должен превысить 1/5 объема буфера D. Чтобы избегать деградации РНК, гомогенизация ткани должна быть выполнена так быстро и полностью, насколько возможно. 2) При выделении РНК может происходить загрязнение геномной ДНК. Однако, если ее количество не превышает по свечению РНК в агарозном геле с бромистым этидием, такое загрязнение не является критичным и дает возможность использовать полученный препарат РНК в дальнейшем. 3) Для хранения выделенной РНК, добавьте 0.1 объема 3М ацетата натрия и 2.5 объемов 96 % этанола к РНК в воде и смешайте полностью. Образец может быть сохранен в течение нескольких лет в –20 °C. 10 Работа 2. Методика выделения геномной ДНК с использованием СТАB 1. Ткань растереть в ступке на холоде. 2. Перенести растертую ткань в прогретую до 65 оС пробирку с 2x CTAB (из расчёта 25 мл 2x CTAB (CTAB - 2% (w/v), 1.4M NaCI, 0.1М Tris-НCI, pH 8.0, 20mM ЭДТА, довести dН2О) на 2–5 г ткани), очень хорошо и быстро перемешать. 3. Инкубировать при 65 оС минимум 20 мин (лучше 1 час). 4. Охладить до комнатной температуры, добавить равный объём хлороформа : изоамилового спирта (24 : 1), перемешивать и оставить инкубироваться на 20 мин. 5. Центрифугировать на 5 000 rpm при комнатной температуре 10 мин. 6. Снять водную фазу, добавить к ней 0.2 объема 5x CTAB (CTAB – 5 % (w/v), 350mM ЭДТА, довести dН2О), перемешать и инкубировать при 65 оС 10 мин. 7. Добавить равный объём хлороформ : изоамиловый спирт, инкубировать 1 мин, периодически перемешивая. 8. Центрифугировать на 5 000 rpm при комнатной температуре 10 мин. 9. Добавить равный объём буфера для преципитации (CTAB – 1 % (w/v), 0.05М Tris-НCI, pH 8.0, 10mM ЭДТА, довести dН 2 О) (можно и 2–3 объёма), перемешать и оставить на 1 час при комнатной температуре. 10. Центрифугировать 8 000 rpm при комнатной температуре 20 мин. 11. Растворить осадок в 1–2 мл HS-TE буфере (1M NaCI, 0.01М TrisНCI, pH 8.0, 1mM ЭДТА, довести dН2О); добавить 2 объема 96 % этанол и инкубировать 1 час при –20 оС или 30 мин при –70 оС. 12. Центрифугировать 8 000 rpm при 4 оС 10 мин. 11 13. К осадку добавить 200 мкл дистиллированной H2O и 100 мкл 7.5M NH4Ac (pH 7.5) и инкубировать 20 мин при 0 оС. 14. Центрифугировать 13 000 rpm при 4 оС 10 мин, добавить к супернатанту 2 объема 96 % этанол и инкубировать 20 мин при –70 оС. 15. Центрифугировать 13 000 rpm при 4 оС 10 мин, осадок сполоснуть 80 % этанолом; 16. Растворить в TE буфере или dH2O; 17. Хранить при –20 оС. Комментарии к методике: 1) Если количество ткани небольшое, удобнее добавлять буфер непосредственно в ступку. Для совсем маленьких образцов используется пестик для микроцентрифужных пробирок. 2) Экстракция хлороформом может уменьшить объём водной фазы. В таких случаях требуется добавить 1х CTAБ буфер до исходного объёма. Работа 3. Методика быстрого выделения РНК из грамм (-) бактерий 1. Осадить клетки из 10 мл культуры центрифугированием 12 000 rpm при 4 оС 10 мин. Ресуспендировать в 10 мл буфера (15мМ Трис-HCI рН 8.0, 0.45М сахароза, 8мМ ЭДТА), добавить 80 мкл (50мг/мл) лизоцима и инкубировать на льду 15 мин. 2. Центрифугировать протопласты 5 мин 6 000 rpm при 4 оС. Ресуспендировать в 0.5 мл лизирующего буфера (10мМ Трис-HCI рН 8.0, 10мМ NaCI, 1мМ цитрат натрия, 1.5 % (w/v) SDS). Инкубировать 5 мин при 37 оС, затем охладить на льду. 3. Добавить 250 мкл насыщенного хлорида натрия, перемешать. Инкубировать 10 мин на льду. 12 4. Центрифугировать на максимальной скорости. Супернатант перенести в новую пробирку и добавить 1 мл охлажденного 96 % этанола. Инкубировать 30 мин при –70 оС. 5. Центрифугировать 15 мин на максимальной скорости при 4 оС. Промыть осадок охлажденным 70 % этанолом и подсушить. 6. Растворить в подходящем объеме (40–100 мкл) деионизованной Н2О. Хранит при –70 оС. Комментарии к методике: 1) После лизиса клеток образуется вязкая масса, поэтому необходимо осторожно отбирать водную фазу, чтобы исключить загрязнение НК белками. 2) приготовление насыщенного раствора хлорида натрия лучше осуществлять с использованием DEPC-воды, что уменьшает риск внесения экзогенных нуклеаз. 3) Осаждение РНК 96% этанолом можно проводить и при –20 оС, увеличив при этом время инкубации до 1–1.5 часов. Работа 4. Методика экстракции ДНК из агарозного геля с использованием наборов фирмы QIAEX II. 1. Вырезать фрагмент геля с ДНК, взвесить его и добавить 3 объема буфера QX 1. 2. Размешать QIAEX II на вортексе 30 с. Прибавить 10–30 мкл QIAEX II. Перемешать на вортексе. 3. Инкубировать 10 мин при 50 оС. Мешать на вортексе каждые 2 минуты. 4. Центрифугировать 30 с при 12 000 rpm, удалить супернатант. 5. К осадку добавить 500 мкл буфера QX 1 и перемешать на вортексе. Центрифугировать 30 с, отобрать весь супернатант. 6. Добавить к осадку 500 мкл буфера PE. Перемешать на вортексе. Центрифугировать 30 с при 12 000 rpm, отобрать весь супернатант. 13 7. Осадок сушить в течение 10–15 мин. Прибавить 30–40 мкл dН2О и перемешать на вортексе. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин. 8. Центрифугировать 30 с при 12 000 rpm. Перенести супернатант в новую пробирку. 9. Повторить п. 9 и 10. Долить супернатант в ту же пробирку. 10. Хранить при –20 оС. Комментарии к методике: 1) ДНК из геля необходимо вырезать как можно точнее. Кроме того, нельзя долгое время светить на гель ультрафиолетом, поскольку ДНК может пришиться к гелю. 2) Буфер PE желательно готовить непосредственно перед использованием. Для его приготовления 100 мкл необходимо взять 20 мкл раствора PE из набора и прибавить 80 мкл 96% этанола. 3) При подсушивании осадка в п. 7 важно не пересушить его, поскольку в длинных молекулах ДНК могут образоваться разрывы, что значительно ухудшит качество препарата. Глава II. Определение качественных и количественных показателей нуклеиновых кислот Метод определения концентрации нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) в растворе основан на существовании у ДНК и РНК максимума поглощения при длине волны 260 нм (рис. 3). Это означает, что в растворах нуклеиновых кислот максимальная фотометрическая абсорбция наблюдается при 260 нм и прямо коррелирует с концентрацией ДНК или РНК. 14 Рис. 3. Спектр поглощения нуклеиновых кислот при разных длинах волн Работа 5. Определение концентрации ДНК или РНК При постановке измерения образец ДНК разбавляют дистиллированной водой в 40 раз (к 5 мкл раствора ДНК добавляют 195 мкл воды). Измерение поглощения при 260 нм проводят в кювете с длиной оптического пути 1 мм, используя воду в качестве контроля. Значение концентрации ДНК в исходном растворе (мкг/мкл) находят, умножая значение поглощения при длине волны 260 нм на К = 20 (К – молекулярный коэффициент экстинкции). [ДНК] = А260 ⋅ К РНК разбавляют водой в 10 раз (к 20 мкл раствора ДНК добавляют 180 мкл воды). Измерение поглощения при 260 нм проводят в кювете с длиной оптического пути 1 мм, используя воду в качестве контроля. Значение концентрации РНК в исходном растворе (мкг/мкл) находят, умножая значение поглощения при длине волны 260 нм на К = 4 (К – молекулярный коэффициент экстинкции). [РНК] = А260 ⋅ К 15 Работа 6. Определение чистоты препарата ДНК или РНК Отношение поглощения при длинах волн 260 нм и 280 нм (260–280 нм) показывает чистоту препарата ДНК или РНК. Препарат считается чистым, если отношение значений 260 / 280 нм приблизительно равно 1.8 для ДНК и 2.8 для РНК. В случае меньших значений показателя 260–280 нм препарат содержит большое количество примесей белка, фенола или иных контаминирующих агентов, имеющих значительное поглощение при 280 нм. ДНК РНК А260/А280 = 1.8 А260/А280 = 2.8 Другим показателем чистоты препарата ДНК или РНК является отношение значений поглощения 260–230 нм. В случае чистого препарата это соотношение обычно равно 1.8 – 2.2. Меньшие значения коэффициента 260/230 нм свидетельствуют о загрязнении препарата компонентами, которые остаются после процедуры выделения ДНК или РНК. 1.8 ≤ А260 ≤ 2.2 А230 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле Для нуклеиновых кислот широко применяется метод гель- электрофореза. Его принцип заключается в следующем. Исследуемый препарат (раствор ДНК или РНК) вносят в лунку, расположенную у края геля. