файл диссертации в формате (0 Kb.)
Реклама
1 МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное бюджетное учреждение «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ И ПЕРИНАТОЛОГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА В.И. КУЛАКОВА» На правах рукописи СЫРКАШЕВА Анастасия Григорьевна СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ПОВЫШЕНИЮ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОГРАММ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ У ПАЦИЕНТОК С ДИСМОРФИЗМАМИ ООЦИТОВ 14.01.01- акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Долгушина Н.В. кандидат биологических наук Макарова Н.П. Москва 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………5 ГЛАВА 1 Современные методы лечения бесплодия у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов у женщин (обзор литературы) ……………..…13 1.1 Влияние качества ооцитов на эффективность ВРТ………………..……..13 1.2 Генез и факторы риска анеуплоидии ооцитов………………….......……..17 1.3 Современные возможности преимплантационного генетического скрининга…………………………………………………………………….22 1.4 Митохондриальная ДНК ооцитов и фертильность женщины…….......….27 1.5 Влияние различных видов дисморфизмов ооцитов на эффективность программ ВРТ………………………………………………………………..32 ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования…………………..…………41 2.1 Дизайн исследования для задачи 1……………………………………....…41 2.2. Дизайн исследования для задачи 2……………………..………………….42 2.3 Дизайн исследования для задачи 3…………………………………………44 2.4 Дизайн исследования для задачи 4…………………………………………45 2.5 Дизайн исследования для задачи 5…………………………………………46 2.6 Дизайн исследования для задачи 6…………………………………………47 2.7 Критерии включения и исключения………………………………………..48 2.8 Расчет объема выборки……………………………………………………...49 2.9 Методы исследования……………………………………………………….51 2.9.1 Общеклинические методы исследования………………………………...54 2.9.2. Ультразвуковое исследование органов малого таза……………………55 2.9.3 Гормональное исследование……………………………………………...56 2.9.4 Исследование эякулята……………………………………………………56 2.9.5 Стимуляция функции яичников и трансвагинальная пункция 3 фолликулов………………………………………………………………………58 2.9.6 Морфологическая оценка ооцитов и оплодотворение…………………..60 2.9.7 Исследование числа копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах...62 2.9.8 Морфологическая оценка эмбрионов…………………………………….63 2.9.9. Преимплантационный генетический скрининг…………………………63 2.9.10 Перенос эмбрионов в полость матки и ведение посттрансферного периода………………………………………………………………………...…65 2.10 Статистическая обработка данных………………………………………..66 ГЛАВА 3. Исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с различными дисморфизмами ооцитов………68 3.1. Клинико-анамнестическая характеристика пар, включенных в исследование……………………………………………………………………..68 3.2 Клинико-лабораторное обследование супружеских пар, включенных в исследование…………………………………………………………………….75 3.3 Особенности протоколов стимуляции суперовуляции у пациенток в изученных группах………………………………………………………………77 3.4 Многофакторный анализ шансов развития дисморфизмов ооцитов в зависимости от изученных предикторов……………………………………….78 3.5 Характеристика оогенеза, раннего эмбриогенеза и исходов программ ВРТ у пациенток в группах сравнения………………………………………………82 ГЛАВА 4. Изучение генеза влияния дисморфизмов на исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий…………………………..92 4.1. Изучение числа копий митохондриальной ДНК в ооцитах человека с различными дисморфизмами…………………………………………………..92 4.2 Клинико-анамнестические характеристики супружеских пар, включенных в исследование…………………………………………………………………..95 4.3 Клинико-лабораторное обследование супружеских пар, включенных в исследование……………………………………………………………………101 4.4. Особенности протоколов стимуляции суперовуляции у пациенток в изучаемых группах……………………………………………………………..103 4 4.5 Характеристика оогенеза, раннего эмбриогенеза и исходов программ ВРТ у пациенток в группах сравнения…………………………………………….104 4.6 Преимплантационный генетический скрининг у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов у пациенток: анализ затраты-эффективность……111 4.7 Клинико-экономический анализ эффективность ПГС для пар с дисморфизмами ооцитов у пациенток………………………………………...115 ГЛАВА 5. Обсуждение полученных результатов…………………………120 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….140 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………………….....142 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ……………144 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………..….147 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Качество половых клеток в циклах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) является ключевым фактором успеха. Именно от зрелости ооцита и сперматозоида, как структурной, так и морфологической, зависит наступление беременности и рождение здорового ребенка. В последнее время в литературе активно обсуждается взаимосвязь между качеством полученных при стимуляции суперовуляции ооцитов и неудачными исходами циклов ВРТ [1]. Аномалии яйцеклеток могут быть разделены на две группы: экстрацитоплазматические и цитоплазматические. К цитоплазматическим аномалиям, наблюдаемым при световой микроскопии ооцита, относят центральную гранулярность цитоплазмы клетки, появление в цитоплазме аномальных агрегатов гладкого эндоплазматического ретикулума (ГЭР), вакуолей, рефрактерных телец, а также наличие темной цитоплазмы клетки. К экстрацитоплазматическим аномалиям относят изменение ширины перивителлинового пространства и появление в нем гранулярности, деформацию мембран оолеммы, а также аномалии строения первого полярного тельца [2]. Получены данные о том, что вышеперечисленные аномалии цитоплазмы, определяющие цитоплазматическую зрелость ооцита, оказывают особое влияние на оплодотворение и дальнейшее развитие эмбриона [3]. При этом окончательно не определена роль каждого из этих нарушений в дальнейшем развитии эмбриона, и не известны клинические предикторы их развития. Нарушения цитоплазматической организации могут влиять на процесс оплодотворения и дальнейшее развитие эмбриона, которые не преодолеваются методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ, от англ. – ICSI - IntraCytoplasmic Sperm Injection). Появление 6 вышеуказанных дисморфизмов ооцитов связывают с развитием генетических, эпигенетических или метаболических нарушений в клетках [4]. Частота генетических нарушений в ооцитах (анеуплоидии) достигает, по данным некоторых авторов, 47,5% [5]. При наличии анеуплоидии в ооцитах наблюдается высокий риск анеуплоидии у эмбрионов [6]. Выявление хромосомных аномалий ооцита возможно лишь при оценке полярного тела, биопсия которого может негативно влиять на последующее деление эмбриона [7]. Именно поэтому поиск ооцитарных морфологических предикторов анеуплоидии эмбрионов является весьма актуальной проблемой. Метаболические явления в ооцитах являются важным фактором, способствующим правильному оплодотворению яйцеклетки и дальнейшему развитию эмбриона [8], [9]. Ооциту требуется большой объем энергии, чтобы осуществились такие важные биологические процессы, как формирование веретена деления, правильное расхождение хромосом, а также деление клетки после оплодотворения. До момента имплантации развивающаяся зигота зависит от существующего пула митохондрий, который уменьшается с каждым циклом деления клеток. Известно, что митохондрии ооцитов, полученных от женщин старшего репродуктивного возраста, содержат делеции ДНК, которые могут нарушать их функционирование. Сочетание уменьшенного числа митохондрий и повышенной частоты мутаций и делеций может привести к неадекватной активности митохондрий, и затем к отсутствию беременности. В последнее время активно изучалась роль митохондриального аппарата в развитии ооцитов и эмбрионов животных [10], [11]. Лучшее понимание морфофункционального состояния митохондриального аппарата ооцитов и эмбрионов ранней стадии развития, возможно, позволит выявить новые предикторы оценки их качества. Использование преимплантационного генетического скрининга (ПГС) предотвращает перенос эмбрионов с аномальным числом хромосом (числовое нарушение кариотипа, анеуплоидии) и позволяет осуществить 7 селекцию генетически полноценных эмбрионов, что в клинической практике ВРТ приводит к увеличению частоты наступления беременности, уменьшению репродуктивных потерь и снижению риска рождения детей с генетической патологией. Оценка клинико-экономической эффективности проведения ПГС необходима для выбора правильной тактики ведения для данной группы пациентов ВРТ. Цель исследования Целью исследования является повышение эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с дисморфизмами ооцитов на основании морфологической оценки качества ооцитов, изучения числа копий митохондриальной ДНК и клинико-экономического анализа преимплантационного генетического скрининга. Задачи исследования 1. Изучить клинико-анамнестические данные и выявить факторы риска развития дисморфизмов ооцитов у пациенток программ ВРТ. 2. Оценить распространенность различных дисморфизмов ооцитов в программах вспомогательных репродуктивных технологий. 3. Провести сравнительный анализ результатов программ ВРТ у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов (параметров фолликулогенеза, оогенеза, раннего эмбрионального развития, наступления беременности и репродуктивных потерь в I триместре). 