Генная инженерия Клеточная биология Молекулярная медицина

2014
2013
Генная инженерия
Клеточная биология
Молекулярная медицина
О компании
Компания Евроген – российская инновационная биотехнологическая компания,
основанная в 2000 г. Основные направления деятельности – научные исследования, разработка новых технологий и продуктов, выполнение заказов в области
молекулярной биологии, биотехнологии и генной инженерии.
Научно-прикладные исследования и работа над проектами ведутся в современном
научном центре ИБХ РАН, оборудованном всем необходимым для выполнения
генно-инженерных процедур, работы с клеточными культурами, флуоресцентной
микроскопии, синтеза олигонуклеотидов, секвенирования ДНК, анализа и систематизации информации.
Успех инновационной деятельности компании и дальнейшие перспективы развития
определяются наличием сплоченной и высокопрофессиональной команды ученых,
имеющих многолетний опыт работы в области молекулярной биологии и генной инженерии.
Содержание
Условные обозначения
– информационный раздел
P
– описание продуктов
S
– описание работ, выполняемых на заказ
Генная инженерия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
Синтез и секвенирование ДНК. Мутагенез . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Синтез олигонуклеотидов и протяженных фрагментов ДНК
Сайт-направленный мутагенез
S
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
S
5
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
Секвенирование фрагментов ДНК
S
Секвенирование следующего поколения (NGS)
S
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
Выделение, очистка и электрофорез нуклеиновых кислот
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
Фиксатор для стабилизации РНК IntactRNA
P
Реагент для выделения суммарной РНК из биологических объектов ExtractRNA
Наборы для выделения плазмид
P
. . . . . . . . . . .
8
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
Наборы для очистки ДНК из геля и реакционных смесей
Соосадитель нуклеиновых кислот Satellite Red
P
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
Маркеры длин ДНК
Синтез кДНК и ОТ-ПЦР
P
P
Обратные транскриптазы MMLV и Mint
Набор MMLV RT kit
P
P
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
Набор OneTube RT-PCRmix
P
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
P
Наборы реактивов Mint для синтеза кДНК
13
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
ПЦР амплификация и клонирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
Синтез и амплификация кДНК
S
P
Термостабильные ДНК полимеразы и наборы реактивов для ПЦР
Готовые смеси для ПЦР
P
. . . . . . . . . . . . . . . . .
17
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
Набор реактивов PCR Control set
pAL-TA вектор
P
P
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
P
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Компетентные клетки
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
P
Прогулка по хромосоме (genome walking)
S
24
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
Амплификация и клонирование фрагментов ДНК
Конструирование библиотек кДНК
S
P
S
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
S
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Нормализация, деплеция и вычитающая гибридизация нуклеиновых кислот
P
S
26
27
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
Дуплекс-специфическая нуклеаза
Нормализация кДНК
23
23
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
S
Быстрая амплификация концевых фрагментов кДНК (RACE)
Субклонирование ДНК
23
P
Удаление избытка копий (деплеция) рибосомальной РНК из образцов кДНК
Деплеция нецелевых транскриптов из образцов кДНК
Нормализация геномной ДНК
S
S
. . . . . . . . . . . . .
31
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
Вычитающая гибридизация кДНК
S
Вычитающая гибридизация бактериальных геномов
S
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
34
Учебные наборы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
Практикум по генной инженерии
www.evrogen.ru
P
S
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
1
Клеточная биология . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Флуоресцентные белки
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Флуоресцентные белки, обладающие стабильной флуоресценцией
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
Фотоактивируемые флуоресцентные белки
Визуализация флуоресцентных белков
Векторы для экспреcсии флуоресцентных белков
Готовые лентивирусные частицы
P
39
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
54
Рекомбинантные флуоресцентные белки
P
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
P
Антитела для анализа флуоресцентных белков
P
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Оптимизация векторов, разработка систем скрининга на основе флуоресцентных белков
55
55
. . . . . . .
56
Флуоресцентные генетически кодируемые биосенсоры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
57
Биосенсор HyPer: анализ внутриклеточных колебаний концентрации H2 O2
P
S
. . . . . . . . . . . .
57
Биосенсор Case12: мониторинг внутриклеточных колебаний концентрации ионов кальция
P
. . . .
58
Биосенсоры Casper3-BG и Casper3-GR: ранняя детекция каспаза-3 зависимого апоптоза
P
. . . .
59
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы
KillerRed
ArrestRed
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
Векторы для экспреcсии и поликлональные антитела для детекции генетически кодируемых фотосенсибилизаторов P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
Трансфекция и трансдукция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
Временная трансфекция культур клеток
S
Конструирование лентивирусных частиц
S
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
64
Лентивирусные конструкции для РНК-интерференции
S
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Создание стабильно трансфецированных клеточных линий
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
S
65
66
Молекулярная медицина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Молекулярная онкология . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Наборы реактивов Insider
P
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Услуги в области молекулярной онкологии
69
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
Молекулярная генетика наследственных заболеваний . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
76
S
Услуги в области молекулярной генетики наследственных заболеваний
Исследования в области молекулярной медицины по ТЗ заказчика
Обзор основных технологий
Синтез кДНК
S
. . . . . . . . . . . . . . . .
76
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
S
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Эффект селективной супрессии ПЦР
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Метод быстрой амплификации 3’- и 5’-концов кДНК (Step-Out RACE)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
84
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
84
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
86
Нормализация и деплеция кДНК и геномной ДНК с помощью дуплекс-специфической нуклеазы
Мутационно-специфическая ПЦР (WTB-PCR)
Информация для покупателей
Условия доставки
. .
87
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
89
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Отправка биологического материала заказчиком
Конфиденциальность
82
83
Супрессионная вычитающая гибридизация
Зеркально-ориентированная селекция
81
. . . . . . . . . . . . . . . .
Прогулка по хромосоме (genome walking)
2
69
90
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
90
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
90
Евроген, Каталог 2013/14
Генная инженерия
Синтез и секвенирование ДНК. Му тагенез
Выделение, очистка и электрофорез нуклеиновых кислот
Синтез кДНК и ОТ-ПЦР
ПЦР амплификация и клонирование
Нормализация, деплеция и вычитающая гибридизация
нуклеиновых кислот
Учебные наборы
Генная инженерия
Синтез и секвенирование ДНК. Мутагенез . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Синтез олигонуклеотидов и протяженных фрагментов ДНК на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Сайт-направленный мутагенез на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Секвенирование фрагментов ДНК на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
Секвенирование следующего поколения (NGS) на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
Выделение, очистка и электрофорез нуклеиновых кислот . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
Фиксатор для стабилизации РНК IntactRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
Реагент для выделения суммарной РНК из биологических объектов ExtractRNA . . . . . . . . . . . . . . . .
8
Наборы для выделения плазмид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Наборы для очистки ДНК из геля и реакционных смесей
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Соосадитель нуклеиновых кислот Satellite Red . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
Маркеры длин ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
Синтез кДНК и ОТ-ПЦР . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
Обратные транскриптазы MMLV и Mint . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
Набор MMLV RT kit
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
Набор OneTube RT-PCRmix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
Наборы реактивов Mint для синтеза кДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
Синтез и амплификация кДНК на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
Синтез и амплификация кДНК для рутинных приложений
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Синтез и амплификация кДНК для массированного секвенирования . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
ПЦР амплификация и клонирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
Термостабильные ДНК полимеразы и наборы реактивов для ПЦР . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
Taq ДНК полимераза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
HS Taq ДНК полимераза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
SNPdetect полимераза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
Encyclo полимераза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
Tersus полимераза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
InBlood полимераза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
Готовые смеси для ПЦР . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
Набор реактивов PCR Control set . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
pAL-TA вектор
23
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Компетентные клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
Прогулка по хромосоме (genome walking) на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
Быстрая амплификация концевых фрагментов кДНК (RACE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
Наборы реактивов для RACE
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
RACE и клонирование полноразмерных транскриптов на заказ
4
9
10
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
25
Субклонирование ДНК на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
Амплификация и клонирование фрагментов ДНК на заказ
26
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Конструирование библиотек кДНК на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
Нормализация, деплеция и вычитающая гибридизация нуклеиновых кислот . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
Дуплекс-специфическая нуклеаза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
Нормализация кДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
Набор реактивов Trimmer-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
Нормализация кДНК на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
Удаление избытка копий (деплеция) рибосомальной РНК из образцов кДНК на заказ . . . . . . . . . . . . . .
31
Деплеция нецелевых транскриптов из образцов кДНК на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
Нормализация геномной ДНК на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
Вычитающая гибридизация кДНК на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
Вычитающая гибридизация бактериальных геномов на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
34
Учебные наборы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
Практикум по генной инженерии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
Евроген, Каталог 2013/14
Синтез и секвенирование ДНК. Мутагенез
Синтез олигонуклеотидов и
протяженных фрагментов ДНК на заказ
Синтез праймеров производится на синтезаторах Applied Biosystems ABI
3900, высочайшая производительность которых позволяет выполнить заказ
в кратчайшие сроки (два-три рабочих дня).
Качество синтеза контролируется с помощью аналитического электрофореза на ПААГ. Олигонуклеотиды обессолены и лиофилизированы.
Cинтез протяженных фрагментов ДНК до 3000 п.о. осуществляется путем
сборки из синтетических олигонуклеотидов с последующим клонированием
целевых фрагментов в бактериальный плазмидный вектор. Правильность
полученной синтетической последовательности подтверждается секвенированием.
Cинтезатор Applied Biosystems ABI 3900.
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Благодаря высокому качеству синтеза полученные олигонуклеотиды не нуждаются в дополнительной очистке на ПААГ для большинства приложений.
Сервис может включать оптимизацию нуклеотидной последовательности
ДНК с учетом частоты встречаемости кодонов для повышения уровня экспрессии гена в различных гетерологических системах.
Услуга
Описание
Кат.#
Синтез праймеров
Синтез олигонуклеотидов длиной до 120 оснований.
Шкала синтеза – 0.04 мкмоль, количество – 5 ОЕ*
SP001
2-3 дня
Синтез олигонуклеотидов длиной до 120 оснований.
Шкала синтеза – 0.2 мкмоль, количество – 15 ОЕ*
SP002
2-3 дня
Синтез олигонуклеотидов длиной до 120 оснований.
Шкала синтеза – 1 мкмоль, количество – 80 ОЕ*
SP003
2-3 дня
Синтез фрагментов ДНК длиной до 3000 п.о.
CS042
договорной
Синтез генов
Срок выполнения
Дополнительные услуги
Очистка праймеров на ПААГ
договорной
* Количество в ОЕ (оптические единицы) для олигонуклеотидов длиной 20 оснований.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Сайт-направленный мутагенез на заказ
Внесение в последовательность ДНК любых точечных мутаций (замена нуклеотидов, делеции, инсерции), а также изменение протяженных структур
ДНК (многонуклеотидные инсерции/делеции, сближенные точечные замены
нуклеотидов, изменение концевых последовательностей фрагментов ДНК).
Соответствие целевого продукта требованиям заказчика определяется секвенированием.
Услуга
Описание
Кат.#
Сайт-направленный
мутагенез
Внесение точечных мутаций и изменение протяженных
структур ДНК
CS041
Срок выполнения
договорной
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
5
Генная инженерия : Синтез и секвенирование ДНК. Мутагенез
Секвенирование фрагментов ДНК на заказ
Секвенирование плазмид и ПЦР-фрагментов осуществляется на автоматическом секвенаторе методом Сэнгера.
Для образцов ДНК с высокой степенью очистки длина прочтения может достигать 800 нуклеотидов за прогон. Средняя длина прочтения – 500-600
нуклеотидов.
Услуга
Кат.#
Секвенирование ДНК
SQ001
Срок выполнения
договорной
Дополнительные услуги
Очистка ДНК перед секвенированием
1 день
Выделение плазмидной ДНК
1 день
Дизайн и синтез праймеров для секвенирования
1 день
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Многоуровневый сервис адаптирован для решения задач, связанных с
получением больших массивов информации о нуклеотидных последовательностях, таких как:
- полногеномное секвенирование
- секвенирование транскриптомов (RNA-seq)
- широкомасштабное секвенирование ампликонов
- секвенирование 16S РНК
- секвенирование малых РНК
- глубокое секвенирование отдельных генов или наборов генов
- секвенирование экзомов
- секвенирование фрагментов ДНК, выделенных методом иммунопреципитации хроматина (ChIP-seq).
Количество прочтений
Секвенирование следующего поколения (NGS) на заказ
7 107
6 107
5 107
4 107
3 107
2 107
1 107
1
2
7
12
17
22
27
32
37
Среднее качество прочтения
Сервис включает подготовку образцов, подбор оборудования, оптимального для решения конкретной задачи (Illumina, Roche 454, Ion Torrent),
секвенирование и биоинформатическую обработку результатов.
Кроме рутинной подготовки образцов геномной ДНК или кДНК к секвенированию по стандартам производителей, в случае целесообразности мы
предложим дополнительные услуги:
- нормализация геномной ДНК: удаление высококонсервативных повторов из образцов геномной ДНК (см. страницу 32)
- нормализация кДНК: выравнивание концентрации разнопредставленных транскриптов в образцах кДНК (см. страницу 29)
- деплеция рибосомальной кДНК: удаление избытка последовательностей
рибосомальной и транспортной РНК (см. страницу 31) из образцов
кДНК
- вычитающая гибридизация кДНК: обогащение образца дифференциальными последовательностями (см. страницу 33)
Распределение показателей качества прочтений (Phred Score) для набора данных, полученного в результате секвенирования кДНК
(RNA-seq) на одной дорожке Illumina HiSeq
при длине прочтения 100 п.о. с одной стороны. Оранжевый фон – низкое качество, голубой
фон – высокое качество. Показатели качества
зависят от природы и качества исходных материалов и типа пробоподготовки.
Во многих случаях такая дополнительная обработка позволяет значительно
повысить эффективность последующего секвенирования.
6
Евроген, Каталог 2013/14
Наиболее востребованные параметры секвенирования:
Параметры секвенирования
Кат.#
Срок выполнения
Секвенирование
следующего поколения
(NGS)
Секвенирование на 1 дорожке Illumina HiSeq с двух
сторон, длина прочтения 2 X 100 п.о.
NGS-IHS-010302
5-12 недель
Секвенирование на 1 дорожке Illumina HiSeq с одной
стороны, длина прочтения 100 п.о.
NGS-IHS-010301
5-12 недель
Секвенирование на Illumina MiSeq с двух сторон, длина
прочтения 2 X 150 п.о.
NGS-IMS-010402
4-8 недель
Секвенирование на 1/16 плашки Roche 454 GS FLX+,
длина прочтения 700 п.о.
NGS-RGS-010101
5-12 недель
Секвенирование на 1/8 плашки Roche 454 GS FLX+,
длина прочтения 700 п.о.
NGS-RGS-020101
5-12 недель
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Услуга
Наиболее востребованные услуги по подготовке образцов к секвенированию:
Услуга
Описание
Кат.#
Подготовка геномной ДНК
к секвенированию
Подготовка геномной ДНК для секвенаторов,
совместимых с TruSeq (Illumina).
NGP01-ILMN
Геномная ДНК эукариот
или прокариот
Нормализация геномной
ДНК. Подготовка ДНК к
секвенированию
Нормализация геномной ДНК. Подготовка геномной ДНК
для секвенаторов, совместимых с TruSeq (Illumina).
NGP13-ILMN
Геномная ДНК эукариот
Синтез и амплификация
кДНК. Подготовка кДНК к
секвенированию
Синтез кДНК по технологии синтеза со сменой матрицы.
Подготовка кДНК для секвенаторов, совместимых с
TruSeq (Illumina).
NGP30-1A-ILMN
Тотальная или
поли(А)+
РНК эукариот
Синтез кДНК по технологии RNA-seq. Подготовка кДНК
для секвенаторов, совместимых с TruSeq (Illumina).
NGP30-2D-ILMN
Поли(А)+ РНК
эукариот
Синтез кДНК по технологии RNA-seq. Подготовка кДНК
для секвенаторов, совместимых с TruSeq (Illumina).
Обратите внимание: для повышения эффективности
секвенирования строго рекомендуется удаление избытка
копий рРНК и тРНК (см. NGP14-ILMN).
NGP30-2E-ILMN
Тотальная РНК
прокариот
Синтез кДНК по технологии синтеза со сменой матрицы.
Нормализация кДНК. Подготовка кДНК для
секвенаторов, совместимых с TruSeq (Illumina).
NGP10-1A-ILMN
Тотальная или
поли(А)+
РНК эукариот
Синтез кДНК по технологии RNA-seq. Нормализация
кДНК. Подготовка кДНК для секвенаторов, совместимых
с TruSeq (Illumina).
NGP10-2D-ILMN
Поли(А)+ РНК
эукариот
Деплеция рибосомальной
кДНК. Подготовка кДНК к
секвенированию
Синтез кДНК по технологии RNA-seq. Удаление избытка
копий рибосомальной и транспортной РНК. Подготовка
кДНК для секвенаторов, совместимых с TruSeq
(Illumina).
NGP14-ILMN
Вычитающая гибридизация
кДНК. Подготовка кДНК к
секвенированию
Синтез кДНК по технологии синтеза со сменой матрицы.
Вычитающая гибридизация кДНК. Подготовка кДНК для
секвенаторов, совместимых с TruSeq (Illumina).
NGP21-1-ILMN
Нормализация кДНК.
Подготовка кДНК к
секвенированию
Стартовый материал
Тотальная РНК эукариот
или прокариот
Тотальная или
поли(А)+
РНК эукариот
Срок выполнения заказа – 3-5 недель.
Описание методов синтеза кДНК – см. страницу 81, нормализации и деплеции – страницу 87, вычитающей гибридизации – страницу 84.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
7
Выделение, очистка и электрофорез нуклеиновых кислот
Фиксатор для стабилизации РНК IntactRNA
IntactRNA – нетоксичный фиксатор для быстрой стабилизации клеточной
РНК в тканях и клеточных культурах.
IntactRNA легко проникает в ткани и клетки и защищает РНК от деградации даже при комнатной температуре. Это позволяет транспортировать,
пересылать и хранить зафиксированные образцы без замораживания до 14
дней.
IntactRNA позволяет быстро зафиксировать большое количество образцов,
не прибегая к ресурсоемким процедурам быстрого выделения РНК или замораживания жидким азотом.
Суммарный препарат РНК, выделенный из зафиксированных фрагментов
ткани, сохраняет качественный и количественный состав и может затем
быть использован в любых молекулярно-биологических приложениях.
Основные свойства IntactRNA:
- обеспечивает быструю инактивацию РНКаз
- позволяет использовать гибкий режим хранения проб
- идеален для создания полевых коллекций
- совместим с большинством методик для выделения РНК
- не нарушает целостность клеток в образце
M
K
1
2
3
4
т.п.о.
3.0
1.0
РНК печени мыши, электрофорез в 1.2% TAE
агарозе. Образцы ткани хранились разное время в фиксаторе IntactRNA, выделение РНК
осуществлялось с использованием реагента
ExtractRNA: (K) РНК из свежей ткани без
фиксации; (1-3) РНК из ткани, хранившейся в фиксаторе IntactRNA в течение 1, 7,
14 дней при комнатной температуре, соответственно; (4) РНК из ткани, хранившейся в
фиксаторе IntactRNA в течение 30 дней при
+4°C. (М) Маркер длин ДНК 1 kb DNA Ladder
(кат. #NL001).
Продукт
Состав
Кат.#
Фиксатор IntactRNA
Водный раствор фиксатора, 100 мл.
BC031
Количество
100 фиксаций
по 100 мг ткани
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Реагент для выделения суммарной РНК
из биологических объектов ExtractRNA
ExtractRNA предназначен для быстрого выделения суммарной РНК высокого качества из широкого круга объектов: животные и растительные ткани,
культуры клеток млекопитающих, бактерий, дрожжей.
Добавленный к образцу реагент моментально лизирует клетки, при этом
целостность РНК сохраняется за счет эффективного ингибирования активности РНКаз.
Суммарная РНК, выделенная с помощью реагента ExtractRNA, может
быть использована для синтеза кДНК, ОТ-ПЦР, Нозерн блота, in vitro
трансляции, выделения поли(А)+ РНК и других приложений.
Продукт
Состав
Кат.#
Реагент ExtractRNA
Монофазный водный раствор на основе фенола и
гуанидин-изотиоцианата, 100 мл
BC032
Количество
100 выделений
из 100 мг ткани
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
8
Евроген, Каталог 2013/14
Наборы для выделения плазмид
Наборы предназначены для выделения плазмидной ДНК из культуры
E. coli. Качество выделенной ДНК позволяет использовать ее в любых молекулярно-биологических приложениях.
M
2
3.0
Принцип метода: на стадии лизиса происходит разрушение клеточных
стенок бактерий в условиях, позволяющих сохранить плазмидную ДНК интактной. Далее плазмидная ДНК сорбируется на силиконовом носителе
спин-колонки, тогда как примеси (различной природы) отделяются промыванием. На последней стадии происходит элюция плазмидной ДНК с
носителя.
1.0
Визуализация с помощью электрофореза в
1.2% TAE агарозе плазмидной ДНК длиной
4.8 т.п.о. (дорожка 1) и 4.0 т.п.о. (дорожка 2),
выделенной из 5 мл культуры E. coli с помощью набора Plasmid Miniprep. (М) Маркер
длин ДНК 1 kb DNA Ladder (кат. #NL001).
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Длительность процедуры: 20-25 минут.
Набор Plasmid Miniprep содержит спин-колонки, позволяющие получать
до 30 мкг плазмидной ДНК из 1-10 мл культуры E. coli. В набор входит
дополнительный раствор для очистки образцов от эндотоксинов, который
рекомендуется использовать при выделении плазмидной ДНК для последующей трансфекции клеток эукариот.
1
т.п.о.
Набор Plasmid Midiprep содержит спин-колонки, позволяющие получать до
350 мкг плазмидной ДНК из 20-50 мл культуры E. coli.
Продукт
Состав
Кат.#
Набор Plasmid Miniprep
Спин-колонки, 50 шт
Собирательные пробирки на 2 мл (без крышки), 50 шт
РНКаза А (лиофилизированная), 1.5 мг
Ресуспендирующий раствор, 14 мл
Лизирующий раствор, 14 мл
Нейтрализующий раствор, 19 мл
Промывочный раствор (концентрат), 9 мл
Элюирующий раствор, 2 х 1.5 мл
Раствор для удаления эндотоксинов, 11 мл
BC021
на 50 выделений
Количество
Набор Plasmid Midiprep
Спин-колонки, 25 шт
РНКаза А (лиофилизированная), 21.5 мг
Ресуспендирующий раствор, 200 мл
Лизирующий раствор, 200 мл
Нейтрализующий раствор, 2 x 140 мл
Промывочный раствор (концентрат), 2 x 32 мл
Элюирующий раствор, 30 мл
BC024
на 25 выделений
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
9
Генная инженерия : Выделение, очистка и электрофорез нуклеиновых кислот
Наборы для очистки ДНК из геля и реакционных смесей
Наборы предназначены для быстрой очистки любых видов двухцепочечной
ДНК из агарозного геля и реакционных смесей (смесь для ПЦР, реакции
рестрикции, лигирования и т.д.).
M
0.25 0.5
1.0
2.5
5.0 8.0
т.п.о.
Длительность процедуры: 15-25 минут.
Очищенная ДНК может быть использована в любых молекулярно-биологических приложениях.
3.0
Основные свойства наборов:
- пригодны для выделения ДНК из любых ферментативных реакционных
смесей и всех типов агарозы (концентрация геля может достигать 2-3%)
- пригодны для очистки ДНК размером от 70 до 10000 п.о.
- нет необходимости в удалении минерального масла при очистке ПЦРпродукта
1.0
Набор Cleanup Standard поставляется со стандартными спин-колонками,
позволяющими выделять до 25 мкг ДНК.
Набор Cleanup Mini содержит спин-колонки с уменьшенным размером
фильтра и рекомендован для получения высококонцентрированных образцов ДНК. Емкость одной колонки – не менее 5 мкг ДНК.
Визуализация с помощью электрофореза результатов очистки ДНК фрагментов разной
длины из 1.2% агарозного геля с помощью
набора Cleanup Standard. Длина фрагментов
(т.п.о.) указана над дорожкой. (M) Маркер
длин ДНК 1 kb DNA Ladder (кат. # NL001).
Продукт
Состав
Кат.#
Набор Cleanup Standard
Спин-колонки, 50 шт
Собирательные пробирки на 2 мл (без крышки), 50 шт
Связывающий раствор, 30 мл
Промывочный раствор (концентрат), 9 мл
Элюирующий раствор, 2 x 1.5 мл
BC022
на 50 выделений
Количество
Набор Cleanup Mini
Мини спин-колонки, 50 шт
Собирательные пробирки на 2 мл (без крышки), 50 шт
Связывающий раствор, 30 мл
Промывочный раствор (концентрат), 9 мл
Элюирующий раствор, 1.5 мл
BC023
на 50 выделений
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Линейный полиакриламид с ковалентно пришитым красителем Satellite red
предназначен для повышения эффективности переосаждения нуклеиновых
кислот этанолом. Интенсивный красный цвет соосадителя (максимум поглощения красителя в видимой области спектра – 520 нм) обеспечивает
легкую визуализацию осадка, что позволяет избежать потерь целевого продукта при переосаждении.
Основные свойства соосадителя:
- эффективен для переосаждения ДНК и РНК, а также синтетических олигонуклеотидов длиной более 50 н.о.
- не содержит примесей, влияющих на сохранность ДНК и РНК
- не влияет на эффективность ферментативных реакций
- не влияет на эффективность трансформации и рост бактерий
- не обладает флуоресценцией и может быть использован для переосаждения ДНК при подготовке проб для автоматического секвенатора
Оптическая плотность, о.е.
Соосадитель нуклеиновых кислот Satellite Red
1.2
видимая область
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
250 300 350 400 450 500 550 600 650
Длина волны, нм
Спектр поглощения соосадителя Satellite red.
Продукт
Состав
Кат.#
Соосадитель Satellite Red
Раствор соосадителя Satellite Red, 100 мкл
BC001
Количество
на 100 процедур
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
10
Евроген, Каталог 2013/14
Маркеры длин ДНК
Маркеры длин ДНК – стандарты для определения длины двухцепочечных
молекул ДНК при анализе с помощью электрофореза в агарозном геле.
Маркеры состоят из фрагментов двухцепочечной ДНК строго определенной
длины. Все фрагменты имеют "тупые концы".
Маркеры могут быть также использованы для приблизительной оценки концентрации ДНК в образце путем сравнения интенсивности полосы образца
с полосой маркера той же длины.
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Маркеры поставляются с буфером для нанесения на гель, содержащим красители бромфеноловый синий и ксиленцианол.
1 kb DNA Ladder состоит из 13 фрагментов ДНК в диапазоне 25010000 п.о. Фрагменты 1000 и 3000 п.о. содержатся в более высокой концентрации, чем остальные, и могут быть легко идентифицированы на геле.
100+ bp DNA Ladder состоит из 9 фрагментов ДНК в диапазоне 1001000 п.о. и дополнительного фрагмента 1500 п.о. Фрагмент 500 п.о. содержится в более высокой концентрации, чем остальные, и может быть легко
идентифицирован на геле.
50+ bp DNA Ladder состоит из 9 фрагментов ДНК в диапазоне 50-500 п.о.
и дополнительного фрагмента 700 п.о. Фрагменты 300, 500 и 700 п.о. имеют увеличенную концентрацию и могут быть легко идентифицированы на
геле.
а масса
б масса
в масса
фрагмент
фрагмент
фрагмент
нг*
п.н.
40
40
40
40
40
10000
8000
6000
5000
4000
80
40
3000
2500
40
2000
40
1500
80
1000
40
750
40
нг*
п.н.
40
1500
51
46
41
41
30
81
1000
900
800
700
600
500
36
400
50
300
44
200
500
40
40
100
нг*
п.н.
75
700
55
500
43
43
65
44
400
350
300
250
44
200
44
150
43
100
44
50
250
1 kb DNA Ladder
100+ bp DNA Ladder
50+ bp DNA Ladder
Визуализация маркеров с помощью гель-электрофореза в TAE-агарозе.
(а) 1 kb DNA Ladder (0.6 мкг на дорожку, 1% агароза); (б) 100+ bp DNA Ladder (0.5 мкг на
дорожку, 2% агароза); (в) 50+ bp DNA Ladder (0.5 мкг на дорожку, 2% агароза).
Продукт
Состав
Кат.#
Количество
Маркер длин ДНК
1 kb DNA Ladder
Маркер длин ДНК 1 kb DNA Ladder (200 мкг/мл), 200 мкл
4X буфер для нанесения проб, 1.5 мл
NL001
40 мкг
Маркер длин ДНК
100+ bp DNA Ladder
Маркер длин ДНК 100+ bp DNA Ladder
(200 мкг/мл), 200 мкл
4X буфер для нанесения проб, 1.5 мл
NL002
40 мкг
Маркер длин ДНК
50+ bp DNA Ladder
Маркер длин ДНК 50+ bp DNA Ladder
(200 мкг/мл), 200 мкл
4X буфер для нанесения проб, 1.5 мл
NL003
40 мкг
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
11
Синтез кДНК и ОТ-ПЦР
Обратные транскриптазы MMLV и Mint
Мы предлагаем наборы реактивов для обратной транскрипции на основе
высокоочищенной рекомбинантной MMLV ревертазы дикого типа и на основе модифицированной ревертазы Mint.
MMLV ревертаза позволяет синтезировать первую цепь кДНК длиной до
5 т.п.о. Фермент обладает слабой активностью РНКазы H.
Mint ревертаза полностью лишена активности РНКазы Н и обеспечивает высокий выход первой цепи кДНК длиной до 7.5 т.п.о. Особенностью
Mint ревертазы является способность после завершения синтеза молекулы кДНК нематрично присоединять к ее 3’-концу 3-5 дезоксинуклеотидов
(преимущественно C). Это позволяет использовать Mint ревертазу для
синтеза обогащенных полноразмерными последовательностями образцов
кДНК (описание технологии – страница 81) и клонирования 5’-концов
кДНК (5’-RACE) методом синтеза со сменой матрицы (описание технологии – страница 83).
Основные свойства обратных транскриптаз
Обратная транскриптаза
MMLV ревертаза
Mint ревертаза
Активность РНКазы H
слабая
нет
Температурный диапазон
37-45°C
37-45°C
Максимальная длина синтеза
5 т.п.о.
7 т.п.о.
Способность к синтезу со
сменой матрицы *
нет
да
Количество РНК на реакцию синтеза кДНК (минимальное / рекомендуемое)
Тотальная РНК, синтез первой
цепи кДНК **
3-5 нг / 0.25-2 мкг
3-5 нг / 0.25-2 мкг
Поли(А)+ РНК, синтез первой
цепи кДНК **
0.5-1 нг / 0.05-1 мкг
0.5-1 нг / 0.05-1 мкг
Тотальная РНК, синтез кДНК со
сменой матрицы ***
–
3-5 нг / 0.25-2 мкг
Поли(А)+ РНК, синтез кДНК со
сменой матрицы ***
–
0.2-0.3 нг / 0.1-1 мкг
* описание технологии – страница 81.