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают электрический ток, они перемещаются в электрическом поле. Для учета результатов выделения нуклеиновых кислот среднего размера обычно применяют агарозные гели в присутствии специфического 16 красителя (как правило, бромистый этидий или SYBR Green I). Для фракционирования более крупных молекул ДНК (миллионы пар оснований) денатурированной ДНК и РНК приходится использовать специальные системы электрофореза. Иногда для решения специальных задач для разделения ДНК применяют полиакриламидные гели. Так, в 20 % полиакриламидном геле можно разделить фрагменты ДНК, состоящие всего из шести оснований и различающиеся лишь одним нуклеотидом. Детекция НК основана на использовании интеркалирующих веществ, активирующих свою способность к флуоресценции в результате присоединения к ДНК или РНК. В качестве основного представителя применяется бромистый этидий и SYBR Green I. Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия под действием ультрафиолетового излучения значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Однако он способен взаимодействовать и с молекулами РНК, но менее интенсивно. Рис. 4. Механизм детекции ДНК с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I 17 Для разделения нуклеиновых кислот применяют различные концентрации геля, в зависимости от длины исследуемой НК. Диапазон нормального разделения линейных ДНК молекул для гелей с различной концентрацией агарозы приведен в таблице. Таблица 1 Зависимость разделения линейных молекул ДНК от концентрации агарозного геля % агарозы Размер ДНК [kbp] 0.3 0.5 0.6 5–60 1–30 1–20 0.7 0.8 0.8– 0.6– 12 10 0.9 1.0 1.2 1.5 0.5–8 0.5–7 0.4–6 0.2–3 Работа 7. Методика электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле 1. Взвесить необходимое количество агарозы (ее количество зависит от концентрации используемого геля). 2. Долить 1х ТАЕ буфер до нужного объёма (можно использовать концентрированный – 50х ТАЕ – буфер (2М Tris-HCI, 5.71 % ледяной уксусной кислоты, 2мМ EDТА, довести рН до 8.5). 3. Довести до кипения, кипятить до полного растворения агарозы. 4. Остудить до 50–60 oС (можно держать банку в руках), добавить бромистый этидий до концентрации 0,1 %. 5. Залить форму, дать агарозе застыть в течение 0.5–1 часа. 6. В кармашки внести образцы НК, предварительно добавив буфер для электрофореза (0.1% бромфеноловый синий, 0.1% ксиленцианол, 60% глицерин, 60мМ ЭДТА). 7. Нагрузка выбирается из расчета 6–10 В на 1 см геля. 18 Комментарии к методике: 1) Использовать гель в течение ~2 часов, либо, не вынимая гребёнку, завернуть в SaranWrap, убрать в холодильник (можно хранить в течение месяца; для < 1% гелей вынимать гребенку из геля можно лишь непосредственно перед применением). 2) При работе с короткими по длине фрагментами ДНК можно использовать ТВЕ буфер (50х: 1М Трис-HCI, 0.9М борной кислоты, 1мМ ЭДТА, довести рН до 8.5), способствующий их лучшему разделению. Раздел 2. Методы анализа нуклеиновых кислот Глава I. Обратная транскрипция Обратная транскрипция – перенос информации с РНК на ДНК, процесс, обратный нормальной транскрипции, осуществляемый ферментом обратной транскриптазой. Обратная транскриптаза (ревертаза, РНКзависимая ДНКполимераза) – фермент класса трансфераз, осуществляющий ДНК-зависимый синтез ДНК и синтез ДНК на матрице РНК (обратная транскрипция). Кроме того, обратная транскриптаза обладает активностью РНКазы Н (т.е. разрушает цепь РНК, входящую в состав ДНК/РНК-дуплекса). Подобно всем ДНКполимеразам, обратная транскриптаза способна функционировать только при наличии затравки. In vivo обратная транскриптаза синтезирует двухцепочечную ДНК на матрице геномной РНК ретровирусов, подготавливая ее для интеграции в геном клетки-хозяина. Обратная транскриптаза широко используется в генной инженерии для клонирования последовательностей нуклеотидов мРНК эукариот. Впервые обнаружена в 1970. В результате работы ревертазы образуется комплементарная ДНК (кДНК), образующаяся на основе клеточной матричной РНК (мРНК). Для 19 синтеза новой цепи ферменту необходима точка инициации, являющейся началом синтеза новой цепи, строительный материал для синтеза ДНК, которым являются дезоксинуклеотидфосфаты (дНТФ) и ингибитор рибонуклеаз (RNAsin). Для получения кДНК возможно проведение трех вариантов реакции обратной транскрипции. Первый тип предполагает использование в качестве затравки oligo(dT) праймер (набор олигонуклеотидов разной длины в состав которого входит только нуклеотид тимин), при этом в качестве матрицы для синтеза кДНК будет использоваться только мРНК, поскольку она имеет на 3’-конце поли-А последовательность, комплементарную oligo(dT) праймеру. Рис. 5. Схема проведения обратной транскрипции с использованием в качестве затравки oligo(dT) праймер 20 Второй тип реакции обратной транскрипции основан на применении в качестве затравки случайных праймеров (random hexamer). В данном случае матрицей для синтеза новой кДНК будут служить любые типы РНК, поскольку случайные праймеры длиной шесть нуклеотидов будут присоединяться к комплементарному участку любой цепи. Рис. 6. Схема проведения обратной транскрипции с использованием в качестве затравки random hexamer праймер Третий вариант проведения реакции обратной транскрипции подразумевает использование в качестве затравки специфического праймера, который предполагается использовать для последующей реакции ПЦР. В данном варианте проведения опыта матрицей для синтезируемой кДНК будет выступать мРНК исследуемого гена. 21 Рис. 7. Схема проведения обратной транскрипции с использованием в качестве затравки специфический праймер Работа 8. Методика проведения обратной транскрипции с использованием фермента M-MuLV Reverse Transcriptase 1. Приготовить смесь общим объемом 11 мкл, состоящую из РНК и праймеров: a. РНК: суммарная РНК – 0.1–5 мкг; мРНК – 10 нг– 0.5 мкг; специфическая РНК – 0.01 пг–0.5 нг. b. праймер: oligo(dT) – 0.5 мкг; random hexamer – 0.2 мкг; специфический праймер – 15–20 пМ. c. довести деионизованной водой до 11 мкл. 22 2. Перемешать и инкубировать при 70 оС 5 минут и быстро перенести на лед. 3. Добавить следующие компоненты: a. 10х реакционный буфер – 2 мкл, b. 10мМ дНТФ – 2 мкл, c. ингибитор рибонуклеаз – 20 ед., d. деионизованной воды до 19 мкл. 4. Инкубировать смесь при 37 оС 5 минут. Если использовались random hexamer, то инкубировать при 25 оС 5 минут. 5. Добавить 200 ед. M-MuLV Reverse Transcriptase, инкубировать реакционную смесь, содержащую oligo(dT) и специфический праймер при 37–42 оС 60 минут. Если использовались random hexamer, инкубацию проводить при 25 оС 60 минут. 6. Остановить реакцию нагреванием до 70 оС. Охладить на льду. Комментарии к методике: 1) Синтезированная кДНК может использоваться непосредственно для амплификации методом ПЦР. Однако можно провести очистку полученной кДНК методом фенолхлороформной экстракции и осаждением этанолом, что позволит избавиться от примесей, влияющих на качество ПЦР. Глава II. Полимеразная цепная реакция Суть полимеразной цепной реакции (ПЦР) заключается в амплификации (умножении) в пробирке определенного участка ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. В основе ПЦР лежит обычная биохимическая реакция синтеза, катализируемая полимеразой. 23 ферментом ДНК- Открытие ПЦР было обусловлено расшифровкой нуклеотидных последовательностей генома ряда микроорганизмов и обнаружением термоустойчивой Taq-ДНК-полимеразы. Данный фермент находится в живущих в горячих источниках бактериях Thermus aquaticus, обладает исключительной термостойкостью и сохраняет ферментативную активность в течение 40 минут при температуре 95° и имеет оптимум работы при 70–72°. ПЦР – это процесс, состоящий из многократно повторяющихся циклов и заканчивающийся получением большого количества копий специфического фрагмента ДНК. Ключевым компонентом реакции, помимо TaqДНК-полимеразы, являются короткие (20–30 нуклеотидов) искусственно синтезированные олигонуклеотиды – праймеры, комплементарные искомым участкам на левой и правой границах матричной ДНК. Праймеры выполняют ряд важных функций при проведении ПЦР: 1) праймеры являются точкой инициации синтеза новой цепи ДНК, 2) достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними, 3) гибридная двуцепочечная система ДНК-праймер является местом присоединения ДНК-полимеразы к матрице. ПЦР проводят в специальном программируемом термостате – амплификаторе, осуществляющем смену температурных циклов по заданной программе. Основным компонентом ДНК-амплификатора является элемент Пэльтье, способный осуществлять быстрые температурные переходы. Каждый цикл ПЦР состоит из 3 этапов. На этапе денатурации при 95° происходит плавление цепочки ДНК и расхождение ее на две цепи. На последующем этапе отжига при наличии в пробе искомого участка ДНК происходит присоединение (отжиг) праймеров (по одному на каждую цепь). Температура присоединения праймеров составляет в зависимости от их нуклеотидного состава 58–62°. При последующем подъеме температуры до 72° активируется Taq-ДНК- полимераза и начинается этап синтеза, заключающийся в присоединении дезоксинуклеотидтрифосфатов и достраивании фрагмента ДНК. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для вто24 рого цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). С каждым последующим циклом количество копий участка ДНК удваивается. Таким образом, происходит накопление ампликонов по формуле: х = 2n , где n – число циклов. В результате 30–40 циклов в растворе накапливается около 100 миллионов молекул ампликона. Этого количества достаточно для визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Рис. 8. Схематическое изображение амплификации ДНК: 1 – денатурация при 96 оC; 2 – отжиг в 68 oC; 3 – удлинение в 72 oC; 4 – окончание первого цикла. (P – Taq-ДНК-полимераза). Две образующихся цепи ДНК являются шаблоном для следующего цикла. Таким образом, происходит удваивание количества ДНК в каждом новом цикле 25 Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо подготовить смесь, содержащую все необходимые компоненты для построения новой цепи ДНК: 1) нуклеотиды: dATP, dGTP, dUTP, dCTP, являются необходимыми компонентами смеси и субстратами для ДНКполимеразы при построении новой цепи ДНК; 2) кофакторы фермента: поскольку Taq-ДНК-полимераза является Mg-зависимым ферментом, для ее нормального функционирования требуется присутствие этих ионов в реакционной смеси; 3) Taq-ДНК-полимераза: фермент, осуществляющий синтез новой цепи ДНК на основе ДНК-матрицы; 4) буфер: используется для поддержания необходимого значения рН среди и концентрации солей; 5) праймеры: короткие нуклеотидные последовательности ДНК (20–40 нуклеотидов), комплементарные искомому участку ДНК-матрицы; 6) ДНК-матрица: последовательность ДНК, на основе которой ДНК-полимераза синтезирует новую цепь. Работа 9. Методика проведения полимеразной цепной реакции 1. Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР. 2. В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соотношениях: 26 Компонент 10х ПЦР-буфер 10мМ смесь дНТФ Праймер 1 (50 мкМ) Праймер 2 (50 мкМ) Taq-ДНК-полимераза 25мМ MgCI2 ДНК-матрица Конечная концентрация 1х 0.2 мМ каждого 1 мкМ 1 мкМ 1.25 ед. 1–4 мМ 0.1–1 мкг Деионизованная вода – Количество компонента на 50 мкл смеси 5 мкл 1 мкл 1мкл 1мкл 0.5 мкл 2–5 мкл варьирует от концентрации образца до 50 мкл 3. Перемешать на вортексе. При необходимости добавить минеральное масло (20–40 мкл) для ПЦР. 4. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и запустить программу. Комментарии к методике: 1) Если матрица одноцепочечная или ПЦР-продукт, этап начальной денатурации можно опустить. Кольцевая плазмидная или геномная ДНК требует тепловой денатурации при 95 oC не менее 3 минут. Однако в данном случае не следует злоупотреблять нагреванием, поскольку часть матрицы может повредиться. Для каждого типа ДНКматрицы необходимо подбирать индивидуальное компромиссное решение. 2) Число циклов обычно 25–35. Слишком большое число циклов чревато насыщением PCR реакции: ограничение по праймерам (синтез длинных продуктов, образованных в результате использования в качестве праймера готового продукта), ограничение по нуклеотидам (большая доля одноцепочечных продуктов, синтез коротких продуктов). 3) Для повышения специфичности ПЦР можно использовать технику так называемого горячего старта, суть которого заключается в добавлении фермента в пробирку с реакционной смесью только после проведения первой денатурации. 4) Для проведения ПЦР часто бывает удобно использовать смеси: a) все, кроме матрицы и Taq-полимеразы. Хранить при –20 oС продолжительное время, при 4 oС – несколько суток; b) все, кроме матрицы и праймеров. Хранить при –70 oС и –20 oС продолжительное время, при 4 oС – несколько недель. 27 c) все, кроме матрицы. Хранить при –70 oС и –20 oС продолжительное время, при 4 oС не более суток. Однократное замораживание-оттаивание не меняет эффективность работы Taq-полимеразы. 5) Если в методике предусмотрено использование масла, то после проведения ПЦР можно избавиться от него следующим способом: • заморозить на –20 oС. Вода замёрзнет, масло – нет; • можно дополнительно сполоснуть охлаждённым (~4 oС) хлороформом. Глава III. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) Данные методы основаны на использовании флуорофоров – молекул, обладающих способностью к флуоресценции в результате поглощения энергии света определенной длины волны и излучать ее на другой длине волны. Для большинства флуорофоров существуют соединения-гасители, молекулы которых, находясь в непосредственной близости с ними, значительно снижают уровень флуоресценции. Они как бы перехватывают на себя энергию излучения от флуорофора. Различают два основных типа гасителей – флуоресцирующие и «темновые». В первом случае переданная гасителю энергия излучается в виде света, отличающегося от свечения свободного от гасителя флуорофора, а во втором – рассеивается в виде тепла, т.е. свечение отсутствует. Эффект гашения резко снижается при увеличении расстояния между молекулами флуорофора и гасителя. Основные преимущества детекции продуктов ПЦР заключаются в следующем: в отличие от электрофорезной детекции, полученные в ходе ПЦР ампликоны, не могут попасть в воздух и привести к появлению ложноположительных результатов. Использование специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к рез28 кому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации. Кроме того флуоресцентная детекция продуктов ПЦР в пробирке в 2–3 раза чувствительнее электрофорезной детекции. Ниже представлены наиболее распространенные методы детекции продуктов амплификации ДНК-олигонуклеотидных последовательностей. Данные методы можно разделить на 2 основные группы. В первой группе методов, детектирующих ДНК, находятся методы, использующие олигонуклеотиды или зонды, меченые красителем, обладающим способностью к флуоресценции. 1. Метод гидролизуемых проб или Taqman. В данном случае в реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5’-положении и гаситель флуоресценции в 3’-положении, а также фосфатная группа в 3’-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3’-положении блокирует ДНК-полимеразу. В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем, чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5’-экзонуклеазной активности. Таким образом, происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Чем больше ампликонов синтезировано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение. 29 Рис. 9. Принцип детекции ПЦР-продуктов с использованием зондов Taqman. Ф – флюорофор. Г – гаситель 2. Метод с использованием зондов с комплементарными концевыми последовательностями (Molecular Beacons). Данная методика отличается от описанной выше лишь тем, что концевые последовательности зонда представляют собой взаимно комплементарные области из 5–6 оснований, вследствие чего они находятся в замкнутом состоянии и образуют «шпильки». Внутренняя часть зондов содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную амплифицируемой области. «Шпилька» зонда в процессе ПЦР денатурирует, и концы зонда (флуоресцентная метка и гаситель) расходятся в разные стороны, и он специфически присоединяется к матрице. Затем под действием 5’-эндонуклеазной активности Taq-полимеразы, достраивающей новую цепь ДНК от праймера, зонд разрезается, флуорофор оказывается свободным от гасителя. В результате увеличивается интенсивность свечения. При отсутствии спе- 30 цифического отжига праймеров и зондов, не происходит присоединение их к ДНК-матрице и сохраняется тушение флуоресценции. Рис. 10. Принцип детекции ПЦР-продуктов с использованием зондов Molecular Beacons. Ф – флюорофор. Г – гаситель 3. Метод с использованием частотного