4. Исследовать число копий митохондриальной ДНК (мтДНК) в неоплодотворившихся ооцитах с различными дисморфизмами у пациенток программ ВРТ. 5. Изучить риск развития анеуплоидии хромосом 13, 18, 21, X, Y в ядрах бластомеров у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов. 8 6. Оценить клинико-экономическую эффективность преимплантационного генетического скрининга в исходах программ ВРТ у пациенток с дисморфизмами ооцитов. Научная новизна В ходе проведения исследования были получены следующие новые знания: Было оценено влияние различных видов дисморфизмов ооцитов на параметры раннего эмбрионального развития и исходы программ ВРТ у супружеских пар с бесплодием с расчетом скорректированного отношения шансов наступления беременности в зависимости от вида дисморфизмов ооцитов. Было изучено влияние различных способов стимуляции суперовуляции и клинико-анамнестических факторов на риск развития различных дисморфизмов ооцитов в программах ВРТ с созданием моделей прогноза развития дисморфизмов ооцитов в зависимости от выявленных факторов риска. Было исследовано число митохондрий путем оценки числа копий мтДНК в ооцитах с различными видами морфологических изменений. Была определена степень риска анеуплоидии в ядрах бластомеров в зависимости от наличия и вида дисморфизмов ооцитов. Была изучена эффективность, в том числе клинико-экономическая эффективность, преимплантационного генетического скрининга в реализации программ ВРТ у пациентов с различными видами дисморфизмов ооцитов у женщин. 9 Практическая значимость В результате проведенного исследования была обоснована значимость морфологической оценки качества ооцитов у пациенток программ ВРТ и выделены группы риска пациенток с наличием ооцитов с различными видами морфологических изменений. Были созданы модели прогноза развития дисморфизмов ооцитов на основании выявленных клинико-анамнестических и ятрогенных факторов риска, которые могут быть использованы в качестве прогностических критериев эффективности программ ВРТ у супружеских пар с бесплодием. Был проведен анализ затраты - эффективность преимплантационного генетического скрининга методом FISH у супружеских пар с различными видами дисморфизмами ооцитов, что послужило обоснованием его применения в изучаемой группе пациентов с учетом клинической и экономической составляющих. Положения, выносимые на защиту 1. Морфологические изменения ооцитов, особенно цитоплазматические дисморфизмы, увеличивают риск неудачных исходов программ ВРТ. Значимыми клинико-лабораторными факторами риска развития дисморфизмов ооцитов являются возраст пациентки, уровень антимюллерового гормона и уровень свободного тироксина. Значимым ятрогенным фактором риска является применение агонистов гонадотропин рилизинг-гормона в качестве триггера овуляции или в протоколах стимуляции суперовуляции. 2. Возможными причинами неэффективности программ ВРТ у пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов могут быть хромосомные или метаболические нарушения в половых клетках. Ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имеют более низкое число копий 10 мтДНК по сравнению с морфологически нормальными ооцитами, а получение и перенос эмбрионов с различными видами анеуплоидий, полученных при их оплодотворении, осуществляется в 3,6 раз чаще. 3. Проведение преимплантационного генетического скрининга методом FISH неэффективно у пациентов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, а в группе пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов увеличивает эффективность программ ВРТ в 1,4 раза, что объясняется переносом в полость матки эуплоидных по 13, 18, 21, X и Y хромосомам эмбрионов. Клинико-экономическая эффективность преимплантационного генетического скрининга методом FISH в лечении бесплодия у супружеских пар с цитоплазматическими дисморфизмами у женщин может быть достигнута путем повышения эффективности лечения бесплодия в программах ВРТ на 19% и снижения стоимости ПГС на 33%. Личный вклад автора Автор участвовал в выборе темы научной работы, разработке цели и задач исследования, морфологического в проведении исследования и интерпретации качества ооцитов, результатов молекулярно- цитогенетических исследований, в обобщении и статистической обработке полученных данных. Автором лично осуществлялось обследование и ведение супружеских пар на всех этапах лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО/ПЭ). Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения специальности 14.01.01 – проведенного исследования диссертации «акушерство и соответствуют соответствуют формуле гинекология». Результаты области исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии. 11 Апробация результатов Основные положения работы доложены на ХV Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2014), VII регионарном форуме «Мать и дитя» (Геленджик, 2014), XXIV Международной конференции РАРЧ (Москва, 2014), XXI Всероссийском конгрессе «Амбулаторно-поликлиническая помощь: с международным от менархе до участием менопаузы» (Москва, 2015). Работа доложена на заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 1 июня 2015 г. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены и используются в практической работе отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (заведующий д.м.н. Калинина Е.А.) и лаборатории репродуктивной генетики (заведующий д.м.н. профессор Бахарев В.А.) ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (директор академик РАН Сухих Г.Т.). Материалы и результаты исследования включены в лекции и практические занятия для клинических ординаторов и аспирантов ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Результаты исследования изложены в 18 печатных работах, из которых 9 напечатаны в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК: в двух обзорных статьях, одном описании клинического случая и шести оригинальных статьях, опубликованных в журналах «Акушерство и гинекология» (импакт-фактор 0,617), «Гинекология» (импакт-фактор 0,465), «Проблемы репродукции» (импактфактор 0,385), "Цитология" медицина» (импакт-фактор 1,513). (импакт-фактор 0,507), «Молекулярная 12 Структура и объем диссертации Диссертация изложена в традиционной форме. Состоит из оглавления, списка принятых сокращений, введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа представлена на 164 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками 32 таблицами. Библиографический указатель включает 13 работ на русском языке и 155 работ на английском языке. 13 Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ЛЕЧЕНИЯ БЕСПЛОДИЯ У СУПРУЖЕСКИХ ПАР С ДИСМОРФИЗМАМИ ООЦИТОВ У ЖЕНЩИН (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Влияние качества ооцитов на эффективность программ ВРТ Бесплодие – это нарушение функции репродуктивной системы, клинически проявляющееся неспособностью супружеской пары добиться беременности в течение как минимум одного года половой жизни без использования контрацепции [12], [13]. Бесплодие может быть обусловлено функциональными или анатомическими нарушениями женской репродуктивной системы (в 35-45% случаев), мужским фактором (в 20-40% случаев), сочетанным генезом (в 20-30% случаев). В некоторых случаях причина бесплодия остается неизвестной [14], [15]. Основными причинами женского бесплодия являются отсутствие или нарушение проходимости маточных труб, отсутствие овуляции, а также наружный гениальный или внутренний эндометриоз. Мужской фактор бесплодия обусловлен нарушениями сперматогенеза, приводящими к отсутствию или снижению концентрации аномальных сперматозоидов, форм, снижению повышению доли подвижности соответственно, их оплодотворяющей способности. морфологически сперматозоидов, и Также бесплодие у мужчин может быть обусловлено нарушением транспорта сперматозоидов по семявыносящим протокам. Тактика ведения супружеских пар с бесплодием индивидуальна. Основными методами лечения являются модификация образа жизни супругов, медикаментозное и/или хирургическое лечение заболеваний, лежащих в основе бесплодия, а при неэффективности данных мероприятий – применение методов вспомогательных репродуктивных технологий. В настоящее время к методам ВРТ относятся: 14 внутриматочная инсеминация спермой мужа (партнера) или донорской спермой; экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов в полость матки; криоконсервация и/или витрификация эмбрионов, ооцитов и спермы; интрацитоплазматическая интрацитоплазматическая инъекция инъекция сперматозоида, морфологически а также нормальным сперматозоидом (ИМСИ); программы суррогатного материнства, а также донорство спермы, ооцитов и эмбрионов; преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) и преимплантационный генетический скрининг [16]. Основной целью программ ЭКО является наступление одноплодной беременности и рождение здорового ребенка при переносе минимального числа эмбрионов в полость матки. Программа ЭКО включает в себя несколько этапов: стимуляция суперовуляции; трансвагинальная пункция яичников и аспирация фолликулярной жидкости, содержащей ооцит-кумулюсные комплексы; селекция и оплодотворение ооцитов; культивирование эмбрионов с последующим переносом эмбриона/ов в полость матки реципиента; Первостепенным фактором, определяющим вероятность наступления клинической беременности и рождения здорового ребенка в результате программы ЭКО, является качество полученных эмбрионов. Разработка схем культивирования эмбрионов до пятых суток развития (стадия бластоцисты) способствовала повышению результативности программ ВРТ при снижении числа переносимых эмбрионов. Культивирование до стации бластоцисты, вопервых, представляет больше