** по результатам синтеза первой цепи кДНК с олиго(dT)-праймера в реакции объёмом 10 мкл и
дальнейшей ПЦР-амплификации с полученной первой цепи гена G3PDH.
*** по результатам синтеза двухцепочеченой кДНК с использованием набора реактивов Mint
(кат. #SK001).
Продукт
Состав
Кат.#
Количество
Обратная транскриптаза
MMLV
MMLV ревертаза, 100 мкл (100 eд./мкл)
5X буфер для синтеза первой цепи, 1 мл
DTT (20 мМ), 500 мкл
Буфер для разведения MMLV ревертазы, 500 мкл
SK022
100 р-ций по 20 мкл
Обратная транскриптаза
Mint
Mint ревертаза, 100мкл (200 ед./мкл)
5X Mint буфер, 220 мкл
DTT (20 мМ), 110 мкл
Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов
(10 мМ каждого), 110 мкл
Вода, свободная от РНКаз, 1.8 мл
SK003
20000 ед.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
12
Евроген, Каталог 2013/14
Набор MMLV RT kit
Олиго(dT) праймер используют только в случае полиаденилированной РНК
матрицы для количественной оценки содержания 3’-концевых фрагментов
транскриптов методом ОТ-ПЦР.
Случайный декануклеотидный праймер применяют для синтеза небольших
(до 1000 п.о.) фрагментов кДНК на любой РНК-матрице, в том числе на
неполиаденилированной РНК или частично деградированной РНК. Например, возможно использование случайного праймера для количественной
оценки методом ОТ-ПЦР содержания фрагментов транскрипта, удаленных
от 3’-конца более, чем на 2 т.п.о., или для приготовления кДНК-зондов и
обогащения образцов кДНК 5’-концевыми последовательностями.
M
Олиго(dT)
Random(dN)10
т.п.о.
3.0
1.0
А
Б
А
Б
Продукты амплификации фрагментов гена
IGF2R человека с матрицы первой цепи
кДНК, синтезированной с использованием
олиго(dT) праймера или случайной затравки Random(dN)10 . Электрофорез в 1.5% TAE
агарозе. Фрагмент А (680 п.о.) расположен в
3’-концевой области гена на расстоянии за
200 п.о. от поли(А) последовательности; фрагмент Б (1700 п.о.) удален на 4 000 п.о. от
3’-конца. (М) Маркер длин ДНК 1 kb DNA
Ladder (кат. #NL001).
Продукт
Состав
Кат.#
Набор реактивов для
синтеза первой цепи кДНК
MMLV RT kit
MMLV ревертаза, 50 мкл (100 eд./мкл)
5X буфер для синтеза первой цепи, 220 мкл
DTT (20 мМ), 110 мкл
Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (10 мМ каждого),
110 мкл
Олиго(dT) праймер (20 мкМ), 50 мкл
Случайный декануклеотидный праймер (20 мкМ), 50 мкл
Буфер для разведения MMLV ревертазы, 500 мкл
Вода, свободная от РНКаз, 1.8 мл
SK021
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Набор предназначен для синтеза первой цепи кДНК и содержит MMLV ревертазу, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, стерильную воду, олиго(dT)
и случайный декануклеотидный праймер. Набор может быть использован
для синтеза кДНК с различных РНК-матриц, в том числе и неполиаденилированных.
Количество
50 р-ций по 20 мкл
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
OneTube RT-PCRmix
2X реакционная смесь OneTube RT-PCRmix предназначена для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР в одной пробирке (ОТ-ПЦР) и
обеспечивает эффективную амплификацию фрагментов длиной до 1.5 т.п.о.
Исходной матрицей для синтеза первой цепи может служить суммарная или
поли(A)+ РНК.
В состав смеси входят следующие компоненты: MMLV ревертаза (см. страницу 12), Encyclo полимераза (см. страницу 19) и универсальный буфер
для ОТ-ПЦР.
При использовании смеси OneTube схема синтеза и амплификации кДНК
сокращается до одной стадии. Это уменьшает трудозатраты при постановке большого количества реакций, позволяет свести к минимуму вариации
в составе реакционной смеси и снижает вероятность контаминации при
смешивании компонентов реакции обратной транскрипции и последующей
ПЦР.
Продукты реакции могут быть клонированы в pAL-TA вектор (кат. #TA001).
А
OT
Б
K
1.35
OT
В
K
0.90
OT
Г
K
0.38
OT
K
M
0.34
Продукты амплификации фрагментов генов с
помощью OneTube RT-PCRmix (ОТ) или по
классической двухстадийной схеме синтеза и
амплификации кДНК (К). (А) рецептор трансферрина; (Б) рецептор интерферона ; (В) p53;
(Г) 2-микроглобулин. (M) Маркер длин ДНК
100+ bp DNA Ladder (кат. # NL002). Длина
амплифицируемых фрагментов (т.п.о.) указана
под дорожками. Электрофорез в 1.5% TAEагарозе.
Продукт
Состав
Кат.#
OneTube RT-PCRmix
2X OneTube RT-PCRmix, 200 мкл
Вода, свободная от РНКаз, 1.8 мл
SK031
Количество
20 р-ций по 20 мкл
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
13
Генная инженерия : Синтез кДНК и ОТ-ПЦР
Наборы реактивов Mint для синтеза кДНК
Наборы реактивов Mint и Mint-2 предназначены для приготовления первой
цепи и двухцепочечной амплифицированной кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями, на основе тотальной или поли(А)+
РНК. Синтез осуществляется методом синтеза кДНК со сменой матрицы
(описание технологии – страница 81). Получаемая кДНК содержит известные последовательности адаптеров на обоих концах.
Минимальное стартовое количество РНК для синтеза первой цепи кДНК
составляет 3-5 нг тотальной или 0.2-0.3 нг поли(А)+ РНК. Для достижения
наилучшего результата рекомендуется использовать 0.25-2 мкг тотальной
РНК или 0.1-1 мкг поли(А)+ РНК.
кДНК, полученная с помощью набора Mint, может быть использована для
приготовления ненаправленных библиотек кДНК, супрессионной вычитающей гибридизации (SSH), нормализации с помощью набора реактивов
Trimmer-2 (кат. # NK003, см. страницу 29), быстрой амплификации 3’- и
5’-концевых фрагментов полноразмерных транскриптов с помощью набора
реактивов Mint RACE ptimer set (кат. # SK004, см. страницу 24) и других
приложений.
M
1
2
3
4
5
6
7
т.п.о.
3.0
1.0
Визуализация с помощью гель-электрофореза
в агарозе кДНК, синтезированной с помощью
набора Mint-2 на основе тотальной РНК из
различных источников: (1) личинка комара;
(2) печень мыши образец 1; (3) клеточная линия
HEK 293; (4) мозжечок мыши; (5) печень мыши
образец 2; (6) плацента человека; (7) клеточная линия OVCAR-3. (М) Маркер длин ДНК
1 kb DNA Ladder (кат. #NL001).
Набор Mint-2 содержит дополнительные адаптеры, позволяющие приготовить кДНК для последующего секвенирования на платформах Roche/454,
ABI/SOLiD или Illumina/Solexa и для направленного клонирования библиотек кДНК.
Продукт
Состав
Кат.#
Количество
Набор для синтеза кДНК
Mint
Mint ревертаза, 20 мкл (200 ед./мкл)
5X Mint буфер, 80 мкл
DTT (20 мМ), 30 мкл
Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов
(10 мМ каждого), 80 мкл
PlugOligo адаптер (15 мкМ), 25 мкл
3’-праймер (10 мкМ), 25 мкл
IP смесь, 130 мкл
Контрольная тотальная РНК (0.5 мкг/мкл), 15 мкл
ПЦР праймер М1 (10 мкМ), 100 мкл
50X смесь полимераз Encyclo, 50 мкл
10X Encyclo буфер, 300 мкл
Вода, свободная от РНКаз, 1.8 мл
SK001
20 р-ций по 10 мкл
Набор для синтеза кДНК
Mint-2
Mint ревертаза, 20мкл (200 ед./мкл)
5X Mint буфер, 80 мкл
DTT (20 мМ), 30 мкл
Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов
(10 мМ каждого), 120 мкл
Смесь праймеров 454 PCR Primer mix
(10 мМ каждого), 100 мкл
PlugOligo-1 адаптер (15 мкМ), 25 мкл
PlugOligo-3M адаптер (15 мкМ), 25 мкл
CDS-1 адаптер (10 мкМ), 25 мкл
CDS-Gsu адаптер (10 мкМ), 25 мкл
CDS-4M адаптер (10 мкМ), 25 мкл
IP смесь, 130 мкл
Контрольная тотальная РНК (0.5 мкг/мкл), 30 мкл
ПЦР праймер М1 (10 мкМ), 150 мкл
50X смесь полимераз Encyclo, 100 мкл
10X Encyclo буфер, 600 мкл
Вода, свободная от РНКаз, 2 x 1.8 мл
Образцы контрольной кДНК для электрофореза
SK005
20 р-ций по 10 мкл
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
14
Евроген, Каталог 2013/14
Синтез и амплификация кДНК на заказ
Технология синтеза кДНК зависит от научно-исследовательской задачи и
стартового материала, предоставляемого заказчиком.
M
1
2
3
4
5
6
т.п.о.
Синтез и амплификация кДНК для ру тинных приложений
Получаемая кДНК обогащена полноразмерными последовательностями
и фланкирована на концах известными адаптерами. Выбор последовательностей адаптеров осуществляется в зависимости от планируемого
использования кДНК. Возможно приготовление кДНК с использованием
нестандартных адаптеров.
В случае целесообразности мы предложим дополнительные услуги, например:
- конструирование библиотек кДНК (см. страницу 27)
- нормализация кДНК: выравнивание концентрации разнопредставленных транскриптов в образцах кДНК (см. страницу 29)
- деплеция кДНК: удаление известных последовательностей транскриптов из образцов кДНК перед функциональным скринингом (см. страницу
31)
- вычитающая гибридизация кДНК: обогащение образца дифференциальными последовательностями (см. страницу 33)
5.0
3.0
1.0
Визуализация с помощью гель-электрофореза
в ТАЕ-агарозе кДНК, полученной с помощью
технологии Mint на основе тотальной РНК
из различных источников: (1) печень мыши;
(2) скелетная мышца мыши; (3) мозг мыши;
(4) лейкоциты человека; (5) легкое человека;
(6) скелетная мышца человека. (M) Маркер
длин ДНК 1 kb DNA Ladder (СибЭнзим).
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Приготовление кДНК для конструирования библиотек кДНК, амплификации целевых транскриптов, RACE, вычитающей гибридизации и других
приложений осуществляется на основе суммарной или поли(А)+ РНК эукариот по методу синтеза со сменой матрицы (см. описание технологии на
странице 81).
Синтез и амплификация кДНК
для массированного секвенирования
Сервис включает приготовление образцов кДНК для массированного секвенирования по технологии RNA-seq или методом синтеза кДНК со сменой
матрицы. Схема приготовления кДНК зависит от от стартового материала и
может осуществляться как с использованием в качестве затравки олиго(dT)
или случайного праймера (см. описание технологий на странице 81).
В случае целесообразности мы предложим дополнительные услуги, например:
- нормализация кДНК: выравнивание концентрации разнопредставленных транскриптов в образцах кДНК для повышения эффективности
секвенирования (см. страницу 29)
- деплеция рибосомальной кДНК: удаление избытка последовательностей
рибосомальной и транспортной РНК из образцов кДНК для повышения
эффективности анализа профилей экспрессии генов (см. страницу 31)
- секвенирование кДНК на платформах Illumina, Roche 454, Ion Torrent
(см. страницу 6)
При необходимости мы поможем разработать индивидуальный дизайн библиотек для секвенирования с применением нестандартных праймеров.
www.evrogen.ru
15
Генная инженерия : Синтез кДНК и ОТ-ПЦР
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
Срок
выполнения
Синтез и
амплификация
кДНК
Приготовление кДНК, обогащенной
полноразмерными последовательностями
для широкого круга приложений:
секвенирования на секвенаторах 454,
Illumina и ABI SOLiD, клонирования
библиотек кДНК, вычитающей
гибридизации, RACE и т.д. Подбор
фланкирующих ДНК адаптеров,
оптимальных для решения конкретной научно-исследовательской задачи
CS030
Тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
1-2 недели
Синтез и
амплификация
кДНК.
Подготовка кДНК
к секвенированию
Синтез кДНК с использованием
олиго(dT)-праймера и метода синтеза кДНК
со сменой матрицы. Подготовка кДНК
для секвенаторов, совместимых с TruSeq
(Illumina).
NGP30-1A-ILMN
Тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
3-5 недели
Синтез кДНК по технологии RNA-seq с
рассеянной затравки. Подготовка кДНК
для секвенаторов, совместимых с TruSeq
(Illumina).
NGP30-2D-ILMN
Поли(А)+ РНК эукариот
3-5 недели
Синтез кДНК по технологии RNA-seq с
рассеянной затравки. Подготовка кДНК
для секвенаторов, совместимых с TruSeq
(Illumina).
Обратите внимание: для повышения
эффективности секвенирования строго
рекомендуется удаление избытка копий
рРНК и тРНК (см. страницу 31)
NGP30-2E-ILMN
Тотальная РНК прокариот
3-5 недели
Дополнительные услуги
Выделение тотальной РНК из тканей
+1 неделя
Наработка кДНК в препаративных количествах (до 30 мкг)
+ 1 день
Массированное секвенирование кДНК (страница 6)
+ 4-12 недель
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
16
Евроген, Каталог 2013/14
ПЦР амплификация и клонирование
Высокоэффективные термостабильные ДНК полимеразы оптимизированы
для решения различных исследовательских задач. Полимеразы комплектуются 10Х ПЦР буфером. В состав наборов, кроме буфера и полимеразы,
входят высокоочищенные дезоксинуклеозидтрифосфаты.
Для контроля качества полимераз рекомендуется использовать универсальный набор контрольных образцов для амплификации PCR Control set (кат.
# PK104, см. страницу 23), в состав которого входят специфические праймеры и матрица для амплификации.
Для наиболее популярных приложений ПЦР (амплификация большого числа образцов, ПЦР в режиме реального времени) разработаны готовые
смеси. Список готовых смесей можно найти на странице 22.
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
Threshold
0
-0.2
0
4
8
12 16 20 24 28
Количество циклов ПЦР
Результат ПЦР-амплификации в реальном
времени контрольной ДНК-матрицы с использованием различных ДНК-полимераз. Голубая
линия – готовая смесь qPCRmix-HS; синяя –
HS Taq ДНК полимераза; оранжевая – Encyclo
полимераза; красная – SNPdetect полимераза; зеленая – Taq ДНК полимераза; лиловая –
Tersus полимераза.
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Флуоресценция (dRn)
Термостабильные ДНК полимеразы и
наборы реактивов для ПЦР
Основные свойства полимераз
Taq ДНК
полимераза
HS Taq ДНК
полимераза
Экзонуклеазная активность
5’-> 3’
5’-> 3’
Горячий старт
нет
95°C, 1 мин
Специфичность
+
SNPdetect
полимераза
Encyclo
полимераза
Tersus
полимераза
InBlood
полимераза
3’-> 5’
3’-> 5’
3’-> 5’
95°C, 1 мин
95°C, 1 мин
95°C, 1 мин
95°C, 1 мин
++++
++++
+++
++++
+++
–
Точность синтеза
+
+
++++
+++
++++
+++
Оптимальный размер
ампликонов
2-3 т.п.о.
2-3 т.п.о.
до 350 п.о.
до 7 т.п.о.
до 3 т.п.о.
до 1.5 т.п.о. (с крови)
Максимальный размер
ампликонов
5 т.п.о.
5 т.п.о.
1 т.п.о.
20 т.п.о.
15-20 т.п.о.
3.5 т.п.о. (с крови)
Клонирование в ТА-вектор
++++
++++
++++
+++
+++
+++
ПЦР в реальном времени с
интеркалирующими
красителями
+
++++
++++
++
++
–
ПЦР в реальном времени с
TaqMan пробами
+
++++
–
–
–
–
Аллель-специфичная ПЦР
+
++
++++
–
–
–
Амплификация
низкокопийных матриц
+
++
++
++++
+++
++
Сравнение полимераз в модельных экспериментах
Taq ДНК
полимераза
HS Taq ДНК
полимераза
SNPdetect
полимераза
Encyclo
полимераза
Tersus
полимераза
InBlood
полимераза
Минимальное кол-во
геномной ДНК на реакцию*
200 пг
200 пг
50 пг
10 пг
50 пг
1% крови
Рекомендуемое кол-во
геномной ДНК на реакцию
10-100 нг
10-100 нг
10-500 нг
1-100 нг
10-500 нг
5-10% крови
Рекомендуемое кол-во
амплифицированной ДНК и
кДНК на реакцию
0.01-10 нг
0.01-10 нг
0.001-10 нг
0.001-10 нг
0.001-10 нг
–
Рекомендуемое кол-во
1-10 нг
плазмидной ДНК на реакцию
1-10 нг
0.001-1 нг
0.001-1 нг
0.001-1 нг
–
Значение порогового цикла
реакции (Ct)**
25
30
24
30
–
25
* по результатам амплификации фрагмента гена HAX1 человека (357 п.о.).
** по результатам амплификации в режиме реального времени фрагмента гена DKC1 (230 п.о.) с 20 нг геномной ДНК человека.
www.evrogen.ru
17
Генная инженерия : ПЦР амплификация и клонирование
Taq ДНК полимераза
Taq ДНК полимераза – фермент термофильной бактерии Thermus aquaticus
YT1, выделенный из рекомбинантного штамма E. coli и предназначенный
для широкого круга рутинных аналитических исследований.
Длина фрагмента, который возможно амплифицировать с помощью Taq
ДНК полимеразы, зависит от природы и качества ДНК-матрицы. В оптимальных условиях она может достигать 5 т.п.о.
Область применения
- амплификация фрагментов ДНК до 5 т.п.о.
- ПЦР-скрининг
- ник-трансляция
- включение в ДНК меченых нуклеотидов
- ПЦР в режиме реального времени
HS Taq ДНК полимераза
HS Taq ДНК полимераза – cмесь высокоочищенной рекомбинантной Таq
ДНК полимеразы и специфических моноклональных антител. Антитела обеспечивают возможность автоматического горячего старта ПЦР – активация
полимеразы происходит только после диссоциации комплекса полимеразы
с антителом в результате повышения температуры выше +70°C в первом
цикле реакции. Таким образом, фермент остается неактивным в течение
всего времени приготовления и первого нагрева реакционной смеси, что
существенно повышает чувствительность и специфичность ПЦР.
а
б
М
1
2
М
т.п.о.
т.п.о.
3.0
3.0
1.0
1.0
1
2
Сравнение специфичности и эффективности
амплификации фрагментов ДНК из геномной
ДНК человека с помощью Тaq ДНК полимеразы (1) или HS Тaq ДНК полимеразы (2):
(а) фрагмент длиной 1600 п.о.; (б) фрагмент
длиной 340 п.о. 30 циклов ПЦР, 5 нг ДНК матрицы на старт, 1.5% ТАЕ-агароза. (M) Маркер
длин ДНК 1 kb DNA Ladder (СибЭнзим).
Область применения
- амплификация фрагментов ДНК до 5 т.п.о.
- высокоспецифичная ПЦР
- высокочувствительная ПЦР
- мультиплекс ПЦР
- ПЦР в режиме реального времени
Продукт
Состав
Кат.#
Taq ДНК полимераза
Taq ДНК полимераза (5 ед./мкл), 5 x 100 мкл
10X Буфер для амплификации, 5 x 1.5 мл
PK013
2000 реакций по 25 мкл
Taq ДНК полимераза (5 ед./мкл), 5 x 100 мкл
10X буфер для амплификации, 5 x 1.5 мл
50X смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов для ПЦР
(10 мМ каждого), 5 x 200 мкл
PK014
2000 реакций по 25 мкл
HS Taq ДНК полимераза (5 ед./мкл), 5 x 100 мкл
10X буфер для амплификации, 5 x 1.5 мл
PK015
2000 реакций по 25 мкл
HS Taq ДНК полимераза (5 ед./мкл), 5 x 100 мкл
10X буфер для амплификации, 5 x 1.5 мл
50X смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов для ПЦР
(10 мМ каждого), 5 x 200 мкл
PK016
2000 реакций по 25 мкл
HS Taq ДНК полимераза
Количество
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
18
Евроген, Каталог 2013/14
Область применения
- высокоточная амплификация фрагментов ДНК до 1000 п.о.
- анализ SNP: аллель-специфичная ПЦР (AS-PCR), аллель-специфичное
удлинение праймера (АS-PEX), минисеквенирование
- высокоспецифичная ПЦР, в том числе мультиплекс ПЦР
- ПЦР в реальном времени с интеркалирующими красителями (SYBR
Green и др.)
Гетерозигота (CT)
Гомозигота (CC)
0 10 20 30 40
Количество циклов
0 10 20 30 40
Количество циклов
1
0
Анализ С/Т полиморфизма в гене KIR3 человека с использованием SNPdetect полимеразы. Аллель-специфичная ПЦР на матрице
геномной ДНК (5 нг) с аллель-специфичными
праймерами: «С-вариант» – красные линии;
«Т-вариант» – черные линии.
Продукт
Состав
Кат.#
SNPdetect полимераза
50X SNPdetect полимераза (10 ед./мкл), 100 мкл
10X буфер для амплификации, 600 мкл
10X буфер для амплификации без Mg2+ , 600 мкл
50 мМ MgCl2 , 300 мкл
PK022
Ге н н а я и н ж е н е р и я
SNPdetect полимераза позволяет синтезировать ДНК из дезокси- и дидезоксинуклеотидов и не имеет 5’->3’ и 3’->5’ экзонуклеазной активности.
Флуоресценция (dRn)
SNPdetect полимераза
Высокоточная полимераза с горячим стартом SNPdetect разработана для
детекции однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Фермент также может
быть использован для высокоточной амплификации коротких фрагментов
ДНК.
Количество
2000 реакций по 25 мкл
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Encyclo полимераза
Смесь термостабильных ДНК полимераз с горячим стартом Encyclo разработана для эффективной амплификации длинных фрагментов ДНК с
широкого спектра матриц.
Encyclo полимераза обладает высокопроцессивной 5’->3’ ДНК полимеразной активностью и корректирующей 3’->5’ экзонуклеазной активностью.
Область применения
- амплификация фрагментов ДНК до 20 т.п.о.
- амплификация сложных смесей ДНК, образцов тотальной кДНК
- ПЦР с малых количеств ДНК
- амплификация низкокопийных последовательностей со сложных матриц
(геномная ДНК, первая цепь кДНК и т.п.)
M
2.9
5
8
10
15
20
т.п.о.
10.0
8.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
Визуализация с помощью гель-электрофореза
в агарозе продукта ПЦР амплификации фрагментов ДНК фага с помощью набора Encyclo
PCR kit. Длина фрагментов указана над дорожками. (M) Маркер длин ДНК 1 kb DNA Ladder
(СибЭнзим).
Продукт
Состав
Кат.#
Количество
Набор реактивов
Encyclo Plus PCR kit
50X смесь полимераз Encyclo, 100 мкл
10X Encyclo буфер, 600 мкл
5X Encyclo-GC буфер*, 1.2 мл
5X Encyclo-Red буфер**, 1.2 мл
Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов
(10 мМ каждого), 120 мкл
Вода, свободная от РНКаз, 4.5 мл
PK101
200 реакций по 25 мкл
Encyclo полимераза
50X смесь полимераз Encyclo, 100 мкл
10X Encyclo буфер, 600 мкл
PK002S
200 реакций по 25 мкл
50X смесь полимераз Encyclo, 5 x 100 мкл
10X Encyclo буфер, 5 x 600 мкл
PK002L
1000 реакций по 25 мкл
* 5X Encyclo-GC – буфер для амплификации GC-богатых участков.
** 5X Encyclo-Red – буфер, содержащий красители и увеличивающие плотность пробы компоненты для нанесения продуктов ПЦР на гель.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
19
Генная инженерия : ПЦР амплификация и клонирование
Tersus полимераза
M
Смесь термостабильных ДНК полимераз с горячим стартом Tersus предназначена для высокоточной и специфичной амплификации фрагментов ДНК
с широкого спектра матриц.
1
2
3
т.п.о.
3.0
1.0
Tersus полимераза обладает высокопроцессивной 5’->3’ ДНК полимеразной активностью и корректирующей 3’->5’ экзонуклеазной активностью.
Высокая точность синтеза ДНК является главным свойством Tersus полимеразы. При ее использовании для амплификации фрагментов ДНК для
переклонирования удается существенно снизить затраты по дальнейшему
секвенированию при отборе клонов, не содержащих точечных замен.
Высокая специфичность полимеразы позволяет использовать ее при работе
со сложными матрицами, например, при амплификации высокогомологичных повторов, фрагментов геномной ДНК или кДНК.
Длина получаемых продуктов ПЦР зависит от свойств ДНК-матрицы (происхождения, GC-состава, структуры). При амплификации простых матриц
(плазмидная ДНК, ДНК фага , предварительно амплифицированные
фрагменты ДНК), Tersus полимераза позволяет получить фрагменты до 15
т.п.о., однако наилучшие результаты достигаются при амплификации фрагментов до 3 т.п.о.
Сравнение эффективности различных полимераз для амплификации фрагмента L1Hs повтора (230 п.н.) с геномной ДНК человека:
(1) Taq-полимераза; (2) Encyclo полимераза и
(3) Tersus полимераза. (M) Маркер длин ДНК
1 kb DNA Ladder (СибЭнзим). 5 нг геномной
ДНК, 28 циклов ПЦР.
Область применения
- высокоточная амплификация фрагментов ДНК для секвенирования и переклонирования
- высокоспецифичная ПЦР со сложных ДНК матриц
- сайт-направленный мутагенез
- ПЦР в реальном времени с интеркалирующими красителями (SYBR
Green и др.)
Продукт
Состав
Кат.#
Количество
Набор реактивов
Tersus Plus PCR kit
50X смесь полимераз Tersus, 100 мкл
10X Tersus буфер, 600 мкл
5X Tersus-GC буфер*Encyclo, 1.2 мл
5X Tersus-Red буфер**, 1.2 мл
Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов
(10 мМ каждого), 120 мкл
Вода, свободная от РНКаз, 4.5 мл
PK021
200 реакций по 25 мкл
Tersus полимераза
50X смесь полимераз Tersus, 100 мкл
10X Tersus буфер, 600 мкл
PK023S
200 реакций по 25 мкл
50X смесь полимераз Tersus, 5 x 100 мкл
10X Tersus буфер, 5 x 600 мкл
PK023L
200 реакций по 25 мкл
* 5X Tersus-GC – буфер для амплификации GC-богатых участков.
** 5X Tersus-Red – буфер, содержащий красители и увеличивающие плотность пробы компоненты для нанесения продуктов ПЦР на гель.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
20
Евроген, Каталог 2013/14
InBlood полимераза
InBlood полимераза позволяет получать единичные ампликоны длиной до
1.5 т.п.о., а также проводить мультиплекс ПЦР при концентрации крови в
реакционной смеси 1-20% (v/v). Наличие функции горячего старта обеспечивает InBlood полимеразе высокую чувствительность при низком уровне
неспецифической амплификации.
InBlood полимераза может быть использована для ПЦР амплификации
фрагментов ДНК из крови человека, млекопитающих (мышь, кошка, собака, крупный рогатый скот), а также некоторых видов птиц (куры, голуби). В
реакции с InBlood полимеразой может быть использована свежая или свежезамороженная кровь, кровь с антикоагулянтами (ЭДТА, цитрат натрия)
или кровь, хранящаяся на бумажных фильтрах.
InBlood полимераза устойчива к содержащимся в крови ингибиторам ПЦР.
Обладает 5’->3’ ДНК полимеразной активностью, небольшой корректирующей 3’->5’ экзонуклеазной активностью, не имеет 5’->3’ экзонуклеазной
активности.
Область применения
- ПЦР фрагментов ДНК до 1.5 т.п.о. с цельной крови
- мультиплекс ПЦР с цельной крови
а
M
5% 10% 15% 20% 25%
M
5% 10% 15% 20% 25%
т.п.о.
0.5
б
т.п.о.
3.0
1.0
Визуализация с помощью гель-электрофореза
в агарозе продуктов амплификации фрагментов ДНК человека из крови с помощью InBlood
полимеразы. Процентное содержание крови
(v/v) указано над дорожками. (а) Фрагмент гена SOX21, 373 п.о. (M) Маркер длин ДНК
100+ bp DNA Ladder (СибЭнзим); (б) фрагмент гена MHC, 1260 п.о. (M) Маркер длин
ДНК 1 kb DNA Ladder (СибЭнзим).
Продукт
Состав
Кат.#
Набор реактивов
InBlood PCR kit
50X InBlood полимераза (20 ед./мкл), 100 мкл
5X буфер для амплификации,
содержащий 17.5 мМ MgCl2 , 1.2 мл
50X смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (10 мМ
каждого), 120 мкл
50 мМ MgCl2 , 300 мкл
Вода, свободная от РНКаз, 1 мл
PK031
200 реакций по 25 мкл
InBlood полимераза
50X InBlood полимераза (20 ед./мкл), 100 мкл
5X буфер для амплификации,
содержащий 17.5 мМ MgCl2 , 1.2 мл
PK032
200 реакций по 25 мкл
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Смесь термостабильных ДНК полимераз с горячим стартом InBlood обеспечивает эффективную амплификацию фрагментов ДНК с использованием
цельной крови в качестве матрицы без предварительного выделения ДНК.
Количество
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
21
Генная инженерия : ПЦР амплификация и клонирование
Готовые смеси для ПЦР
Готовые смеси предназначены для рутинной амплификации большого числа
образцов и ПЦР в режиме реального времени.
а
б
Смеси приготовлены на основе Taq ДНК или HS Taq ДНК полимеразы.
Смеси содержат все компоненты для проведения ПЦР, при постановке реакции в смесь требуется добавить только праймеры, ДНК-матрицу и воду.
Готовые смеси уменьшают трудозатраты при постановке большого количества реакций и позволяют свести к минимуму вариации в составе
реакционной смеси.
б
40
Значение Ct
Норм. флуоресценция
1
0.8
0.6
0.4
threshold
0.2
30
25
0
0
35
Норм. флуоресценция
а
Визуализация с помощью гель-электрофореза
в 1,5% ТАЕ-агарозе продуктов ПЦР, полученных с использованием смеси ScreenMix:
(а) фотография геля в проходящем свете; (б) в
ультрафиолете.
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Количество циклов
20
0.002
0.02
0.2
2
20
Количество ДНК на старте (нг)
Результат ПЦР в режиме реального времени фрагмента гена HAX1 с использованием готовой
смеси для ПЦР qPCRmix-HS SYBR. В качестве матрицы использованы последовательные разведения геномной ДНК человека (20 нг; 2 нг; 0.2 нг; 20 пг; 2 пг на старт реакции).
(а) график нарастания флуоресценции в процессе амплификации (после сглаживания); (б) калибровочный график.