резонансного переноса энергии (Light Cycler). В данном случае используют 2 зонда с резонансным переносом энергии. Данный способ детекции накопления продуктов амплификации отличается повышенной специфичностью, так как увеличение флуоресценции происходит при комплементарном связывании с ампликонами сразу двух ДНК-зондов. Принцип метода заключается в переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на 3`-конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5`-конце второго зонда, причем расстояние между зондами, содержащими флуоро31 форы составляет 1–5 нуклеотидов. При одновременном связывании обоих зондов с ДНК-матрицей испускаемое первым флуорофором излучение передается на второй флуорофор, а его излучение детектируется прибором. Таким образом, возрастает специфичность анализа. Рис. 11. Принцип детекции ПЦР-продуктов с использованием метода частотного резонансного переноса энергии (Light Cycler). Фд – флюорофор-донор. Фа – флюорофор-акцептор Ко второй группе методов детекции продуктов ПЦР принадлежат методы, основанные на использовании интеркалирующих веществ, активирующих свою способность к флуоресценции в результате присоединения к ДНК. В качестве основных представителей этих веществ можно назвать бромистый этидий, красители SYBR Green I/II и SYBR Gold. Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия и красителя SYBR Green I и SYBR Gold под действием ультрафиолетового излучения значительно возрастает при их внедрении в двухцепо32 чечные молекулы ДНК (см. рис. 4). В настоящее время красители SYBR Green I и SYBR Gold признаны более чувствительными по сравнению с бромистым этидием. В настоящее интеркалирующие агенты используются для детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе и по завершению ПЦР. Для этого добавляют краситель SYBR Green I в реакционную ПЦРсмесь перед запуском ПЦР. Однако следует отметить то, что в данном случае увеличение флуоресценции может быть связано как с накоплением специфического, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмеры) продукта. В этой связи детекция продуктов ПЦР с помощью предварительного добавления интеркалирующих агентов в ПЦР-смесь требует дополнительного изучения полученных ампликонов с помощью построения так называемых «кривых плавления». Кроме того, в ряде случаев возникает необходимость нормализации сигнала флуоресценции красителя, используемого в реакции, что достигается использованием пассивного референсного красителя, например ROX. Принцип построения «кривых плавления» основан на том, что для конкретной ДНК-последовательности существует своя температура плавления. Если мы будем повышать температуру раствора ДНК, то на какомто уровне средняя кинетическая энергия молекул окажется выше энергии водородных связей, которыми скреплены половинки двойной спирали. Температура, при которой распадается (денатурирует) половина молекул ДНК, называется температурой плавления. В паре гуанин-цитозин (ГЦ) три водородные связи, в паре аденин-тимин (АТ) только две. Поэтому чем больше ГЦ в ДНК, тем более она «тугоплавка». Отсюда следует, что по ширине интервала температур, в котором ДНК плавится, можно судить о ее составе. «Кривые плавления» исследуют после окончания ПЦР, когда реакционную смесь нагревают, и молекула флюорофора отщепляется от ДНК, и ее флуоресценция резко снижается. Если в пробирке находятся ампликоны с разной температурой плавления, то на кривой будет заметно не33 сколько пиков, каждый из которых будет соответствовать своему ампликону. Наличие ампликонов с разной температурой плавления свидетельствует о накоплении неспецифических продуктов ПЦР. Рис. 12. Исследование полученных ампликонов с помощью «кривых плавления». Tm 1 и Tm 2 – температура плавления продуктов реакции. Пунктирная линия – интенсивность свечения ПЦР-продуктов, содержащих флуоресцентную метку. Сплошная линия – интенсивность свечения референсного красителя Процедура проведения ПЦР в реальном времени имеет некоторые отличия от базовой, связанные с необходимостью детекции продуктов амплификации после каждого цикла. Работа 10. Методика амплификации с использованием красителя SYBR Green 1) Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР. 2) В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соотношениях: 34 Компонент 10х ПЦР-буфер 10мМ смесь дНТФ Праймер 1 (5 мкМ) Праймер 2 (5 мкМ) SYBR Green ROX Taq-ДНК-полимераза 25мМ MgCI2 ДНК-матрица Деионизованная вода Конечная концентрация 1х 0.2 мМ каждого 0.1 мкМ 0.1 мкМ 1.25 ед. 5 мМ 0.1–1 мкг – Количество компонента на 50 мкл смеси 5 мкл 1 мкл 1мкл 1мкл 0.125 мкл 0.26 мкл 0.5 мкл 10 мкл варьирует от концентрации образца до 50 мкл 3) Перемешать на вортексе. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и запустить программу: 1. Первичная денатурация ДНК при 95 оС. Время денатурации зависит от типа используемой матрицы. 2. Денатурация цикла при 95 оС 30 с. 3. Отжиг праймеров при 60–65 оС 20–30 с. 4. Элонгация при 70–72 оС 1 мин. 5. Детекция флюорисцентного сигнала. 6. Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 5) 30–40 раз. 7. Построение кривых плавления в интервале от 60 оC до 95 оC с детекцией через каждые 0.2 оC. Комментарии к методике: 1) Поскольку краситель SYBR Green довольно быстро разлагается на свету, необходимо все манипуляции совершать быстро и в затемненных пробирках. 2) Для того, чтобы предотвратить образование димеров праймеров, стадия отжига должна быть как можно короче. Как правило, 15–20 с вполне достаточно для отжига праймеров на специфическом субстрате. 3) Поскольку SYBR Green, как правило, дает достоверные результаты при C(T) не больше 35–38, 40 циклов амплификации является оптимальным значением. 4) При работе с SYBR Green необходимо строить кривую плавления ДНК для определения специфичности ПЦР-реакции. 35 Работа 11. Методика амплификации ДНК с применением зондов Taqman 1) Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР. 2) В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соотношениях: Компонент 10х ПЦР-буфер 10мМ смесь дНТФ Праймер 1 (5 мкМ) Праймер 2 (5 мкМ) TaqMan Taq-ДНК-полимераза 25мМ MgCI2 ДНК-матрица Конечная концентрация 1х 0.2 мМ каждого 0.1 мкМ 0.1 мкМ 0.25 мкМ 1.25 ед. 3.5 мМ 0.1–1 мкг Деионизованная вода – Количество компонента на 50 мкл смеси 5 мкл 1 мкл 1мкл 1мкл 1 мкл 0.5 мкл 7 мкл варьирует от концентрации образца до 50 мкл 3) Перемешать на вортексе. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и запустить программу: 1. Первичная денатурация ДНК при 95 оС 10 мин. 2. Денатурация цикла при 95 оС 15 с. 3. Отжиг праймеров с последующей элонгацией цепи при 60 оС 1 мин. 4. Детекция флюорисцентного сигнала. 5. Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 4) 40–45 раз. Комментарии к методике: 1) Поскольку при проведении такого типа реакции ПЦР-РВ используются специфические типы полимераз (Pfu, Pwo и др.), их активность проявляется в диапазоне температур 60–72 оС. 2) Построение кривой плавления после реакции не обязательно (это будет кривая плавления не ПЦР-продуктов, а дуплекса зонда с ампликоном). 36 Работа 12. Обработка данных Детекция в реальном времени флюоресценции продуктов ПЦР позволяет вычислять первоначальное количество присутствия шаблона в различных образцах. Осуществляется это путем подсчета числа циклов ПЦР, необходимых для достижения заданного уровня флюоресценции (пороговой флюоресценции). В связи с тем, что интенсивность флюоресценции отражает количество продукта, то для образцов, которые первоначально имели больше матрицы, потребуются меньше циклов ПЦР для достижения заданного порога флюорисценции, чем для образцов с меньшим количеством матрицы. Такая взаимосвязь может быть задана математически: количество циклов, необходимых для достижения порога (то есть пороговый цикл, или величина CT), обратно пропорционально логарифму первоначального количества матрицы. Поэтому значения CT могут использоваться для расчета исходного количества матрицы. Для подсчета исходного количества матрицы в образце необходимо сначала задать порог флюоресценции, при котором различные образцы будут сравниваться. Для этого сначала необходимо начертить зависимость флюоресценции от номера цикла, а затем провести линию порога на графике в точке, где сигналы превосходят фоновые уровни и начинают увеличиваться экспоненциально. Величина CT для отдельного образца определяется, как цикл, при котором линия флюоресценции образца пересекла линию порога. Значения CT, полученные в разных образцах, сравниваются с CT стандарта для вычисления абсолютного или относительного количества шаблона. Если величины количественного анализа образцов совпадают с диапазоном матрицы, то можно сгенерировать линейную стандартную кривую зависимости логарифма количества матрицы от CT. Абсолютное количество исходной матрицы в неизвестных образцах затем может быть 37 рассчитано из стандартов, используя значения CT образцов. Если способ расчета по стандартам невозможен, то количество шаблона в одном образце может быть вычислено относительно другого образца на основании разницы в значениях CT – ΔCT. В настоящее время разработано большое количество программного обеспечения, которое автоматически генерирует стандартные кривые для абсолютного количественного анализа, если стандарты заданы в настройке плашки. Кроме того, программное обеспечение также оценивает эффективность реакции и вычисляет значения ΔCT для анализа относительных значений. Два основных принципа обработки данных ПЦР в реальном времени: 1. Метод калибровочного графика. 