возможностей для отбора «лучших» эмбрионов, обладающих максимальным потенциалом к имплантации и 15 дальнейшему развитию, а, во-вторых, делает перенос адекватным моменту физиологического попадания эмбрионов в «имплантационное окно». Тем не менее, несмотря на все достижения последних десятилетий в области клинической репродуктологии, эмбриологии и генетики, судьба эмбриона прежде всего зависит от исходного качества гамет, а именно их морфологической и структурной зрелости [17]. В опытах на ооцитах и эмбрионах млекопитающих было показано, что качество ооцита играет более важную роль, чем качество сперматозоида [18], [19]. Активация собственного генома эмбриона человека происходит на 3 сутки после оплодотворения на 8-клеточной стадии, когда начинают работать более 4000 генов, компактизацию, которые формирование обеспечивают бластоцисты, дальнейшее дробление, имплантацию и все последующее развитие эмбриона [20]. Однако до этого момента важны накопленные в течение оогенеза продукты — мРНК, протеины, субстраты, питательные вещества, которые аккумулируются в ооците. Именно поэтому для оплодотворения и развития эмбриона первостепенное значение имеет именно качество ооцита. Клинические испытания подтверждают данные фундаментальных исследований. Использование донорских ооцитов является эффективным методом лечения бесплодия, позволяющим беременности и рождения здорового добиться наступления ребенка женщинам с низким овариальным резервом, независимо от того, вызвано ли снижение функции яичников возрастом, преждевременной недостаточностью яичников или ятрогенными факторами [21], [22]. В мета-анализе, опубликованном в 2013 году американскими авторами, оценивается эффективность программ ВРТ с использованием донорских ооцитов у пациенток с ожирением. По данным литературы, эффективность программ ЭКО у пациенток с нарушениями жирового обмена значительно ниже общепопуляционных значений, что может быть связано с явлениями окислительного стресса в различных тканях и клетках, в том числе ооцитах [23], [24]. Тем не менее, при использовании 16 донорских ооцитов частота наступления беременности, частота ранних репродуктивных потерь и частота живорождений у пациенток с ожирением не отличаются от аналогичных показателей у пациенток с нормальным индексом массы тела (ИМТ) [25]. Испанские авторы в 2014 году опубликовали исследование, посвященное влиянию возраста отцов на исходы программ ЭКО/ИКСИ с использованием донорских ооцитов, проанализировав 4887 циклов ВРТ. Авторы наблюдали статистически значимую корреляцию между увеличивающимся возрастом мужчин и снижением качества спермы, а именно снижением объема, общей концентрации сперматозоидов, общей подвижности сперматозоидов, а также повышением морфологически аномальных форм. Ассоциация возраста мужчин с репродуктивными исходами (частота биохимических и клинических беременностей, частота репродуктивных потерь в I триместре беременности и частота живорождений) была проанализирована с помощью метода логистической регрессии, в качестве конфаундеров рассматривались возраст донора ооцитов, возраст реципиента, состояние спермы (свежая или криоконсервированная), а также число перенесенных в полость матки эмбрионов. Не было получено статистических значимых различий между исходами программ ВРТ и возрастом мужчины [26]. Авторы предполагают, что качественные ооциты молодых женщин совместно с использованием метода ИКСИ способны преодолевать низкий репродуктивный потенциал сперматозоидов возрастных мужчин. Таким образом, качество ооцитов является одним из основных факторов, ограничивающих как фертильность женщины, так и эффективность лечения бесплодия в целом. Характеристики ооцитов, способные влиять на их качество, могут быть разделены на морфологические, генетические, метаболические и эпигенетические. В рутинной клинической практике лабораторий ЭКО применяется оценка клеток преимущественно по их морфологическим характеристикам и их свойствам во время и после оплодотворения. В данном обзоре литературы будут рассмотрены 17 морфологические, генетические и метаболические характеристики ооцитов. Эпигенетические характеристики ооцитов на данном этапе практически не изучены, хотя представляют определенный научный интерес. 1.2. Генез и факторы риска анеуплоидии ооцитов Анеуплоидии (изменения числа хромосом) являются самыми распространенными вариантами хромосомных аномалий у человека, а также основной генетической причиной потерь беременности и рождения детей с врожденными дефектами, как при естественном зачатии, так и при применении ВРТ. Анеуплоидии являются результатом ошибок мейоза. Известно, что большинство хромосомных нарушений в ооцитах возникают вследствие неправильного расхождения хромосом в анафазе I деления мейоза. Исследования гаметогенеза у человека показали, что оогенез значительно более подвержен ошибкам мейоза, чем сперматогенез [27], [28]. По данным литературы, распространенность анеуплоидии по 13, 18, 21, X, Y хромосомам в нормальной или субфертильной сперме не превышает 0,6% [29], а распространенность анеуплоидии по 24 хромосомам не превышает 5%, хотя при наличии патозооспермии, особенно тератозооспермии, распространенность анеуплоидии может возрастать в 4-5 раз [30], [31]. Появление процедуры ИКСИ сделало возможным получение эмбрионов даже при наличии тяжелой формы патозооспермии у мужчин, которая препятствует наступлению спонтанной беременности, что привело к более широкому распространению эмбрионов с отцовскими анеуплоидиями [32], [33], [34]. Оценка хромосомного набора ооцита возможно только при проведении оплодотворения in vitro и генетическом исследовании полярного тельца. По данным литературы, средний уровень анеуплоидии в ооцитах, полученных в естественных циклах, составляет около 20% [35]. Данные литературы о распространенности анеуплоидии в ооцитах в стимулированных циклах 18 варьируют в широком диапазоне (20-70%), при этом наблюдается четкая прямая связь между возрастом пациентки и долей анеуплоидных ооцитов [6]. С помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) было показано, что у женщин старше 40 лет доля ооцитов с анеуплоидиями превышает 0,5 [36]–[38]. Возможной причиной большей предрасположенности к анеуплоидии именно ооцитов, а не сперматозоидов, являются различия между гаметогенезом у мужчин и женщин [27], [39]. Сперматогенез у мужчин является непрерывным процессом, в то время как женщины рождаются с законченным набором незрелых ооцитов, находящихся в пассивном состоянии, и процесс созревания завершается только в естественном или экзогенно стимулированном овуляторном менструальном цикле. У обоих полов основой мейоза служит репликация ДНК в родительской клетке, за которой следуют два цикла деления ядра и клетки, известные как первое деление мейоза (мейоз I) и второе деление мейоза (мейоз II), которые приводят к образованию гаплоидных гамет. В профазе I гомологичные хромосомы выстраиваются в ряд, образуют хиазмы (точки перекреста), а затем происходит кроссинговер, необходимый для образования новых генных комбинаций. Также в течение профазы I происходит дезинтеграция ядрышек и ядерных оболочек клетки, и образуются нити веретена деления. В метафазе I пары хромосом выстраиваются у экватора веретена деления, прикрепляясь к нитям центромерами (центромеры – точки соединения хромосом). В анафазе I микротрубочки сокращаются, в результате чего нити веретена тянут гомологичные хромосомы к противоположным полюсам веретена деления. В анафазе I хромосомы разделяются на два гаплоидных набора, по одному на каждом полюсе веретена деления. В результате мейоза I деления гомологичные хромосомы расходятся к противоположным полюсам веретена деления. При этом число хромосом уменьшается вдвое, но они состоят из двух хроматид каждая. В результате кроссинговера возникают новые генные комбинации, и хроматиды неидентичны. Результатом мейоза 19 II, которое по структуре сходно с митотическим делением, является образование гаплоидных дочерних клеток. В процессе сперматогенеза мейотическое деление клеток происходит постоянно, начиная со времени полового созревания, и затем в течение всей жизни мужчины. В женском организме первое мейотическое деление начинается во время эмбрионального развития – в него вступают примордиальные зародышевые клетки, образовавшиеся в результате митоза (примерно с 20-й недели гестации), а затем мейоз останавливается на стадии профазы I [40]. В дальнейшем мейотическое деление продолжается только в результате овуляторного пика лютеинизирующего гормона (ЛГ) у девочки, достигшей полового созревания. Для большинства ооцитов финальная стадия мейоза никогда не наступает, а для остальных овуляторный пик ЛГ происходит спустя годы и десятилетия. Длительный временной интервал между началом и остановкой мейоза во время эмбрионального развития женского организма и окончанием мейоза во время овуляторных циклов является наиболее вероятной причиной высокой частоты хромосомных нарушений в ооцитах. Расхождение хромосом в течение мейотического деления в целом является точно скоординированным биологическим процессом, и ошибки возникают достаточно редко. К примеру, у дрожжевых грибов только 1 из 100 000 делений ассоциировано с нарушением расхождения хромосом. Анеуплоидии в гаметах млекопитающих, например грызунов, встречаются значительно чаще, их распространенность составляет от 0,5% до 1,0% [41]. Хромосомный статус человеческих ооцитов в процессе оогенеза и оплодотворения также достаточно хорошо изучен. Известно, что на различных этапах мейоза могут произойти ошибки, которые приведут к несбалансированному распределению хромосом, за счет нерасхождения хромосомы целиком или преждевременного разделения и случайного расхождения сестринских хроматид [42],[43]. 