Продукт
Описание
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
400
500
600
700
Длина волны (нм)
Спектр возбуждения и эмиссии флуоресценции
ROX в реакционном буфере для ПЦР, pH 8,0.
Кат.#
Количество
Окрашенные смеси, облегчающие нанесение на гель продукта ПЦР
ScreenMix
ScreenMix-HS
5X окрашенная реакционная смесь для проведения
ПЦР-анализа большого количества образцов с
последующим анализом на гель-электрофорезе;
содержит Taq ДНК полимеразу*
5X окрашенная реакционная смесь с горячим стартом
(95°C, 2 мин) для проведения высокоспецифичной ПЦР
большого количества образцов с последующим анализом на
гель-электрофорезе; содержит HS Taq ДНК полимеразу*
PK041S
100 реакций по 25 мкл
PK041L
1000 реакций по 25 мкл
PK143S
100 реакций по 25 мкл
PK143L
1000 реакций по 25 мкл
PK145S
100 реакций по 25 мкл
PK145L
1000 реакций по 25 мкл
PK147S
100 реакций по 25 мкл
PK147L
1000 реакций по 25 мкл
PK149S
100 реакций по 25 мкл
PK149L
1000 реакций по 25 мкл
PK151S
100 реакций по 25 мкл
PK151L
1000 реакций по 25 мкл
Смеси для ПЦР в режиме реального времени
qPCRmix-HS
qPCRmix-HS SYBR
qPCRmix-HS ROX
qPCRmix-HS SYBR+ROX
5X реакционная смесь с горячим стартом для проведения
высокоспецифичной ПЦР большого количества образцов и
ПЦР в реальном времени с флуоресцентными зондами
(TaqMan пробы) или интеркалирующими красителями;
содержит HS Taq ДНК полимеразу*
5X реакционная смесь с горячим стартом для ПЦР в
режиме реального времени; содержит HS Taq ДНК
полимеразу* и интеркалирующий краситель SYBR Green I
5X реакционная смесь с горячим стартом для проведения
ПЦР в реальном времени; содержит HS Taq ДНК
полимеразу* и референсный краситель ROX
5X реакционная смесь с горячим стартом для проведения
ПЦР в реальном времени; содержит HS Taq ДНК
полимеразу*, интеркалирующий краситель SYBR Green I
и референсный краситель ROX
* Основные свойства полимераз приведены на странице 17.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
22
Евроген, Каталог 2013/14
Набор реактивов PCR Control set
Набор предназначен для быстрой проверки активности ДНК-полимеразы
методом ПЦР.
Состав
Кат.#
Набор реактивов
PCR Control set
Контрольная ДНК-матрица (плазмида), 50 мкл
Смесь праймеров (5 мкM каждого), 50 мкл
50X смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов
(10 мМ каждого), 25 мкл
Вода, свободная от РНКаз, 1.8 мл
PK104
Количество
50 реакций по 25 мкл
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Продукт
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
pAL-TA вектор
pAL-TA вектор предназначен для быстрого клонирования продуктов ПЦР
за счет выступающих на концах амплифицированных фрагментов ДНК дезоксиаденозиновых остатков.
Вектор является аналогом широко известного вектора pGEM-T Easy, однако намного более стабилен при хранении и выдерживает многократное
размораживание / замораживание без ощутимого снижения эффективности
клонирования.
Основные свойства
- клонирование продуктов ПЦР в вектор не требует предварительной ферментативной обработки ДНК
- возможно клонирование как индивидуальных амплифицированных
фрагментов ДНК, так и сложных смесей (например, библиотек кДНК)
- доступна бело-голубая селекция
- возможена амплификация вставок с использованием стандартной пары
праймеров
f1 ori
lac Z
Ampr
pAL-TA
вектор
Plac
pUC ori
Схема pAL-TA вектора, 3.0 т.п.н.
Ampr – ген устойчивости к ампициллину; P –
промотор; ori – ориджин репликации.
Продукт
Состав
Кат.#
Количество
pAL-TA вектор
Лиофилизированный вектор
TA001
20 реакций
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Компетентные клетки
Замороженные компетентные клетки E.coli штамм XL1-Blue предназначены для химической трансформации неочищенной лигазной смесью или
другой плазмидной ДНК, находящейся в умеренно солевом буфере.
Основные свойства
- высокая эффективность трансформации (1-5х107 cfu/мкг) большинством плазмидных и -векторов
- возможность бело-голубой селекции
Продукт
Состав
Кат.#
Количество
Компетентные клетки для
химической трансформации
Замороженные компетентные клетки, готовые к
применению согласно стандартным протоколам
CC001
10 х 100 мкл
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
23
Генная инженерия : ПЦР амплификация и клонирование
Прогулка по хромосоме (genome walking) на заказ
Сервис включает клонирование промоторов и других областей генов,
фланкирующих известную последовательность, клонирование полученных
фрагментов в бактериальный плазмидный вектор по выбору заказчика и секвенирование (описание технологии – страница 84).
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
Прогулка по хромосоме
(genome walking)
Определение последовательностей ДНК,
фланкирующих известную
последовательность, клонирование целевых
фрагментов ДНК в бактериальный вектор
CS035
Геномная ДНК
Срок
выполнения
договорной
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Быстрая амплификация
концевых фрагментов кДНК (RACE)
Наборы реактивов для RACE
Метод Step-Out RACE (описание технологии – стр. 83) является самым
быстрым и надежным на сегодняшний день способом получить данные о
структуре полноразмерного транскрипта, основываясь на минимальной информации о его последовательности (30-50 нуклеотидов).
IFNGR1
M
Набор реактивов Mint RACE cDNA amplification set содержит дополнительные реактивы для приготовления кДНК на матрице тотальной или
поли(А)+ РНК и ПЦР-амплификации.
3’
TFRC
5’
3’
HPRT1
5’
3’
т.п.о.
3.0
Метод не содержит трудоемких стадий лигирования адаптеров, клонирования и скрининга полноразмерных библиотек кДНК, и позволяет
изолировать целевые концевые фрагменты транскриптов за несколько раундов ПЦР-обогащения.
Набор праймеров Mint RACE primer set содержит смеси адаптерных
праймеров для проведения ПЦР-обогащения (до трех раундов) продукта амплификации целевыми последовательностями при эффективном
подавлении фоновой амплификации. Набор адаптирован для работы с
обогащенной полноразмерными последовательностями кДНК-матрицей,
приготовленной с помощью наборов для синтеза кДНК Mint или Mint-2
(кат. # SK001, SK005; см. страницу 14).
5’
2.0
1.0
Визуализация с помощью электрофореза в
1.5% TAE-агарозе ПЦР-продуктов, полученных в ходе 5‘- и 3‘- Step-Out RACE маркерных
генов. IFNGR1 – рецептор-1 интерферона- ;
TFRC – рецептор трансферрина; HPRT1 – гипоксантин фосфорибозилтрансфераза-1. Матрица – суммарная кДНК из плаценты человека.
(M) Маркер длин ДНК 1 kb DNA Ladder (Gibco
BRL).
Продукт
Состав
Кат.#
Набор реактивов Mint
RACE cDNA amplification
set
Набор праймеров Mint RACE primer set
Набор реактивов для синтеза кДНК Mint (стр. 14)
Набор для ПЦР Encyclo Plus PCR kit (стр. 19)
pAL-TA вектор для быстрого клонирования продуктов
ПЦР (стр. 23)
SKS02
20 реакций синтеза кДНК +
200 реакций амплификации
по 25 мкл +
20 реакций лигирования
Количество
Набор праймеров Mint
RACE primer set
25X смесь праймеров Step-out primer miх1, 200 мкл
25X смесь праймеров Step-out primer miх2, 200 мкл
25X смесь праймеров Step-out primer miх3, 200 мкл
Контрольный 3’-праймер (10 мкМ), 25 мкл
Контрольный 5’-праймер (10 мкМ), 25 мкл
Стерильная вода, 3 x 1.5мл
SK004
200 реакций по 25 мкл
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
24
Евроген, Каталог 2013/14
RACE и клонирование
полноразмерных транскриптов на заказ
Сервис включает клонирование 5’- и 3’-концевых последовательностей
кДНК целевых генов, сборку полноразмерных кДНК из полученных фрагментов, их клонирование в бактериальный вектор по выбору заказчика и
секвенирование.
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
RACE и клонирование
полноразмерных
транскриптов на заказ
Определение полной последовательности
транскрипта и клонирование полноразмерных
целевых кДНК в бактериальный вектор
CS033
Тотальная или поли(А)+
РНК
Срок
выполнения
договорной
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Идентификация последовательностей, фланкирующих известную последовательность транскрипта, осуществляется методом Step-Out RACE (описание технологии – стр. 83) при наличии информации о структуре кДНК (не
менее 50 п.о.) или пептида (не менее 20 аминокислот).
Дополнительные услуги
Выделение тотальной РНК из тканей
+1 неделя
Клонирование в нестандартный вектор
договорной
Наработка материала в препаративных количествах
договорной
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Субклонирование ДНК на заказ
Евроген предлагает услуги по субклонированию вставок ДНК из исходной
плазмиды в целевой вектор для получения экспрессионных конструкций,
модификации существующих векторов, создания химерных белков и т.д.
Соответствие полученного продукта исходному подтверждается секвенированием.
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
Срок
выполнения
Субклонирование ДНК
Переклонирование фрагментов ДНК из
исходной плазмиды в целевой вектор, полное
секвенирование вставки для выбора клона с
нуклеотидной последовательностью,
полностью совпадающей с предоставленной
заказчиком сиквенсовой информацией
CS032
Плазмидная ДНК,
содержащая целевой
фрагмент
договорной
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
25
Генная инженерия : ПЦР амплификация и клонирование
Амплификация и клонирование
фрагментов ДНК на заказ
Евроген осуществляет все виды работ по клонированию и амплификации
ДНК или кДНК. Возможно крупномасштабное приготовление материала
для ДНК-чипов или иных приложений.
Стандартный вариант услуги включает:
- синтез праймеров для ПЦР
- амплификация целевых фрагмента ДНК (кДНК) из биологического материала (плазмидная ДНК, геномная ДНК, амплифицированная кДНК)
- клонирование фрагмента в стандартный бактериальный вектор
- отбор целевой вставки секвенированием
- выделение плазмидной ДНК одного отобранного клона (3-5 мкг).
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
Срок
выполнения
Амплификация и
клонирование фрагментов
ДНК
ПЦР амплификация и клонирование
фрагментов ДНК или кДНК, секвенирование
вставки в одном направлении для выбора
клона, содержащего целевой фрагмент
CS031
Плазмидная ДНК,
геномная ДНК,
амплифицированная
кДНК, РНК,
биологический материал
договорной
ПЦР амплификация и клонирование
фрагментов ДНК или кДНК, полное
секвенирование вставки для выбора клона с
нуклеотидной последовательностью,
полностью совпадающей с предоставленной
заказчиком сиквенсовой информацией
CS031-2
Плазмидная ДНК,
геномная ДНК,
амплифицированная
кДНК, РНК,
биологический материал
договорной
Дополнительные услуги
Выделение тотальной РНК из тканей
+1 неделя
Клонирование в нестандартный вектор
договорной
Наработка материала в препаративных количествах
договорной
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
26
Евроген, Каталог 2013/14
Конструирование библиотек кДНК на заказ
Сервис включает синтез кДНК, обогащенной полноразмерным последовательностями, на основе тотальной или поли(А)+ РНК, приготовление
первичной библиотеки кДНК и ее амплификацию.
В ходе приготовления первичной библиотеки образец кДНК направленно
клонируют в стандартный плазмидный вектор по сайтам рестрикции SfiIA
– SfiIB, SrfI – NotI или AscI – NotI и трансформируют в E. coli. По желанию заказчика возможно клонирование с использованием других сайтов
рестрикции.
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Для амплификации первичные библиотеки рассевают в 5-8 плашках (25 x
25 см, примерно 105 колоний на плашку); клоны смывают LB-средой с ампициллином; к амплифицированным библиотекам добавляют глицерин до
конечной концентрации 17%.
Для контроля качества клонирования определяют процент рекомбинантов и
средний размер вставки для 22 случайно отобранных клонов.
Перед клонированием кДНК может быть подвергнута дополнительной обработке:
- нормализация кДНК: выравнивание концентрации разнопредставленных транскриптов в образцах кДНК (см. страницу 29)
- деплеция кДНК: удаление известных последовательностей транскриптов из образцов кДНК перед функциональным скринингом (см. страницу
31)
- вычитающая гибридизация кДНК: обогащение образца дифференциальными последовательностями (см. страницу 33)
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
Конструирование
стандартных библиотек
кДНК
Конструирование
направленно-клонированных
амплифицированных библиотек кДНК,
обогащенных полноразмерными
последовательностями. Библиотеки содержат
примерно 750000 независимых клонов.
CS040
Тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
Срок
выполнения
5-7 недель
Дополнительные услуги
Выделение тотальной РНК из тканей
Клонирование библиотек в вектор по выбору заказчика
+1 неделя
договорной
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
27
Нормализация, деплеция и вычитающая гибридизация
нуклеиновых кислот
Дуплекс-специфическая нуклеаза
Дуплекс-специфическая нуклеаза (ДСН) – термостабильный фермент, выделенный из гепатопанкреаса камчатского краба. ДСН специфически
гидролизует двухцепочечную ДНК и ДНК в составе ДНК-РНК дуплексов,
оставляя интактной одноцепочечную ДНК и РНК. Гидролитическая активность зависит от присутствия ионов двухвалентных металлов (например,
Mg2+ ).
1
2
3
4
ДНК фага
ДНК фага M13
ДСН может быть использована для удаления двухцепочечной ДНК из
сложных смесей нуклеиновых кислот, например, при нормализации или
деплеции образцов кДНК и ДНК, а также при определении длины выступающих теломерных концов.
Основные свойства ДСН:
- рекомендуемая концентрация ионов магния для большинства приложений – 5 мМ. Ингибируется в присутствии ЭДТА.
- субстратная специфичность: гидролизует ДНК в гибридах ДНК-ДНК
(минимальная длина спаренной последовательности субстрата 9-10
п.о.) и ДНК-РНК (минимальная длина спаренной последовательности
субстрата 15-20 п.о.)
- температурный оптимум: 55-65°C
- рН оптимум: 7-8
- рН стабильность: от 4 до 12
- устойчива к обработке протеиназой К (30 мин при 37°C )
- температурная стабильность:
Температура
60°C
70°C
80°C
90°C
Действие ДСН на одноцепочечный (ДНК фага M13) и двухцепочечный (ДНК фага )
ДНК-субстраты. Дорожки 1, 2 – отрицательный
контроль, инкубация в течение 5 мин при 70°C
ДНК фага M13 и смеси ДНК фага M13 и ДНК
фага соответственно, в отсутствие ДСН. Дорожки 3, 4 – инкубация смеси ДНК фага M13
и ДНК фага в присутствии ДСН при 70°C в
течение 1.5 мин и 5 мин соответственно.
Остаточная активность*, %
100
60
40
10
* Остаточная активность после 30-минутного прогревания
Продукт
Состав
Кат.#
Количество
Дуплекс-специфическая
нуклеаза (лиоф.)
Лиофилизированная дуплекс-специфическая нуклеаза
Буфер для хранения ДСН, 100 мкл
10Х ДСН буфер, 100 мкл
ДСН стоп-раствор, 500 мкл
Контрольная плазмидная ДНК (0.1 мкг/мл), 20 мкл
EA001
50 ед. Куница
EA002
100 ед. Куница
EA003
10 ед. Куница
Активность ДСН измеряют с помощью модифицированного метода Куница (Kunitz, 1950), где за единицу активности принимают кол-во фермента,
которое при добавлении к 50 мкг/мл ДНК из тимуса теленка приводит к увеличению абсорбции раствора на 0.001 единицу за минуту. Измерение
активности проводят при 25°C в 50мМ Tris-HCl буфере (pH 7.15), содержащем 5мМ MgCl2 .
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
28
Евроген, Каталог 2013/14
Нормализация кДНК
Технология нормализации основана на уникальных свойствах термостабильной дуплекс-специфической нуклеазы (ДСН) и кинетики гибридизации
нуклеиновых кислот в растворе. Метод не содержит низкоэффективных стадий физического отделения нормализованной фракции кДНК и позволяет
нормализовать как фрагментированную кДНК, так и кДНК, обогащенную
полноразмерными последовательностями (описание технологии – страница 87).
Набор реактивов Trimmer-2
Набор реактивов Trimmer-2 предназначен для нормализации двухцепочечной кДНК, приготовленной с помощью наборов Mint или Mint-2 (см.
страницу 14). После нормализации образцы кДНК могут быть использованы для конструирования библиотек кДНК или секвенирования, в том числе
на платформах Roche/454, ABI/SOLiD и Illumina/Solexa.
a
M
1
2
б
M
т.п.о.
т.п.о.
5.0
3.0
1
2
3.0
1.0
ACTB
1.0
т.п.о.
3.0
1.0
UBC
Результат нормализации кДНК: (а) визуализация с помощью гель-электрофореза в 1.2%
ТАЕ-агарозе ненормализованного (1) и нормализованного (2) образцов кДНК из плаценты
человека; (б) псевдо-Нозерн блот этих образцов с пробами, соответствующими высокопредставленным транскриптам: ACTB,
-актин;
UBC, убикуитин. (M) Маркер длин ДНК 1 kb
DNA ladder (СибЭнзим).
Продукт
Состав
Кат.#
Количество
Набор реактивов
Trimmer-2
Лиофилизированная дуплекс-специфическая нуклеаза
(ДСН), 50 ед.
Буфер для хранения ДСН, 120 мкл
4X гибридизационный буфер, 70 мкл
2X ДСН буфер, 500 мкл
ДСН стоп-раствор, 1000 мкл
Контрольная плазмидная ДНК (100 нг/мкл), 20 мкл
Контрольная кДНК (50-70 нг/мкл), 50 мкл
Смесь праймеров GAPD (10 мкМ каждого), 25 мкл
ПЦР праймер М1 (10 мкМ), 150 мкл
Смесь праймеров 454 (10 мкМ каждого), 100 мкл
CDS-Gsu адаптер (10 мкМ), 25 мкл
CDS-4M адаптер (10 мкМ), 25 мкл
NK003
На 10 р-ций
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Нормализация кДНК – процесс выравнивания концентрации разнопредставленных транскриптов в образце кДНК – позволяет существенно увеличить эффективность дальнейшего исследования транскриптома (поиск
редких транскриптов, функциональный скрининг, массированное секвенирование транскриптома).
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Нормализация кДНК на заказ
Сервис включает приготовление двухцепочечной кДНК на основе суммарной или РНК про- или эукариотических организмов или поли(А)+ РНК
эукариот с использованием технологии RNA-seq (для секвенирования на
Illumina) или метода синтеза кДНК со сменой матрицы (синтез кДНК,
обогащенной полноразмерными последовательностями, описание технологий – стр. 81) и нормализацию кДНК с помощью дуплекс-специфической
нуклеазы. Выбор технологии и адаптеров для синтеза кДНК зависит от
конкретной научно-исследовательской задачи. По желанию заказчика возможна подготовка нормализованных образцов кДНК для секвенирования
на совместимых с TruSeq секвенаторах или конструирование нормализованной библиотеки кДНК (см. страницу 27).
Оценка эффективности гибридизации осуществляется с помощью ПЦР в реальном времени или секвенирования 90 случайных клонов из библиотеки
кДНК.
www.evrogen.ru
1200
- все сиквенсы
- уникальные
- не уникальные
1000
800
600
400
200
0
не норм.
норм.
Результаты секвенирования фрагментов из
нормализованных и ненормализованных образцов кДНК Aplisia californica. Белые столбцы – все выявленные последовательности; синие столбцы – уникальные последовательности;
серые столбцы – повторяющиеся последовательности.
29
Генная инженерия : Нормализация, деплеция и вычитающая гибридизация нуклеиновых кислот
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
Нормализация кДНК
Синтез кДНК по технологии синтеза
кДНК со сменой матрицы.
Нормализация кДНК. Подбор
фланкирующих кДНК адаптеров,
оптимальных для решения конкретной
научно-исследовательской задачи:
секвенирование на секвенаторах
454, Illumina или ABI SOLiD,
клонирование библиотек кДНК и т.д.
CS010
Тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
2-4 недели
Нормализация кДНК.
Подготовка кДНК к
секвенированию
Синтез кДНК по технологии синтеза
кДНК со сменой матрицы.
Нормализация кДНК.
Подготовка кДНК для секвенаторов,
совместимых с TruSeq (Illumina).
NGP10-1A-ILMN Тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
3-5 недель
Синтез кДНК по технологии RNA-seq.
Нормализация кДНК.
Подготовка кДНК для секвенаторов,
совместимых с TruSeq (Illumina).
NGP10-2D-ILMN Поли(А)+ РНК эукариот
3-5 недель
Приготовление образцов
нормализованной кДНК для
направленного клонирования;
лигирование образцов в плазмидный
вектор.
CS011-2A
Тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
3-5 недель
Приготовление неамплифицированных
нормализованных библиотек кДНК,
содержащих приблизительно 100000
независимых клонов.
CS011-2B
Тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
4-6 недель
Приготовление амплифицированных
нормализованных библиотек кДНК,
содержащих приблизительно 400000
независимых клонов.
CS011-2C
Тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
4-6 недель
Приготовление неамплифицированных
нормализованных библиотек кДНК +
анализ эффективности нормализации
путем секвенирования 90 случайных
клонов из библиотеки.
CS011-3A
Тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
5-7 недель
Приготовление амплифицированных
нормализованных библиотек кДНК +
анализ эффективности нормализации
с помощью секвенирования 90
случайных клонов из библиотеки.
CS011-3B
Тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
5-7 недель
CS024-5
РНК прокариот
Конструирование
нормализованных
библиотек кДНК
Срок
выполнения
Дополнительные услуги
Выделение тотальной РНК из тканей
+1 неделя
Клонирование библиотек в вектор по выбору заказчика
договорной
Наработка кДНК в препаративных количествах (до 30 мкг)
+ 1 день
Анализ эффективности нормализации с помощью ПЦР в реальном времени
+1-3 недели
Массированное секвенирование ДНК (страница 6)
+ 4-12 недель
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
30
Евроген, Каталог 2013/14
Удаление избытка копий (деплеция) рибосомальной РНК
из образцов кДНК на заказ
а
109
108
107
106
105
104
* Удаление рибосомальной РНК сопровождается небольшим снижением относительной представленности мажорных транскриптов, при этом
соотношение концентраций средних и редких транскриптов остается практически неизменным.
107
106
105
104
Ге н н а я и н ж е н е р и я
ACTB
GAPDH
TBP
IGFR
IFNR
ACTB
GAPDH
TBP
IGFR
IFNR
109
108
103
102
Adk
NarP
TalB
1
Adk
NarP
TalB
101
23S
Сервис включает синтез кДНК по технологии RNA-seq (описание технологии – страница 81), удаление избытока кДНК-фрагментов, соответствующих рРНК и тРНК (описание технологии – страница 88) и оценку
эффективности деплеции с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Деплецированная кДНК готова к секвенированию на секвенаторах,
совместимых с TruSeq (Illumina).
б
28S
1
Удаление (деплеция) кДНК-копий, соответствующих рРНК и тРНК, с
помощью дуплекс-специфической нуклеазы приводит к уменьшению их
количества в образце тотальной кДНК при сохранении относительной
представленности других транскриптов* и значительно повышает эффективность исследования транскриптома.
18S
103
102
101
16S
Синтез кДНК с рассеяной затравки широко применяется в ситуациях, когда использование олиго(dT)-праймера невозможно или нецелесообразно,
например, при работе с неполиаденилированной РНК микроорганизмов
или с частично деградированной тотальной РНК эукариот (например, РНК,
выделенной из парафиновых блоков, или РНК из крови, хранящейся на
фильтрах). В этих случаях высокая концентрация рибосомальных и транспортных РНК (до 95%) существенно осложняет секвенирование образцов
кДНК и анализ профиля экспрессии генов.
Уровень представленности различных транскриптов и рРНК в образцах кДНК до (белые
столбцы) и после (синие столбцы) деплеции
рРНК и тРНК: (а) образцы кДНК человека; (б)
образцы кДНК E. coli.
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
Деплеция рибосомальной
кДНК
Синтез кДНК с рассеянной затравки
по технологии RNA-seq. Удаление
избытка копий рибосомальной и
транспортной РНК. Подготовка
кДНК для секвенаторов,
совместимых с TruSeq (Illumina).
NGP14-ILMN
Тотальная РНК эукариот
или прокариот
Срок
выполнения
3-5 недель
Дополнительные услуги
Выделение тотальной РНК из тканей
+1 неделя
Проверка эффективности деплеции с помощью ПЦР в реальном времени.
+1 неделя
Наработка кДНК в препаративных количествах (до 30 мкг)
Массированное секвенирование ДНК (страница 6)
+1 день
+ 4-12 недель
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Деплеция нецелевых транскриптов
из образцов кДНК на заказ
Удаление нецелевых (уже известных) транскриптов из образцов ДНК позволяет повысить эффективность функционального скрининга и выявление
новых мишеней, обладающих искомой активностью.
ДСН-деплеция – метод, основанный на свойствах дуплекс-специфической
нуклеазы (описание технологии – страница 88) – позволяет эффективно удалять до 50 различных нецелевых последовательностей из образца
кДНК. Деплеция сопровождается частичной (или полной, по запросу)
нормализацией кДНК, что приводит также к снижению уровня высокопредставленных транскриптов в образце.
www.evrogen.ru
31
Генная инженерия : Нормализация, деплеция и вычитающая гибридизация нуклеиновых кислот
Сервис включает приготовление амплифицированной кДНК, обогащенной
полноразмерными последовательностями (описание технологии синтеза
кДНК – страница 81), деплецию нецелевых последовательностей и контроль эффективности деплеции с помощью ПЦР в реальном времени.
Возможно конструирование деплецированных направленно-клонированных библиотек кДНК, обогащенных полноразмерными последовательностями (см. страницу 27).
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
Срок
выполнения
Деплеция нецелевых
транскриптов из образцов
кДНК
Приготовление кДНК, обогащенной
полноразмерными последовательностями;
удаление нежелателдьных транскриптов с
помощью ДСН-деплеции
CS012-1
Тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
4-6 недель
Конструирование деплецированных
амплифицированных библиотек кДНК,
содержащих примерно 400000 независимых
клонов
CS012-2
Тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
5-7 недель
Дополнительные услуги
Выделение тотальной РНК из тканей
+1 неделя
Клонирование библиотек в вектор по выбору заказчика
договорной
Наработка кДНК в препаративных количествах (до 30 мкг)
+ 1 день
Анализ эффективности деплеции с помощью ПЦР в реальном времени
+1 неделя
Массированное секвенирование ДНК (страница 6)
+ 4-12 недель
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Нормализация геномной ДНК на заказ
Сервис включает нормализацию образцов геномной ДНК с помощью метода, основанного на свойствах дуплекс-специфической нуклеазы (описание
технологии – страница 88). Нормализация позволяет уменьшить представленность близкородственных повторяющихся элементов в геномной ДНК,
что значительно облегчает дальнейшее секвенирование геномов (особенно
геномов высших растений) на высокопроизводительных секвенаторах нового поколения (Illumina, 454 Roche и ABI SOLiD).
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
Срок
выполнения
Нормализация геномной
ДНК
Нормализация геномной ДНК.
Подготовка геномной ДНК для
секвенаторов, совместимых с TruSeq
(Illumina)
NGP13-ILMN
геномная ДНК эукариот
3-5 недель
Нормализация геномной
ДНК
Приготовление образцов
нормализованной геномной ДНК для
секвенирования на
высокопроизводительных
секвенаторах нового поколения
CS013
геномная ДНК эукариот
5-5 недель
Дополнительные услуги
Наработка ДНК в препаративных количествах (до 30 мкг)
+1 день
Массированное секвенирование ДНК (страница 6)
+ 4-12 недель
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
32
Евроген, Каталог 2013/14
Вычитающая гибридизация кДНК на заказ
Вычтенные образцы кДНК обогащены дифференциально экспрессирующимися последовательностями и могут быть использованы для приготовления
вычтенных библиотек кДНК, секвенирования, дифференциального скрининга, приготовления чипов.
исходные образцы образцы
образцы после SSH после MOS
M
1
2
#1 #2 #1‘ #2‘
т.п.о.
3.0
1.0
0.5
При необходимости вычитающую гибридизацию дополняют зеркально-ориентированной селекцией (MOS, описание технологии – страница 86) для
удаления из образцов ложно-позитивных последовательностей.
Использование MOS рекомендуется:
- при сравнении образцов РНК с высокой сложностью (например, РНК из
мозга млекопитающих)
- при сравнении слабо различающихся образцов РНК
- в случаях, когда в вычтенных библиотеках обнаруживается высокий процент ложно-позитивных клонов
Результат супрессионной вычитающей гибридизации и зеркально-ориентированной селекции образцов кДНК. Зеркально-ориентированная селекция позволяет выявить полосы, соответствующие дифференциальным транскриптам и удаляет большинство ложно-позитивных
сигналов. (M) Маркер длин ДНК 1 kb DNA
Ladder (Gibco BRL).
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
Вычитающая
гибридизация кДНК
эукариот
Приготовление образцов вычтенной
кДНК (вычитание в обоих
направлениях)
CS021-1
тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
3-4 недели
Приготовление образцов вычтенной
кДНК. Клонирование полученных
образцов в плазмидный вектор
CS021-2
тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
4-6 недель
Приготовление вычтенных библиотек
кДНК, скрининг случайных клонов
(по одному 96-луночному планшету
для каждого направления) для
выявления дифференциальных
последовательностей*
CS021-3
тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
5-6 недель
Приготовление вычтенных библиотек
кДНК, скрининг случайных клонов
(пять 96-луночных планшетов для
одного направления и один – для
другого)*
CS021-4
тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
5-11 недель
Приготовление вычтенных библиотек
кДНК, скрининг случайных клонов
(по пять 96-луночных планшетов для
каждого направления)*
CS021-5
тотальная или поли(А)+
РНК эукариот
5-11 недель
Приготовление образцов вычтенной
кДНК (вычитание в обоих
направлениях)
CS024-1
тотальная РНК прокариот
3-4 недели
Приготовление образцов вычтенной
кДНК. Клонирование полученных
образцов в плазмидный вектор
CS024-2
тотальная РНК прокариот
4-6 недель
Приготовление вычтенных библиотек
кДНК, скрининг случайных клонов
(по одному 96-луночному планшету
для каждого направления) для
выявления дифференциальных
последовательностей*
CS024-3
тотальная РНК прокариот
5-6 недель
Вычитающая
гибридизация кДНК
прокариот
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Сравнение популяций транскриптов осуществляется с помощью высокоэффективного метода супрессионной вычитающей гибридизации (SSH,
описание технологии – страница 84).