2. Прямое сравнение данных. Метод калибровочного графика Этот метод предполагает построение калибровочного графика в координатах C(T) – log P0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P0) в экспериментальных образцах. Точность метода зависит от того, насколько условия ПЦР (и, прежде всего, эффективность амплификации) серии стандартов близки к условиям ПЦР экспериментальных образцов. Поэтому при выборе стандартов необходимо руководствоваться следующими правилами: 1. Содержание примесей в стандартном препарате должно быть сходно с таковым в экспериментальном препарате. 2. Доля амплифицируемого фрагмента в стандартной ДНК долж- на быть близка к таковой в экспериментальной ДНК. 3. Серия разведений стандартной ДНК должна охватывать весь диапазон возможных концентраций субстрата в экспериментальной ДНК. 38 Если достаточно определить лишь относительную концентрацию субстрата, для построения калибровочного графика удобно использовать серию разведений одного из экспериментальных образцов. В тех случаях, когда образцы могут сильно отличаться по примесям и доле амплифицируемого фрагмента в реакционной смеси, имеет смысл при наладке эксперимента приготовить серию разведений каждого из них и сравнить эффективности. Прямое сравнение данных Из уравнения C(T) = – (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E (1) следует, что при равной эффективности реакции E в образцах 1 и 2, относительная концентрация субстрата R = P1/P2 = E – (C(T)1–C(T)2) = E - С(T) (2) Проведем нормализацию этих результатов по данным амплификации с контрольной последовательностью REF (соответствующей, например, housekeeping gene (конститутивный, референсный ген)). Пусть реакция REF в обоих образцах протекает с эффективностью Eref. Тогда R=E– С(T) / Eref – С(T) ref . (3) Если эффективности «контрольной» и «опытной» реакций сходны, приближенно можно записать: R=E– С(T) /E– С(T) С(T) ref– ref = E С(T ) (4) . И, наконец, если обе реакции протекают со сходной эффективностью, близкой к 2, формула упрощается до вида: R= E С(T) ref - С(T) ~2 С(T) ref - 39 С(T) = 2- С(T ) . (5) При проведении ПЦР-РВ в качестве REF можно использовать последовательность, соответствующую референсному гену, однако нужно иметь в виду, что уровень экспрессии некоторых референсных генов иногда значительно варьирует в разных тканях. Лучше всего проводить нормализацию по усредненным данным амплификации нескольких house-keeping genes. Рис. 13. Расчет данных ПЦР-РВ методом прямого сравнения (ΔΔСТ метод) 40 Глава IV. Гибридизация нуклеиновых кислот В 1961 году было обнаружено, что процесс денатурации ДНК обратим: после денатурации при 100 оС, выдерживание ДНК при температуре 65 оС привело к восстановлению структуры двойной спирали. Этот процесс называется ренатурация или гибридизация. Процессы гибридизации происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК – ДНК, РНК – РНК, ДНК – РНК. Для проведения гибридизации необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный той последовательности, которую необходимо обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонированием, либо путем химического синтеза. Одноцепочечная ДНК, используемая в качестве индикатора, называется ДНК-зонд. Она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов. Анализ проводят по следующей схеме: исследуемую ДНК гидролизуют рестриктазами, фракционируют электрофорезом, переносят разделенные фрагменты на нитроцеллюлозный фильтр и проводят реакцию гибридизации с мечеными олигонуклеотидами. Зонд метится какой-либо репортерной группой: радиоактивным изотопом, флуорохромом, ферментом, дающим окрашенный или люминесцирующий продукт и т. д. Этот метод был разработан Саузерном в 1975 году. «Блоттинг» – в переводе с английского означает «промокашка», «саузерн» – «южный». Молекулы исследуемой ДНК разгоняют в агарозном геле электрофорезом. ДНК в геле денатурируют щелочью. После переноса щелочь нейтрализуют, и пластину геля накрывают нитроцеллюлозой. Сверху на нитроцеллюлозу помещают стопку листов фильтровальной бумаги, обеспечивая медленный ток буферного раствора через гель в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. ДНК диффундирует из геля и 41 связывается с нитроцеллюлозным фильтром. Данный способ переноса ДНК на нитроцеллюлозную мембрану получил название «мокрый перенос». После прогревания фильтра при 80 оС в вакууме или обработки УФсветом ДНК необратимо связывается с нитроцеллюлозой. Затем мембрану помещают в раствор с меченым зондом, в котором и происходит гибридизация. После отмывки несвязавшейся радиоактивности результат выявляют с помощью радиоавтографии или иных способов в случае использования нерадиоактивных меток. Расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле. Рис. 14. Схема проведения гибридизации ДНК по Саузерну 42 ДНК, связанную с нитроцеллюлозным фильтром, можно гибридизовать с радиоактивно меченым ДНК-зондом. Блоттинг по Саузерну является исключительно полезным также и для локализации изучаемых генов в определенных фрагментах, полученных в результате гидролиза различными рестриктазами гибридных молекул ДНК, хромосомной ДНК и т. д. Аналогичным методом на нитроцеллюлозу переносят молекулы РНК (Нозерн (северный) блоттинг) и белка (Вестерн (западный) блоттинг). При проведении гибридизации РНК по Нозерну, стандартные условия блотинга по Саузерну не применимы, так как она не связывается с обычными нитроцеллюлозными и нейлоновыми мембранами. Для иммобилизации РНК вначале был предложен специальный вид бумаги с диазобензилоксиметилом (DMB-целлюлоза), а затем были найдены условия для нековалентного связывания РНК с нитроцеллюлозой (предварительная денатурация РНК диметилсульфоксидом, формальдегидом и др.) и разработаны для этого подходящие нейлоновые фильтры. Одним из наиболее точных и современных методов анализа является использование чипов. Они представляют собой пластинки с иммобилизованными меченными ДНК-зондами. Каждая такая пластинка может содержать несколько десятков тысяч зондов, расположенных в определенной последовательности. Метка проявляется только в спаренных двухцепочечных фрагментах. Если в исследуемом образце есть последовательности, комплементарные последовательностям зонда, то гибридизацию можно определить визуально или с помощью специальных приборов. Как правило, детекторы соединены с компьютером, то есть процедура считывания и обработки информации автоматизирована. При подготовке ДНК-зондов включение метки в ДНК возможно двумя основными способами: 1) Удлинение затравки. Данный способ получения ДНК-зондов подразумевает использование олигонуклеотида (менее 20 звеньев), ком43 плементарного какому-либо известному участку анализируемой ДНК. В процессе его гибридизации с денатурированной ДНК в реакционную смесь добавляют ДНК-полимеразу и набор всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ), один из которых несет метку. Используя олигонуклеотид в качестве затравки, полимераза удлиняет растущую цепь, встраивая в нее меченый нуклеотид. В результате образуется полинуклеотидный меченый зонд. 2) Полимеразная цепная реакция. ПЦР предусматривает наличие двух олигонуклеотидных затравок, комплементарных участкам, фланкирующим выбранный район ДНК. При проведении ПЦР в присутствии нуклеотида, несущего метку, происходит синтез ПЦР продуктов, несущих в своем составе меченые нуклеотиды. При повторении процедуры денатурации, гибридизации и полимеризации около 30 циклов можно получить несколько миллионов меченых полинуклеотидов, используемых в качестве ДНК-зондов. Работа 13. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного мечения ДНК методом ПЦР 1) Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР. 2) Для постановки реакции смешайте в пробирке следующие компоненты: Компоненты реакции Количество компонента на 25 мкл смеси 4.0 мкл 2.5 мкл 1 мкл 1 мкл 0.5–2.5 ед. 0.02–0.15 мкг 3.5 мкл до 25 мкл смесь биотин-11-dUTP 1/3 10х ПЦР-буфер Праймер 1 (50мкМ) Праймер 1 (50мкМ) Taq-полимераза ДНК-матрица 25мМ Деионизованная вода 44 3) Перемешать компоненты на вортексе и установить следующий цикл амплификации: 1. Первичная денатурация при 94 оС – 1 мин; 2. Денатурация цикла при 94 °С – 10 с; 3. Отжиг праймеров при 37–68 °С – 10 с; 4. Элонгация при 72 °С – 10–60 с (в зависимости от длины получаемого продукта); 5. Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 4) 40 раз. 6. Время инкубации после последнего этапа при 72 °С – 3 мин. Работа 14. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного мечения ДНК методом удлинения затравки 1. В пробирку внесите следующие компоненты в указанном порядке: – матричная ДНК (50-100 нг) – 5.0 мкл, – 10х реакционный буфер – 2.5 мкл, – гексануклеотидная затравка – 2.5 мкл, – деионизированная вода – 6.0 мкл. 2. Встряхните пробирку на вортексе и собирите капли центрифугированием. 3. Инкубируйте пробу 5–10 мин в кипящей водяной бане для денатурации ДНК и затем быстро перенесите пробирку в лед. Соберите капли центрифугированием. 4. Добавьте к пробе следующие компоненты: – смесь дНТФ с биотин-11-dUTP – 8.0 мкл, – ДНК-полимеразу: фрагмент Кленова – 1.0 мкл или термостабильная полимераза – 0.5 мкл. 5. Инкубируйте пробу в течение часа при 37 °С при использовании фрагмента Кленова или при 45 °С при использовании термостабильной полимеразы. 45 6. Остановите реакцию добавлением 1 мкл 0.5М ЭДТА рН 8.0. 7. Полученную меченую ДНК можно использовать сразу или храните при – 20 °С. Еще лучше переосадить меченую ДНК. Для этого к реакционной смеси (25 мкл) добавьте 8 мкл 7 М ацетата аммония, 100 мкл этанола, хорошо перемешайте и оставьте минимум на 30 мин при –70 °С или на 2 часа при –20 °С. 8. Отцентрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 10 мин, промойте осадок холодным 70 % этанолом, высушите под вакуумом и растворите в подходящем объеме воды или ТЕ буфера. Комментарии к методике: 1) Повысить включение меченого основания можно, оставляя реакционную смесь для инкубации на ночь при 37 °С или при комнатной температуре (~22 °С). Инкубация при комнатной температуре продлевает жизнь фермента (фрагмента Кленова) и делает включение более эффективным. 2) Количество синтезированной меченой ДНК зависит не только от чистоты, но и от количества взятой в реакцию матричной ДНК. 3) При использовании термостабильной полимеразы добиться большего выхода меченого продукта можно, повторив процедуру денатурация–отжиг–ферментативная реакция. Для этого после стадии 4 в вышеприведенной методике переходите к стадии 2. Работа 15. Проведение гибридизации ДНК по Саузерну 1. Исследуемую ДНК обработать соответствующими рестриктазами согласно рекомендациям производителя. 2. Для денатурации фрагментов ДНК гель вымачивают в буфере для денатурации (1,5М NaOH, 0,5М NaCI) при осторожном покачивании в течение 30 мин при комнатной температуре, затем выдерживают в буфере для нейтрализации (1,5М Трис-НСI, 0,5М NaCI, pH 6,5) в течение 30 мин. 46 3. За это время замочить нейлоновый или нитроцеллюлозный фильтр для переноса ДНК в 6х SSPE в течение 5 мин. 4. Собрать систему для переноса ДНК, и провести перенос при комнатной температуре в течение ночи. В качестве буфера для переноса используют 20х SSPE (1,5М Трис-НСI, 0,5 М NaCI, pH 6,5): • сполоснуть H2O; • инкубировать покачивая в 0.4N NaOH ~30 мин; • в это время подготовить: * 3 куска ватмана 3MM по размеру геля; * 2 больших куска ватмана 3MM – на подложку; * мембрану Hybond N+ (размер геля + 3–5 mm c каждой стороны); * 4 ленты парафилма или полиэтилена; * стопку фильтровальной бумаги; • поочередно обмакнуть в 0.4M NaOH большие куски ватмана и положить их на подложку без пузырей, опустить концы в NaOH; • положить гель дном вверх (без пузырей), налить сверху немного 0.4M NaOH; • подложить рядом ленты парафилма (полиэтилена) так, чтобы мембрана не соприкоснулась с ватманом 3MM, когда гель сожмется; • мембрану смочить в 0.4M NaOH, положить на гель (без пузырей); • сверху – 3 куска ватмана 3MM (нижний перед укладкой смочить в 0.4N NaOH), стопку фильтровальной бумаги, плоскую пластину и груз (~300 г для 10 × 10 см2 геля); 5. По окончании переноса снять фильтровальную бумагу и отметить положение лунок на фильтре. Фильтр снять и для удаления прилипшей агарозы промыть в 20х SSPE в течение 1 мин. 6. Пришить ДНК к фильтру, поместив последний (стороной с ДНК вверх) на 5 мин под УФ-лампу (254 нм). 7. Поместить фильтр в полиэтиленовый пакет и запаять его. Провести предгибридизацию при 42 оС в течение 10 мин и гибридизацию с соответствующим меченым зондом при той же температуре в течение 30–60 мин. 47 8. Промыть фильтр в двух-трех сменах 2х SSPE, 0,1% ДСН, по 5 мин в каждой смене. 9. Гибридизовавшийся зонд выявляют соответствующими методами детекции. Комментарии к методике: 1) Считается, что присутствие Mg2+ ингибирует связывание ДНК с мембраной (даже при ~1мМ Mg2+). Добавление ЭДТА до 100мМ перед денатурацией восстанавливает связывающую способность даже для 6мМ MgCl2. Работа 16. Выявление меченых ДНК с образованием нерастворимого окрашенного продукта 1. После переноса ДНК на мембрану гель сполоснуть в 2х SSC буфере при комнатной температуре. Промокнуть излишек жидкости. 2. Проинкубируйте мембрану в течение 30 мин в блокирующем буфере (0.1 мл на 1 см2 фильтра). Буфер: 5% БСА, 0.1% Tween 20, 150мМ NaCI в 50мМ фосфатном буфере. 3. Промойте мембрану в 2х SSC буфере. 4. Разведите коньюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза в буфере (0.1% Tween 20 в 50мМ фосфатном буфере) до разведения 1 : 3000 (0.1 мл на 1 см2 фильтра). Разведенный коньюгат стабилен при +4 °С около 12 часов. 5. Проинкубируйте мембрану в течение 30 мин в соответствующем объеме разведенного коньюгата. 6. Удалите несвязавшийся коньюгат, промывая мембрану 2 раза по 15 мин 2х SSC буфером. 7. Проинкубируйте мембрану с буфером (0,1М Трис-HCI рН 7.6, 10мМ MgCI2, 10мМ ZnCI2, 0.1% Тритон Х-100) в течение 2 мин. 48 8. Инкубируйте мембрану в соответствующем объеме красящего раствора (0.1 мл (к 0.1 мл буфера (см. п. 7) добавить 0.7 мкл субстрата 1 (НСТ) и 0.35 мкл субстрата 2 (5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфатом)) на 1 см2 фильтра). 9. Для прекращения реакции ополосните мембрану дистиллированной водой. Комментарии к методике: 1) Для экономии раствора инкубацию рекомендуется проводить в полиэтиленовом пакете, подобранному по размеру мембраны. Инкубацию проводите в темном месте, что уменьшает образование фона. Образование окраски может начаться через несколько минут, но обычно реакция занимает от 30 мин до 3 часов в зависимости от количества меченой пробы (можно для ускорения образования окраски помещать мембрану на +37 °С, хотя это может приводить к усилению фона). 2) Если получается сильно окрашенный фон на мембране, то можно уменьшить количество меченой ДНК пробы при гибридизации; увеличить объем буфера при предгибридизации, чтобы уменьшить вероятность подсыхания фильтра; можно использовать более сильное разведение коньюгата. Работа 17. Дот-блот-гибридизация ПЦР-амплифицированной ДНК 1. Исследуемую ДНК обработать соответствующими рестриктазами согласно рекомендациям производителя. 2. Вымачить нейлоновый фильтр в дистиллированной воде не менее 5 мин. 3. 10–20 мкл ПЦР-амплифицированной ДНК добавить к 300 мкл раствора для денатурации (1,5М NaOH, 0,5 МNaCI). Денатурация при этом происходит практически мгновенно. 