20 Под воздействием овуляторного пика ЛГ возобновляется первое мейотическое деление в ооците, пары хромосом (биваленты) разделяются и мигрируют к противоположным полюсам веретена деления. Один из бивалентов переходит в первое полярное тельце (PB1), в то время как второй остается в цитоплазме ооцита. В норме каждый из бивалентов содержит 23 хромосомы и 46 хроматид, которые соединены между собой специфическими когезионными белками. Данная фаза соответствует второму мейотическому делению, которое завершается только после проникновения сперматозоида в клетку, индукции активации ооцита и выброса второго полярного тельца (PB2). На данном этапе сестринские хроматиды разделяются, и одна из них переходит во второе полярное тельце, а вторая остается в цитоплазме ооцита (рисунок 1). По данным литературы, существует несколько гипотез, объясняющих механизм патологического расхождения хромосом в течение оогенеза. Причинами данного состояния, по мнению американских ученых, могут быть неудачи кроссинговера в профазе I мейоза, неправильное расположение хиазм (слишком близко или, наоборот, слишком далеко от центромер), дефекты в формировании веретена деления, а также потери когезионных белков, осуществляющих связь между сестринскими хроматидами [6]. Вторым возможным механизмом является запаздывание хромосом в анафазе первого мейотического деления, которое представляет собой задержку движения одной из хромосом относительно других, обусловленную нарушением ее ориентации. Как правило, отстающие хромосомы не попадают в дочерние клетки и подвергаются разрушению в цитоплазме клетки [44]. Третьим возможным механизмом является гонадный мозаицизм – явление, при котором оогонии исходно являются анеуплоидными, а анеуплоидии возникают в процессе митотического деления на этапах формирования женского организма [45]. Как показали исследования, посвященные изучению хромосомного набора как ооцитов, так и 21 соответствующих им первых полярных телец, гонадный мозаицизм встречается гораздо чаще, чем предполагалось ранее [46], [47]. Наличие в ооците и в соответствующем ему первом полярном тельце некомплементарных анеуплоидий является признаком наличия изменений числа хромосом в оогониях, которые имели анеуплоидии до начала первого мейотического деления. Результатом первого мейотического деления оогоний, имеющих анеуплоидии, становится появление первого полярного тельца и ооцита, один из которых повторяет анеуплоидии, а второй является эуплоидным – именно так возникают некомплементарные анеуплоидии. PB1 PB2 Нормальное расхождение материнских хромосом PB1 PB2 Нерасхождение материнских хромосом PB1 PB2 Преждевременное расхождение хроматид PB1 PB2 Рисунок 1. Возможные причины анеуплоидии в человеческих ооцитах. 22 Предполагается, что около 30% человеческих эмбрионов имеют хромосомные аномалии в виде анеуплоидии, и этот показатель может значительно увеличиваться у женщин старше 38 лет [4], [48]. Аналогичные тенденции наблюдаются и при изучении эмбрионов, полученных in vitro в программах ЭКО: в 2010 году авторы из Великобритании опубликовали обзор литературы, по данным которого распространенность эмбрионов с анеуплоидиями в циклах ЭКО составляет от 50 до 70% и зависит, прежде всего, от возраста матери [49]. Суммарная частота анеуплоидии в эмбрионах на стадии бластоцисты, по-видимому, ниже, чем в эмбрионах на более ранних стадиях культивирования, но составляет около 50% у женщин старше 37 лет (по данным FISH-диагностики) [50]. Проспективные исследования демонстрируют, что даже в морфологически нормальных бластоцистах анеуплоидии являются широко встречающимся явлением [51]. Кроме возраста матери, факторами риска анеуплоидии ооцитов являются наличие привычного невынашивания беременности [52], [53] и неудачных программ ЭКО в анамнезе [37], [54]. Перенос анеуплоидных эмбрионов приводит к клиническим последствиям в виде повышения частоты прерываний беременности в I триместре гестации [55]. Хотя большинство беременностей анеуплоидным эмбрионом прерываются на очень ранних сроках беременности, некоторые трисомии, а именно трисомии 13, 18, 21 и половых хромосом, совместимы с жизнеспособностью эмбриона. Беременности анеуплоидными эмбрионами приводят к рождению детей с врожденными аномалиями, а также с умственной отсталостью, которые в большинстве случаев приводят к их ранней смерти. 1.3. Современные возможности преимплантационного генетического скрининга Преимплантационная генетическая диагностика является методом селекции как ооцитов, так и эмбрионов in vitro с целью профилактики 23 рождения детей с врожденными и наследственными заболеваниями. ПГД служит альтернативой пренатальной диагностике и селективному прерыванию беременности на ранних сроках у пар с высоким риском рождения детей с врожденными аномалиями. Впервые генетическое исследование эмбрионов доимплантационной стадии было проведено в 1968 году с целью определения пола потомства кроликов [56]. В клиническую практику ПГД была внедрена только в 1990 году в качестве экспериментальной процедуры для диагностики моногенных заболеваний, таких как муковисцидоз, а также заболеваний, сцепленных с полом, таких как мышечная дистрофия Дюшена или гемофилия [57], [58]. Вначале технология генетической диагностики на этапе до переноса эмбрионов в полость матки не выглядела перспективной: за первые 3 года использования метода родилось всего несколько здоровых детей, к тому же были подтверждены случаи серьезных ошибок в диагнозе [59], [60]. Тем не менее, после внедрения методики флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и ее использования для диагностики хромосомных нарушений у эмбрионов, число циклов ПГД начало стремительно увеличиваться, и уже через два года использования данной технологии число родившихся здоровых детей превысило сотню [59]. В настоящее время показанием для проведения ПГД является высокий риск врожденных аномалий у потомства, не связанный с носительством известных мутаций. В клинической практике это пары, в которых возраст матери превышает беременности, 35 лет, выраженную имеющие привычное патозооспермию у невынашивание супруга, а также множественные неудачи ЭКО – отсутствие имплантации при переносе эмбрионов, либо неудовлетворительное качество эмбрионов в предыдущих программах. В данной преимплантационного ситуации генетического методика носит скрининга. название Термин преимплантационная генетическая диагностика более точно характеризует 24 ситуации, когда необходимо исключить передачу известной хромосомной аномалии одного из родителей эмбриону. В качестве материала для генетического исследования могут быть использованы первое или второе полярное тельце ооцитов, один или два бластомера эмбриона 3-х суток культивирования, трофоэктодермы эмбриона на стадии бластоцисты. или клетки В качестве метода исследования в настоящее время используют следующие технологии: полимеразную цепную реакцию (ПЦР), флуоресцентную гибридизацию in situ, а также метод сравнительной геномной гибридизации (СГГ, от англ. CGH – comparative genomic hybridization). Метод ПЦР применяется для диагностики мутаций в отдельных генах, что в клинической практике необходимо, во-первых, для диагностики моногенных заболеваний, а, вовторых, для определения антигенов системы тканевой совместимости человека (англ. HLA - Human Leucocyte Antigens) и резус-принадлежности эмбрионов. FISH применятся как для определения пола эмбриона, так и для диагностики хромосомной патологии. Для гибридизации используются индивидуальные ДНК-зонды, которые связываются с комплементарными мишенями в исследуемом образце. FISH-диагностика применяется также для диагностики сбалансированных транслокаций у эмбрионов, но для каждого вида хромосомной патологии требуется изготовление специфичных ДНКзондов. Основным ограничением метода FISH является небольшое число исследуемых хромосом (максимум 12). Для каждой хромосомы используется свой флуоресцирующий краситель – флюорохром, и чем больше их используется в одном препарате, тем больше вероятность наложения сигналов, а, значит, ошибки диагностики. Как правило, в клинической практике данный метод применяется для определений анеуплоидии не более чем 6 хромосом одновременно. Соответственно, при применении FISH не могут быть выявлены аномалии строения хромосом, которые не были подвергнуты исследованию. Метод CGH является альтернативой FISHдиагностике и позволяет проанализировать каждую из 24 хромосом 25 одновременно. Технология CGH была успешно внедрена в клиническую практику для диагностики в онкологии [61], и только потом стала использоваться для ПГС [62]. С помощью CGH возможно диагностировать анеуплоидии, делеции и дупликации, а также несбалансированные транслокации. Однако сбалансированные транслокации или инверсии, а также полногеномные моно- или полиплоидии (например, 69, ХХХ или 23, Х) не могут быть зафиксированы. Другим ограничением метода является его высокая стоимость. Как обсуждалось ранее, первое и второе полярные тельца содержат хромосомы и хроматиды, которые были отбракованы в процессе мейотического деления с целью формирования гаплоидного статуса ооцита. В норме полярные тельца являются точным зеркальным отражением ооцита. FISH стала первой методикой, которая с успехом применялась для диагностики анеуплоидии 13, 16, 18, 21 и 22 и половой хромосом ооцитов [63], [64], [65]. Также исследование полярных телец ооцитов широко используется для профилактики передачи потомству аутосомно-рецессивных заболеваний и заболеваний, связанных с Х-хромосомой [66], [67], [68], [69]. Метод CGH также применяется для диагностики хромосомной патологии ооцитов путем изучения первого и второго полярных телец, особенно у пациенток старшего репродуктивного возраста, хотя имеются данные, что около 75-80 % выявленных анеуплоидий поражают 13, 16, 18, 21 и 22 хромосомы, а, значит, могут быть выявлены с помощью FISH [70], [5], [71]. Основными ограничениями изучения полярных телец ооцита является невозможность оценить вклад хромосомного набора сперматозоида [72], и выявить аномалии Преимуществом ранних данного митотических метода является делений эмбриона возможность [73]. избежать инвазивного вмешательства в клеточную массу развивающегося эмбриона, так как изучению подвергаются только побочные продукты мейотического деления. 