Срок
выполнения
продолжение...
www.evrogen.ru
33
Генная инженерия : Нормализация, деплеция и вычитающая гибридизация нуклеиновых кислот
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
Срок
выполнения
Приготовление вычтенных библиотек
кДНК, скрининг случайных клонов
(пять 96-луночных планшетов для
одного направления и один – для
другого)*
CS024-4
тотальная РНК прокариот
5-11 недель
Приготовление вычтенных библиотек
кДНК, скрининг случайных клонов
(по пять 96-луночных планшетов для
каждого направления)*
CS024-5
тотальная РНК прокариот
5-11 недель
Дополнительные услуги
Выделение тотальной РНК из тканей
+1 неделя
Зеркально-ориентированная селекция (MOS)
+1 неделя
Наработка кДНК в препаративных количествах
+1 день
Клонирование библиотек в нестандартный вектор
договорной
* Сервисы включают выделение плазмидной ДНК выявленных дифференциальных клонов (не более 100 для каждой библиотеки), псевдо-Нозерн
блот гибридизацию 5 клонов, отобранных из каждой библиотеки для подтверждения дифференциального распределения, секвенирование вставок для
клонов с подтвержденным дифференциальным распределением (не более 10 клонов).
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Вычитающая гибридизация бактериальных геномов на заказ
Cравнение геномов близкородственных штаммов бактерий методом супрессионной вычитающей гибридизации (SSH, описание технологии –
страница 84). Вычтенные образцы используют для приготовления библиотек ДНК, обогащенных генами, отличающими сравниваемые штаммы, и для
дифференциального скрининга.
Услуга
Описание
Кат.#
Стартовый материал
Срок
выполнения
Вычитающая
гибридизация
бактериальных геномов
Приготовление образцов вычтенной
ДНК из геномной ДНК
бактериальных штаммов (вычитание
в обоих направлениях)
CS022-1
геномная ДНК прокариот
3-4 недели
Приготовление образцов вычтенной
ДНК, клонирование полученных
образцов в стандартный вектор
CS022-2
геномная ДНК прокариот
4-6 недель
Конструирование вычтенных
библиотек ДНК, скрининг 96
случайных клонов (для каждого
направления) для выявления
дифференциальных
последовательностей*
CS022-3
геномная ДНК прокариот
5-6 недель
Конструирование вычтенных
библиотек ДНК, скрининг случайных
клонов (пять 96-луночных планшетов
для одного направления и один – для
другого)*
CS022-4
геномная ДНК прокариот
5-11 недель
Конструирование вычтенных
библиотек ДНК, скрининг случайных
клонов (по пять 96-луночных
планшетов для каждого
направления)*
CS022-5
геномная ДНК прокариот
5-11 недель
* Сервис включает выделение плазмидной ДНК выявленных дифференциальных клонов (не более 100 для каждой библиотеки), Саузерн блот гибридизацию 5 клонов, отобранных из каждой библиотеки для подтверждения дифференциального распределения, секвенирование вставок для клонов с
подтвержденным дифференциальным распределением (не более 10 клонов).
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
34
Евроген, Каталог 2013/14
Учебные наборы
Практикум по генной инженерии
В ходе практикума на примере клонирования и экспрессии гена флуоресцентного белка из кораллового полипа рода Clavularia отрабатывается ряд
методов, широко применяемых в современной генной инженерии, в том
числе выделение суммарной РНК, электрофорез нуклеиновых кислот, обратная транскрипция, ПЦР-амплификация кДНК, поиск и клонирование
участков интересующего гена, скрининг экспрессионной библиотеки, экспрессия и очистка рекомбинантного белка.
Практикум разбит на несколько задач, моделирующих реальное научное
исследование. Задачи практикума могут быть выполнены в комплексе (по
очереди) или отдельно друг от друга. При недостатке времени, оборудования и т.д. некоторые задачи могут быть исключены из программы
практикума.
Основные задачи практикума
M
1
2
3
4
т.п.о.
3.0
1.0
Ге н н а я и н ж е н е р и я
Практикум предназначен для студентов 3-4 курса, специализирующихся в
области молекулярной биологии, генетики, вирусологии и смежных специальностей, а также для повышения профессионального уровня аспирантов
и начинающих исследователей.
0.5
Визуализация с помощью электрофореза в
1.5% TAE-агарозе продуктов первого, второго
и третьего раундов амплификации (дорожки 2,
3, 4 соответственно) 3’-концевого фрагмента
кДНК гена флуоресцентного белка из кораллового полипа Clavularia. Дорожка 1 – исходная
кДНК. М – маркер длин ДНК 1 kb DNA Ladder
(Сибэнзим).
Задача
Краткое описание
Задача 1.
Выделение суммарной РНК;
анализ суммарной РНК
методом гель-электрофореза
В рамках задачи предлагается выделение РНК из фиксированных тканей
кораллового полипа рода Clavularia. Так же для выделения РНК можно
использовать любые другие доступные живые объекты (насекомое, икру рыб и т.д.).
Анализ суммарной РНК методом гель-электрофореза является завершающим
этапом первой задачи.
1 учебный день
Задача 2.
Синтез кДНК на матрице
суммарной РНК
Задача включает приготовление амплифицированной двухцепочечной кДНК и
оценку качества препарата с помощью гель-электрофореза. В качестве стартового
материала может быть использована РНК, полученная при выполнении задачи 1,
или контрольная РНК из набора Clavularia FP cloning set.
1 учебный день
Задача 3.
Идентификация 3’- и
5’-концевых фрагментов
целевых транскриптов
Задача включает два или три последовательных раунда быстрой амплификации
3’-концевого фрагмента кДНК флуоресцентного белка из кораллового полипа
Clavularia. В результате выполнения задачи должен быть получен гомогенный
продукт ПЦР длиной около 550 п.о., соответствующий 3’-концевой
последовательности мРНК.
Продукт амплификации может быть клонирован и секвенирован, если учебный
центр оснащен необходимым оборудованием. В качестве стартового материала
может быть использована кДНК, полученная при выполнении задачи 2, или
контрольная кДНК из набора Clavularia FP cloning set.
Процедура 5’-RACE вынесена за рамки лабораторной работы и рассматривается
только теоретически
2 учебных дня
Задача 4.
Амплификация полной кодирующей последовательности
гена флуоресцентного белка
и его направленное клонирование в бактериальный
экспрессионный вектор
Задача включает амплификацию и направленное клонирование в экспрессионный
вектор полной кодирующей последовательности гена флуоресцентного белка, отбор
целевых клонов и выделение плазмидной ДНК. В качестве стартового материала
может быть использована кДНК, полученная при выполнении задачи 2, или
контрольная кДНК из набора Clavularia FP cloning set.
6 учебных дней
Задача 5.
Экспрессия гена
флуоресцентного белка в
бактериях E. coli,
визуализация и выделение
рекомбинантного белка
Задача включает наращивание биомассы, продуцирующей рекомбинантный белок,
визуализацию флуоресценции как доказательство функциональной активности этого
белка и выделение рекомбинантного белка методом металл-аффинной
хроматографии. В качестве стартового материала могут быть использованы
трансформированные бактерии, полученные при выполнении задачи 4, или
контрольная плазмида, вложенная в набор Clavularia FP cloning set. В последнем
случае лабораторная работа должна включать трансформацию бактерий
контрольной плазмидой.
2 учебных дня
www.evrogen.ru
Срок выполнения
35
Генная инженерия : Учебные наборы
Продукт
Состав
Кат.#
Срок выполнения
Набор для практикума
Clavularia FP cloning set*
Фрагмент тканей коралла Clavularia sp. в фиксаторе,
2-3 шт.
Ген-специфические праймеры для трех раундов 3’-RACE
флуоресцентного белка Clavularia (10 мкМ),
50 мкл каждого
Праймеры для клонирования флуоресцентного белка
(10 мкМ), 50 мкл каждого
Контрольная кДНК Clavularia, 10 мкл
Контрольная РНК Clavularia (0.2 мг/мл), 10 мкл
Контрольная плазмида pQE-30-FP с геном
флуоресцентного белка (10 нг/мкл), 15 мкл
Вектор для клонирования pQE-30 (100 нг/мкл), 30 мкл
Cмесь праймеров для скрининга библиотеки кДНК
(10 мкМ каждого), 50 мкл
Вода, свободная от РНКаз, 1.8 мл
Пестик для гомогенизации образцов, 2 шт
MB001
Для проведения
практикума группой до
10 чел.
Комплект реактивов для
проведения практикума по
генной инженерии
Набор для практикума Clavularia FP cloning set
(кат. # MB001)
Реагент ExtractRNA для выделения суммарной РНК из
биологических образцов (кат. # BC032)
Набор реактивов для ПЦР Encyclo Plus PCR kit
(кат. # PK101)
Набор реактивов Mint для синтеза кДНК (кат. # SK001)
Набор праймеров Mint RACE primer set (кат. # SK004)
Набор для очистки ДНК Cleanup Standard (кат. # BC022)
Набор для выделения плазмидной ДНК Plasmid Miniprep
(кат. # BC021)
MBS02
Для проведения
практикума группой до
10 чел.
*Набор Clavularia FP cloning set содержит все необходимые исходные материалы (контрольные образцы), позволяющие осуществить любую из задач
практикума без выполнения предыдущих. Список необходимого для проведения практикума оборудования, расходных материалов и дополнительных
реагентов доступен по адресу: http://www.evrogen.ru/education/education.shtml
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
36
Евроген, Каталог 2013/14
К леточная биология
Флуоресцентные белки
Флуоресцентные генетически кодируемые биосенсоры
Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы
Временная и стабильная трансфекция
Лентивирусные частицы
РНК-интерференция
Клеточная биология
Флуоресцентные белки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
Флуоресцентные белки, обладающие стабильной флуоресценцией . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
Мечение клеток
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
41
Мечение клеточных органелл и белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
41
Анализ активности промоторов, тканеспецифичная экспрессия флуоресцентных белков . . . . . . . . .
42
Технологии с использованием резонансного переноса энергии (FRET, Forster resonance energy transfer)
42
Технологии whole body imaging
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
Фотоактивируемые флуоресцентные белки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
Визуализация флуоресцентных белков
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
Векторы для экспреcсии флуоресцентных белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
Экспрессионные С-векторы
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Экспрессионные N-векторы
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
48
Готовые векторы для мечения внутриклеточных структур . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
Готовые векторы для мечения белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50
Лишенные промотора векторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
52
Бактериальные экспрессионные векторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
52
Плазмиды Gateway® С-terminal entry clone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
53
Плазмиды Gateway® N-terminal entry clone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
53
Готовые лентивирусные частицы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
54
Рекомбинантные флуоресцентные белки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55
Антитела для анализа флуоресцентных белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55
Оптимизация векторов, разработка систем скрининга на основе флуоресцентных белков . . . . . . . . . . . .
56
Флуоресцентные генетически кодируемые биосенсоры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
57
Биосенсор HyPer: анализ внутриклеточных колебаний концентрации H2 O2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
57
Биосенсор Case12: мониторинг внутриклеточных колебаний концентрации ионов кальция
. . . . . . . . . . .
58
Биосенсоры Casper3-BG и Casper3-GR: ранняя детекция каспаза-3 зависимого апоптоза
. . . . . . . . . . .
59
Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
KillerRed . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
ArrestRed . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
Векторы для экспреcсии и поликлональные антитела для детекции генетически кодируемых фотосенсибилизаторов 62
Трансфекция и трансдукция
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Временная трансфекция культур клеток на заказ
38
63
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
Конструирование лентивирусных частиц на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
64
Лентивирусные конструкции для РНК-интерференции на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
Создание стабильно трансфецированных клеточных линий на заказ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
66
Евроген, Каталог 2013/14
Флуоресцентные белки
Для каждого флуоресцентного белка создан набор векторов и готовых
лентивирусных частиц. При необходимости возможна оптимизация генетического кода генов флуоресцентных белков под любую систему экспрессии
(см. страницу 56). Мы также предлагаем изготовление стабильных клеточных линий (см. страницу 66) и лентивирусных частиц (см. страницу 64),
несущих гены флуоресцентных белков из нашей коллекции, на заказ.
Флуоресценция
Мы предлагаем коллекцию флуоресцентных белков, оптимизированных для
решения различных научно-исследовательских задач. Палитра флуоресценции включает цвета от синего до дальнего красного, что позволяет
использовать их для одновременной визуализации нескольких внутриклеточных структур и белков.
Трансгенная лягушка Xenopus laevis, экспрессирующая дальне-красный флуоресцентный
белок TurboFP635 под контролем промотора
актина ACTC. Фотографии любезно предоставлены А. Зарайским (ИБХ РАН, Россия).
Клеточная биология
Флуоресцентные белки – генетически кодируемые маркеры для прижизненной визуализации клеток, клеточных органелл и белков, а также для анализа
активности промоторов по флуоресцентному сигналу. Способность формировать флуорофорную группу автокаталитически, без привлечения внешних
кофакторов и ферментов, в сочетании с низкой токсичностью и высокой
стабильностью, позволяет использовать флуоресцентные белки в разных системах гетерологической экспрессии.
Дневной свет
Флуоресцентные белки,
обладающие стабильной флуоресценцией
Возбуждение, %
Детекция флуоресценции может осуществляться с помощью флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии.
100
80
60
40
20
0
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
Эмиссия, %
Длина волны (нм)
100
80
60
40
20
0
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
Длина волны (нм)
Спектральное разнообразие флуоресцентных белков компании Евроген. Нормализованные спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции.
Группа TagFPs:
TagBFP
TagCFP
TagGFP2
TagYFP
TagRFP
Группа TurboColors:
TurboGFP
TurboYFP
TurboRFP
TurboFP602
TurboFP635
. . . . . . FusionRed
mKate2
TurboFP650
Белки для специальных приложений: . . . . . . NirFP
www.evrogen.ru
39
Клеточная биология : Флуоресцентные белки
Основные свойства флуоресцентных белков
Белок
Цвет
Максимум
возбуждения /
эмиссии, нм
Яркость,
Структура
% от EGFP
pKa
Фотостабильность
Скорость
созревания в
клетках
+++
+++
+++
+++
++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
Ta g F P s , м о н о м е р н ы е б е л к и д л я F R E T п р и л о ж е н и й и м е ч е н и я б е л к о в
TagBFP
синий
402 / 457
99
мономер
2.7
TagCFP
голубой
458 / 480
64
мономер
4.7
TagGFP2
зеленый
483 / 506
105
мономер
5.0
TagYFP
желтый
508 / 524
94
мономер
5.5
TagRFP
оранжевый /
красный
555 / 584
148
мономер
3.8
FusionRed
красный
580 / 608
47
супермономер*
4.6
mKate2
дальний красный
588 / 633
74
мономер
5.4
Tu r b o C o l o r s , д и м е р н ы е б е л к и д л я м е ч е н и я к л е т о к и а н а л и з а а к т и в н о с т и п р о м о т о р о в
5.7
+++
+++
+++
++
+++
+++
++++
++++
++++
+++
++++
++++
4.5
+++
+ + + **
TurboGFP
зеленый
482 / 502
112
димер
5.2
TurboYFP
желтый
525 / 538
169
димер
5.9
TurboRFP
красный
553 / 574
187
димер
4.4
TurboFP602
красный
574 / 602
79
димер
4.7
TurboFP635
дальний красный
588 / 635
67
димер
5.5
TurboFP650
дальний красный /
инфракрасный
592 / 650
47
димер
13
димер
Белки для специальных приложений
NirFP
дальний красный /
инфракрасный
605 / 670
* Очищенный рекомбинантный белок проявляет свойства мономера в концентрации 10 мг/мл по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
** NirFP быстро созревает в E.coli, однако обладает относительно низкой яркостью, поэтому его визуализацию рекомендуется производить через
48 часов после трансфекции.
Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в различных приложениях
Белок
Мечение клеток, анализ
активности промоторов
Создание
химерных белков
Мечение органелл с
кислым содержимым
Технологии Whole
body imaging
Стабильная
экспрессия
+++
++
++++
+++
++++
+
++
++++
+++
++++
+++
++++
++++
++++
++++
+++
++
++
++++
+++
++
–
–
+
+
+++
+++
++++
+++
+++
+++
+++
+++
++++
++++
++++
++++
++++
++
++
+
+
++
+
+
+
+
++
+
+++
+++
++
++
+
+
+++
+++
++++
++++
+++
++
+++
+++
+++
+++
+
++++
+++
Ta g F P s
TagBFP
TagCFP
TagGFP2
TagYFP
TagRFP
FusionRed
mKate2
Tu r b o F P s
TurboGFP
TurboYFP
TurboRFP
TurboFP602
TurboFP635
TurboFP650
Белки для специальных приложений
NirFP
40
+
+
Евроген, Каталог 2013/14
Для трансфекции клеток млекопитающих могут быть использованы векторы,
помеченные буквами «C» или «N». В этих векторах гены флуоресцентных
белков находятся под контролем конституционного промотора цитомегаловируса (CMV). Векторы также содержат ген устойчивости к канамицину
(под контролем бактериального промотора) и неомицину (под контролем
раннего промотора вируса SV40) для проведения антибиотической селекции. Схемы векторов представлены на страницах 47 и 48.
Для бактериальной экспрессии могут быть использованы векторы, помеченные буквой «B». В них ген флуоресцентного белка находится под контролем
T5 промотора lac оператора (см. схему на странице 52).
Для быстрого переклонирования генов флуоресцентных белков в другую систему экспрессии по технологии «Gateway» доступны плазмиды
«Gateway® entry clones». Схемы плазмид представлены на странице 53.
Для эффективной трансфекции клеток также могут быть использованы лентивирусные частицы (см. страницу 54).
а
б
в
г
Стабильно-трансфецированные клеточные линии, экспрессирующие флуоресцентные белки:
(а) клетки H-TG, белок TurboGFP; (б) клетки
U-2-OS, белок TurboFP602; (в) клетки T-24,
белок TurboFP635; (г) клетки W-PY, белок
PhiYFP (вариант белка TurboYFP). Фотографии предоставлены др. Пецелтом (Маринфарм,
Германия).
Клеточная биология
Мечение клеток
Все флуоресцентные белки из нашей коллекции могут быть использованы
для мечения клеток. В большинстве случаев мы рекомендуем использовать для этих целей яркие и быстросозревающие димерные белки группы
TurboFPs.
Вы можете также воспользоваться услугами по экспрессии флуоресцентных
белков в клетках (см. страницу 63) и приготовлению стабильно-трансфецированных клеточных линий (см. страницу 66).
Мечение клеточных органелл и белков
Оптимальным решением для приготовления химерных конструктов для
мечения внутриклеточных белков и органелл являются мономерные флуоресцентные белки группы TagFPs. Эти белки не проявляют склонности к
олигомеризации в клетках, что позволяет использовать их в качестве партнеров слияния даже с олигомеризующимися белками.
Особую проблему представляет мечение органелл с кислым внутренним
содержимым, таких как лизосомы и эндосомы. Для этих целей мы рекомендуем использовать белки, обладающие высокой устойчивостью к кислым
значениям pH: TagBFP (pKa=2.7) и TagRFP (pKa=3.8).
Для создания химерных конструкций с добавлением последовательности
партнера слияния (целевого белка или сигнала внутриклеточной локализации) на C-конец флуоресцентного белка следует использовать векторы,
помеченные буквой «C», а для присоединения целевой последовательности на N-конец флуоресцентного белка – векторы, помеченные буквой «N»
(схемы векторов представлены на страницах 47 и 48). Возможно создание химерных конструкций на основе флуоресцентных белков на заказ (см.
страницу 56).
Кроме того, мы предлагаем коллекцию готовых к использованию векторов
для мечения различных внутриклеточных структур и белков млекопитающих
(см. страницу 50):
- органеллы: митохондрии, аппарат Гольджи, пероксисомы, плазматическая мембрана, эндосомы, лизосомы, эндоплазматический ретикулум
- белки цитоскелета и адгезии: -актинин, -V-интегрин, -тубулин,
-актин, ассоциированные с микротрубочками белки EB3 и MAP4,
протеин тирозин киназа фокальной адгезии (FAK), цитокератин-18,
профилин, виментин, винкулин, зиксин, миозин (MYL9), талин, VE-кадхерин
- белки щелевых контактов (gap junction): коннексин 26, коннексин 32,
коннексин 43
www.evrogen.ru
а
б
в
г
Использование флуоресцентных белков для
многоцветного мечения внутриклеточных структур в клетках млекопитающих: (а) клетка HeLa,
содержащая флуоресцентно-меченые митохондрии (желтый, PhiYFP), аппарат Гольджи
(оранжевый, TagRFP), гистон H2B (синий,
-актин (зеленый, TagGFP2) и
TagBFP),
зиксин (красный, mKate2); (б) клетка HeLa,
содержащая флуоресцентно-меченые митохондрии (желтый, PhiYFP), -актин (голубой,
TagCFP) и клатрин (красный, mKate2);
(в) клетка REF3, окрашенная Hoechst (синий) и содержащая флуоресцентно-меченые
митохондрии (зеленый, TagGFP2) и цитокератин-14 (красный, TagRFP); (г) клетка REF52,
экспрессирующая
флуоресцентно-меченые
белки: -актин (зеленый, TagGFP2) и зиксин
(красный, mKate2).
41
Клеточная биология : Флуоресцентные белки
Анализ активности промоторов,
тканеспецифичная экспрессия флуоресцентных белков
Для анализа активности промоторов мы предлагаем векторы, помеченные
буквами «PRL» (promoterless). Эти векторы кодируют яркие быстросозревающие белки TurboFPs, но не содержат собственного промотора для их
экспрессии. Вместо него в векторах присутствует полилинкер для клонирования исследуемого промотора.
В нашей коллекции имеются также векторы, кодирующие дестабилизированные варианты белков TurboFPs (помечены как «dest1»). Благодаря
повышенной скорости деградации в клетках такие белки позволяют проводить мониторинг быстрых изменений активности промоторов в живых
системах.
Схема лишенного промотора вектора представлена на странице 52.
Технологии с использованием резонансного переноса
энергии (FRET, Forster resonance energy transfer)
Флуоресцентные белки широко используются в качестве доноров и акцепторов флуоресценции в технологиях резонансного переноса энергии (FRET),
например, при анализе белок-белковых взаимодействий. Пары TagBFP
– TagGFP2 и TagGFP2 – TagRFP обладают наибольшей эффективностью
FRET среди известных мономерных флуоресцентных белков.
На основе FRET-пар TagBFP – TagGFP2 и TagGFP2 – TagRFP разработаны генетически-кодируемые сенсоры Casper3-BG и Casper3-GR (см.
страницу 59).
EGFP
TurboGFP
Мы постоянно расширяем список доступных конструкций, самую актуальную информацию можно найти на нашем сайте www.evrogen.ru
Флуоресценция
Стадия поздней гаструлы
Дневной свет
Флуоресценция
EGFP
Экспрессия химерных белков обуславливается активностью промотора цитомегаловируса, селекция – канамицин/неомицин.
Стадия средней гаструлы
Дневной свет
TurboGFP
- белки везикулярного транспорта: клатрин LCB
- ядерные белки: гистон H2B, ламин B1, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA)
- белки сигнальной трансдукции: аннексин, паксиллин, CD151, Rab-5A,
CDC42
- белки метаболизма: пируватдегидрогеназа 1 (PDHA1)
Сравнение скорости созревания флуоресцентных белков TurboGFP и EGFP в развивающихся эмбрионах лягушки Xenopus laevis.
Вектор для экспрессии флуоресцентного белка под контролем промотора цитомегаловируса
был микроинъецирован в анимальный полюс
эмбриона лягушки на стадии двух бластомеров.
Фотографии живых эмбрионов были сделаны
со стороны анимального полюса на стадиях
средней и поздней гаструлы. Данные любезно
предоставлены А. Зарайским (ИБХ РАН, Россия).
Характеристики некоторых FRET-пар флуоресцентных белков
Донор
флуоресценции
Акцептор
флуоресценции
Радиус
Фоновый
Ферстера (R0) FRET
TagBFP (402/457 нм)
TagGFP2
(483/506 нм)
5.25 нм
0.85%
TagGFP2 (483/506 нм)
TagRFP (555/584 нм)
5.70 нм
Не детектируется
ECFP (433/475 нм)
EYFP (513/527 нм)
4.86 нм
6.2%
Данные о FRET паре ECFP-EYFP получены из литературных источников и приведены для сравнения.
42
Евроген, Каталог 2013/14
Технологии whole body imaging
Прямая визуализация клеток в тканях с помощью флуоресцентных белков
является наиболее простым и наименее инвазивным способом исследования биологических процессов, происходящих внутри организма. Лучше
всего для этих целей подходят белки с эмиссией в дальней красной
или инфракрасной областях спектра (650-1100 нм), поскольку именно в
этом диапазоне ткани животных максимально прозрачны для света. Наша коллекция включает в себя четыре таких белка – mKate2, TurboFP635,
TurboFP650 и NirFP.
б
TurboFP650
1.2
*
1
0.8
*
0.6
0.4
0.2
0
640
680
720
760
Длина волны светофильтров эмиссии
Трансгенная рыба Danio rerio, экспрессирующая флуоресцентный белок TurboFP635 в
мышечной ткани: (а) фотография при дневном
свете; (б) флуоресценция.
Клеточная биология
mNeptune
Флуоресценция, у.е.
E2-Crimson
а
Визуализация флуоресцентного сигнала в живых мышах с использованием системы IVIS Spectrum (Caliper). На фотографии показаны мыши, в которых были внутримышечно инъецированы
клетки линии HEK-293T, продуцирующие белки E2-Crimson, mNeptune и TurboFP650. Детекция
флуоресцентного сигнала производилась с помощью светофильтров, пропускающих свет с длиной
волны 575-635 нм (возбуждение) и 640-680 нм (эмиссия). Зеленой звездочкой отмечена фоновая флуоресценция в мыши, инъецированной клетками, продуцирующими белок E2-Crimson.
Цветовая шкала показывает относительную эффективность эмиссии. На графике отражена интенсивность флуоресцентного сигнала инъецированных клеток, регистрируемого с помощью набора
светофильтров эмиссии при возбуждении светом с длиной волны 575-635 нм. Значения интенсивности флуоресценции были нормированы на интенсивность сигнала люциферазы светлячка,
экспрессированной в тех же клетках. Показаны значения яркости для TurboFP650 относительно
прочих белков и стандартная ошибка среднего (n = 6-10). *P < 0.05 (тест Стъюдента). Красная
линия – TurboFP650, зеленая линия – mNeptune, синяя линия – E2-Crimson.
Белок
Цвет флуоресценции
Максимумы
возбуждения/
эмиссии (нм)
Структура
Яркость,
% от
EGFP
Фотостабильность
Скорость
созревания
при 37°C
mKate2
дальний красный
588 / 633
мономер
74
TurboFP635
дальний красный
588 / 635
димер
67
+++
+++
+++
++++
+++
++++
++++
+ + +*
TurboFP650
дальний красный / инфракрасный
592 / 650
димер
47
NirFP
дальний красный / инфракрасный
605 / 670
димер
13
* NirFP быстро созревает в E.coli, однако обладает относительно низкой яркостью, поэтому его визуализацию рекомендуется производить через
48 часов после трансфекции.
www.evrogen.ru
43
Клеточная биология : Флуоресцентные белки
Фотоактивируемые флуоресцентные белки
Фотоактивируемые флуоресцентные белки обладают уникальной способностью менять спектральные характеристики под воздействием интенсивного
света определенной длины волны, что делает их удобным инструментом для
мечения клеток, органелл и белков с целью последующего мониторинга их
перемещений in vivo.
а
б
Основные свойства фотоактивируемых флуоресцентных белков
Белок
PS-CFP2
до/после
активации
PA-TagRFP
до/после
активации
KFP-Red
до/после
активации
Цвет флуоресценции
голубой / зеленый
нет / красный
нет / красный
Максимум возбуждения
флуоресценции (нм)
400 / 490
нет / 562
нет / 580
Максимум эмиссии
флуоресценции (нм)
468 / 511
нет / 595
нет / 600
Активирующий свет
УФ
(450 нм)
УФ
(390-420 нм)
зеленый
(530-560 нм)
Контраст фотоактивации (раз)
более 2000
540
35-70
Яркость (% от EGFP)
26 / 33
нет / 76
нет / 12.4
Структура
мономер
мономер
тетрамер
pKa
4.3 / 6.1
нет данных / 5.3 нет данных
Дневной свет Флуоресценция
высокая
средняя
Агрегация
нет
нет
нет
Длина полипептида
(аминокислот)
238
237
238
Молекулярная масса (кДа)
27
27
26
Возбуждение, %
Скорость созревания при 37°C высокая
б
в
Мониторинг клеточной миграции в развивающейся нейральной пластинке Xenopus laevis
с помощью фотоактивируемого белка KFPRed: (a) шарообразная группа клеток внутри
нейральной пластинки на стадии ранней нейрулы была подвергнута облучению интенсивным
зеленым светом, что привело к необратимой
фотоактивации KFP-Red; (б) через два часа
наблюдалось перераспределение облученных
клеток вдоль нейральной пластинки; (в) в конце нейруляции облученные клетки образовали
полосу внутри нейральной пластинки. Данные
любезно предоставлены А. Зарайским (ИБХ
РАН, Россия).
80
60
40
20
400
450
500
550
600
650
700
Наложение
а
100
0
350
Фотоконверсия PS-CFP2 в клетках млекопитающих. Центральная клетка, экспрессирующая
PS-CFP2, была облучена интенсивным светом с длиной волны 405 нм, что привело к
фотоконверсии PS-CFP2 из синей в зеленую
флуоресцентную форму: (а) клетки до облучения; (б) после облучения.
750
Эмиссия, %
Длина волны (нм)
100
80
60
40
20
0
350
400
450
500
550
600
650
700
750
Длина волны (нм)
Спектральное разнообразие фотоактивируемых флуоресцентных белков компании Евроген.
Нормализованные спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции.
PS-CFP до активации
PS-CFP после активации
KFP-Red после активации
PA-TagRFP после активации
44
Евроген, Каталог 2013/14
Наблюдение за белками
Рекомендуемые белки:
PS-CFP2, PA-TagRFP
Отслеживаемые параметры:
- скорость и направление белкового
транспорта
- коэффициент диффузии
- выявление мобильных и статических
фракций
- скорость деградации
h
Наблюдение за клеточными органеллами
Отслеживаемые параметры:
- скорость и направление движения
- скорость обновления содержимого
- слияние и деление
h
Мониторинг миграции клеток
Рекомендуемые белки:
PS-CFP2, PA-TagRFP, KFP-Red
Отслеживаемые параметры:
- скорость и направление движения
- локализация
- скорость деления
- изменение формы и объема
Клеточная биология
Рекомендуемые белки:
PS-CFP2, PA-TagRFP, KFP-Red
h
Исследования клеточной динамики с помощью фотоактивируемых белков. Cфокусированный луч света (синяя стрелка на схеме) используют для
активации фотоактивируемого белка в интересующей области клетки, ткани или организма (оранжевый цвет). Динамику отмеченного объекта можно
отслеживать с течением времени.
В ходе эксперимента отдельные клетки, клеточные органеллы или пул молекул исследуемого белка, помеченные фотоактивируемым флуоресцентным
белком, облучают интенсивным светом определенной длины волны. В облучаемых объектах происходит фотоконверсия фотоактивируемого белка,
которая приводит к изменению его спектральных характеристик. После
этого становиться возможным наблюдать за перемещениями «перекрашенных» объектов в режиме реального времени.
Фотопереключаемый флуоресцентный белок PS-CFP2 может быть также использован для определения скорости деградации белков-мишеней в клетке.