49 4. Каждый образец наносят на отдельный участок мембраны для получения. При нанесении ДНК на мембрану необходимо учитывать, что для всасывания образца требуется около 1 мин. 5. Пришить ДНК к фильтру, поместив последний (стороной с ДНК вверх) на 5 мин под УФ (254 нм). 6. Промыть мембрану 20х SSPE (3М NaCI, 200мМ NaH2PO4xH2O, 20мМ ЭДТА) три раза по 5 мин. 7. Гибридизовавшийся зонд выявляют соответствующими методами детекции. Глава V. Клонирование ДНК в бактериальные системы Для проведения экспериментов с фрагментами ДНК зачастую возникает необходимость их многократно копирования (клонировать). В классической методике клонирования ДНК используется способность клеток бактерий поглощать и реплицировать короткие кольцевые молекулы ДНК, известные как плазмиды. Сначала клонируемый фрагмент ДНК вырезается из исходной ДНК с помощью рестриктазы. Обычно используются два разных фермента. В качестве переносчика («вектора») служит плазмида с единственным участком, узнаваемым специфической рестриктазой. Кольцевая плазмида линеаризуется с помощью рестрикции и затем смешивается с изучаемым фрагментом ДНК. Поскольку фрагмент и вектор имеют одинаковые липкие концы, некоторые из молекул будут гибридизоваться таким образом, что клонируемый фрагмент окажется интегрированным в структуру вектора. Затем концы линейной молекулы ковалентно сшиваются с помощью ДНК-лигазы с образовании новой «рекомбинантной» плазмиды. При обработке большого количества клеток некоторые из них по50 глощают рекомбинантную плазмиду (так называемая трансформация). Трансформированные клетки реплицируют плазмиду вместе с собственным геномом. Обычно используют плазмиды, придающие трансформированной клетке устойчивость (резистентность) к определенному антибиотику. При инкубации популяции клеток в присутствии антибиотика будут реплицироваться только те клоны, которые содержат плазмиду. Из полученного клона выделяют плазмиду и после расщепления соответствующей рестриктазой получают множество копий клонированного фрагмента ДНК. Для выделения определенных фрагментов ДНК и последующего их соединения с другими фрагментами для получения новых комбинаций генов используются ферменты, которые специфически разрезают и вновь сшивают молекулы ДНК. Наиболее важной группой ферментов являются эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), катализирующие специфическое расщепление двунитевой ДНК. Известно большое число рестриктаз. Для их обозначения используются сокращенные названия микроорганизмов – продуцентов (например, EcoRI – эндонуклеаза, выделенная из Escherichia coli). Этот фермент расщепляет ДНК по палиндромной после- довательности, т. е. короткому сегменту ДНК, в котором обе цепи при считывании в направлении 5'→3' имеют одинаковую последовательность. Для EcoRl это последовательность 5'-GAATTC-3'. Гомодимер EcoRI расщепляет фосфодиэфирные связи обеих цепей между G и А. Это приводит к образованию комплементарных «липких» концов (ААТТ), которые удерживаются вместе за счет спаривания оснований. Их, однако, можно легко отделить друг от друга путем небольшого нагревания. При охлаждении липкие концы гибридизуются вновь в правильной ориентации. Кроме того, существуют рестриктазы, образующие фрагменты с тупыми концами (Sma I, EcoR V и др.). Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК. 51 1. Сшивка фрагментов с липкими концами. Этот метод является самым распространенным и популярным. В результате обработки ДНК рестриктазами, образующими липкие концы. Эти комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и поэтому их называют комплементарными или липкими концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями, образовавшимися под действием одной и той же рестриктазы, за счет образования водородных связей между однонитиевыми участками комплементарных нуклеотидов. Также места расщепления можно соединить с помощью ДНК-лигазы. Рис. 15. Схема проведения рестрикции с образованием липких концов и последующим лигированием 2. Сшивка фрагментов с тупыми концами. Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. Для этого используют фермент-концевую трансферазу, которая присоединяет нуклеотиды к 3'концам цепей ДНК. Если к 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro 52 фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные oligo(dA)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента – oligo(dT)-сегменты примерно такой же длины, то при смешении полученных таким образом фрагментов происходит спаривание за счет образования водородных связей между oligo(dА)- и oligo(dT)-последовательностями. Для ковалентного соединения двух фрагментов используется ДНК-лигаза. 3. Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами. В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или «переходники»). Линкеры – это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Существуют линкеры «тупой конец – липкий конец». При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента – эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы «застраивают», то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить. Плазмиды – это внехромосомные автономно реплицирующиеся двуцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды встречаются практически у всех бактерий и выполняют ряд функций: обеспечивают их собственный перенос из одной клетки в другую (F-плазмиды); несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды деградации). Есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие какие-то определенные функции (критические плазмиды; от англ. cryptic – скрытый, латентный). Размеры плазмид варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. Каждая из них содержит сайт начала репликации (ori), без кото53 рого репликация плазмиды в клетке-хозяине невозможна. Некоторые плазмиды представлены в клетке 10–100 копиями; они называются высококопийными. Низкокопийные плазмиды присутствую в клетке в числе 1– 4 копий. Рис. 16. Плазмидный вектор pGEM-T. Слева обозначен сайт рестрикции с указанием рестриктаз Как автономно реплицирующиеся генетические элементы плазмиды обладают всеми основными свойствами, которые позволяю использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК: 1) небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в Е. coli значительно снижается при длине плазмиды более 15 т.п.н.; 2) наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка; 3) наличие одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК. Полученную рекомбинантную плазмиду необходимо ввести в клетку-хозяина (как правило, Е. coli). Этот процесс называется трансформацией. Обычные бактериальные клетки практически не подвергаются трансформации, т. к. проникновению ДНК внутрь клетки мешает клеточная стенка и мембрана. Бактериальные клетки, способные трансформироваться, называются компетентными. 54 Рис. 17. Схема трансформации бактериальной клетки плазмидным вектором Для высокой эффективности введения рекомбинантной ДНК бактериальные клетки могут обрабатываться специальным раствором солей, после чего клеточная стенка и мембрана становится проницаемой для небольших плазмид. Еще одним методом введения ДНК в бактерию является обработка клеток «холодовым шоком». Другим способом трансформации является электропорация. 55 Работа 18. Приготовление компетентных клеток 1. Рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной средой без антибиотика. Выращивать при 37 oС 10–12 часов. 2. Несколько колоний (10–12) диаметром ~2–3 мм поместить в колбу с 40 мл жидкой среды (2% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10мМ NaCI, 10 мМ KCI). 3. Выращивать бактерии при постоянном помешивании (200–300 rpm) при 37 oС до оптической плотности OD600 = 0.6. Все дальнейшие манипуляции проводить на холоде!!! 4. В 50 мл пробирку поместить 30 мл культуры, охладить на льду в течение 10–15 мин. 5. Центрифугировать на 2 000 rpm при 4 oC 10 мин, тщательно удалить жидкость. 6. Осадок бактерий суспензировать в 10 мл буфера (10 мМ HEPES рН 6.7, 55мМ MgCI2, 15 мМ CaCI, 250мМ KCI). Охладить на льду 10–15 мин. 7. Центрифугировать на 2 000 rpm при 4 oC 10 мин, тщательно удалить жидкость. 8. Ресуспензировать осадок в 2 мл буфере (см. п. 6), добавить DMSO до 3.5 %. Охладить на льду 10–15 мин. 9. Разаликвотировать по 100 мкл в охлажденные 2 мл пробирки. Заморозить в жидком азоте. Хранить в жидком азоте или на –70 oС. Комментарии к методике: 1) Рост при 37 oС приводит к резкой (с острым максимумом) зависимости компетентности от плотности клеток. При 18 oС высокая компетентность достигается в широком интервале. 