26 Наиболее широко используемым материалом для проведения ПГС на сегодняшний день являются отдельные бластомеры эмбрионов. Биопсия одного или, редко, двух бластомеров, осуществляется на 3-и сутки культивирования эмбриона, когда эмбрион содержит от 6 до 10 клеток, являющихся тотипотентными, а процесс компактизации еще не начался. На данной стадии биопсия бластомера не оказывает отрицательного влияния на дальнейшее развитие эмбриона. Эмбрионы продолжают культивирование in vitro до стадии бластоцисты, а селекция бластоцист для переноса в полость матки осуществляется на основании как морфологической оценки эмбриона, так и результатов генетической диагностики. Изучение хромосомного набора бластомеров проводится как методом FISH [74], [75], так и методом CGH [76], [77]. Основным преимуществом генетического исследования бластомеров является возможность проведения переноса эмбрионов в полость матки в исследуемом цикле. Тем не менее, в литературе имеются данные об отсутствии влияния генетической диагностики бластомеров методом FISH на результативность программ ЭКО [78], [79], или даже о снижении частоты наступления беременности после проведения данного вида диагностики [80], [7]. Несомненно, ограничениями исследования бластомеров эмбрионов являются, во-первых, невозможность исключить мозаицизм исследуемых эмбрионов [81], [82], а также их потенциальную способность к самокоррекции [83], [84]. Во-вторых, при проведении диагностики методом FISH изучаются анеуплоидии только тех хромосом, анеуплоидии которых ассоциированы с жизнеспособностью эмбрионов и возможностью рождения живых детей с хромосомной патологией. Соответственно, использование данной технологии объективно снижает вероятность рождения детей с хромосомной патологией, но не исключает переноса в полость матки эмбрионов, имеющих анеуплоидии по оставшимся хромосомам, которые могут быть ассоциированы с отсутствием имплантации или прерывания имплантации на ранних сроках гестации. Также некоторые 27 ученые не исключают прямого отрицательного влияния процедуры биопсии бластомеров на последующую имплантацию [7]. Одним из наиболее перспективных методов генетической диагностики эмбрионов представляется исследование клеток трофоэктодермы. Исследование клеток трофоэктодермы проводится, как правило, методом CGH [85], [86] хотя в некоторых исследованиях представлены результаты FISH-диагностики [87], [88]. Преимуществами биопсии бластоцисты являются снижение травматичности для эмбриона, а также большая информативность вследствие исключения мозаичности клеток эмбриона. Тем не менее, биопсия бластоцисты требует сепарации цикла ЭКО и проведения криоконсервации или витрификации исследуемых эмбрионов с целью их криопереноса в последующих циклах после получения результатов диагностики. Для проведения витрификации бластоцист требуется высокий уровень материально-технического оснащения эмбриологической лаборатории, а также увеличиваются финансовые затраты на проведения программы ЭКО. На настоящий момент имеющиеся в литературе данные о влиянии ПГС на эффективность программ ЭКО, в том числе частоту наступления беременности, частоту живорождений и частоту прерываний беременности на ранних сроках гестации, противоречивы. По данным Кохрановского систематического обзора, нет доказательств в пользу достоверного влияния ПГС на увеличение частоты живорождений [89]. Также четко не определены показания к проведению ПГС, и возможности применения различных методик генетической диагностики у различных групп пациентов. 1.4. Митохондриальная ДНК ооцитов и фертильность женщины Присутствующие во всех эукариотических клетках митохондрии – принципиально важные органеллы, играющие ключевую роль в различных биохимических процессах, включая аэробное дыхание и продуцирование 28 энергии. Предполагается, что митохондрии являются эволюционными реликтами древних бактерий-симбионтов [90], а основным доказательством данной гипотезы служит наличие в митохондриях собственного генома, который носит название митохондриальной ДНК. МтДНК является единственным источником ДНК вне ядра клетки и имеет отличный от ядерной ДНК способ наследования. Митохондрии представляет собой мембранные органеллы, состоящие из двух мембран – наружной и внутренней, между которыми располагается небольшое внутримембранное пространство. Внутренняя мембрана образует многочисленные гребневидные складки (кристы), значительно увеличивающие площадь внутренней мембраны. Основной функцией митохондрий является дыхание и продукция аденозинтрифосфата (АТФ), универсального переносчика энергии в клетке путем окислительного фосфорилирования. Кроме того, биологическими функциями митохондрий являются регуляция апоптоза, цитозольной концентрации кальция, а также синтеза железносерных кластеров – белковых кофакторов, играющих важную роль в процессе окислительно-восстановительных реакций в клетке. Митохондрии являются первичным источников эндогенных активных форм кислорода и местом протекания важнейших биохимических процессов в клетке – цикла трикарбоновых кислот (цикл Кребса) и фрагмента орнитинового цикла. Окислительное фосфорилирование требует скоординированной работы пяти ферментных комплексов, расположенных на внутренней мембране митохондрий. Электроны, полученные при окислении жирных кислот или глюкозы, переходят от одного энзимного комплекса к другому, создавая, таким образом, электрохимический градиент для протонов на внутренней мембране, который запускает механизм синтеза АТФ из аденозиндифосфата (АДФ) с помощью АТФ-синтазы. ДНК митохондрий представляет собой кольцевую молекулу ДНК, представленную множеством копий в каждой клетке, имеющей ядро. Геном митохондрий содержит 16 569 пар нуклеотидов, а полное его секвенирование 29 было осуществлено в 1981 году [91], [92]. Митохондриальный геном кодирует в общей сложности 37 генов, которые расположены как на тяжелой (H-цепь, от англ. - heavy, так как содержит больше гуанина) цепи, так и на легкой (L-цепь, от англ. - light, так как содержит больше цитозина). Из всех генов 13 кодируют синтез субъединиц ферментных комплексов дыхательной цепи, еще 22 гена кодируют синтез транспортных РНК (тРНК), а оставшиеся 2 кодируют синтез рибосомальных РНК (рРНК). Другие белки, необходимые для синтеза митохондрий и поддержания их нормальной метаболической активности, закодированы в ядерном геноме. Они синтезируются клеткой и затем поступают в митохондрии из матрикса цитоплазмы [93]. Митохондрии в зрелых ооцитах обладают некоторыми отличиями от митохондрий в соматических клетках. Во-первых, они значительно меньше по размеру, имеют сферическую форму и состоят из нескольких частей. В отличие от своих полностью дифференцированных аналогов в соматически клетках, которые постоянно перемещаются по цитоплазме, динамически объединяются и разделяются, образуя объединенную сеть, они имеют меньше крист и электронно плотный матрикс [94]. В созревающих ооцитах процессы деления и слияния митохондрий происходят намного реже [95]. Во-вторых, митохондрии ооцитов, по-видимому, имеют только одну или две молекулы мтДНК в отличие от митохондрий соматических клеток, в которых число молекул мтДНК варьируется от двух до десяти [96], [97]. Именно это предположение о распределении мтДНК было использовано для оценки числа копий мтДНК в цитоплазме ооцитов. Изучение числа копий мтДНК в ооцитах млекопитающих, и особенно ооцитах человека, является актуальной проблемой. Тем не менее, на сегодняшний день данные различных исследований противоречивы, и не существует общепринятых нормативов количества копий мтДНК в ооцитах человека. В различных исследованиях число копий мтДНК в ооцитах человека широко варьирует не только между различными пациентками, но и между отдельными ооцитами в одной когорте [8], [9], [98]–[100], и оценивается в диапазоне между 104 и 107 30 числом копий в одной клетке. Следует отметить, что для оценки числа копий мтДНК в ооцитах используется гипотеза о том, что митохондрии содержат одну или две молекулы мтДНК, хотя напрямую количество молекул в одной митохондрии ооцита человека не изучалось. В связи с этим данные, отражающие число копий мтДНК в ооцитах человека, могут быть значительно преувеличены [101]. В-третьих, считается, что процессы репликации и транскрипции мтДНК приостановлены в зрелых ооцитах млекопитающих, и восстановление их происходит только после оплодотворения клетки [102]. Предполагается, что возобновление транскрипции митохондриального генома происходит одновременно с активацией собственного генома эмбриона [11]. Активация собственного генома эмбриона начинается на