Для этого в клетки вводится генетическая конструкция, кодирующая белок-мишень, слитый с PS-CFP2. Интенсивность голубой флуоресценции в
клетке соответствует концентрации химерного белка и зависит как от скорости его синтеза и созревания, так и от скорости деградации. После полной
фотоконверсии PS-CFP2 во всей клетке, появляется пул молекул химерного
белка, обладающих зеленой флуоресценцией. Отслеживая падение уровня зеленой флуоресценции, можно оценить скорость деградации химерного
белка.
Фотоактивируемые метки открыли новые перспективы в развитии микроскопии высокого разрешения. Микроскопия PALM (photoactivated localization microscopy) с использованием фотоактивируемых флуоресцентных
белков позволяет визуализировать внутриклеточные белки с нанометровым
разрешением.
а
б
а
б
в
г
Мониторинг перестройки цитоскелета с помощью фотоконвертируемого химерного белка
PS-CFP2- -актин: (а) локализация химерного
белка в эпителиальных клетках печени опоссума; (б) фотоконверсия PS-CFP2 в выбранном
регионе (красный прямоугольник) с помощью
облучения диодным лазером с длиной волны
405 нм и 40% мощностью; (в) изображение
клетки через 10 мин после облучения. Видно
включение активированного белка в филаменты
необлученной области; (г) изображение клетки
через 30 мин после облучения. Наблюдается перераспределение фотоконвертированного
белка по всей клетке. Фотографии предоставлены М.Девидсоном (Государственный Университет Флориды, США).
в
Использование PA-TagRFP для PALM: (a, б) визуализация флуоресцентных сигналов химерных
белков VSVG-PAGFP (а) и EGFR-PATagRFP (б), полученная с помощью PALM; (в) совмещение
изображений (а) и (б). Стрелками указана наблюдаемая колокализация молекул белков VSVG и
EGFR.
www.evrogen.ru
45
Клеточная биология : Флуоресцентные белки
Визуализация флуоресцентных белков
Рекомендуемые наборы фильтров
Цвет флуоресценции
Белки
Максимумы возбуждения /
эмиссии флуоресценции, нм
Наборы фильтров
СИНИЙ
TagBFP
402/457
Omega Optical XF119-2; QMAX-Blue
Semrock DAPI-5060B
Chroma Technology Corp. 31016
(Hydroxycoumarin)
ГОЛУБОЙ
TagCFP
458/480
Omega Optical XF114-2; XF130-2
Стандартные наборы фильтров для ECFP
PS-CFP (до активации)
400/468
Omega Optical XF119-2*; XF131; XF06;
XF03; XF11; XF129-2; XF05-2
Стандартные наборы фильтров для ECFP
ЗЕЛЕНЫЙ
TagGFP2
TurboGFP
PS-CFP (после активации)
482/505
482/502
490/511
Omega Optical QMAX-Green; XF100-2;
XF100-3; XF115-2; XF116-2
Semrock DAPI-5060B*; DAPI-1160A
Chroma Technology Corp. 31037, 31041,
31016, 31021, 31000v2, 1009v2, 31013v2,
11005v2, 31047
ЖЕЛТЫЙ
TagYFP
508/524
Omega Optical XF104-3; XF105-2
Chroma Technology Corp. 41028 Yellow GFP
BP (10C/Topaz)
TurboYFP
PhiYFP
525/538
525/537
Omega Optical XF104-3
Chroma Technology Corp. 42003 (ZsYellow1)
КРАСНО-ОРАНЖЕВЫЙ
TagRFP
TurboRFP
555/584
553/574
Omega Optical QMAX-Yellow; XF108-2;
XF101-2; XF111-2
Стандартные наборы фильтров для TRITC
КРАСНЫЙ
TurboFP602
FusionRed
PA-TagRFP
KFP-Red
574/602
580/608
562/595
580/600
Omega Optical QMAX-Red; XF102-2; XF174
Стандартные наборы фильтров для TRITC
ДАЛЬНИЙ КРАСНЫЙ
mKate2
TurboFP635
588/635
588/635
Omega Optical QMAX-Red
Стандартные наборы фильтров для Texas Red
NirFP
605/670
Omega Optical XF110-2**; XF102-2,
XF40-2
Chroma Technology Corp. 41024 Cy5
Longpass Emission**; 49006 ET – Cy5**;
11010v2 Yellow, 41024 Cy5 Longpass
Emission
Semrock Cy5-4040A**; Cy5-4040B**;
LF594/LP-A**; LF594/LP-A
Стандартные наборы фильтров для Texas Red
Chroma Technology Corp. (www.chroma.com); Omega Optical (www.omegafilters.com); Semrock (www.semrock.com).
* – предпочтительные наборы фильтров.
** – наборы фильтров, позволяющие эффективно отличать флуоресценцию NirFP от красно-оранжевых белков (TagRFP и TurboRFP).
46
Евроген, Каталог 2013/14
Векторы для экспреcсии флуоресцентных белков
Экспрессионные С-векторы
Репортер
Флуоресцентный белок
Генетический код
репортера
Оптимизирован для экспрессии в клетках
млекопитающих
Промотор
Ранний промотор цитомегаловируса (CMV)
Клетки-хозяева
Клетки млекопитающих
Селекция
Прокариоты – канамицин
Эукариоты – неомицин (G418)
Ориджин репликации
Прокариоты – pUC
Эукариоты – ориджин вируса SV40
Описание
Векторы предназначены для экспрессии гена
флуоресцентного белка в клетках млекопитающих.
Полилинкер, расположенный на 3’-конце кодирующей
последовательности гена флуоресцентного белка (до
сайта полиаденилирования), позволяет конструировать
химерные флуоресцентные белки с присоединением
последовательности партнера слияния к С-концу
флуоресцентного белка.
Схема экспрессионного C-вектора. PCMV IE –
ранний промотор цитомегаловируса; FP – флуоресцентный белок; MCS – полилинкер; polyA
– сайт полиаденилирования; HSV TK – тимидинкиназа вируса простого герпеса; P –
бактериальный промотор; PSV40 – промотор вируса SV40; Kanr /Neor – ген устойчивости к
канамицину/неомицину; ori – ориджин репликации.
Продукт
Репортер
Цвет флуоресценции
Структура
Кат.#
pFusionRed-C
FusionRed
красный
мономер
FP411
20 мкг
pmKate2-C
mKate2
дальний красный
мономер
FP181
20 мкг
pNirFP-C
NirFP
дальний красный
димер
FP741
20 мкг
pPA-TagRFP-C
PA-TagRFP
разжигаемый красный
мономер
FP811
20 мкг
pPhi-Yellow-C
PhiYFP-m
желтый
димер
FP601
20 мкг
pPS-CFP2-C
PS-CFP2
голубой -> зеленый
мономер
FP801
20 мкг
pTagBFP-C
TagBFP
синий
мономер
FP171
20 мкг
pTagCFP-C
TagCFP
голубой
мономер
FP111
20 мкг
pTagGFP2-C
TagGFP2
зеленый
мономер
FP191
20 мкг
pTagRFP-C
TagRFP
оранжево-красный
мономер
FP141
20 мкг
pTagYFP-C
TagYFP
желтый
мономер
FP131
20 мкг
pTurboFP602-C
TurboFP602
красный
димер
FP711
20 мкг
pTurboFP635-C
TurboFP635
дальний красный
димер
FP721
20 мкг
pTurboFP650-C
TurboFP650
дальний красный
димер
FP731
20 мкг
pTurboGFP-C
TurboGFP
зеленый
димер
FP511
20 мкг
pTurboRFP-C
TurboRFP
оранжево-красный
димер
FP231
20 мкг
pTurboYFP-C
TurboYFP
желтый
димер
FP611
20 мкг
PCMV IE
pUC ori
FP
HSV TK
poly A
C-вектор
r
MCS
SV40 poly A
r
Kan /Neo
f1 ori
SV40 ori P
Клеточная биология
PSV40
Количество
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
47
Клеточная биология : Флуоресцентные белки
Экспрессионные N-векторы
PCMV IE
Репортер
Флуоресцентный белок
Генетический код
репортера
Оптимизирован для экспрессии в клетках
млекопитающих
MCS
pUC ori
HSV TK
poly A
FP
N-вектор
Промотор
Ранний промотор цитомегаловируса (CMV)
Клетки-хозяева
Клетки млекопитающих
Селекция
Прокариоты – канамицин
Эукариоты – неомицин (G418)
Ориджин репликации
Прокариоты – pUC
Эукариоты – ориджин вируса SV40
Описание
Векторы предназначены для экспрессии гена
флуоресцентного белка в клетках млекопитающих.
Полилинкер, расположенный на 5’-конце кодирующей
последовательности гена-репортера (после промотора),
позволяет конструировать химерные флуоресцентные
белки с присоединением последовательности партнера
слияния к N-концу флуоресцентного белка.
Схема экспрессионного N-вектора. PCMV IE –
ранний промотор цитомегаловируса; MCS –
полилинкер; FP – флуоресцентный белок; polyA
– сайт полиаденилирования; HSV TK – тимидинкиназа вируса простого герпеса; P –
бактериальный промотор; PSV40 – промотор вируса SV40; Kanr /Neor – ген устойчивости к
канамицину/неомицину; ori – ориджин репликации.
Продукт
Репортер
Цвет флуоресценции
Структура
Кат.#
pFusionRed-N
FusionRed
красный
мономер
FP412
pKindling-Red-N
KFP-Red
разжигаемый красный
тетрамер
FP301
20 мкг
pmKate2-N
mKate2
дальний красный
мономер
FP182
20 мкг
peNirFP-N
NirFP
дальний красный
димер
FP743
20 мкг
pPA-TagRFP-N
PA-TagRFP
разжигаемый красный
мономер
FP812
20 мкг
pPhi-Yellow-N
PhiYFP
желтый
димер
FP602
20 мкг
pPS-CFP2-N
PS-CFP2
голубой -> зеленый
мономер
FP802
20 мкг
pTagBFP-N
TagBFP
синий
мономер
FP172
20 мкг
pTagCFP-N
TagCFP
голубой
мономер
FP112
20 мкг
pTagGFP2-N
TagGFP2
зеленый
мономер
FP192
20 мкг
pTagRFP-N
TagRFP
оранжево-красный
мономер
FP142
20 мкг
pTagYFP-N
TagYFP
желтый
мономер
FP132
20 мкг
pTurboFP602-N
TurboFP602
красный
димер
FP712
20 мкг
pTurboFP635-N
TurboFP635
дальний красный
димер
FP722
20 мкг
pTurboFP650-N
TurboFP650
дальний красный
димер
FP732
20 мкг
pTurboGFP-N
TurboGFP
зеленый
димер
FP512
20 мкг
pTurboRFP-N
TurboRFP
оранжево-красный
димер
FP232
20 мкг
Kanr /Neor
SV40 poly A
f1 ori
PSV40
SV40 ori P
Количество
20 мкг
pTurboYFP-N
TurboYFP
желтый
димер
FP612
20 мкг
pPhi-Yellow-dest1
PhiYFP-m-dest1*
желтый
димер
FP608
20 мкг
peTurboGFP-dest1
TurboGFP-dest1*
зеленый
димер
FP524
20 мкг
peTurboYFP-dest1
TurboYFP-dest1*
желтый
димер
FP617
20 мкг
*dest1 – дестабилизированная версия флуоресцентного белка.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
48
Евроген, Каталог 2013/14
Готовые векторы для мечения вну триклеточных структур
PCMV IE
Флуоресцентный белок, слитый с сигналом
внутриклеточной локализации
Генетический код
репортера
Оптимизирован для экспрессии в клетках
млекопитающих
Промотор
Ранний промотор цитомегаловируса (CMV)
Клетки-хозяева
Клетки млекопитающих
Селекция
Прокариоты – канамицин
Эукариоты – неомицин (G418)
Ориджин репликации
Прокариоты – pUC
Эукариоты – ориджин вируса SV40
Описание
Векторы предназначены для мечения внутриклеточных
структур (митохондрии, аппарат Гольджи, пероксисомы,
эндосомы, лизосомы, эндоплазматический ретикулум,
плазматическая мембрана) в клетках млекопитающих.
Продукт
Репортер
FP-LS
pUC ori
HSV TK
poly A
Вектор для
мечения
внутриклеточных
структур
SV40 poly A
f1 ori
Kanr /Neor
Цвет флуоресценции
P
SV40 ori
PSV40
Схема вектора для мечения внутриклеточных
структур. PCMV IE – ранний промотор цитомегаловируса; FP-SL – флуоресцентный белок,
слитый с сигналом внутриклеточной локализации; polyA – сайт полиаденилирования; HSV
TK – тимидинкиназа вируса простого герпеса;
P – бактериальный промотор; PSV40 – промотор
вируса SV40; Kanr /Neor – ген устойчивости к
канамицину/неомицину; ori – ориджин репликации.
Структура
Кат.#
Количество
Клеточная биология
Репортер
Митохондрии
pKindling-Red-mito
KFP-Red
разжигаемый красный
тетрамер
FP401
20 мкг
pmKate2-mito
mKate2
дальний красный
мономер
FP187
20 мкг
pPhi-Yellow-mito
PhiYFP
желтый
димер
FP607
20 мкг
pTagCFP-mito
TagCFP
голубой
мономер
FP117
20 мкг
pTagGFP2-mito
TagGFP2
зеленый
мономер
FP197
20 мкг
pTagRFP-mito
TagRFP
оранжево-красный
мономер
FP147
20 мкг
pTagYFP-mito
TagYFP
желтый
мономер
FP137
20 мкг
pTurboFP602-mito
TurboFP602
красный
димер
FP717
20 мкг
pTurboGFP-mito
TurboGFP
зеленый
димер
FP517
20 мкг
pTurboRFP-mito
TurboRFP
оранжево-красный
димер
FP237
20 мкг
pFusionRed-Golgi
FusionRed
красный
мономер
FP419
20 мкг
pTagRFP-Golgi
TagRFP
оранжево-красный
мономер
FP367
20 мкг
pmKate2-peroxi
mKate2
дальний красный
мономер
FP313
20 мкг
pPhi-Yellow-peroxi
PhiYFP-m
желтый
димер
FP606
20 мкг
pFusionRed-endo
FusionRed
красный
мономер
FP427
20 мкг
pmKate2-endo
mKate2
дальний красный
мономер
FP314
20 мкг
mKate2
дальний красный
мономер
FP312
20 мкг
А п п а р а т Го л ь д ж и
Пероксисомы
Эндосомы
Лизосомы
pmKate2-lyso
Эндоплазматический ретикулум
pFusionRed-ER
FusionRed
красный
мономер
FP420
20 мкг
pmKate2-ER
mKate2
дальний красный
мономер
FP324
20 мкг
Плазматическая мембрана
pFusionRed-f-mem
FusionRed
красный
мономер
FP418
20 мкг
pmKate2-f-mem
mKate2
дальний красный
мономер
FP186
20 мкг
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
49
Клеточная биология : Флуоресцентные белки
Готовые векторы для мечения белков
PCMV IE
Репортер
Генетический код
репортера
Флуоресцентный белок, слитый с целевым клеточным
белком
Оптимизирован для экспрессии в клетках
млекопитающих
Промотор
Ранний промотор цитомегаловируса (CMV)
Клетки-хозяева
Клетки млекопитающих
Селекция
Прокариоты – канамицин
Эукариоты – неомицин (G418)
Ориджин репликации
Прокариоты – pUC
Эукариоты – ориджин вируса SV40
Описание
Векторы предназначены для мечения целевых белков в
клетках млекопитающих.
Продукт
Репортер
FP-fusion
pUC ori
HSV TK
poly A
Вектор для
мечения белков
SV40 poly A
f1 ori
Kanr /Neor
P
SV40 ori
PSV40
Схема вектора для мечения клеточных белков.
PCMV IE – ранний промотор цитомегаловируса;
FP-fusion – химерный флуоресцентный белок;
polyA – сайт полиаденилирования; HSV TK –
тимидинкиназа вируса простого герпеса; P –
бактериальный промотор; PSV40 – промотор вируса SV40; Kanr /Neor – ген устойчивости к
канамицину/неомицину; ori – ориджин репликации.
Цвет флуоресценции
Партнер слияния
Кат.#
Количество
Белки щелевых контактов
pFusionRed-Cx26
FusionRed
красный
коннексин 26
FP416
20 мкг
pTagFP635-Cx26
TagFP635
дальний красный
коннексин 26
FP382
20 мкг
pTagRFP-Cx26
TagRFP
оранжево-красный
коннексин 26
FP362
20 мкг
pTagFP635-Cx32
TagFP635
дальний красный
коннексин 32
FP383
20 мкг
pTagRFP-Cx32
TagRFP
оранжево-красный
коннексин 32
FP363
20 мкг
pFusionRed-Cx43
FusionRed
красный
коннексин 43
FP417
20 мкг
pTagFP635-Cx43
TagFP635
дальний красный
коннексин 43
FP384
20 мкг
pTagRFP-Cx43
TagRFP
оранжево-красный
коннексин 43
FP364
20 мкг
Белки везикулярного транспорта и метаболизма
pmKate2-clathrin
mKate2
дальний красный
клатрин LCB
FP322
20 мкг
pFusionRed-PDHA1
FusionRed
красный
пируватдегидрогеназа 1
FP430
20 мкг
pFusionRed-H2B
FusionRed
красный
гистон H2B
FP421
20 мкг
pmKate2-H2B
mKate2
дальний красный
гистон H2B
FP311
20 мкг
pPA-TagRFP-H2B
PA-TagRFP
разжигаемый красный
гистон H2B
FP815
20 мкг
pTagBFP-H2B
TagBFP
синий
гистон H2B
FP176
20 мкг
pTagRFP-H2B
TagRFP
оранжево-красный
гистон H2B
FP368
20 мкг
pFusionRed-laminB1
FusionRed
красный
ламин B1
FP422
20 мкг
pmKate2-laminB1
mKate2
дальний красный
ламин B1
FP310
20 мкг
pTagGFP2-laminB1
TagGFP2
зеленый
ламин B1
FP199
20 мкг
pTagRFP-laminB1
TagRFP
оранжево-красный
ламин B1
FP370
20 мкг
pFusionRed-PCNA
FusionRed
красный
PCNA
FP437
20 мкг
Ядерные белки
Белки сигнальной трансдукции
pFusionRed-annexin
FusionRed
красный
аннексин
FP414
20 мкг
pmKate2-annexin
mKate2
дальний красный
аннексин
FP321
20 мкг
pFusionRed-paxillin
FusionRed
красный
паксиллин
FP429
20 мкг
pmKate2-paxillin
mKate2
дальний красный
паксиллин
FP323
20 мкг
pFusionRed-CD151
FusionRed
красный
CD151
FP415
20 мкг
pFusionRed-Rab5a
FusionRed
красный
Rab-5A
FP431
20 мкг
pFusionRed-CDC42
FusionRed
красный
CDC42
FP435
20 мкг
продолжение...
50
Евроген, Каталог 2013/14
Продукт
Репортер
Цвет флуоресценции
Партнер слияния
Кат.#
Количество
FusionRed
красный
-актинин
FP426
20 мкг
pmKate2-actinin
mKate2
дальний красный
-актинин
FP317
20 мкг
pTagRFP-actinin
TagRFP
оранжево-красный
-актинин
FP360
20 мкг
pTagRFP-integrin
TagRFP
оранжево-красный
-V-интегрин
FP361
20 мкг
pFusionRed-tubulin
FusionRed
красный
-тубулин
FP433
20 мкг
pmKate2-tubulin
mKate2
дальний красный
-тубулин
FP185
20 мкг
pPA-TagRFP-tubulin
PA-TagRFP
разжигаемый красный
-тубулин
FP814
20 мкг
pTagBFP-tubulin
TagBFP
синий
-тубулин
FP175
20 мкг
pTagCFP-tubulin
TagCFP
голубой
-тубулин
FP115
20 мкг
pTagGFP2-tubulin
TagGFP2
зеленый
-тубулин
FP195
20 мкг
pTagRFP-tubulin
TagRFP
оранжево-красный
-тубулин
FP145
20 мкг
pTagYFP-tubulin
TagYFP
желтый
-тубулин
FP135
20 мкг
pFusionRed-actin
FusionRed
красный
-актин
FP413
20 мкг
pmKate2-actin
mKate2
дальний красный
-актин
FP184
20 мкг
pPA-TagRFP-actin
PA-TagRFP
разжигаемый красный
-актин
FP813
20 мкг
pTagBFP-actin
TagBFP
синий
-актин
FP174
20 мкг
pTagCFP-actin
TagCFP
голубой
-актин
FP114
20 мкг
pTagGFP2-actin
TagGFP2
зеленый
-актин
FP194
20 мкг
pTagRFP-actin
TagRFP
оранжево-красный
-актин
FP144
20 мкг
pTagYFP-actin
TagYFP
желтый
pmKate2-EB3
mKate2
дальний красный
pTagRFP-EB3
TagRFP
оранжево-красный
EB3
FP365
20 мкг
pFusionRed-MAP4
FusionRed
красный
MAP4
FP428
20 мкг
pTagRFP-FAK
TagRFP
оранжево-красный
киназа фокальной
адгезии
FP366
20 мкг
pmKate2-keratin
mKate2
дальний красный
цитокератин-18
FP319
20 мкг
pTagCFP-keratin
TagCFP
голубой
цитокератин-18
FP119
20 мкг
-актин
EB3
FP134
20 мкг
FP316
20 мкг
pTagRFP-keratin
TagRFP
оранжево-красный
цитокератин-18
FP369
20 мкг
pmKate2-profilin
mKate2
дальний красный
профилин
FP320
20 мкг
pTagRFP-profilin
TagRFP
оранжево-красный
профилин
FP371
20 мкг
pFusionRed-vimentin
FusionRed
красный
виментин
FP423
20 мкг
pmKate2-vimentin
mKate2
дальний красный
виментин
FP318
20 мкг
pFusionRed-vinculin
FusionRed
красный
винкулин
FP424
20 мкг
pTagFP635-vinculin
TagFP635
дальний красный
винкулин
FP388
20 мкг
pTagRFP-vinculin
TagRFP
оранжево-красный
винкулин
FP372
20 мкг
pFusionRed-zyxin
FusionRed
красный
зиксин
FP425
20 мкг
pmKate2-zyxin
mKate2
дальний красный
зиксин
FP315
20 мкг
pTagRFP-zyxin
TagRFP
оранжево-красный
зиксин
FP373
20 мкг
pFusionRed-myosin
FusionRed
красный
легкая цепь
миозина 9
FP436
20 мкг
pFusionRed-talin
FusionRed
красный
талин-1
FP432
20 мкг
pFusionRed-cadherin
FusionRed
красный
VE-кадхерин
FP434
20 мкг
Клеточная биология
Белки цитоскелета и адгезии
pFusionRed-actinin
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
51
Клеточная биология : Флуоресцентные белки
Лишенные промотора векторы
pUC ori
Репортер
Флуоресцентный белок
Генетический код
репортера
Оптимизирован для экспрессии в клетках
млекопитающих
HSV TK
poly A
MCS
FP
Лишенный
промотора
вектор
Промотор
Нет
Клетки-хозяева
Клетки млекопитающих
Селекция
Прокариоты – канамицин
Эукариоты – неомицин (G418)
Ориджин репликации
Прокариоты – pUC
Эукариоты – ориджин вируса SV40
Описание
Векторы предназначены для анализа активности промоторов в клетках млекопитающих. Перед трансфекцией
клеток в полилинкер вектора, расположенный на 5’-конце
кодирующей последовательности флуоресцентного белка,
необходимо клонировать функциональный промотор.
Схема лишенного промотора вектора. MCS –
полилинкер; FP – флуоресцентный белок; polyA
– сайт полиаденилирования; HSV TK – тимидинкиназа вируса простого герпеса; P –
бактериальный промотор; PSV40 – промотор вируса SV40; Kanr /Neor – ген устойчивости к
канамицину/неомицину; ori – ориджин репликации.
Продукт
Репортер
Цвет флуоресценции
Структура
Кат.#
pPhi-Yellow-PRL
PhiYFP
желтый
димер
FP604
20 мкг
pTurboFP602-PRL
TurboFP602
красный
димер
FP715
20 мкг
pTurboGFP-PRL
TurboGFP
зеленый
димер
FP515
20 мкг
pTurboRFP-PRL
TurboRFP
оранжево-красный
димер
FP235
20 мкг
pTurboYFP-PRL
TurboYFP
желтый
димер
FP615
20 мкг
pPhi-Yellow-PRL-dest1
PhiYFP-m-dest1*
желтый
димер
FP605
20 мкг
peTurboGFP-PRL-dest1
TurboGFP-dest1*
зеленый
димер
FP523
20 мкг
peTurboYFP-PRL-dest1
TurboYFP-dest1*
желтый
димер
FP616
20 мкг
Kanr /Neor
SV40 poly A
f1 ori
PSV40 SV40 ori P
Количество
*dest1 – дестабилизированная версия флуоресцентного белка.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Бактериальные экспрессионные векторы
Репортер
5’-Region
Флуоресцентный белок
Генетический код
репортера
Оптимизирован для экспрессии в клетках
млекопитающих
Промотор
T5 промотор / Lac оператор
Клетки-хозяева
Бактериальные клетки (E. coli )
FP
3’-Region
PT5/LacO
Бактериальный
экспрессионный
вектор
Селекция
Ампициллин
Ориджин репликации
Col E1
Описание
Векторы предназначены для экспрессии гена-репортера
(флуоресцентного белка) в клетках прокариот.
Схема бактериального экспрессионного вектора. FP – флуоресцентный белок; 3’-Reg и 5’-Reg
– регионы, фланкирующие кодирующую последовательность гена-репортера и содержащие
рестриктные сайты; Ampr – ген устойчивости
к ампициллину; ori – ориджин репликации,
PT5/LacO – T5 промотор/Lac оператор.
Продукт
Репортер
Цвет флуоресценции
Структура
Кат.#
pFusionRed-B
FusionRed
красный
мономер
FP438
pKindling-Red-B
KFP-Red
разжигаемый красный
тетрамер
FP302
20 мкг
pPhi-Yellow-B
PhiYFP
желтый
димер
FP603
20 мкг
Ampr
Col E1
Количество
20 мкг
pTurboFP602-B
TurboFP602
красный
димер
FP713
20 мкг
pTurboGFP-B
TurboGFP
зеленый
димер
FP513
20 мкг
pTurboRFP-B
TurboRFP
оранжево-красный
димер
FP233
20 мкг
pTurboYFP-B
TurboYFP
желтый
димер
FP613
20 мкг
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
52
Евроген, Каталог 2013/14
Плазмиды Gateway® С-ter minal entr y clone
attL1
Флуоресцентный белок
Промотор
Нет
Клетки-хозяева
Бактериальные клетки (E. coli )
Селекция
Канамицин
Ориджин репликации
pUC
Описание
Плазмиды предназначены для быстрого
переклонирования гена-репортера (флуоресцентного
белка) в экспрессионные Gateway® векторы для
гетерологической экспрессии. Кодирующая
последовательность гена-репортера фланкирована attL
сайтами для сайт-специфической рекомбинации с
помощью фермента LR Clonase II (Инвитроген).
На 3’-конце (последовательности репортера находится
полилинкер для конструирования химерных белков.
pUC ori
FP
Gateway R
C-terminal
entry clone
MCS
Stop
attL2
Kanr /Neor
P
Схема плазмиды Gateway® С-terminal entry
clone. FP – флуоресцентный белок; MCS – полилинкер; attL – сайты для рекомбинации; P
– бактериальный промотор; Kanr /Neor – ген
устойчивости к канамицину/неомицину; ori –
ориджин репликации, Stop – стоп кодон.
Продукт
Репортер
Цвет флуоресценции
Оптимизация
кодонов
Структура
Кат.#
Количество
Gateway® TagBFP-AS-C
TagBFP
синий
Arabidopsis,
Saccharomyces
мономер
FP177
20 мкг
Gateway® TagRFP-AS-C
TagRFP
оранжево-красный
Arabidopsis,
Saccharomyces
мономер
FP148
20 мкг
Gateway® TurboGFP-C
TurboGFP
зеленый
млекопитающие
димер
FP521
20 мкг
Клеточная биология
Ген-репортер
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Плазмиды Gateway® N-ter minal entr y clone
Ген-репортер
attL1 MCS
Флуоресцентный белок
pUC ori
Промотор
Нет
Клетки-хозяева
Бактериальные клетки (E. coli )
FP
Gateway R
N-terminal
entry clone
Селекция
Канамицин
Ориджин репликации
pUC
Описание
Плазмиды предназначены для быстрого
переклонирования гена-репортера (флуоресцентного
белка) в экспрессионные Gateway® векторы для
гетерологической экспрессии. Кодирующая
последовательность гена-репортера фланкирована attL
сайтами для сайт-специфической рекомбинации с
помощью фермента LR Clonase II (Инвитроген).
На 5’-конце (последовательности репортера находится
полилинкер для конструирования химерных белков.
Схема плазмиды Gateway® N-terminal entry
clone. FP – флуоресцентный белок; MCS – полилинкер; attL – сайты для рекомбинации; P
– бактериальный промотор; Kanr /Neor – ген
устойчивости к канамицину/неомицину; ori –
ориджин репликации, Stop – стоп кодон.
Продукт
Репортер
Цвет флуоресценции
Оптимизация
кодонов
Структура
Кат.#
Gateway® TagBFP-AS-N
TagBFP
синий
Arabidopsis,
Saccharomyces
мономер
FP178
20 мкг
Gateway® TagRFP-AS-N
TagRFP
оранжево-красный
Arabidopsis,
Saccharomyces
мономер
FP149
20 мкг
Gateway® TurboGFP-N
TurboGFP
зеленый
млекопитающие
димер
FP522
20 мкг
Stop
attL2
Kanr /Neor
P
Количество
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
53
Клеточная биология : Флуоресцентные белки
Готовые лентивирусные частицы
Мы предлагаем готовые к использованию лентивирусные частицы, несущие ген флуоресцентного белка. Область применения лентивирусных частиц
включает трансдукцию клеток-мишеней для получения флуоресцентных
клеток, создание стабильных клеточных линий, экспрессирующих флуоресцентные белки, и анализ чувствительности клеточных линий к трансдукции.
Лентивирусные частицы представляют собой высокоэффективное средство
доставки генетического материала. Они способны трансдуцировать как делящиеся, так и неделящихся и труднотрансфецируемые клетки, в том числе,
первичные культуры. Лентивирусные векторы эффективно встраиваются в
геном клеток-мишеней, вызывая стабильную экспрессию флуоресцентного
белка через 48-72 часа после трансдукции.
Готовые к работе лентивирусные частицы получены в культуре клеток 293Т
с помощью временной ко-трансфекции самоинактивирующегося лентивирусного вектора третьего поколения, несущего ген флуоресцентного белка,
и хелперных плазмид, кодирующих структурные белки и оболочку вируса везикулярного стоматита. Лентивирусный вектор разработан на основе
дефектного вируса иммунодефицита человека HIV-1. Упаковка частиц в
оболочку вируса везикулярного стоматита обеспечивает лентивирусам широкий тропизм к клеткам различного видового и тканевого происхождения.