56 2) PIPES в составе TB можно заменить на HEPES или BES. Это приведёт к небольшому увеличению компетентности. 3) DMSO токсичен для бактерий в высокой концентрации (это позволяет не заботится о его стерильности), поэтому он добавляется к клеткам в два этапа при постоянном перемешивании. 4) Замораживание в жидком азоте повышает компетентность в 4–5 раз. Работа 19. Трансформация бактериальных клеток методом «холодового шока» 1) Приготовить свежий раствор пДНК (плазмидная ДНК) с концентрацией 50 нг/мкл. a) Необходимо измерить концентрацию вектора и пДНК. Протестировать различные соотношения вектор : пДНК для нахождения оптимального значения. Для этого, в двух пробирках приготовить смесь вектор : пДНК в соотношениях 1 : 1 и 1 : 3. Следующее соотношение позволяет рассчитать молярное отношение к молекулярной массе для вектора и фрагменту ДНК, который используется для встраивания в вектор. масса вектора (нг) ⋅ размер вставки (kb) размер вектора (kb) вставка вектор = масса вставки (нг) b) Рассчитав подходящее соотношение вектор : вставка, поставить реакцию лигирования: вектор – 100 нг, вставка – 50 нг, 10х буфер (50мM Трис-HCI (pH 7.8 при 25 °C); 10мM MgCI2; 10мM ДTT; 1мM ATФ; – 1 мкл, 25 мкг/мл БСА) Т4 ДНК-лигаза – 1 ед., деионизованная вода – до 10 мкл. 57 c) Реакцию лигирования проводить при температуре 16 оС в течение 30–40 мин. 2) Оттаять во льду 0.5 M β-меркаптоэтанол и аликвоту компетентных клеток. 3) К аликвоте компетентных клеток добавить: 4 мкл 0.5M β-меркаптоэтанола и 2 мкл пДНК; 4) Инкубировать смесь при 0 oC 20–60 мин. 5) Быстро, но без встряхивания, перенести клетки на 42 oC. Инкубировать 30 с. 6) Быстро перенести в лед на 2 мин. 7) После охлаждения к аликвоте клеток добавить 400 мкл буфера (2% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10мМ NaCI, 10мМ KCI). 8) Выращивать, перемешивая горизонтально на бактериальном шейкере при 37 oС 30 мин. 9) Высеять 50 мкл клеток на чашку с антибиотиком (добавить 100 мкл 0.1М IPTG и 20 мкл xGal (50 мг/мл)). Инкубировать 10–12 часов при 37 оС. 10) Проанализировать состояние колоний. Белые колонии, как правило, представлены трансформированными клетками, несущими рекомбинантную плазмиду. Голубой цвет колонии указывает на присутствие в них клеток, в которых присутствует вектор без вставки ДНК. 11) Рассчитать компетентность клеток: если выросло «N» колоний, то компетентность = N × 106 [колоний/мкг]. Комментарии к методике: 1) При тепловом шоке температура может быть в интервале 40–50 оС. 2) Если тепловой шок заменить замораживанием в жидком азоте и оттаиванием до комнатной температуры, то компетентность повысится в ~10 раз. 58 Работа 20. Выделение плазмидной ДНК (лизис щелочью) 1. 1.5 мл культуры клеток поместить в 1.7 мл пробирку, центрифугировать 30 с при 10 000 rpm, полностью удалить супернатант (при необходимости повторить). 2. Ресуспензировать осадок в 200 мкл раствора (25мМ Трис- HCI рН 8.0, 50мМ глюкоза, 10мМ ЭДТА), перемешать на вортеке. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин. 3. К суспензии добавить 400 мкл раствора (0.2Н NaOH, 1% ДСН), резко вылить, сразу же резко встряхнуть, перевернуть ~5 раз. Инкубировать при 0 oС 5 мин (не больше!!!). 4. Прибавить 200 мкл холодного 10М AcONH4, ~5 раз перевернуть. Инкубировать при 0 oС 5 мин. 5. Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm 5 мин. 6. Супернатант перенести в пробирку с 500 мкл изопропанола, смешать. Инкубировать при комнатной температуре 10 мин. 7. Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm 5 мин. 8. К осадку прилить 100 мкл 2М AcONH4, перемешать на вортексе 20 с. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин. 9. Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm 5 мин., перенести супернатант в пробирку со 100 мкл изопропанола. Инкубировать при комнатной температуре 10 мин. 10. Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm 10 мин, сполоснуть осадок 70 % этанолом, подсушить. При необходимости обработать РНКазой. 11. Растворить осадок в 25 мкл (H20 или TE буфера). 59 Комментарии к методике: 1) При щелочной денатурации ДНК нужно постараться как можно меньше раздробить геномную ДНК, иначе возникнут проблемы с ее осаждением в дальнейшем. 2) Превышение времени денатурации приводит к тому, что плазмида денатурирует необратимо – одно кольцо сдвинется относительно другого так далеко, что достигнет локально устойчивого состояния. Необратимо денатурированные плазмиды можно использовать для сиквенса, они не режутся рестриктазами и обладают аномальной подвижностью на электрофорезе. Работа 21. Выделение плазмидной ДНК методом фенол- хлороформной экстракции (экспресс-метод) 1. Перенести колонию клеток в пробирку. Добавить 25 мкл STE буфера (10мМ Трис-HCI рН 8.0, 10мМ NaCI, 1мМ ЭДТА). 2. Перемешать на вортексе и добавить 25 мкл смеси фенол : хлороформ : изопропанол в соотношении 25 : 24 : 1. 3. Перемешать полученную смесь на вортексе 1 минуту. Центрифугировать при 12 000 rpm 20 с. 4. Супернатант перенести в новую пробирку. Центрифугировать при 12 000 rpm 10 мин. 5. Супернатант можно использовать для ПЦР-анализа. Комментарии к методике: 1) Для более качественной очистки пДНК можно использовать осаждение 96 % спиртом после п. 5. 60 Работа 22. Определение вставки ДНК в трансформированных клетках методом рестрикции 1. Рестрикцию вставки ДНК можно проводить любой рестриктазой, имеющей по одному сайту рестрикции с каждой стороны от вставки, например, EcoR I. 2. Собрать смесь для рестрикции: 10х ПЦР буфер для EcoR I Плазмидная ДНК Фермент EcoR I Деионизованная вода – – – – 1,5 мкл. 1 мкг. 1 ед. до 15 мкл. 3. Инкубировать смесь при 37 оС 30 мин. Инактивировать фермент нагреванием до 65 оС на 20 мин. Работа 23. Идентификация вставки ДНК в трансформированных клетках методом ПЦР 1. При определении вставки можно использовать как секвенирующие праймеры М13, так и специфические праймеры для ДНК вставки. 2. В случае использования специфических праймеров для вставки ДНК, программа и параметры амплификации используются соответствующие. 3. Если использовать праймеры М13, то программа для амплификации следующая: оо 1) Денатурация при 95 оС 3 мин. 2) Денатурация цикла при 95 оС 30 с. 3) Отжиг праймеров при 50 оС 30 с. 4) Элонгация цепи при 72 оС 40 с. 5) Повторить цикл амплификации с п. 2. по п. 4. 30 раз. 6) Финальная элонгация при 72 оС 3 мин. 61 Рекомендуемая литература: 1. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / под ред. Н.К. Янковского. – М. : Мир, 2002. – 588 с. 2. Попечителев Е.П. Аналитические исследования в медицине, биологии и экологии / Е.П. Попечителев, О.Н. Старцева. – М. : Высш. шк., 2003. – 279 с. 3. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии / В.Н. Рыбчин. – СПб. : Изд-во СПбГТУ, 1999. – 519с. 4. Ленинджер А. Основы биохимии / А. Ленинджер. – М. : Мир, 1985. 5. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии / Ю.Б. Филиппович. – М. : Высш. шк., 1993. 6. Албертс Б. Молекулярная биология клетки / Б. Альбертс и др. – М. : Мир, 1995. 7. Медицинские лабораторные технологии. Справочник / под ред. А.И. Карпищенко. – СПб. : Интерм., 1999. 8. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / под ред. Н.К. Янковского. – М. : Мир, 2002. 9. С. Колеман. Наглядная биохимия / С. Колеман, М. Рем. – М. : Мир, 2002. 10. Н.А. Кузьмина. Основы биотехнологии // http://www.biotechnolog.ru/, 2005. 11. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / под ред. С. Херрингтона. – М. : Мир, 1999. 12. http://www.molbiol.ru/ 62 Учебное издание Еприцев Александр Трофимович, Попов Василий Николаевич, Федорин Дмитрий Николаевич ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Учебно-методическое пособие для вузов Редактор И.Г. Валынкина Подписано в печать 21.08.08. Формат 60×84/16. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 50 экз. Заказ 977. Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета. 394000, г. Воронеж, пл. им. Ленина, 10. Тел. 208-298, 598-026 (факс) http://www.ppc.vsu.ru; e-mail: pp_center@ppc.vsu.ru Отпечатано в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, г. Воронеж, ул. Пушкинская, 3. Тел. 204-133. 63 64