разных стадиях дробления у разных млекопитающих. У человека геном эмбриона начинает реплицироваться примерно через 72 часа после оплодотворения, когда эмбрион содержит от 4 до 8 бластомеров. Таким образом, на ранних этапах эмбриогенеза репликации мтДНК не происходит, соответственно, число молекул мтДНК в отдельных бластомерах прогрессивно уменьшается с каждым циклом деления эмбриона, также как уменьшается объем цитоплазмы. Только на стадии бластоцисты начинается полноценная экспрессия факторов репликации мтДНК и, соответственно, репликация мтДНК в клетках трофоэктодермы. Одновременно происходит изменение структуры митохондрий – органеллы вытягиваются в длину, кристы углубляются, увеличивается фосфорилирования активность процесс окислительного [103]. Что касается процесса оогенеза, число копий мтДНК в созревающих ооцитах непрерывно увеличивается параллельно с объемом цитоплазмы, и в течение развития от стадии первичной зародышевой клетки до стадии примордиального фолликулы их число увеличивается примерно в 50 раз [104]–[106]. В отличие от ядерной ДНК, мтДНК передается по наследству только по материнской линии [107]. В сперматозоидах млекопитающих обычно 31 содержится не более десяти митохондрий, а в сперматозоиде человека – одна спирально закрученная митохондрия [108]. Более того, после оплодотворения начинается активная деградация митохондрий сперматозоидов. В нормальной сперме человека содержится мтДНК [109], и хотя в литературе обсуждался отдельный клинический случай передачи мтДНК от отца к ребенку [110], в последующих популяционных исследованиях не было найдено убедительных доказательств в пользу наследования мтДНК по отцовской линии [111], [112]. Несмотря на опасения ученых, что при проведении процедуры ИКСИ может быть нарушен механизм, посредством которого осуществляется деградация отцовской мтДНК после оплодотворения, даже при проведении ЭКО/ИКСИ механизм передачи мтДНК не нарушался [113]. В литературе активно обсуждается связь между числом копий мтДНК, продукцией АТФ митохондриями и качеством ооцитов, а также потенциалом развития эмбрионов в программах ВРТ. Несмотря на то, что созревание ооцита может происходить при большой вариабельности содержания АТФ в клетке, ооциты с более высокой концентрацией АТФ обладают большим потенциалом к успешному эмбриогенезу и имплантации [114]. Хотя число копий мтДНК в ооцитах широко варьирует, как обсуждалось ранее, ооциты с более низким числом копий мтДНК, по данным н, имеют более низкую частоту оплодотворения [9]. Отмечается четкая корреляция между увеличением возраста пациентки и снижением числа копий мтДНК в ооцитах [115]. Кроме того, ооциты пациенток с преждевременной недостаточностью яичников содержат значительно меньшее число копий мтДНК, чем пациентки с нормальным овариальным резервом [116]. Тем не менее, полученные данные сложно интерпретировать с практической точки зрения, так как изучение митохондрий в отдельных ооцитах сопряжено с гибелью клетки, и доподлинно не известно, насколько возможно экстраполировать полученные данные на общую популяцию гамет. 32 Большой интерес представляет исследование Murakoshi et al. (2013), в котором ученые из Японии анализировали число копий мтДНК в отдельных бластомерах эмбрионов 3-суток культивирования. Эмбрионы продолжали культивировать после биопсии, а затем переносили в полость матки на стадии бластоцисты. В данном исследовании была выявлена статистически значимая положительная связь между числом копий мтДНК в отдельных бластомерах эмбрионов и частотой наступления клинической беременности [115]. Биология и генетика митохондрий представляет собой большой научный интерес, особенно в области патологии репродукции и методов ВРТ. Изучение митохондриального аппарата ооцитов человека, особенно числа копий мтДНК, необходимо для более полного понимания процессов метаболических нарушений в ооцитах, а значит, для разработки методов их коррекции. 1.5. Влияние различных видов дисморфизмов ооцитов на эффективность программ ВРТ В повседневной клинической практике лаборатории ЭКО оценка качества полученных при трансвагинальной пункции ооцитов производится достаточно поверхностно. При проведении инсеминации ооцитов in vitro (процедура классического ЭКО) тщательная оценка морфологии ооцитов не проводится, учитывая наличие в препарате клеток кумулюса. И хотя при проведении процедуры ИКСИ оплодотворение ооцитов производится после энзимного удаления клеток кумулюса, оценка качества клеток сводится в основном к определению степени зрелости ооцита (стадия зародышевого пузырька – GV, метафазы I или метафазы II). Даже при наличии грубых морфологических аномалий, все зрелые ооциты на стадии MII подвергаются процедуре ИКСИ. При этом потенциал развития эмбрионов оценивается исключительно по морфологии самого эмбриона без связи с качеством 33 ооцита, из которого данный эмбрион был получен. Нельзя не отметить, что морфологической оценке ооцитов уделяется меньше внимания, чем выбору сперматозоидов для проведения ИКСИ или анализу эмбрионов в процессе культивирования. Применение контролируемой стимуляции функции яичников дополнительно усложняет ситуацию. Созревание ооцита in vivo является результатом длительной и тщательной селекции. Стимуляция функции яичников подавляет естественную селекцию и приводит к созреванию заведомо аномальных ооцитов, которые физиологически должны были подвергнуться апоптозу. Распространенность морфологических аномалий ооцитов, по данным разных авторов, достигает 50% [117]. Аномалии строения ооцитов (дисморфизмы) классифицируются на две группы: цитоплазматические и экстрацитоплазматические. К цитоплазматическим относят повышение гранулярности цитоплазмы, повышение вакуолизации, аномальные агрегаты гладкого эндоплазматического ретикулума, а также наличие разнообразных цитоплазматических включений. Принято считать, что данная группа аномалий является признаком цитоплазматической незрелости клетки, а, значит, наличие оплодотворение цитоплазматических ооцита экстрацитоплазматическим перивителлинового и дисморфизмов дальнейшее аномалиям пространства, развитие относят наличие влияет эмбриона. изменение на К ширины гранулярности в перивителлиновом пространстве, изменение толщины и/или формы зоны пеллюцида, а также особенности строения первого полярного тельца. Остается спорным вопрос, влияют ли данные аномалии на частоту оплодотворения, развитие эмбриона и способность его к имплантации. В качестве возможных факторов риска появления дисморфизмов ооцитов рассматриваются возраст женщины, генетические нарушения, причина бесплодия, а также наличие метаболических нарушений (избыточная масса тела и ожирение) и гинекологических заболеваний 34 (наружный генитальный эндометриоз, синдром поликистозных яичников, ановуляция) [118], [119], [120]. При этом нет данных за четкую связь между данными факторами и появлением у пациенток дисморфизмов ооцитов. Особое внимание уделяется влиянию различных протоколов стимуляции функции яичников в программах ЭКО на морфологию ооцитов. В крупном ретроспективном когортном исследовании были получены данные о том, что длительность стимуляции функции яичников четко коррелирует с качеством ооцитов и эмбрионов 3-х суток культивирования. При длительности стимуляции функции яичников меньше девяти дней отмечается значительно более частая фрагментация бластомеров эмбрионов [121].Учитывая, что длительность стимуляции функции яичников связана с длительностью собственного менструального цикла пациентки, которая в свою очередь уменьшается с возрастом или при снижении овариального резерва, можно провести параллель между данными состояниями и качеством эмбрионов. В другом проспективном рандомизированном исследовании связи между различными протоколами стимуляции функции яичников и морфологией полученных ооцитов отмечено не было [119]. К наиболее часто встречающимся цитоплазматическим дисморфизмам ооцитов относят центральную гранулярность цитоплазмы, наличие в цитоплазме вакуолей, рефрактерных телец, а также аномальных агрегатов ГЭР. Центральная гранулярность цитоплазмы является особенностью строения ооцита и представляет собой крупную темную губчатую зернистую область в цитоплазме. Распространенность данного варианта дисморфизма составляет около 30-35 % [1], [122]. Основным фактором риска появления данной аномалии ооцитов считался возраст женщины [123], однако эти данные не получили подтверждения в последующих исследованиях [124]. Связи между данным дисморфизмом и различными протоколами стимуляции функции яичников также не было отмечено [1], [124]. Зрелые ооциты с гранулярностью цитоплазмы имеют более кислую внутриклеточную среду, а 35 также низкое содержание АТФ в клетке [123], что, по мнению авторов, связано с гипоксией фолликулов в процессе фолликулогенеза. Отрицательное влияние центральной гранулярности на частоту оплодотворения и качество полученных эмбрионов является спорным [122], [124]–[126]. При этом во всех исследованиях отмечалась существенно более низкая частота наступления развивающихся беременностей, не превышающая 10%. По данным генетического исследования частота анеуплоидии в бластомерах эмбрионов, полученных путем оплодотворения ооцитов с центральной гранулярностью, достигает 52%, что может быть объяснением причины низкой эффективности программ ЭКО у данной группы пациенток [114], [122]. Вакуоли представляют собой цитоплазматические включения, окруженные мембраной и заполненные жидкостью, иногда содержащие дегенерирующие органеллы клетки (лизосомы или митохондрии). Вакуоли могут