Обработка клеток препаратом лентивирусных частиц приводит к проникновению в цитоплазму клетки-мишени вирусной РНК и белков. Вирусная
обратная транскриптаза синтезирует с РНК-генома вируса ДНК-копию,
которая интегрируется в геном клетки-хозяина. Интегрированный вирусный геном не способен к полной транскрипции из-за наличия в структуре
«самоинактивирующегося» LTR, что приводит к абортивной инфекции
(трансдукции) клеток. В трансдуцированных клетках происходит экспрессия флуоресцентного белка под контролем внутреннего универсального
промотора фактора элонгации трансляции EF1 .
Продукт
Описание
Кат.#
Лентивирусные частицы
в культуральной среде
DMEM c 10% FCS с
титром не менее
105 TU/мл
LP001
1 мл
LP002
1 мл
LP003
1 мл
LVT-TurboFP650
LP004
1 мл
LVT-TagGFP2
LP005
1 мл
LVT-FusionRed
LP006
1 мл
LVT-FusionRed-H2B
LP007
1 мл
LVT-FusionRed-Mem
LP008
1 мл
LVT-TagRFP
LVT-TagRFP-Puro
LVT-TurboFP635
RSV/LTR EF1
FP
WPRE SIN LTR
Схема генома лентивирусного вектора, кодирующего флуоресцентный белок.
RSV/LTR – Tat-независимый LTR; EF1 –
промотор фактора элонгации трансляции 1 ;
WPRE – пост-транскрипционный элемент вируса WHV; SIN LTR – «самоинактивирующийся»
LTR; FP – ген флуоресцентного белка.
а
б
в
г
Визуализация флуоресценции клеточных линий, стабильно-трансфецированных лентивирусами, несущими гены флуоресцентных белков: (а) клетки CHO-K1, белок FusionRed;
(б) клетки HeLa, белок TagGFP2; (в) клетки
Colon-26, белок FusionRed, слитый с сигналом локализации на плазматической мембране;
(г) клетки CHO-K1, белок FusionRed, слитый с
сигналом локализации на плазматической мембране.
Количество
При работе с лентивирусными частицами необходимо придерживаться правил работы с патогенными микроорганизмами II группы патогенности (опасности) (BSL-II: biosafety level II) в связи
с риском инсерционного мутагенеза.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти
на сайте www.evrogen.ru
54
Евроген, Каталог 2013/14
Рекомбинантные флуоресцентные белки
Рекомбинантные флуоресцентные белки очищены из культуры E. coli и обладают теми же спектральными характеристиками, что и соответствующие
белки, экспрессированные в клетке (см. страницу 40).
б
Визуализация окраски и флуоресценции рекомбинантных флуоресцентных белков: (а) проходящий свет; (б) ультрафиолетовая лампа.
Продукт
Описание
Кат.#
rKFP-Red
Очищенный рекомбинантный тетрамерный
фотоактивируемый красный флуоресцентный белок
KFP-Red*
FP351
Количество
100 мкг
rPhiYFP
Очищенный рекомбинантный димерный желтый
флуоресцентный белок PhiYFP**
FP651
100 мкг
rTurboGFP
Очищенный рекомбинантный димерный зеленый
флуоресцентный белок TurboGFP
FP552
100 мкг
Клеточная биология
Область применения
- положительный контроль для флуоресцентной микроскопии с использованием экспрессированных флуоресцентных белков
- стандарт при постановке Вестерн блот гибридизации, белкового гельэлектрофореза, флуориметрических исследованиях
- материал для микроинъекций
а
* KFP-Red – нефлуоресцентный окрашенный белок, который переходит во флуоресцентную форму при облучении зеленым светом.
** PhiYFP – версия белка TurboYFP, обладающая такими же спектральными характеристиками.
Мы также предлагаем выделение других рекомбинантных флуоресцентных белков из нашей коллекции на заказ.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
Антитела для анализа флуоресцентных белков
1
Коллекция очищенных поликлональных антител (IgG) кролика предназначена для иммунологической детекции флуоресцентных белков.
Антитела получены путем иммунизации кроликов рекомбинантными флуоресцентными белками и очищены методом аффинной хроматографии.
Область применения
- Вестерн блот
- иммуногистохимические исследования
- ELISA
2 3 4
5 6
7 8 9 10 11 12
а
б
в
г
Вестерн
блот
флуоресцентных
белков
с использованием антител: (a) AntiTag(CGY)FP;
(б)
Anti-TurboGFP(d);
(в) Anti-PhiYFP(d); (г) Anti-tRFP. (1) TagCFP;
(2) TagGFP; (3) TagYFP; (4) TagRFP;
(5) TurboFP602; (6) TurboGFP; (7) TurboYFP;
(8) TurboRFP; (9) PS-CFP2; (10) Dendra2;
(11) KillerRed; (12) EGFP.
Продукт
Специфичность
Кат.#
Anti-Tag(CGY)FP
TagCFP, TagGFP, TagGFP2, TagYFP, PS-CFP2,
Case12, HyPer и EGFP
AB121
100 мкг
AB122
200 мкг
TurboRFP, TurboFP602, TurboFP635, TurboFP650, NirFP,
TagBFP, TagRFP, TagFP635, mKate2 и PA-TagRFP
AB233
100 мкг
AB234
200 мкг
AB513
100 мкг
AB514
200 мкг
AB601
100 мкг
AB602
200 мкг
AB603
100 мкг
AB604
200 мкг
Anti-tRFP
Anti-TurboGFP(d)
Anti-PhiYFP
Anti-PhiYFP(d)
TurboGFP и CopGFP
неденатурированные PhiYFP, PhiYFP-m и TurboYFP
денатурированные PhiYFP, PhiYFP-m и TurboYFP
Количество
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
55
Клеточная биология : Флуоресцентные белки
Оптимизация векторов, разработка систем скрининга
на основе флуоресцентных белков
Флуоресцентные белки широко используются в различных системах функционального скрининга. Мы предлагаем услуги по модификации векторов,
кодирующих флуоресцентные белки, и создание скрининговых систем на их
основе:
- оптимизация нуклеотидных последовательностей флуоресцентных
белков с учетом частоты встречаемости кодонов для повышения
уровня экспрессии в гетерологических системах
- конструирование векторов на основе флуоресцентных белков для мечения клеточных структур и белков-мишеней
- конструирование векторов на основе флуоресцентных белков для
изучения активности промоторов
- субклонирование кодирующих флуоресцентные белки последовательностей в вектор по выбору заказчика.
- тестирование конструкций на панели клеточных линий
- подбор наиболее подходящих клеточных линий для функционального
скрининга
- получение стабильно-трансфецированных клеточных линий
Визуализация флуоресценции красного флуоресцентного белка mKate2, слитого с аннексином A4 человека, во время его транслокации
в клетках HeLa из цитоплазмы на плазматическую и ядерную мембраны в результате
индукции иономицином.
Услуга
Описание
Кат.#
Срок выполнения
Оптимизация векторов,
кодирующих
флуоресцентные белки
Любые модификации векторов, кодирующих
флуоресцентные белки, из продуктовой линейки компании
Евроген
FPS00
зависит от сложности заказа
Разработка систем
скрининга
Приготовление конструкций на основе флуоресцентных
белков и их тестирование на панели модельных клеточных
линий; подбор клеточных линий для скрининга; получение
стабильно-трансфецированных клеточных линий
AD001
зависит от сложности заказа
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
56
Евроген, Каталог 2013/14
Флуоресцентные генетически кодируемые биосенсоры
HyPer обладает высокой специфичностью к H2 O2 , не продуцирует АФК под
действием света и не чувствителен к супероксиду, окисленному глутатиону,
оксиду азота и пероксинитриту.
HyPer – флуоресцентный белок, имеющий два пика возбуждения флуоресценции (420 и 500 нм). Повышение концентрации H2 O2 вызывает
пропорциональное уменьшение пика на 420 нм и увеличение пика на
500 нм, что позволяет использовать HyPer как ратиометрический сенсор.
HyPer может быть непосредственно экспрессирован в клетках-мишенях или
направлен в клеточные компартменты для регистрации изменений концентрации H2 O2 в живых клетках и внутриклеточных структурах. Окисленный
HyPer способен к самовосстановлению, что позволяет проводить многократные измерения внутри одной и той же клетки или клеточной структуры.
Основные свойства биосенсора HyPer
Цвет флуоресценции
Максимум возбуждения флуоресценции
Максимум эмиссии флуоресценции
Специфичность
Чувствительность
pKa
Структура
Склонность к агрегации
Скорость созревания при 37°C
Длина полипептида
Молекулярная масса
зеленый
420 и 500 нм
516 нм
H2 O2
наномолярные концентрации
8.5
мономер
нет
высокая
478 аминокислот
52 кДа
Постоянно расширяемый список векторов для экспрессии биосенсора доступен на сайте компании Евроген (www.evrogen.ru). Мы также предлагаем
изготовление на заказ стабильных клеточных линий (см. страницу 66) и лентивирусных частиц (см. страницу 64), несущих ген биосенсора HyPer.
250
4
200
3
2
150
1
100
50
0
420
440
460
480
500
520
Длина волны, нм
Изменение спектра возбуждения флуоресценции биосенсора HyPer в ответ на добавление
H2 O2 : (1) спектр возбуждения в отсутствие
H2 O2 ; (2) после добавления 25 нМ H2 O2 ;
(3) после добавления 100 нМ H2 O2 ; (4) после
добавления 250 нМ H2 O2 .
0
3
25
285
Клеточная биология
HyPer – уникальный биосенсор, позволяющий проводить анализ изменений
внутриклеточной концентрации перекиси водорода – одной из основных активных форм кислорода (АФК), образующихся в клетке.
Флуоресценция, у.е.
Биосенсор HyPer:
анализ внутриклеточных колебаний концентрации H 2 O 2
Концентрация H2 O2
Низкая
Высокая
Регистрация колебаний концентрации H2 O2 с
помощью HyPer, экспрессированного в цитоплазме клеток HeLa. Серия конфокальных
рациометрических изображений клеток после
добавления в среду 180 мкМ H2 O2 . Время
после добавления H2 O2 (сек) показано над
изображением.
Продукт
Описание
Кат.#
pHyPer-cyto вектор
Вектор для экспрессии HyPer в клетках млекопитающих
под контролем CMV-промотора
FP941
Количество
20 мкг
pHyPer-dMito вектор
Вектор для экспрессии HyPer, слитого с сигналом
локализации в митохондриях, в клетках млекопитающих
под контролем CMV-промотора
FP942
20 мкг
pHyPer-nuc вектор
Вектор для экспрессии HyPer, слитого с сигналом
локализации в ядре, в клетках млекопитающих под
контролем CMV-промотора
FP944
20 мкг
Gateway® HyPer-AS entry
clone
Gateway® плазмида для быстрого переноса кодирующей
последовательности HyPer в экспрессионный Gateway®
вектор; генетический код HyPer оптимизирован для
экспрессии в Arabidopsis и Saccharomyces
FP943
20 мкг
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
57
Клеточная биология : Флуоресцентные генетически кодируемые биосенсоры
Case12 – флуоресцентный биосенсор, предназначенный для мониторинга
колебаний внутриклеточной концентрации ионов Ca2+ в широком диапазоне физиологических значений. При возрастании концентрации Ca2+ в
системе, Case12 демонстрирует двенадцатикратное увеличение интенсивности флуоресценции. Он связывает ионы кальция быстро и обратимо, что
позволяет отслеживать быстрые колебания Ca2+ .
Флуоресценция, %
Биосенсор Case12: мониторинг внутриклеточных
колебаний концентрации ионов кальция
100
80
60
40
20
Case12 может быть непосредственно экспрессирован в клетках-мишенях
или направлен в отдельные клеточные компартменты для регистрации внутриклеточных изменений в концентрации Ca2+ .
зеленый
491 нм
516 нм
Ca2+
Kd = 1 мкМ
7.2
мономер
нет
высокая
415 аминокислот
46.4 кДа
450
500
550
600
Длина волны, нм
а
Мы предлагаем векторы для экспрессии Case12 в клетках млекопитающих,
изготовление на заказ стабильных клеточных линий (см. страницу 66) и лентивирусных частиц (см. страницу 64), несущих ген Case12.
Флуоресценция, у.е.
400
Нормализованные спектры возбуждения (синяя линия) и эмиссии (зеленая линия) флуоресценции биосенсора Case12 до (пунктирная
линия) и после (сплошная линия) добавления
1 мМ Ca2+ .
Основные свойства биосенсора Case12
Цвет флуоресценции
Максимум возбуждения флуоресценции
Максимум эмиссии флуоресценции
Специфичность
Чувствительность
pKa
Структура
Склонность к агрегации
Скорость созревания при 37°C
Длина полипептида
Молекулярная масса
0
350
б
Регистрация изменения концентрации Ca2+ с
помощью биосенсора Case12 в клетках HeLa
при добавлении ионофора A23187: (а) визуализация флуоресценции Case12 до добавления
ионофора; (б) после добавления ионофора.
50
40
30
20
10
50
100
150
200
250
300
350
400
Время, сек.
Изменение флуоресценции клеток меланомы M21, экспрессирующих Case12 в ответ на добавление 100 мкМ АТФ. Регистрацию изменений флуоресценции осуществляли с помощью
конфокального микроскопа каждые 0.294 сек.
Продукт
Описание
Кат.#
Количество
pCase12-cyto вектор
Вектор для экспрессии Case12 в клетках млекопитающих
под контролем CMV-промотора
FP991
20 мкг
pCase12-mito вектор
Вектор для экспрессии Case12, слитого с сигналом
локализации в митохондриях, в клетках млекопитающих
под контролем CMV-промотора
FP992
20 мкг
pCase12-mem вектор
Вектор для экспрессии Case12, слитого с сигналом
локализации на мембране, в клетках млекопитающих под
контролем CMV-промотора
FP993
20 мкг
Gateway® Case12-cyto
entry clone
Gateway® плазмида для быстрого переноса кодирующей
последовательности Case12-cyto в экспрессионный
Gateway® вектор
FP994
20 мкг
Gateway® Case12-mito
entry clone
Gateway® плазмида для быстрого переноса кодирующей
последовательности Case12-mito в экспрессионный
Gateway® вектор
FP995
20 мкг
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
58
Евроген, Каталог 2013/14
Каждый из биосенсоров состоит из двух флуоресцентных белков, представляющих собой эффективную пару для резонансного переноса энергии
Ферстера (FRET), связанных полипептидным линкером DEVD. Последовательность DEVD опознается и специфически расщепляется каспазой-3.
Расщепление линкера приводит к нарушению FRET между флуоресцентными белками и изменению цвета флуоресценции биосенсора.
Основные свойства биосенсоров Casper3-BG и Casper3-GR
Характеристика
Casper3-BG
Casper3-GR
Длина полипептида (аминокислот)
Молекулярная масса
Эффективность FRET
Радиус Ферстера
490
55 кДа
0.57
5.25
484
54 кДа
0.5
5.7
Донор флуоресценции
Цвет флуоресценции
Максимум возбуждения (нм)
Максимум эмиссии (нм)
Яркость (% от EGFP)
pKa
TagBFP
синий
402
457
99
2.7
TagGFP
зеленый
482
505
104
4.7
Акцептор флуоресценции
Цвет флуоресценции
Максимум возбуждения (нм)
Максимум эмиссии (нм)
Яркость (% от EGFP)
pKa
TagGFP2
зеленый
483
506
105
5.0
TagRFP
красно-оранжевый
555
584
148
3.8
100
80
60
40
20
0
300
350
400
450
500
550
600
650
Длина волны, нм
Нормализованные
спектры
возбуждения
(пунктирные линии) и эмиссии (сплошные
линии) флуоресценции TagBFP (синий) и
TagGFP2 (зеленый). Перекрытие спектров
отмечено серым.
100
80
60
Клеточная биология
Каспаза-3 (CASP3, CPP32, apopain, YAMA) – член семейства аспартат-специфических цистеиновых протеаз, один из основных медиаторов
клеточного апоптоза. Ее активация происходит на ранних статдиях апоптоза путем самопротеолиза и/или за счет воздействия других протеаз.
Флуоресценция, %
Casper3-BG и Casper3-GR – флуоресцентные биосенсоры для мониторинга
активности каспазы-3 – предназначены для раннего выявления каспаза-3зависимого апоптоза в живых клетках.
Флуоресценция, %
Биосенсоры Casper3-BG и Casper3-GR:
ранняя детекция каспаза-3 зависимого апоптоза
40
20
0
350
400
450
500
550
600
650
700
Длина волны, нм
Нормализованные
спектры
возбуждения
(пунктирные линии) и эмиссии (сплошные
линии) флуоресценции TagGFP (зеленый)
и TagRFP (красный). Перекрытие спектров
отмечено серым.
30
60
180
326
Мы предлагаем векторы для экспрессии сенсоров Casper3-BG и Casper3-GR
в клетках млекопитающих, изготовление на заказ стабильных клеточных линий (см. страницу 66) и лентивирусных частиц (см. страницу 64), несущих
гены этих биосенсоров.
Изменение спектральных свойств сенсора Casper3-GR при индукции апоптоза в
клетках HeLa с помощью стауроспорина.
Цифрами указано время после добавления
стауроспорина (мин).
Продукт
Описание
Кат.#
Количество
pCasper3-GR вектор
Вектор для экспрессии Casper3-GR в клетках
млекопитающих под контролем CMV-промотора
FP971
20 мкг
pCasper3-BG вектор
Вектор для экспрессии Casper3-BG в клетках
млекопитающих под контролем CMV-промотора
FP970
20 мкг
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
59
Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы
Генетически кодируемый фотосенсибилизатор KillerRed – флуоресцентный
белок семейства GFP, обладающий красной флуоресценцией и способный
производить активные формы кислорода (АФК) при облучении зеленым
светом с длиной волны 540-580 нм. До активации KillerRed токсических
свойств не проявляет.
KillerRed может быть использован для избирательного светоиндуцируемого уничтожения клеток. Цитотоксический эффект KillerRed зависит от его
внутриклеточной локализации. Направленный в митохондрии KillerRed вызывает при облучении апоптотическую гибель клеток, а локализованный
на плазматической мембране – окисление липидного слоя и некроз. Экспрессированный в цитоплазме KillerRed имеет слабую цитотоксическую
активность против эукариотических клеток, однако эффективен для уничтожения бактериальных клеток.
KillerRed может быть также использован для селективной инактивации белков (технология CALI, chromophore-assisted light inactivation). Несмотря
на склонность к димеризации, KillerRed подходит для создания химерных
конструкций со многими клеточными белками, включая -актин, фибрилларин, Tau34, транспортер дофамина и т.д.
Флуоресценция, %
KillerRed
100
21.2
80
60
40
20
0
400
450
1.0
500
550
600
650
700
Длина волны, нм
Нормализованные спектры возбуждения (тонкая линия) и эмиссии (толстая линия) флуоресценции белка KillerRed.
Синий и зеленый столбцы – относительный фототоксический эффект KillerRed при облучении
синим (460-490 нм) и зеленым (540-580 нм)
светом с интенсивностью 35 мВт/см2 . Числа
над столбцами – уменьшение числа живых клеток E. coli после 30 мин облучения (раз).
а
Основные свойства фотосенсибилизатора KillerRed
Активирующий свет
Цвет флуоресценции
Максимум возбуждения
Максимум эмиссии
Яркость (% от EGFP)
Структура
Склонность к агрегации
Скорость созревания при 37°C
Длина полипептида
Молекулярная масса
зеленый (540-580 нм)
красный (до активации*)
585 нм
610 нм
34
димер
нет
низкая
239 аминокислот
27 кДа
б
0
2
14
22
34
42
* В результате активации KillerRed утрачивает способность к флуоресценции.
а
Мембрана
PH
domain
N
Цитоплазма
ROS
C
PH
domain
N
GFP
KillerRed
h
б
C
GFP
KillerRed
в
Светоиндуцируемое уничтожение клетки HeLa
с помощью белка KillerRed, локализованного на плазматической мембране: (а) конфокальное изображение клетки, экспрессирующей KillerRed (красная флуоресценция), локализованный на плазматической мембране,
и TurboGFP (зеленая флуоресценция) в цитоплазме; (б) конфокальные изображения этой
клетки после 10-минутного облучения зеленым
светом (ртутная лампа, 7 Вт/см2 , 515-560 нм).
Цифрами указано время после облучения, мин.
Шкала, 10 мкм.
Фотоиндуцируемая KillerRed-опосредованная инактивация PH-домена фосфоинозитид фосфатазы -1: (а) схема эксперимента; (б,в) конфокальные изображения клетки, экспрессирующей
химерный белок EGFP-PH-KillerRed (зеленый сигнал – флуоресценция EGFP) до (б) и после (в)
10-секундного облучения зеленым светом.
60
Евроген, Каталог 2013/14
ArrestRed
Механизм действия ингибитора ArrestRed заключается в фотоиндуцированном выделении активных форм кислорода, повреждающих геномную
ДНК. Такие повреждения инициируют процесс репарации и последующую
остановку клеточного цикла. После завершения репарации ДНК клетка возвращается к нормальному делению.
ArrestRed является уникальным инструментом для изучения роли отдельных клеточных популяций в процессах развития, регенерации и канцерогенеза.
а
б
циклопический глаз
глаз
мозг
глаз
мозг
Трансгенные головастики, экспрессирующие
ArrestRed под контролем промотора Xanf1,
специфического для переднего мозга: (а) головастик, подвергнутый облучению зеленым светом на стадии ранней нейрулы; (б) головастик,
не подвергнутый облучению. Данные любезно предоставлены А. Зарайским (ИБХ РАН,
Москва).
а
б
Клеточная биология
ArrestRed (H2B-tKR) – химерный белок, представляющий собой тандемный вариант фотосенсибилизатора KillerRed, связанный с гиcтоном
H2B. Экспрессирующийся в клетках ArrestRed связывается с хроматином,
однако до активации не влияет на клеточный цикл. После облучения интенсивным зелёным светом ArrestRed переходит в активированное состояние
и останавливает деление примерно на 24 часа. По прошествии этого времени приблизительно у 90% клеток, экспрессирующих ArrestRed, клеточный
цикл восстанавливается. Повторное облучение позволяет остановить клеточное деление на более длительное время.
Основные свойства фотосенсибилизатора ArrestRed
Активирующий свет
Цвет флуоресценции
Максимум возбуждения
Максимум эмиссии
Яркость (% от EGFP)
Структура
Склонность к агрегации
Скорость созревания при 37°C
Длина полипептида
Молекулярная масса
зеленый (540-580 нм)
красный (до активации*)
585 нм
610 нм
68
мономер
нет
низкая
637 аминокислот
70 кДа
Трансгенные головастики, экспрессирующие
ArrestRed под контролем промотора Xag2,
специфического для цементных желез. Верхняя панель – проходящий свет; нижняя –
красная флуоресценция. (а) ArrestRed был активирован на стадии ранней нейрулы; (б) активации ArrestRed не проводили. Данные любезно предоставлены А. Зарайским (ИБХ РАН,
Москва).
* В результате активации ArrestRed утрачивает способность к флуоресценции.
а
0
10
20
30
40
120
0
10
20
30
40
50
б
Визуализация митотических клеток HeLa, экспрессирующих ArrestRed. Показаны изображения красной флуоресценции и ее наложения на фотографии клеток, сделанные в проходящем
свете. Цифрами показано время в мин. (а) Клетка, подвергнутая облучению на стадии метафазы;
(б) необлученная клетка.
www.evrogen.ru
61
Клеточная биология : Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы
Векторы для экспреcсии и поликлональные антитела для детекции генетически
кодируемых фотосенсибилизаторов
Продукт
Описание
Кат.#
Количество
Векторы для экспреcсии KillerRed
pKillerRed-C вектор
Вектор для экспрессии KillerRed в клетках
млекопитающих под контролем CMV-промотора,
содержит полилинкер (MCS) на 3’-конце кодирующей
последовательности KillerRed
FP961
20 мкг
pKillerRed-N вектор
Вектор для экспрессии KillerRed в клетках
млекопитающих под контролем CMV-промотора,
содержит полилинкер (MCS) на 5’-конце кодирующей
последовательности KillerRed
FP962
20 мкг
pKillerRed-B вектор
Вектор для экспрессии KillerRed в клетках прокариот
FP963
20 мкг
pKillerRed-dMito вектор
Вектор для экспрессии KillerRed, слитого с сигналом
локализации в митохондриях, в клетках млекопитающих
под контролем CMV-промотора. Активация KillerRed,
локализованного в митохондриях, приводит к гибели
клеток путем апоптоза
FP964
20 мкг
pKillerRed-mem вектор
Вектор для экспрессии KillerRed, слитого с сигналом
локализации на мембране, в клетках млекопитающих под
контролем CMV-промотора. Активация KillerRed,
локализованного на мембране, приводит к гибели клеток в
следствие разрушения липидного слоя.
FP966
20 мкг
FP980
20 мкг
AB961
100 мкг
AB962
200 мкг
Вектор для экспреcсии ArrestRed
pArrestRed вектор
Вектор для экспрессии ArrestRed в клетках
млекопитающих под контролем CMV-промотора
Поликлональные антитела
Антитела Anti-KillerRed
Поликлональные антитела кролика к белкам
KillerRed, ArrestRed и JRed
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
62
Евроген, Каталог 2013/14
Трансфекция и трансдукция
Мы предлагаем услуги по осуществлению временной трансфекции культур
клеток плазмидной ДНК, несущей целевой ген. Экспрессия целевого гена
начинается в среднем через 24 часа и наблюдается от 48 до 96 часов в
зависимости от типа клеток и особенностей белка.
Для трансфекции может быть использована клеточная линия из нашей коллекции или клеточная линия, предоставленная заказчиком. Все клеточные
линии обязательно проходят проверку на контаминацию микоплазмой. При
необходимости, проводится оптимизация условий трансфекции для выбранной клеточной линии.
а
б
в
г
Дополнительные услуги могут включать клонирование целевого гена в выбранный плазмидный вектор, а также анализ трансфецированных клеток с
помощью флуоресцентной микроскопии, иммуноцитохимии и т.д.
Список доступных клеточных линий:
- A-431 – эпителиподобные клетки из эпидермоидной карциномы человека
- НЕК-293 – эпителиподобные клетки из эмбриональной почки человека,
трансформированы ДНК аденовируса
- 293Т – из эмбриональной почки человека, трансформированы ДНК
аденовируса и Т-антигена SV-40
- HeLa – эпителиподобные клетки из цервикальной карциномы человека
- HeLa-Kyoto – эпителиподобные клетки из цервикальной карциномы
человека
- Hs-68 – фибробласты кожи человека
- WI-38 – фибробласты легкого человека
- U2OS – эпителиподобные клетки из остеосаркомы человека
- 3T3 - Swiss albino – эмбриональные фибробласты мыши линии Swiss
- 3T3-NIH – эмбриональные фибробласты мыши линии NIH
- BHK-21 clone 13 – фибробласты почки сирийского хомячка
- IAR-2 – эпителиподобные клетки печени крысы
- RAW-264.7 – эмбриональные фибробласты крысы
- Vero – эпителиподобные клетки почки зеленой мартышки
- MDCK-II – эпителиподобные клетки почки собаки
Визуализация флуоресценции клеток HeLa,
временно трансфецированных конструкциями, несущими гены флуоресцентных белков:
(а) зеленый флуоресцентный белок TurboGFP;
(б) красный флуоресцентный белок TurboRFP;
(в) красный флуоресцентный белок TagRFP,
слитый с гистоном H2B, синий флуоресцентный белок TagBFP, слитый с цитоплазматическим -актином, и направленный в пероксисомы желтый флуоресцентный белок PhiYFP
(котрансфекция); (г) красный флуоресцентный
белок mKate2, слитый с аннексином А4 (котрансфекция).
Клеточная биология
Временная трансфекция культур клеток на заказ
Список доступных для трансфекции клеточных линий постоянно расширяется. Актуальные предложения доступны на нашем сайте www.evrogen.ru.
Услуга
Описание
Кат.#
Трансфекция культуры
клеток плазмидной ДНК
Подготовка вектора для трансфекции (клонирование,
перетрансформация и выделение плазмидной ДНК);
подготовка клеточной линии (разморозка, пассирование,
проверка на микоплазму); оптимизация условий
трансфекции; трансфекция и культивирование клеток;
приготовление клеточного осадка или клеточной суспензии
CS053
Срок выполнения
2-4 недели
Дополнительные услуги
Переклонирование целевой последовательности ДНК в экспрессионный вектор
договорной
Клонирование целевой последовательности ДНК из биологического материала
договорной
Анализ трансфецированных клеток
договорной
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
63
Клеточная биология : Трансфекция и трансдукция
Конструирование лентивирусных частиц на заказ
Мы предлагаем услуги по изготовлению лентивирусных векторов и наработке частиц для доставки чужеродной ДНК в различные типы клеток.
При создании целевых конструкций используется самоинактивирующийся
вектор третьего поколения на основе дефектного вируса иммунодефицита
человека, в котором удалено около 80% нуклеотидной последовательности
генома HIV-1. Вектор кодирует только переносимую ДНК и содержит cisэлементы, необходимые для ее упаковки и интеграции.
RSV/LTR EF1
Целевой ген WPRE SIN LTR
Схема генома лентивирусного вектора, кодирующего целевой ген. RSV/LTR – Tat-независимый LTR; EF1 – промотор фактора элонгации трансляции 1 ; WPRE – пост-транскрипционный элемент вируса WHV; SIN LTR –
«самоинактивирующийся» LTR.
Сборка лентивирусных частиц происходит в результате коэкспрессии в
293Т клетках лентивирусного вектора и хелперной плазмиды, кодирующей
оболочку вируса везикулярного стоматита и структурные белки вирусных
частиц.
Преимущества лентивирусов:
- интегрируются в геном клетки-мишени, обеспечивая постоянную экспрессию трансгена
- доставляют ДНК в труднотрансфецируемые и неделящиеся клетки,
включая первичные дифференцированные клетки (нейроны, макрофаги,
гепатоциты)
- имеют широкий тропизм благодаря упаковке в оболочку вируса везикулярного стоматита
- имеют низкую иммуногенность (в опытах на животных)
- имеют высокую емкость (вставки длиной до 8 т.п.н.).
Услуга
Описание
Кат.#
Конструирование
лентивирусов
Конструирование лентивирусного вектора, кодирующего
целевую последовательность ДНК под контролем
универсального промотора. Наработка лентивирусных
частиц с титром* 105 -106 TU/мл в клетках 293Т в
культуральной среде DMEM.
CS050
Срок выполнения
договорной
* Титр частиц, содержащих ген флуоресцентного белка, определяют на трансдуцированных клетках HEK293, титр прочих частиц – по концентрации
вирусного капсидного белка р24 в иммуноферментном анализе.
На странице 54 приведен список готовых лентивирусов, несущих гены флуоресцентных белков.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
64
Евроген, Каталог 2013/14
Лентивирусные конструкции для РНК-интерференции
на заказ
pGPV
вставка shRNA
петля
антисенс
19-23 п.о.
Мы предлагаем лентивирусную систему для эффективной доставки и стабильной экспрессии siRNA в культурах клеток. Лентивирусные векторы
позволяют доставить siRNA даже в неделящиеся первичные клетки и трудно
трансфецируемые клеточные линии.