появляться в ооците или бластомерах на любой стадии развития, быть единичными или многочисленными. Размер вакуолей широко варьирует. Появление вакуолей может быть, как спонтанным во время созревания ооцита, когда происходит выделение первого полярного тельца, так и искусственным после проведения ИКСИ. Жидкость, заполняющая вакуоли, по составу близка содержимому перивителлинового Распространенность вакуолизации в зрелых ооцитах пространства. на стадии профазы второго мейотического деления (МII) невысока и составляет около 3-4% [1], [127]. Факторы риска появления данного дисморфизма ооцитов не определены. Потенциал дальнейшего развития ооцитов и эмбрионов с вакуолями значительно снижен. Частота оплодотворения ооцитов с данным дисморфизмом ниже, чем в морфологически нормальных ооцитах, и зависит от количества и размера вакуолей [127], [128]. Оплодотворение ооцита отсутствует, если размер вакуолей превышает 14 мкм. Существует гипотеза, что крупные вакуоли смещают веретено деления, а также нарушают архитектонику цитоплазмы (приводят к смещению микротрубочек), что 36 препятствует нормальному движению пронуклеусов. Наличие вакуолей в ооцитах также оказывает неблагоприятное воздействие на развитие эмбриона. Такие эмбрионы реже достигают стадии бластоцисты, либо формируется бластоциста низкого качества [127]. Рефрактерные тельца состоят из смеси липидов и плотного материала гранул. Они могут обнаруживаться на различных стадиях созревания ооцитов. Основную роль играет размер гранул. Доказано, что наличие рефрактерных телец размеров более 5 мкм сопровождается снижением частоты оплодотворения и развития эмбрионов до стадии бластоцисты [129]. Скопление аномальных агрегатов ГЭР представляет собой круглые гладкие прозрачные диски, находящиеся, как правило, в центре ооцита. Данный дисморфизм наблюдается только в зрелых ооцитах на стадии МII, распространенность его составляет 0,5-2% [1], [130]. Появление агрегатов ГЭР снижает вероятность оплодотворение клетки и потенциал развития эмбриона [130]–[132]. В процессе оплодотворения проникновение сперматозоида в ооцит запускает цепь реакций, тесно связанных с кинетикой внутриклеточного кальция. Выброс кальция необходим для протекания кортикальной реакции, завершения мейоза и формирования пронуклеусов. Кроме того, нормальная кинетика внутриклеточного кальция необходимо для развития эмбриона до стадии бластоцисты. В клетке основной органеллой, накапливающей кальций, служит ГЭР, поэтому изменения внутриклеточного распределения данной органеллы могут влиять на выброс кальция, оплодотворение, а также на ранние этапы эмбриогенеза. Ооциты с данным дисморфизмом чаще встречаются в протоколах гонадотропин рилизинг-гормона (ГнРГ). При этом с антагонистами не зарегистрировано появления таких ооцитов в циклах без стимуляции функции яичников [130], [132]. Наличие агрегатов ГЭР в ооцитах коррелирует с низкой частотой оплодотворения, низким качеством полученных эмбрионов, при этом эмбрионы редко имплантация и достигают стадии развивающаяся бластоцисты, беременность реже [130]–[132]. наступает Помимо 37 эмбриологических аспектов, наличие агрегатов ГЭР в ооцитах ассоциировано с частыми акушерскими осложнениями. Наблюдается более высокая частота преждевременных родов и рождения детей с серьезными пороками развития, а также более низкий вес новорожденных [130]–[132]. По данным генетического исследования, частота анеуплоидии в бластомерах эмбрионов, полученных при оплодотворении ооцитов с данным дисморфизмом, достигает 37% [114]. Большинство авторов рекомендует отказаться от оплодотворения ооцитов с агрегатами ГЭР, учитывая все вышеописанные факторы [130], [132]. Наличие темной цитоплазмы ооцита увеличивает риск получения эмбрионов низкого качества, что может быть связано с цитоплазматической незрелостью клетки [133], [134]. К экстрацитоплазматическим увеличение перивителлинового дисморфизмам пространства, ооцитов наличие относят гранулярности (дебриса) в перивителлиновом пространстве, изменение формы и/или толщины зоны пеллюцида, а также аномалии строения первого полярного тельца. Перивителлиновое пространство ооцитов человека может варьировать по размеру, а также по наличию или отсутствию гранулярности. Наличие дебриса часто сочетается с увеличенным перивителлиновым пространством. Распространенность увеличенного перивителлинового пространства ооцитов составляет около 30% [1]. Факторы риска появления данного дисморфизма неизвестны, хотя предполагается, что широкое перивителлиновое пространство ооцитов является специфической ответной реакцией на стимуляцию функции яичников. Гранулярность перивителлинового пространства наблюдается только в зрелых ооцитах на стадии МII. Вероятнее всего, появление дебриса в перивителлиновом пространстве связано с преждевременным закрытием пор зоны пеллюцида. Существует гипотеза о том, что наличие гранулярности в перивителлиновом пространстве связано с преждевременным экзоцитозом секреторных гранул при больших дозах 38 гонадотропинов в циклах ЭКО [135]. Большинство исследователей считают, что наличие увеличенного перивителлинового пространства и дебриса в нем не влияет на частоту оплодотворения, развитие эмбриона и его способность к имплантации [2], [135]–[137]. Существует мнение, что увеличенное перивителлиновое пространство и наличие в нем дебриса коррелируют с образованием эмбрионов низкого качества, но при этом данные дисморфизмы не влияют на частоту имплантации и процент клинических беременностей [138]. В ряде исследований было показано, что ооциты с широким перивителлиновым пространством и дебрисом имеют более низкую частоту оплодотворения [125], [139], имплантации и клинических беременностей [140]. Частота генетических нарушений в клетках с дебрисом в перивителлиновом пространстве не отличается от таковой в морфологически нормальных ооцитах. При генетической диагностике первого и второго полярных телец ооцитов было выявлено, что в ооцитах с увеличенным перивителлиновым пространством несколько повышена частота анеуплоидий 18 хромосомы [141]. По наличию первого полярного тельца в циклах ИКСИ можно судить о готовности ооцита к оплодотворению. Только ооциты на стадии метафазы второго мейотического деления пригодны для оплодотворения методом ИКСИ. Существуют различные аномалии первого полярного тельца: фрагментация, увеличение размера, нарушение формы. Распространенность фрагментации первого полярного тельца достигает 50%, а других аномалий около 4% [1].Фрагментация первого полярного тельца, по данным исследований, не влияет на частоту оплодотворения и качество полученных эмбрионов [125], [142] хотя есть данные, что скорость дробления таких эмбрионов достаточно низкая [123]. При наличии других аномалий строения (гигантское или дегенеративное первое полярное тельце) снижается частота оплодотворения, но сохраняется нормальная морфология пронуклеусов [1]. Предполагается, что наличие дегенеративного первого полярного тельца является признаком асинхронности процессов созревания в 39 ядре и цитоплазме, что объясняет низкий процент оплодотворения таких клеток. Гигантское первое полярное тельце отображает дислокацию мейотического веретена деления в клетке. Таким образом, ооциты с наличием данных аномалий строения имеют сниженный потенциал к оплодотворению, но если оплодотворение произошло, дальнейшее развитие таких эмбрионов не нарушено. Зона пеллюцида, или прозрачная оболочка, - внешняя оболочка ооцита, конгломерат из гликопротеинов, синтезируемых и секретируемых растущим ооцитом и клетками гранулезы, который утолщается по мере роста ооцита. В норме толщина прозрачной оболочки варьирует от 10 до 31 мкм и не зависит от диаметра цитоплазмы. Распространенность аномалий строения зоны пеллюцида составляет около 4-5% [1]. При утолщении прозрачной оболочки может нарушаться проникновение сперматозоида в клетку. Известно, что лучше всего оплодотворяются ооциты, имеющие толщину прозрачной оболочки не более 18,6 мкм. На развитие эмбриона после проведения оплодотворения методом ИКСИ толщина прозрачной оболочки влияния не оказывает [143]. Не получено данных о том, что изменение формы зоны пеллюцида негативно влияет на частоту оплодотворения, качество эмбрионов и частоту имплантации [133]. Снижение тургора ооцита не является само по себе морфологической характеристикой ооцитов, тем не менее, наличие данной особенности клетки было включено в морфологические классификации клеток [128]. Ооциты со сниженным тургором характеризуются более низкой частотой формирования бластоцист. Несмотря на высокую распространенность аномалий строения ооцитов в программах ВРТ, достоверных данных о корреляции отдельных дисморфизмов с генетическими и/или метаболическими нарушениями в клетках нет. Особый интерес представляет изучение частоты анеуплоидии в ооцитах с различными дисморфизмами, так как изменение хромосомного набора в ооцитах является наиболее вероятной причиной низкой 40 эффективности программ ВРТ, а имеющихся в литературе данных недостаточно для замены ПГС морфометрией гамет у данной группы пациентов [141]. При анализе научных публикаций нами не было найдено данных о корреляции между дисморфизмами ооцитов и изменениями строения и функции митохондрий в клетках, в том числе изменениями числа копий мтДНК. Тем не менее, подобные исследования представляют большой научный интерес, вследствие потенциального нарушения метаболизма в ооцитах с дисморфизмами, прежде всего с цитоплазматическими, что также может негативно влиять на результативность программ ВРТ. 41 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проводилось на базе ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (директор - академик РАН Г.