Для создание конструкции используется лентивирусный вектор pGPV, содержащий Н1 промотор для экспрессии shRNA – двуцепочечной РНК со
шпилечной структурой, которая в клетке-мишени в результате процессинга
превращается в siRNA.
сенс
H1
9-12 п.о.
19-23 п.о.
Транскрипция
5’3’-
транскрипт shRNA
Dicer
siRNA
Схема образования siRNA при экспрессии вектора pGPV.
Вектор pGPV несет ген устойчивости к пуромицину и зеленый флуоресцентный белок CopGFP, позволяющие детектировать трансфецированные клетки
с помощью флуоресценции и проводить их селекцию на антибиотике (пуромицине).
а
siRNA–
siRNA+
б
siRNA–
Клеточная биология
РНК-интерференция (RNAi) – явление, при котором короткие двуцепочечные РНК (siRNA) инициируют подавление экспрессии генов в результате
сиквенс-специфической деградации комплементарной мРНК. РНК-интерференция стала эффективным экспериментальным орудием, позволяющим
регулировать экспрессию генов.
siRNA+
Анализ эффективности siRNA в культурах клеток: (а) клетки НЕК293, котрансфецированные
плазмидой pTagRFP и лентивирусным вектором, кодирующим anti-TagRFP siRNA; (б) клеточная
линия HeLa, стабильно экспрессирующая TagRFP, через 3 дня после трансдукции лентивирусом, кодирующим anti-TagRFP siRNA. Красная флуоресценция – экспрессия TagRFP. Зеленый
флуоресцентный маркер CopGFP служит для детекции трансфецированных (а) или трансдуцированных (б) клеток.
Услуга
Описание
Кат.#
Конструирование и
наработка лентивируса
для РНК-интерференции
Синтез пары олигонуклеотидных последовательностей,
кодирующей shRNA, не более 70 оснований,
конструирование лентивирусного вектора, кодирующего
shRNA, подтверждение секвенированием
CS051
Срок выполнения
2 недели
Наработка лентивирусных частиц с титром 105 -106 TU/ml
в клетках 293Т в культуральной среде DMEM,
определение титра
CS052
3 недели
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
65
Клеточная биология : Трансфекция и трансдукция
Создание стабильно трансфецированных
клеточных линий на заказ
Мы предлагаем услуги по созданию клеточных линий млекопитающих,
стабильно экспрессирующих флуоресцентные белки (см. страницу 39), фотосенсибилизатор KillerRed (см. страницу 60) и биосенсоры (см. страницу
57) из нашей коллекции. ДНК, кодирующая выбранный флуоресцентный
маркер, интегрируется в геном клетки с помощью трансдукции лентивирусным вектором. Клеточные линии, созданные с использованием лентивирусной трансдукции, обладают рядом преимуществ:
а
б
в
г
- возможно получение клеточных клонов, содержащих строго одну копию
интересующего гена на клеточный геном
- полученные клеточные линии не теряют встроенную ДНК
- не требуется культивирование клеточных линий в присутствии селективного антибиотика.
Применение самоинактивирующихся лентивирусных векторов (технология
SIN) исключает возможность образования вирусоподобных частиц в культуре трансдуцированных клеток, поэтому при работе с такими клеточными
линиями не требуются особые условия и меры безопасности.
Стабильно трансфецированные клеточные линии, экспрессирующие флуоресцентные белки:
(а) клетки HeLa, белок Fusion Red, слитый с сигналом локализации на мембране (наложение
фотографии клеток в проходящем свете и флуоресценции); (б) клетки HeLa, белок FusionRed,
слитый с гистоном H2B; (в) клетки HeLa, белок KillerRed, слитый с сигналом локализации в
митохондриях; (г) клетки Colon26, белок Fusion
Red.
Услуга
Описание
Кат.#
Создание моноклональной
клеточной линии,
стабильно
экспрессирующей
флуоресцентный белок
Конструирование лентивирусного вектора для
трансдукции; трансдукция клеточной линии; клонирование
и отбор клеточных клонов; наращивание моноклональной
клеточной линии
CS054
Срок выполнения
8 недель
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
66
Евроген, Каталог 2013/14
Молек улярная медицина
Молекулярная онкология
Молекулярная генетика наследственных заболеваний
Исследования в области молекулярной медицины
Молекулярная медицина
68
Молекулярная онкология . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
69
Наборы реактивов Insider . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
69
Набор Insider B-Raf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
69
Набор Insider K-Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
70
Услуги в области молекулярной онкологии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
Молекулярная генетика наследственных заболеваний . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
76
Услуги в области молекулярной генетики наследственных заболеваний . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
76
Исследования в области молекулярной медицины по ТЗ заказчика . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
Евроген, Каталог 2013/14
Молекулярная онкология
Наборы реактивов Insider
Молекулярная медицина
Наборы реактивов Insider предназначены для детекции мутаций в «горячих
точках» ключевых клеточных протоонкогенов B-Raf и K-Ras, выявляющихся
в большинстве злокачественных опухолей человека. Возможные применения наборов включают молекулярное профилирование опухолевых клеток и
поиск мутаций в биологических жидкостях.
Для анализа может быть использована ДНК человека, полученная из различного биологического материала (культуры клеток, ткани, мазки, соскобы,
биологические жидкости).
Анализ производится методом мутационно-специфической ПЦР с детекцией в режиме реального времени (описание технологии – см. страницу 89).
Специфичность обнаружения в образце целевых фрагментов генов составляет 100%, специфичность обнаружения в образце фрагментов гена с
мутациями – 99.5%.
Наборы позволяют выявлять 15 и более копий гена в образце, содержащем
не менее 10 нг геномной ДНК. Выявление мутантных вариантов возможно
на фоне 200-кратного избытка копий гена дикого типа.
Набор Insider B -Raf
Набор предназначен для выявления мутаций в 600-м и 601-м кодонах гена
B-Raf (15-й экзон).
Ген B-Raf активируется более чем в 10% случаев злокачественных опухолей человека. Основным механизмом его активации являются точечные
мутации, более 90% которых приходится на 600-й и 601-й кодоны. Мутации в этом регионе гена B-Raf отличаются высокой функциональной
однородностью: все они приводят к активации сигнальных каскадов, в которые включен белок BRAF, прежде всего каскада Ras-Raf-Mek-ERK.
б
Первичная опухоль
Rn, RFU
а
в
0.2
0.1
0
-0.1
-0.2
-0.3
-0.4
-0.5
-0.6
-0.7
BRaf Tot
BRaf Mut
4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Номер цикла ПЦР
д
Rn, RFU
Лимфатический узел
г
е
0.2
0.1
0
-0.1
-0.2
-0.3
-0.4
-0.5
-0.6
-0.7
BRaf Tot
BRaf Mut
4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Номер цикла ПЦР
Анализ мутаций в 15-м экзоне гена B-Raf методом мутационно-специфической ПЦР: уточнение характера мутации и выявление микрометастазов в
лимфатическом узле. (а, б, в) Первичная опухоль (меланома кожи); (г, д, е) лимфатический узел. (а, г) Стандартный анализ (ПЦР + секвенирование):
(а) выявлены две мутации (нуклеотидные замены), (г) мутаций не выявлено. (б, д) Мутационно-специфическая ПЦР в режиме реального времени с
помощью набора Insider B-Raf: (б) выявлена мутация в концентрации около 50%, (д) выявлена мутация в концентрации около 15%. (в, е) Секвенирование продукта мутационно-специфической ПЦР: (в) выявлен сцепленный характер мутаций, (е) выявлены идентичные мутации – верифицировано
метастатическое поражение.
www.evrogen.ru
69
Молекулярная медицина : Молекулярная онкология
Набор Insider K-Ras
Набор предназначен для выявления любых мутаций в 12-м и 13-м кодонах гена K-Ras (2-й экзон). Мутации гена K-Ras выявляются более чем
в 30% случаев злокачественных опухолей человека. Более 90% мутаций
приходится на «горячие точки» 2-го экзона гена – 12-й и 13-й кодоны.
Мутации в этом регионе гена K-Ras отличаются высокой функциональной
однородностью: все они приводят к активации сигнальных каскадов, в которые включен белок KRAS, прежде всего каскада Ras-Raf-Mek-ERK.
Продукт
Состав
Кат.#
Количество
Набор Insider K-Ras
Смесь для ПЦР, 12 стрипов по 8 пробирок
ПЦР-растворитель, 1.05 мл
ДНК полимераза, 60 мкл
Положительный контроль ДНК, 400 мкл
Отрицательный контроль ДНК, 400 мкл
GK001
24 реакции*
Смесь для ПЦР, 120 стрипов по 8 пробирок
ПЦР-растворитель, 10 х 1.05 мл
ДНК полимераза, 600 мкл
Положительный контроль ДНК, 4 х 400 мкл
Отрицательный контроль ДНК, 4 х 400 мкл
GK002
240 реакций*
Смесь для ПЦР в 96-луночном планшете, 1 шт.
ПЦР-растворитель, 1.05 мл
ДНК полимераза, 60 мкл
Положительный контроль ДНК, 400 мкл
Отрицательный контроль ДНК, 400 мкл
GK003
24 реакции*
Смесь для ПЦР в 96-луночных планшетах, 10 шт.
ПЦР-растворитель, 10 х 1.05 мл
ДНК полимераза, 600 мкл
Положительный контроль ДНК, 4 х 400 мкл
Отрицательный контроль ДНК, 4 х 400 мкл
GK004
240 реакций*
Смесь для ПЦР, 12 стрипов по 8 пробирок
ПЦР-растворитель, 1.05 мл
ДНК полимераза, 60 мкл
Положительный контроль ДНК, 400 мкл
Отрицательный контроль ДНК, 400 мкл
GK006
24 реакции*
Смесь для ПЦР, 120 стрипов по 8 пробирок
ПЦР-растворитель, 10 х 1.05 мл
ДНК полимераза, 600 мкл
Положительный контроль ДНК, 4 х 400 мкл
Отрицательный контроль ДНК, 4 х 400 мкл
GK007
240 реакций*
Смесь для ПЦР в 96-луночном планшете, 1 шт.
ПЦР-растворитель, 1.05 мл
ДНК полимераза, 60 мкл
Положительный контроль ДНК, 400 мкл
Отрицательный контроль ДНК, 400 мкл
GK008
24 реакции*
Смесь для ПЦР в 96-луночных планшетах, 10 шт.
ПЦР-растворитель, 10 х 1.05 мл
ДНК полимераза, 600 мкл
Положительный контроль ДНК, 4 х 400 мкл
Отрицательный контроль ДНК, 4 х 400 мкл
GK009
240 реакций*
Набор Insider B-Raf
* Включая контрольные реакции
Положительный контроль ДНК – образец геномной ДНК человека (0.7 нг/мкл), содержащий мутированный целевой ген и ген дикого типа в соотношении 1:200. Отрицательный контроль ДНК – образец геномной ДНК человека (0.7 нг/мкл), содержащий целевой ген дикого типа.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
70
Евроген, Каталог 2013/14
Услуги в области молекулярной онкологии
В настоящий момент возможен анализ более чем 200 протоонкогенов и
генов-супрессоров человека, отобранных на основе систематического анализа научных публикаций в области молекулярной и клинической онкологии
и биомедицинских баз данных.
Для анализа могут быть использованы различные биологические образцы,
в том числе образцы выделенных нуклеиновых кислот, парафиновые блоки,
плазма и сыворотка крови, моча, цитологический материал и т.д.
Rn, RFU
0.2
0.1
0
-0.1
-0.2
-0.3
-0.4
-0.5
-0.6
-0.7
-0.8
EGFRvIII
wtEGFR
4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52
Номер цикла ПЦР
б
1.4
1.3
1.2
1.1
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
-0.1
MGMT (метил)
ActB (неметил)
4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52
Номер цикла ПЦР
Выявление хромосомных аберраций (а) и статуса метилирования ДНК (б) с помощью ПЦР
в режиме реального времени.
CEP17
Молекулярная медицина
- Установление первичной структуры ДНК (типирование однонуклеотидных полиморфизмов, поиск мутаций, выявление хромосомных
аберраций) осуществляется с помощью прямого секвенирования, фрагментного анализа, рестрикционного анализа и аллель-специфической
ПЦР в режиме реального времени
Для анализа мутаций опухолевого происхождения в сложных биологических образцах (в том числе в ДНК и РНК биологических жидкостей)
мы применяем оригинальные протоколы выявления редких аллелей, в
частности, на основе высокоэффективной технологии WTB-PCR (описание технологии – см. страницу 89)
- Оценка эпигенетического статуса генов (метилирование CpG-островков) ДНК выполняется теми же методами после бисульфитной модификации ДНК или ее обработки метилчувствительными и метилспецифическими рестриктазами
- Анализ количества копий генов (установление амплификаций или делеций) проводится с помощью количественной ПЦР в режиме реального
времени и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH)
- Выявление крупных перестроек в ДНК (транслокаций, обширных делеций и инсерций) осуществляется методами ПЦР в режиме реального
времени, прямого секвенирования и флуоресцентной гибридизации in
situ (FISH)
- Оценка уровня экспрессии мРНК осуществляется методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени
- Оценка уровня экспрессии белков и анализ их посттрансляционных
модификаций проводится иммуногистохимическим методом и методом
Вестерн блота
а
Rn, RFU
Мы выполняем услуги (НИР) по комплексному молекулярному анализу регуляторных генов, вовлеченных в патогенез онкологических заболеваний
человека:
Her-2/Neu
Анализ копийности генов с помощью FISH.
p63
Точность наших исследований подтверждена сертификатами системы
внешнего контроля качества Европейского общества патоморфологии.
Результаты анализа предоставляются в виде отчета о НИР и могут быть использованы для решения следующих задач:
- определение наследственной предрасположенности к развитию онкологических заболеваний
- диагностика заболеваний (исследование молекулярно-генетических онкомаркеров в биологических жидкостях)
- молекулярное профилирование опухолевой ткани
- выявление потенциальной чувствительности опухолевых и нормальных
клеток к воздействию противоопухолевых препаратов
www.evrogen.ru
Анализ продукции белка с помощью иммуногистохимии.
71
Молекулярная медицина : Молекулярная онкология
Наиболее востребованные услуги
Услуга
Сфера применения
Кат.#
Срок
выполнения
Молекулярное профилирование опухолевой ткани;
оценка опухолевого присутствия, в том числе по
ДНК биологических жидкостей;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к таргетной
терапии
CM001LQ001
20 дней
CM001SQ002
20 дней
CM001SQ003
20 дней
Поиск мутаций в гене K-Ras методом
секвенирования (экзон 4)
CM001SQ004
20 дней
Поиск мутаций в гене K-Ras методом
мутационно-специфической ПЦР (экзон 2,
кодоны 12-13)
CM001HE001
10 дней
Поиск мутаций в гене K-Ras методом
мутационно-специфической ПЦР с
идентификацией выявленных мутаций методом
секвенирования (экзон 2, кодоны 12-13)
CM001VE001
20 дней
CM213MR001
20 дней
CM213MQ001
20 дней
Анализ статуса метилирования тела гена
MGMT методом ПЦР в реальном времени
CM213MR002
20 дней
Анализ статуса метилирования тела гена
MGMT с подтверждением методом
секвенирования
CM213MQ002
20 дней
Определение наследственной предрасположенности
к развитию онкологических заболеваний (HNPCC
– синдром Линча);
молекулярное профилирование опухолевой ткани;
исследование прогностических факторов;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к
фторпиримидинам, препаратам платины,
иринотекану и алкилирующим агентам
CM221FC001
20 дней
Определение наследственной предрасположенности
к развитию онкологических заболеваний
(исключение наследственной природы
заболевания при колоректальном раке);
молекулярное профилирование опухолевой ткани;
оценка опухолевого присутствия, в том числе по
ДНК биологических жидкостей;
исследование прогностических факторов;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к таргетной
терапии
CM004LQ001
20 дней
CM004SQ011
20 дней
CM004SQ015
20 дней
CM004HE001
10 дней
CM004VE001
20 дней
Ге н K- R a s – м у т а ц и и
Поиск мутаций в гене K-Ras методом
секвенирования (экзоны 2, 3, 4)
Поиск мутаций в гене K-Ras методом
секвенирования (экзон 2)
Поиск мутаций в гене K-Ras методом
секвенирования (экзон 3)
Ге н M G M T – с т а т у с м е т и л и р о в а н и я и э к с п р е с с и я
Анализ статуса метилирования промоторной
области гена MGMT методом ПЦР в реальном
времени
Анализ статуса метилирования промоторной
области гена MGMT с подтверждением
методом секвенирования
Молекулярное профилирование опухолевой ткани;
оценка опухолевого присутствия, в том числе по
ДНК биологических жидкостей;
исследование прогностических факторов;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к алкилирующим
агентам
Микросателлитная нестабильность
Исследование микросателлитной
нестабильности методом AFLP (фрагментного
анализа)
Ге н B - R a f – м у т а ц и и
Поиск мутаций в гене B-Raf методом
секвенирования (экзоны 11, 15)
Поиск мутаций в гене B-Raf методом
секвенирования (экзон 11)
Поиск мутаций в гене B-Raf методом
секвенирования (экзон 15)
Поиск мутаций в гене B-Raf методом
мутационно-специфической ПЦР (экзон 15,
кодоны 600-601)
Поиск мутаций в гене B-Raf методом
мутационно-специфической ПЦР с
идентификацией выявленных мутаций методом
секвенирования (экзон 15, кодоны 600-601)
продолжение...
72
Евроген, Каталог 2013/14
Услуга
Сфера применения
Кат.#
Срок
выполнения
CM005LQ001
20 дней
CM005SQ002
20 дней
CM005SQ003
20 дней
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзон 7)
CM005SQ007
20 дней
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзон 8)
CM005SQ008
20 дней
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзон 10)
CM005SQ010
20 дней
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзон 11)
CM005SQ011
20 дней
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзон 12)
CM005SQ012
20 дней
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзон 15)
CM005SQ015
20 дней
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзон 18)
CM005SQ018
20 дней
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзон 19)
CM005SQ019
20 дней
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзон 20)
CM005SQ020
20 дней
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзон 21)
CM005SQ021
20 дней
Выявление делеционной мутации EGFRvIII в
гене EGFR методом ПЦР в реальном времени
CM005AR001
20 дней
Выявление делеционной мутации EGFRvIII в
гене EGFR методом ПЦР в реальном времени
с подтверждением секвенированием
CM005AQ001
20 дней
Оценка количества копий гена EGFR методом
FISH
CM005CF001
20 дней
Оценка уровня экспрессии гена EGFR
иммуногистохимическим методом
CM005EM001
5 дней
CM201LQ001
20 дней
CM201SQ005
20 дней
CM201SQ006
20 дней
CM201SQ007
20 дней
CM201SQ008
20 дней
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзон 2)
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзон 3)
Молекулярное профилирование опухолевой ткани;
оценка опухолевого присутствия, в том числе по
ДНК и РНК биологических жидкостей;
исследование прогностических факторов;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к таргетной
терапии
Молекулярная медицина
Ге н E G F R – м у т а ц и и , к о п и й н о с т ь и э к с п р е с с и я
Поиск мутаций в гене EGFR методом
секвенирования (экзоны 2, 3, 7, 8, 10, 11, 12,
15, 18, 19, 20, 21)
Ге н T P 5 3 ( p 5 3 ) – м у т а ц и и и э к с п р е с с и я
Поиск мутаций в гене TP53 (p53) методом
секвенирования (экзоны 5, 6, 7, 8, 9)
Поиск мутаций в гене TP53 (p53) методом
секвенирования (экзон 5)
Поиск мутаций в гене TP53 (p53) методом
секвенирования (экзон 6)
Поиск мутаций в гене TP53 (p53) методом
секвенирования (экзон 7)
Поиск мутаций в гене TP53 (p53) методом
секвенирования (экзон 8)
Определение наследственной предрасположенности
к развитию онкологических заболеваний;
молекулярное профилирование опухолевой ткани;
оценка опухолевого присутствия, в том числе по
ДНК биологических жидкостей;
исследование прогностических факторов;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к широкому
кругу классических и таргетных
противоопухолевых препаратов, а также к
лучевой терапии
продолжение...
www.evrogen.ru
73
Молекулярная медицина : Молекулярная онкология
Услуга
Сфера применения
Кат.#
Срок
выполнения
Поиск мутаций в гене TP53 (p53) методом
секвенирования (экзон 9)
CM201SQ009
20 дней
Оценка уровня экспрессии белка TP53 (p53)
иммуногистохимическим методом
CM201EM001
5 дней
CM013LQ001
20 дней
CM013SQ004
20 дней
CM013SQ005
20 дней
Поиск мутаций в гене IDH2 методом
секвенирования (экзоны 4, 5)
CM014LQ001
20 дней
Поиск мутаций в гене IDH2 методом
секвенирования (экзон 4)
CM014SQ004
20 дней
Поиск мутаций в гене IDH2 методом
секвенирования (экзон 5)
CM014SQ005
20 дней
CM018LQ001
20 дней
CM018SQ020
20 дней
CM018SQ021
20 дней
Поиск мутаций в гене ALK методом
секвенирования (экзон 22)
CM018SQ022
20 дней
Поиск мутаций в гене ALK методом
секвенирования (экзон 23)
CM018SQ023
20 дней
Выявление транслокаций с участием гена ALK
методом FISH
CM018AF001
20 дней
Оценка количества копий гена ALK, включая
химерные варианты, методом FISH
CM018CF001
20 дней
CM006LQ001
20 дней
CM006SQ018
20 дней
CM006SQ019
20 дней
Поиск мутаций в гене ERBB2 (Her-2/Neu)
методом секвенирования (экзон 20)
CM006SQ020
20 дней
Поиск мутаций в гене ERBB2 (Her-2/Neu)
методом секвенирования (экзон 21)
CM006SQ021
20 дней
Оценка количества копий гена ERBB2
(Her-2/Neu) методом FISH
CM006CF001
20 дней
Оценка уровня экспрессии гена ERBB2
(Her-2/Neu) иммуногистохимическим методом
CM006EM001
5 дней
Ге н ы I D H 1 и I D H 2 – с о м а т и ч е с к и е м у т а ц и и
Поиск мутаций в гене IDH1 методом
секвенирования (экзоны 4, 5)
Поиск мутаций в гене IDH1 методом
секвенирования (экзон 4)
Поиск мутаций в гене IDH1 методом
секвенирования (экзон 5)
Молекулярное профилирование опухолевой ткани;
оценка опухолевого присутствия, в том числе по
ДНК биологических жидкостей;
исследование прогностических факторов;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к
антиангиогенным препаратам
Ге н A L K – т р а н с л о к а ц и и , к о п и й н о с т ь , с о м а т и ч е с к и е м у т а ц и и
Поиск мутаций в гене ALK методом
секвенирования (экзоны 20-23)
Поиск мутаций в гене ALK методом
секвенирования (экзон 20)
Поиск мутаций в гене ALK методом
секвенирования (экзон 21)
Определение прогностических факторов;
оценка опухолевого присутствия, в том числе по
ДНК биологических жидкостей;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к таргетной
терапии
Ге н E R B B 2 ( H e r - 2 / N e u ) – к о п и й н о с т ь , с о м а т и ч е с к и е м у т а ц и и , э к с п р е с с и я
Поиск мутаций в гене ERBB2 (Her-2/Neu)
методом секвенирования (экзоны 18-21)
Поиск мутаций в гене ERBB2 (Her-2/Neu)
методом секвенирования (экзон 18)
Поиск мутаций в гене ERBB2 (Her-2/Neu)
методом секвенирования (экзон 19)
Определение прогностических факторов;
оценка опухолевого присутствия, в том числе по
ДНК биологических жидкостей;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к таргетной
терапии
продолжение...
74
Евроген, Каталог 2013/14
Услуга
Сфера применения
Кат.#
Срок
выполнения
Оценка опухолевого присутствия, в том числе по
ДНК биологических жидкостей;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к таргетной
терапии
CM008LQ001
20 дней
CM008SQ008
20 дней
Поиск мутаций в гене ERBB4 (Her-4) методом
секвенирования (экзон 12)
CM008SQ012
20 дней
Поиск мутаций в гене ERBB4 (Her-4) методом
секвенирования (экзон 14)
CM008SQ014
20 дней
Поиск мутаций в гене ERBB4 (Her-4) методом
секвенирования (экзон 21)
CM008SQ021
20 дней
Определение прогностических факторов;
оценка опухолевого присутствия, в том числе по
ДНК биологических жидкостей;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к таргетной
терапии и к ингибиторам COX2, включая аспирин
CM083LQ001
20 дней
Определение прогностических факторов;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к гемцитабину и
препаратам из группы 5-фторурацила
CM434ER001
20 дней
Оценка опухолевого присутствия, в том числе по
ДНК биологических жидкостей;
оценка потенциальной чувствительности и
устойчивости опухолевых клеток к таргетной
терапии
CM049LQ001
20 дней
Поиск мутаций в гене ERBB4 (Her-4) методом
секвенирования (экзон 8)
Ге н P I K 3 C A – с о м а т и ч е с к и е м у т а ц и и
Поиск мутаций в гене PIK3CA методом
секвенирования (экзоны 9, 20)
Молекулярная медицина
Ге н E R B B 4 ( H e r - 4 ) – с о м а т и ч е с к и е м у т а ц и и
Поиск мутаций в гене ERBB4 (Her-4) методом
секвенирования (экзоны 8, 12, 14, 21)
Ге н S L C 2 9 A 1 ( h E N T 1 ) – э к с п р е с с и я
Оценка уровня экспрессии гена SLC29A1
(hENT1) методом ПЦР в реальном времени
Ге н D D R 2 – с о м а т и ч е с к и е м у т а ц и и
Поиск мутаций в гене DDR2 методом
секвенирования (экзоны 5, 13, 14)
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
75
Молекулярная генетика наследственных заболеваний
Услуги в области молекулярной генетики
наследственных заболеваний
Мы выполняем услуги по поиску мутаций, вовлеченных в патогенез
моногенных и мультифакторных наследственных заболеваний человека.
Основным методом поиска мутаций является секвенирование. Результаты
работы предоставляются в виде отчета о НИР.
Заболевание
Услуга
Кат.#
Анемия
Даймонда-Блэкфэна
Поиск мутаций в гене RPS19 методом прямого
секвенирования
MG004
7-14 дней
Болезнь Штаргардта,
тип 1
Поиск мутаций в экзонах 12, 13, 17, 21, 41, 42 гена
ABCA4 методом прямого секвенирования
MG007
7-14 дней
Врожденный дискератоз
Поиск мутаций в гене DKC1 методом SSCP-анализа
MG001
7-10 дней
Поиск мутаций в гене DKC1 методом прямого
секвенирования
MG002
10-20 дней
Поиск мутаций в гене TERC методом прямого
секвенирования
MG003
7-10 дней
Поиск мутаций в экзоне 6 гена TINF2 методом прямого
секвенирования
MG025
7-10 дней
Поиск мутаций в гене ELANE (ELA2) методом прямого
секвенирования
MG005
7-14 дней
Поиск мутаций в гене HAX1 методом прямого
секвенирования
MG006
7-14 дней
Метахондроматоз
Поиск мутаций в экзоне 4 гена PTPN11 методом прямого
секвенирования
MG014
10-20 дней
Сердечно-кожно-лицевой
синдром
Поиск мутаций в экзонах 6, 11-17 гена BRAF методом
прямого секвенирования
MG013
20-30 дней
Поиск мутаций в гене KRAS методом прямого
секвенирования
MG018
20-30 дней
Поиск мутаций в экзонах 2, 3, 6 гена MEK1 методом
прямого секвенирования
MG023
10-20 дней
Поиск мутаций в экзонах 2, 3, 7 гена MEK2 методом
прямого секвенирования
MG024
10-20 дней
Поиск мутаций в гене RDS (PRPH2) методом прямого
секвенирования
MG026
7-14 дней
Поиск мутаций в гене RHO методом прямого
секвенирования
MG027
7-14 дней
Синдром Костелло
Поиск мутаций в экзоне 2 гена HRAS методом прямого
секвенирования
MG020
10-20 дней
Синдром LEOPARD,
типы 1, 2, 3
Поиск мутаций в экзонах 7, 12, 13 гена PTPN11 методом
прямого секвенирования
MG011
10-20 дней
Поиск мутаций в экзонах 6, 13, 16 гена RAF1 методом
прямого секвенирования
MG012
10-20 дней
Поиск мутаций в экзонах 6, 11-17 гена BRAF методом
прямого секвенирования
MG013
20-30 дней
Поиск мутаций в гене FBN1 методом прямого
секвенирования
MG009
45-60 дней
Врожденная нейтропения
первого типа /
Циклическая нейтропения
/ Синдром Костманна
Пигментный ретинит
Синдром Марфана
Срок выполнения
продолжение...
76
Евроген, Каталог 2013/14
Услуга
Кат.#
Синдром Нунан
Поиск мутаций в экзонах 3, 8, 9, 13 гена PTPN11
методом прямого секвенирования
MG015
20-30 дней
Поиск мутаций в гене SOS1 методом прямого
секвенирования
MG016
45-60 дней
Поиск мутаций в экзонах 7, 12, 14, 17 гена RAF1
методом прямого секвенирования
MG017
20-30 дней
Поиск мутаций в гене KRAS методом прямого
секвенирования
MG018
20-30 дней
Поиск мутаций в экзонах 6, 13, 15 гена BRAF методом
прямого секвенирования
MG019
20-30 дней
Поиск мутаций в экзоне 6 гена COL1A1 методом прямого
секвенирования
MG021
10-20 дней
Поиск мутаций в экзоне 6 гена COL1A2 методом прямого
секвенирования
MG022
10-20 дней
Поиск мутаций в гене COL3A1 методом прямого
секвенирования
MG008
45-60 дней
Синдром Элерса-Данло,
типы VIIA, VIIB
(артрохалазия)
Синдром Элерса-Данло,
сосудистый тип
Срок выполнения
Отчет о НИР не является медицинским документом. В случае поиска мутаций при наследственном заболевании интерпретация значимости выявленных изменений относится к компетенции врача.
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
www.evrogen.ru
Молекулярная медицина
Заболевание
77
Мы предлагаем выполнение научно-исследовательских работ (НИР) по
комплексному молекулярному анализу генов, потенциально вовлеченных в
патогенез онкологических и наследственных заболеваний человека.
Мы проведем анализ литературных научных источников и биомедицинских баз данных, разработаем план исследования и в зависимости от
потребностей заказчика осуществим типирование однонуклеотидных полиморфизмов, поиск мутаций и хромосомных аберраций, оценку количества
копий гена и его эпигенетического статуса, качественный и количественный анализ РНК и белка, выявление посттрансляционных модификаций в
предоставленных биологических образцах.
Rn, RFU
Исследования в области молекулярной медицины
по ТЗ заказчика
0.6
0.5
0.4
hENT1
0.3
0.2
GAPDH
0.1
0
-0.1
4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52
Номер цикла ПЦР
Оценка уровня экспресии гена с помощью ПЦР
в режиме реального времени
Услуга
Описание
Кат.#
Срок выполнения
Анализ структуры и/или
экспрессии целевого гена
Типирование однонуклеотидных полиморфизмов, поиск
мутаций и хромосомных аберраций, оценку количества
копий гена и его эпигенетического статуса, качественный
и количественный анализ РНК и белка, выявление
посттрансляционных модификаций в предоставленных
биологических образцах по ТЗ заказчика
GS001
договорной
Разработка стратегии и
плана исследования в
области молекулярной
онкологии или
молекулярной генетики
наследственных
заболеваний
Анализ литературных научных источников и
биомедицинских баз данных, выбор мишеней для
анализа, разработка плана исследования целевых генов в
биологических образцах
GS002
договорной
Обработка данных
исследования в области
молекулярной онкологии
или молекулярной
генетики наследственных
заболеваний
Анализ литературных научных источников и
биомедицинских баз данных, интрепретация результатов
анализа целевых генов в биологических образцах
GS003
договорной
Полный список продуктов и услуг, актуальные цены и специальные предложения вы можете найти на сайте www.evrogen.ru
78
Евроген, Каталог 2013/14
Обзор
основных технологий
Синтез кДНК
Эффект супрессии ПЦР
Метод быстрой амплификации Step-Out RACE
Прогулка по хромосоме
Супрессионная вычитающая гибридизация
Зеркально-ориентированная селекция
Нормализация и деплеция ДНК и кДНК
Му тационно-специфическая ПЦР
Обзор основных технологий
Синтез кДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
81
Синтез кДНК со сменой матрицы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
81
Технология RNA-seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
81
Эффект селективной супрессии ПЦР
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
82
Метод быстрой амплификации 3’- и 5’-концов кДНК (Step-Out RACE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
83
Прогулка по хромосоме (genome walking) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
84
Супрессионная вычитающая гибридизация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
84
Зеркально-ориентированная селекция
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Нормализация и деплеция кДНК и геномной ДНК с помощью дуплекс-специфической нуклеазы
80
. . . . . . . .
86
87
Нормализация кДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
87
Деплеция рибосомальной кДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
88
Деплеция нецелевых транскриптов из образцов кДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
88
Нормализация геномной ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
88
Мутационно-специфическая ПЦР (WTB-PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
89
Евроген, Каталог 2013/14
Синтез кДНК
Синтез кДНК со сменой матрицы
Метод синтеза кДНК со сменой матрицы (template switching cDNA
synthesis) – один из наиболее эффективных и простых в использовании
подходов для приготовления кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями.
Получаемая таким способом первая цепь кДНК содержит на обоих концах
специфические последовательности адаптеров, которые могут быть использованы для ПЦР-амплификации двухцепочечной (дц) кДНК.
РНК
AAAA 3‘
5‘
Олиго(dT)
праймер
Синтез первой цепи кДНК
TTTT
AAAA
TTTT
Ревертаза
AAAA
TTTT
CCCC
Введение адаптера на 5‘-конец кДНК
5’-адаптер
PlugOligo
GGGG
GGGG
....
....
....
....
CCCC
AAAA
TTTT
GGGG
....
....
....
....
CCCC
AAAA
TTTT
Амплификация кДНК
Праймер M1
GGGG
CCCC
AAAA
TTTT
Праймеры, адаптеры и комплементарные им последовательности обозначены прямоугольниками.
Схема синтеза кДНК со сменой матрицы.
Синтез первой цепи кДНК начинается
на РНК матрице с 3’-концевого олиго(dT)-праймера, состоящего из олиго(dT)
последовательности и универсальной адаптерной последовательности. По окончании
матричного синтеза обратная транскриптаза добавляет несколько dC-нуклеотидов
на конец первой цепи. Олиго(dC) последовательность служит местом отжига
олигонуклеотидного адаптера (PlugOligo),
имеющего комплементарную олиго(dG)
последовательность на 3’-конце, и универсальную адаптерную часть на 5’-конце.
Обратная транскриптаза продолжает синтез
первой цепи по матрице PlugOligo.
В результате первая цепь кДНК оказывается
фланкирована с обеих сторон универсальной последовательностью, которая со стороны 3’-конца была введена с помощью 3’праймера, а со стороны 5’-конца – с помощью PlugOligo адаптера. Эту последовательность используют для отжига праймера
в ходе последующей амплификации двухцепочечной кДНК.
3’-конец PlugOligo-адаптора химически заблокирован, что предотвращает его участие
в реакции как неспецифического праймера.
Обзор основных технологий
Метод основан на способности некоторых мутантов MMLV ревертазы (например, Mint ревертазы) по достижении конца РНК-матрицы нематрично
добавлять на 3’-конец новосинтезированной цепи кДНК несколько нуклеотидных остатков, преимущественно dC [1, 2]. Нематрично добавленная
последовательность может служить сайтом отжига для адаптера, который
воспринимается ревертазой как продолжение РНК-матрицы.
Технология RNA-seq
Образцы RNA-seq представляют собой пул коротких молекул кДНК, подготовленных для дальнейшего секвенирования на секвенаторах нового
поколения.
Перед началом синтеза образцы РНК гидролизуют, чтобы получить фрагменты длиной 200-300 п.о. Полученные фрагменты используют в качестве
матрицы для синтеза кДНК, например, с помощью метода синтеза кДНК
со сменой матрицы (см. схему выше). В этом случае, для затравки синтеза используют декамерную случайную затравку, имеющую на 5’-конце
последовательность универсального адаптера. Далее первую цепь кДНК
подвергают ПЦР-амплификации, в ходе которой на концы кДНК вводят
дополнительные адаптерные последовательности, необходимые для секвенирования.
В случае использования в качестве матрицы суммарной РНК эукариот
или бактериальной РНК образцы кДНК рекомендуется подвергнуть доwww.evrogen.ru
81
Обзор основных технологий
полнительной обработке для удаления избытка копий рибосомальной и
транспортной РНК (см. описание технологии деплеции рибосомальной
кДНК на странице 88).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1]
[2]
Matz et al. (1999) Nucleic Acids Res, 27 (6): 1558–1560 / pmid: 10037822.
Schmidt and Mueller. (1999) Nucleic Acids Res, 27 (21): e31 / pmid: 10518626.
Эффект селективной супрессии ПЦР
Эффект супрессии ПЦР (ССП-эффект) состоит в ингибировании амплификации молекул ДНК, фланкированных инвертированными концевыми
повторами (ИКП) в ПЦР с праймером, соответствующим внешней части
ИКП, при условии, что длина праймера значительно меньше длины ИКП
[1, 2].
ИКП
ИКП
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
Плавление
Следующий
цикл ПЦР
Схема эффекта супрессии ПЦР.
На каждом цикле ПЦР после денатурации
в процессе охлаждения образца внутримолекулярная гибридизация ИКП (самоотжиг)
происходит раньше, чем отжиг праймера,
поскольку температура самоотжига ИКП
выше температуры отжига праймера. Только небольшая часть молекул ДНК достигает
температуры отжига праймера без формирования вторичной структуры, закрывающей
сайт посадки праймера. Те молекулы, на
которые праймер все-таки отжегся, после
синтеза ДНК восстанавливают исходную
структуру, что обеспечивает сохранение ингибиторного эффекта на дальнейших циклах
ПЦР.
Охлаждение
вторичная структура
типа 'сковородка'
Отжиг праймера
и элонгация
Праймеры, адаптеры и комплементарные им последовательности обозначены прямоугольниками.
ССП-эффект используется в ряде описанных ниже технологий, таких как
прогулка по хромосоме, амплификация 3’- и 5’-концов кДНК (RACE), супрессионная вычитающая гибридизация, для подавления амплификации
нежелательной фракции кДНК.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1]
[2]
82
Лукьянов и др. (1994) Биоорганическая Химия. 20 (6): 701–704 / pmid: 7945464.
Siebert et al. (1995) Nucleic Acids Res, 23 (6): 1087–1088 / pmid: 7731798.
Евроген, Каталог 2013/14
Метод быстрой амплификации 3’- и 5’-концов кДНК
(Step-Out RACE)
Технология Step-Out RACE – один из наиболее эффективных методов
идентификации 3’- и 5’-концевых фрагментов целевых транскриптов при
наличии информации о фрагменте его нуклеотидной или аминокислотной
последовательности [1, 2].
На втором этапе в ходе одной или нескольких последовательных ПЦР из
образца кДНК амплифицируют гомогенные 3’- и 5’-концевых фрагменты
кДНК, фланкирующие известную последовательность. При амплификации
применяется техника пошагового «внешнего праймирования» универсальными смесями адаптерных праймеров (step-out ПЦР) одновременно с
пошаговым «заглублением» ген-специфических праймеров (nested ПЦР).
Ген-специфические праймеры подбирают на основании имеющейся информации о фрагменте целевого транскрипта. В случаях, когда известна только
аминокислотная последовательность или последовательности гомологичных генов, вместо ген-специфических используют вырожденные праймеры.
кДНК
5’
3’
3’
5’
5’ RACE
3’ RACE
I раунд амплификации
Step-out mix1
GSP 5’rev1
....
....
....
Step-out mix1
GSP 3’rev1
.... ....
....
.... ....
....
....
....
....
....
....
....
.... ....
....
....
....
Целевой продукт
Подавление неспецифической амплификации
с одного адаптерного праймера
II раунд амплификации
Step-out mix2
Step-out mix12
GSP 5’rev2
(для nested ПЦР)
GSP 3’rev2
(для nested ПЦР)
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
Схема I и II раундов RACE.
Смеси адаптерных праймеров для step-out
ПЦР (Step-out mix) содержат два адаптера – длинный супрессионный и короткий внешний. 3’-фрагмент супрессионного
адаптера комплементарен последовательности фланкирующей кДНК, а 5’-конец представляет собой новую адаптерную последовательность, идентичную короткому внешнему адаптеру. Концентрация праймеров в
смесях подобрана таким образом, что длинный праймер участвует только в первых
циклах ПЦР, формируя сайт для отжига короткого адаптера. Затем длинный адаптер
полностью расходуется и перестает участвовать в реакции; дальнейшая амплификация
происходит с короткого адаптера.
В ходе step-out ПЦР на концах молекул
кДНК формируются длинные концевые повторы, препятствующие амплификации этих
молекул с одного короткого адаптера за счет
супрессии ПЦР (см. страницу 82). Эффективной амплификации подвергаются лишь
молекулы, содержащие последовательность
ген-специфического праймера.
На каждом новом раунде амплификации,
осуществляется переход «наружу» на новый
адаптерный участок на 3’- или 5’-конце молекулы кДНК.
Обзор основных технологий
Первым этапом Step-Out RACE является получение кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями, с помощью метода синтеза
кДНК со сменой матрицы (см. страницу 81). Полученная в результате синтеза кДНК фланкирована универсальными адаптерами на обоих концах.
Праймеры, адаптеры и комплементарные им последовательности обозначены прямоугольниками; GSP – геноспецифический праймер.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1]
[2]
Shagin et al. (1999) Nucleic Acids Res, 27 (18): e23 / pmid: 10471753.
Matz et al. (2003) Methods Mol Biol, 221: 41–49 / pmid: 12703732.
www.evrogen.ru
83
Обзор основных технологий
Прогулка по хромосоме (genome walking)
Геномная ДНК
Метод основан на использовании эффекта супрессии ПЦР (см. описание
на странице 82) [1].
Обработка
эндонуклеазой
рестрикции
Для получения образца ДНК, содержащего инвертированные концевые повторы (ИКП), геномную ДНК обрабатывают эндонуклеазой рестрикции так,
чтобы получить фрагменты с тупыми концами, и лигируют полученный образец с псевдодвуцепочечным супрессионным адаптером.
Адаптер представляет собой смесь двух олигонуклеотидов – длинного и
короткого, причем короткий олигонуклеотид комплементарен 3’-концевой
части длинного. Эти олигонуклеотиды формируют дуплекс, участвующий в
процессе лигирования. Поскольку олигонуклеотиды не фосфорилированы,
фосфодиэфирную связь образует только длинный олигонуклеотид, который
лигируется своим 3’-концом к 5’-концу каждой цепи ДНК. После достройки
3’-концов дуплексов молекулы кДНК оказываются симметрично фланкированы последовательностью адаптера.
Выделение регуляторных областей интересующего гена производится в
ходе нескольких раундов nested ПЦР полученного образца ДНК с использованием ген-специфических праймеров и праймера, соответствующего
внешней части супрессионного адаптора. В каждом раунде ПЦР происходит амплификация только тех фрагментов ДНК, которые имеют сайт отжига
ген-специфического праймера (GSP). Амплификация с одного адаптерного
праймера подавляется за счет супрессии ПЦР.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1]
Siebert et al. (1995) Nucleic Acids Res, 23 (6): 1087–1088 / pmid: 7731798.
Супрессионная вычитающая гибридизация
Супрессионная вычитающая гибридизация (Suppression Subtractive Hybridization, SSH) – наиболее эффективный на сегодняшний день метод
вычитающей гибридизации, который позволяет сравнивать образцы кДНК,
полученные из малых количеств биологического материала, и выявлять даже редкие дифференциальные транскрипты [1, 2, 3]. Также SSH может быть
использована для сравнения образцов геномной ДНК близкородственных
штаммов бактерий [4] и некоторых эукариотических геномов [5]. В основе
метода лежит процесс истощающей гибридизации двух популяций молекул
ДНК (называемых драйвером и трейсером), проводимый для выявления
последовательностей, которые присутствуют в одной популяции ДНК (трейсере), но отсутствуют или представлены на более низком уровне в другой
популяции ДНК (драйвере).
Лигирование
Достройка 3’-концов
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
GSP
ПЦР с праймерами
и
GSP
Экспоненциальная
амплификация
Подавление
неспецифической
амплификации
с одного
адаптерного
праймера
Схема метода прогулки по хромосоме с использованием супрессии ПЦР.
Праймеры, адаптеры и комплементарные
им последовательности обозначены прямоугольниками; GSP – геноспецифический
праймер.
До начала вычитания образцы трейсера и драйвера обрабатывают эндонуклеазой рестрикции, генерирующей тупые концы. Трейсер разделяют
на два образца (А и Б), к каждому из которых лигируют свой адаптер.
Адаптер представляет собой смесь двух олигонуклеотидов – длинного и
короткого, причем короткий олигонуклеотид комплементарен 3’-концевой
части длинного. Эти олигонуклеотиды в дуплексе формируют «тупой конец», участвующий в процессе лигирования. Поскольку олигонуклеотиды не
фосфорилированы, фосфодиэфирную связь образует только длинный олигонуклеотид, который лигируется своим 3’-концом к 5’-концу каждой цепи
ДНК. Дальнейшая обработка образцов производится согласно схеме, представленной на следующей странице.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
84
Лукьянов и др. (1994) Биоорганическая Химия. 20 (6): 701–704 / pmid: 7945464.
Diatchenko et al. (1996) Proc Natl Acad Sci U S A, 93 (12): 6025–6030 / pmid: 8650213.
Gurskaya et al. (1996) Anal Biochem, 240 (1): 90–97 / pmid: 8811883.
Akopyants et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A, 95 (22): 13108–13113 / pmid: 9789049.
Rebrikov et al. (2002) BMC Genomics, 3 (1): 15 / pmid: 12065025.
Евроген, Каталог 2013/14
драйвер (избыток)
Смешивание,
денатурация,
гибридизация
трейсер Б
пробирка Б
пробирка А
Смешивание,
денатурация,
гибридизация
Смешивание,
гибридизация
Схема метода SSH.
К каждому образцу трейсера добавляют избыток ДНК драйвера и после денатурации
проводят первую гибридизацию в двух отдельных пробирках. В ходе гибридизации
образуются несколько типов молекул: одноцепочечный и двухцепочечный драйвер, одноцепочечный трейсер, гетерогибриды трейсер-драйвер, образованные общими для образцов драйвера и трейсера молекулами,
и гомогибриды трейсер-трейсер, образовавшиеся в результате самореассоциации молекул трейсера и имеющие одинаковые выступающие 5’-концы.
На второй стадии вычитания образцы А и
Б смешивают и гибридизуют совместно. В
ходе гибридизации кроме вышеописанных
образуется новый тип молекул – геторогибриды трейсер-трейсер, возникшие при
реассоциации молекул из разных образцов
трейсера и имеющие различные выступающие 5’-концы.
После гибридизации производится достройка концов гибридных молекул, вследствие
чего на концах гомогибридов трейсертрейсер формируются инвертированные
концевые повторы. В ходе последующей
ПЦР с парой праймеров, комплементарных
внешней части супрессионных адаптеров,
происходит экспоненциальная амплификация только гетерогибридов трейсер-трейсер
– фракции, обогащенной специфическими
только для трейсера молекулами. Амплификация гомогибридов трейсера подавляется
благодаря ССП-эффекту.
Обзор основных технологий
трейсер А
Достройка концов,
ПЦР амплификация
с праймерами
и
Супрессия
ПЦР
Линейная
ПЦР
нет
ПЦР
Экспоненциальная
ПЦР
Праймеры, адаптеры и комплементарные им последовательности обозначены прямоугольниками.
www.evrogen.ru
85
Обзор основных технологий
Зеркально-ориентированная селекция
Несмотря на высокую эффективность SSH, еe использование для очень
сложных образцов кДНК (например, для образцов суммарной кДНК из
мозга млекопитающих) оказалось затруднено, вследствие большого числа
ложнопозитивных сигналов, выявляемых в ходе дифференциального скрининга.
Основной причиной возникновения таких ложнопозитивных сигналов является следующее: в ходе вычитания часть высокопредставленных молекул
трейсера случайным образом избегает гибридизации с драйвером, остается
в одноцепочечной фракции и в дальнейшем может амплифицироваться. Для
их удаления разработана процедура зеркально-ориентированной селекции
(MOS, Mirror orientation selection) [1], представленная на схеме.
Целевой ген
адаптер A
Фон
адаптер B
адаптер A
адаптер B
Удаление адаптера B
Денатурация
5’
3’
5’
3’
5’
3’
Гибридизация
Достройка концов
Схема метода зеркально-ориентированной
селекции.
Метод MOS основан на наблюдении, что
фон, создающийся реассоциацией не-трейсер-специфичных молекул, появляется случайным образом и представлен крайне малым числом молекул относительно целевых трейсер-специфичных последовательностей. Как фоновые, так и целевые молекулы, сформированные в ходе SSH, фланкированы последовательностями двух разных
супрессионных адаптеров, однако целевые
последовательности имеют фланкирующие
адаптеры в обоих ориентациях, тогда как
фоновые – только в одной.
Для удаления фоновых молекул образец
вычтенной кДНК подвергают обработке эндонуклеазой рестрикции, удаляющей один
из адаптеров с концов молекул кДНК. Образец денатурируют и оставляют реассоциировать. После достройки концов часть истинно дифференциальных последовательностей
образует дуплексы, фланкированные последовательностью второго адаптора с обоих
концов, тогда как вероятность появления
таких дуплексов для фоновых молекул исчезающе мала.
Истинно дифференциальные последовательности затем амплифицируют с помощью
ПЦР с одним праймером, комплементарным
супрессионному адаптеру.
ПЦР с праймером А
Экспоненциальная ПЦР
амплификация
Линейная ПЦР
амплификация
Праймеры, адаптеры и комплементарные им последовательности обозначены прямоугольниками.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1]
86
Rebrikov et al. (2000) Nucleic Acids Res, 28 (20): e90 / pmid: 11024192.
Евроген, Каталог 2013/14
Нормализация и деплеция кДНК и геномной ДНК
с помощью дуплекс-специфической нуклеазы
Нормализация кДНК
кДНК, предназначенная для нормализации, должна быть фланкирована известными последовательностями адаптеров и может быть приготовлена с
помощью метода синтеза кДНК со сменой матрицы или по технологии RNAseq (описание методов синтеза кДНК представлено на странице 81). В ходе
синтеза в последовательность кДНК могут быть введены различные концевые адаптеры, оптимизированные для решения конкретной научной задачи.
Метод основан на кинетике гибридизации двухцепочечной (дц) ДНК в
растворе и уникальных свойствах дуплекс-специфической нуклеазы (ДСН)
камчатского краба, специфически гидролизующей только дц ДНК.
двухцепочечная кДНК
AAAAA
TTTTT
AAAAA
TTTTT
AAAAA
TTTTT
AAAAA
TTTTT
денатурация
AAAAA
AAAAA
TTTTT
TTTTT
AAAAA
AAAAA
TTTTT
TTTTT
гибридизация
AAAAA
TTTTT
AAAAA
AAAAA
TTTTT
AAAAA
TTTTT
TTTTT
двухцепочечная ДНК фракция, образованная
высокопредставленными транскриптами
нормализованная одноцепочечная ДНК фракция
Схема ДСН-нормализации кДНК.
В ходе ДСН-нормализации двухцепочечную (дц) кДНК денатурируют и оставляют
реассоциировать в течение нескольких часов. Согласно кинетики гибридизации ДНК
в растворе скорость реассоциации молекул
ДНК пропорциональна квадрату их концентраций. Таким образом, в дц-форму в
первую очередь переходят высокопредставленные транскрипты, тогда как молекулы
с уникальной последовательностью остаются одноцепочечными (оц). Таким образом
формируются оц-фракция нормализованной
кДНК и нецелевая дц-фракция.
Для удаления нецелевой фракции используют ДСН. Так как ДСН – термостабильный фермент, деградация дц-фракции кДНК
проводится при той же температуре, что и
гибридизация. Это позволяет избежать потери транскриптов, склонных к образованию
вторичных структур, в процессе обработки.
Оставшуюся нормализованную оц-фракцию
далее амплифицируют в ПЦР.
Обзор основных технологий
Разница в уровнях экспрессии генов в различных типах клеток существенно
осложняет анализ библиотек кДНК и выявление новых генов в ходе масштабного секвенирования. Нормализация с помощью дуплекс-специфической нуклеазы (ДСН-нормализация) [1, 2, 3], приводящая к выравниванию
концентраций различных типов транскриптов в образце кДНК, позволяет
значительно повысить эффективность поиска редких генов и сократить расходы на секвенирование.
обработка ДСН
AA AAA
AAAAA
TTTTT
TTTTT
AAAAA
AAAAA
TTTTT
TTTTT
деградация двухцепочечной кДНК
ПЦР амплификация с праймером
AAAAA
TTTTT
AAAAA
TTTTT
нормализованная кДНК
Праймеры, адаптеры и комплементарные им последовательности обозначены прямоугольниками. Зеленая линия – редкий транскрипт; черная линия – высокопредставленный транскрипт.
www.evrogen.ru
87
Обзор основных технологий
Деплеция рибосомальной кДНК
В зависимости от времени реассоциации, исходной концентрации кДНК
в гибридизационной смеси и ряда других условий можно добиваться различной глубины ДСН-нормализации (см. схему на странице 87). «Мягкая
нормализация» позволяет удалить избыток копий тРНК, рРНК и высокопредставленных генов «домашнего хозяйства» из образцов суммарной
кДНК, сохраняя относительную представленность остальных кодирующих
последовательностей [4].
Деплеция нецелевых транскриптов из образцов кДНК
Экспрессионное клонирование – один из важнейших инструментов для
поиска генов, кодирующих белки с определенными функциональными свойствами. Метод включает приготовление библиотеки кДНК и ее скрининг
с использованием функционального теста на целевую активность. Присутствие в исследуемом образце уже изученных транскриптов, обладающих
искомыми свойствами, мешает идентификации новых мишеней с той же
активностью, особенно, если их концентрация невелика. ДСН-деплеция
позволяет удалить до 50 известных последовательностей из образцов
кДНК, обогащенных полноразмерными последовательностями, до клонирования библиотеки.
драйвер (избыток)
кДНК
AAAA
TTTT
AAAA
TTTT
транскрипт, подлежащий деплеции
Денатурация и гибридизация
AAAA
AAAA
TTTT
TTTT
оц ДНК фракция
дц ДНК фракция
Обработка ДСН
AAAA
AAAA
TTTT
TTTT
ПЦР с праймером
гидролиз
AAAA
TTTT
AAAA
TTTT
Праймеры, адаптеры и комплементарные им последовательности обозначены прямоугольниками.
Схема ДСН-деплеции кДНК.
В ходе ДСН-деплеции двухцепочечную (дц)
кДНК денатурируют и оставляют реассоциировать в присутствии избытка ДНК драйвера, представляющего собой денатурированные фрагменты подлежащих удалению
транскриптов или синтетические олигонуклеотиды, комплементарные обеим цепям
этих транскриптов.
Согласно кинетике гибридизации ДНК в
растворе скорость реассоциации молекул
ДНК пропорциональна квадрату их концентраций. Таким образом, в дц-форму в
первую очередь переходят молекулы, способные образовывать дуплексы с ДНК драйвера. В результате формируются одноцепочечная (оц) фракция кДНК, обедненная
нецелевыми транскриптами, и нецелевая дцфракция. Деплеция сопровождается частичной или полной, в зависимости от времени
гибридизации, нормализацией оц-фракции.
Для удаления нецелевой фракции используют ДСН, специфично гидролизующую дцДНК в дуплексах длиной более 10 п.о. [5,
6]. ДСН – термостабильный фермент, активный при температуре 70°C, и деградация
дц-фракции проводится при той же температуре, что и гибридизация кДНК. Это
позволяет избежать неспецифической гибридизации кДНК в процессе обработки и, соответственно, потери транскриптов, склонных
к образованию вторичных структур. Одноцепочечную фракцию далее амплифицируют с
помощью ПЦР.
Нормализация геномной ДНК
ДСН-нормализация, схема которой приведена на странице 87, может быть
также использована для удаления высокогомологичных повторяющихся
элементов из образцов геномной ДНК [7]. Наличие таких последовательностей, а их содержание в геноме высших растений может достигать 95%
[8], затрудняет секвенирование с помощью современных высокопроизводительных технологий и последующий анализ полученной информации.
Для нормализации может быть использована геномная ДНК, выделенная из
биологического материала любым стандартным методом. Подготовка ДНК
к нормализации включает ее дробление с помощью ультразвука для получе88
Евроген, Каталог 2013/14
В результате нормализации происходит более чем 15-кратное падение
концентрации таких последовательностей, при этом концентрации последовательностей, обладающих более слабой гомологией, практически не
меняются.
45
40
35
30
25
20
15
10
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
5
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
0
Zhulidov et al. (2004) Nucleic Acids Res, 32 (3): e37 / pmid: 14973331.
Жулидов и др. (2005) Биоорганическая Химия. 31 (2): 186–194 / pmid: 15889793.
Bogdanova et al. (2010) Curr Protoc Mol Biol. Chapter 5: Unit 5.12.1–27 / pmid: 20373503.
Богданова и др. (2011) Биоорганическая Химия. 237 (6): 854–857 / pmid: 22497085.
Shagin et al. (2002) Genome Res, 12 (12): 1935–1942 / pmid: 12466298.
Zhao et al. (2008) Nucleic Acids Res, 36 (3): e14 / pmid: 18073199.
Shagina et al. (2010) Biotechniques, 48 (6): 455–459 / pmid: 20569220.
Flavell. (1986) Philos Trans R Soc Lond. B Biol Sci, 312 (1154): 227–242 / pmid: 2870519.
все 90-100% 80-89% 70-79% 60-69%
сиквенсы
Представленность повторяющихся элементов
генома в ненормализованных (белые столбцы)
и нормализованных (зеленые столбцы) образцах ДНК. Данные для последовательностей с
разной степенью идентичности получены в ходе
модельного эксперемента.
Мутационно-специфическая ПЦР (WTB-PCR)
Мутационно-специфическая ПЦР (WTB-PCR, Wild-Type Blocking PCR) –
одна из наиболее эффективных технологий обнаружения редких аллелей,
содержащих точечные мутации (единичные однонуклеотидные замены или
небольшие делеции/инсерции) [1, 2, 3].
Обзор основных технологий
Технология ДСН-нормализации геномной ДНК направлена прежде всего на удаление повторяющихся последовательностей, имеющих 90-100%
идентичности.
Количество сиквенсов
ния фрагментов длиной 200-700 п.о., лигирование концевых адаптеров и
амплификацию.
Применение WTB-PCR позволяет добиться избирательности не менее 1 :
2000 при чувствительности менее 5 копий исследуемой ДНК [4, 5].
Фрагмент ДНК без мутации
Фрагмент ДНК с мутацией
ДНК-полимераза
5’
ДНК-полимераза
3’
Блокер
5’
Блокер
Праймер
ДНК-полимераза
5’
Праймер
ДНК-полимераза
3’
Блокер
3’
5’
Праймер
3’
Праймер
Блокер
ДНК-полимераза
5’
3’
Блокер
ДНК-полимераза
5’
3’
Праймер
Терминирование
амплификации
Праймер
Амплификация
Схема мутационно-специфической ПЦР.
Сутью технологии является введение в ПЦРсмесь дополнительных модифицированных
олигонуклеотидов-блокеров, комплементарных последовательности исследуемого региона ДНК "дикого типа" и имеющих достаточно высокую температуру плавления.
В ходе ПЦР олигонуклеотиды-блокеры не
отделяются от своей мишени на этапах отжига и элонгации и таким образом препятствуют полимеразному синтезу новых копий
ДНК.
Однако при наличии в исследуемом регионе
хотя бы одной точечной мутации температура плавления данных олигонуклеотидов значительно снижается и полимеразный синтез
начинает идти беспрепятственно.
Блокер
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
Chiou, Luo, and Chen. (2006) Nat Protoc, 1 (6): 2604–2612 / pmid: 17406515.
Dominguez and Kolodney. (2005) Oncogene, 24 (45): 6830–6834 / pmid: 16116485.
Gilje et al. (2008) J Mol Diagn. 10 (4): 325–331 / pmid: 18556764.
Orou et al. (1995) Human mutation, 6 (2): 163–169 / pmid: 7581400.
Seyama et al. (1992) Nucleic acids research, 20 (10): 2493–2496 / pmid: 1598207.
www.evrogen.ru
89
Информация для покупателей
Подробная информация о том, как оформить заказ, представлена на сайте
нашей компании в разделе «Как заказать» по адресу:
http://www.evrogen.ru/support/order.shtml.
Условия доставки
В зависимости от характера посылаемых материалов мы осуществляем доставку при комнатной температуре или на льду. Каждая посылка содержит
описание отсылаемых материалов. Доставка осуществляется курьерскими
службами. Время доставки зависит от конкретной службы доставки и обсуждается с заказчиком при оформлении заказа.
Отправка биологического материала заказчиком
Информацию о возможности приема различных биоматериалов и об условиях их подготовки, хранения и транспортировки вы можете узнать на
сайте нашей компании в разделе «Отправка материалов» по адресу:
http://www.evrogen.ru/support/sample-requirement.shtml
Внимание: Мы не принимаем нуклеиновые кислоты и биологические образцы (ткани, культуры клеток), которые могут представлять опасность
инфекционного заражения человека или животных.
Конфиденциальность
Евроген гарантирует сохранение конфиденциальности данных, полученных
в процессе выполнения и обсуждения заказа.
90
Евроген, Каталог 2013/14
ЗАО Евроген
Москва 117997,
ул. Миклухо-Маклая 16/10, корпус 70
(Технопарк ИБХ)
тел.: +7(495)988-4083
факс: +7(495)988-4085
www.evrogen.r u
E-mail: evrogen@evrogen.r u