Т. Сухих). Набор пациентов осуществлялся в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия (заведующий - д.м.н. Е.А. Калинина). Лабораторные исследования проводились в лаборатории репродуктивной генетики (заведующий профессор В.А. Бахарев) и в лаборатории цитологии (заведующий - к.б.н. А.М. Красный). Было обследовано 420 супружеских пар с бесплодием различного генеза. В результате проведенного обследования из 420 пар выбыло 77 пар в связи с несоответствием критериям включения, либо отказа от дальнейшего участия в исследовании. Для финального анализа было отобрано 343 супружеские пары, подписавшие добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Супружеские пары были обследованы в соответствии с приказом Минздрава России №107н от 30.08.2012 г. "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению". На первом этапе у супружеских пар оценивались клинико-анамнестические данные, а также лабораторные характеристики. В процессе проведения программы ЭКО проводилась морфометрия полученных ооцитов. На втором этапе у части пациентов проводилось исследование числа копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. На третьем этапе у части пациентов проводилось молекулярно-цитогенетическое исследование эмбрионов (FISH-методом). 2.1. Дизайн исследования для задачи 1 Для оценки распространенности различных цитоплазматических и экстрацитоплазматических дисморфизмов в программах ВРТ было проведено 42 одномоментное исследование (Рисунок 2). Оценка морфологии ооцитов производилась эмбриологом с помощью световой микроскопии, после механического и энзимного удаления клеток кумулюса, непосредственно перед проведением процедуры ИКСИ. На основании морфологической оценки выявляли наличие или отсутствие, а также тип дисморфизма. К цитоплазматическим дисморфизмам относили наличие в цитоплазме ооцита центральной гранулярности, вакуолей различного размера, аномальных агрегатов ГЭР, рефрактерных телец, а также темной цитоплазмы. К экстрацитоплазматическим дисморфизмам относили изменение толщины перивителлинового пространство, наличие в нем дебриса, аномалии строение первого полярного тельца, наличие деформации или утолщение зоны пеллюцида ооцита. Первичной конечной точкой данного этапа исследования явилась распространенность различных дисморфизмов ооцитов у пациенток в программах ЭКО/ИКСИ. Пациентки ЭКО Дисморфизмы ооцитов + Дисморфизмы ооцитов - Цитоплазматические дисморфизмы Экстрацитоплазматические дисморфизмы Оценка качества ооцитов и выявление дисморфизмовооцитов (световая микроскопия) Рисунок 2. Дизайн исследования для задачи 1. 2.2. Дизайн исследования для задачи 2 Для оценки влияния клинико-анамнестических данных, включая ятрогенные факторы, как возможные предикторы появления дисморфизмов ооцитов в циклах ВРТ, было проведено проспективное исследование случай- 43 контроль (Рисунок 3). Группы формировались путем метода подбора пар (англ. – matching) по числу полученных ооцитов (2-5 ооцитов, 6-10 ооцитов и более 10 ооцитов) и эмбриологу, выполнявшему морфометрию клеток (морфологическое исследование ооцитов осуществлялось 3-мя эмбриологами). Критерием отнесения пациенток в группу с дисморфизмами было наличие 100% ооцитов с патологией цитоплазмы или с экстрацитоплазматическими нарушениями, в группу без дисморфизмов – наличие 100% нормальных ооцитов. Факторы риска + Дисморфизмы ооцитов + (группа 1) Факторы риска - Дисморфизмы ооцитов – (группа 2) Цитоплазматические дисморфизмы (группа 1а) Экстрацитоплазматические дисморфизмы (группа 1б) Рисунок 3. Дизайн исследования для задачи 2. В качестве предполагаемых факторов риска рассматривались возраст пациенток, ИМТ, протокол стимуляции функции яичников (длинный или короткий с агонистами гонадотропин рилизинг-гормона (а-ГнРГ), с антагонистами гонадотропин рилизинг-гормона (ант-ГнРГ), а также ЭКО в естественном цикле), длительность стимуляции функции яичников, суммарная доза экзогенных гонадотропинов, триггер овуляции в коротком протоколе с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона, гормональные характеристики (уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), антимюллерового гормона (АМГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), тестостерона, эстрадиола, тиреотропного гормона (ТТГ) и свободного тироксина), наличие эндометриоза и синдрома поликистозных яичников (СПКЯ), невынашивание беременности в анамнезе. 44 Группу 1а составили пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, группу 1б – пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, группу 2 – пациентки с морфологически нормальными ооцитами. Первичной конечной точкой исследования данного этапа исследования явилось скорректированное отношение шансов (ОШкор) развития различных дисморфизмов ооцитов в зависимости от наличия выявленных факторов риска, оцененное с помощью многофакторного анализа – логистической регрессии. 2.3. Дизайн исследования для задачи 3 Для анализа исходов программ ВРТ у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов (параметры раннего эмбрионального развития, частота биохимических и клинических беременностей, частота потерь беременности до 12 недель гестации, а также частота живорождений) было проведено проспективное когортное исследование (Рисунок 4). Критерием отнесения пациенток в группу с дисморфизмами было наличие 100% ооцитов с патологией цитоплазмы или экстрацитоплазматическими нарушениями, в группу без дисморфизмов – наличие 100% нормальных ооцитов. Частота наступления биохимической и клинической беременности, частота потерь беременности до 12 недель гестации, частота живорождений, а также процент циклов с отменой переноса по причине отсутствия эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки рассчитывались на один проведенный цикл ЭКО/ИКСИ. Частота оплодотворения ооцитов, доля эмбрионов различных классов и доля эмбрионов, остановившихся в развитии на ранних этапах, рассчитывались на один полученный при трансвагинальной пункции зрелый ооцит. Группу 1 составили пациентки с дисморфизмами ооцитов: группу 1а - с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, группу 1б – с экстрацитоплазматическими 45 дисморфизмами ооцитов, группу 2 – пациентки с морфологически нормальными ооцитами. Первичной конечной точкой данного этапа исследования явилось ОШкор наступления клинической беременности в изучаемых группах, оцененное с помощью многофакторного анализа – логистической регрессии. Пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов (группа 1а) Беременность +* Параметры раннего эмбриогенеза** Пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов (группа 1б) Пациентки без дисморфизмов ооцитов (группа 2) Беременность -* *Беременность: **Параметры раннего эмбриогенеза: - доля биохимических беременностей; - частота оплодотворения ооцитов; -доля клинических беременностей; -доля эмбрионов различных классов -доля потерь беременности до 12 недель (А,В,С,D) на 3-и сутки гестации; культивирования; - доля живорождений. - доля эмбрионов, остановившихся в развитии на ранних этапах (до 3-х суток культивирования); - доля циклов с отменой ПЭ по причине отсутствия эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки. Рисунок 4. Дизайн исследования для задачи 3. 2.4. Дизайн исследования для задачи 4 Для оценки числа копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах пациенток программ ВРТ было проведено одномоментное исследование в параллельных группах. Критериями отбора ооцитов для включения в исследование было отсутствие двух пронуклеусов в цитоплазме ооцита через 46 18-20 часов после проведения ИКСИ, отсутствие дробления ооцита через 40 часов после проведения ИКСИ, а также подписанное информированное согласие пациентки. В зависимости от наличия или отсутствия, а также типа дисморфизма, пациентки были разделены на 3 группы: группу 1 составили ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами, группу 2 – ооциты с экстрацитоплазматическими дисморфизмами, группу 3 – морфологически нормальные ооциты. Первичной конечной точкой данного этапа исследования явилось распределение копий мтДНК в различных группах дисморфизмов ооцитов. 2.5. Дизайн исследования для задачи 5 Для изучения риска развития анеуплоидии 13, 18, 21, X, Y хромосом в ядрах бластомеров у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов и морфологически нормальными ооцитами, а также оценки исходов программ ВРТ после переноса эуплоидных по указанным хромосомам эмбрионов было проведено проспективное когортное исследование (Рисунок 5). Критерием отнесения пациенток в группу с дисморфизмами было наличие 100% ооцитов с патологией цитоплазмы или экстрацитоплазматическими нарушениями, в группу без дисморфизмов – наличие 100% нормальных ооцитов. Группу 1 составили пациентки с дисморфизмами ооцитов: группу 1а - с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, группу 1б – с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, группу 2 – пациентки с морфологически нормальными ооцитами. Первичной конечной точкой данного этапа исследования явилось скорректированное отношение шансов развития анеуплоидии и различных видов анеуплоидии бластомеров у пациенток различных групп, оцененное с помощью многофакторного анализа – логистической регрессии. 47 Ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами (группа 1а) Анеуплоидия+ (бластомер) Параметры эмбриогенеза** Ооциты с экстрацитоплазматическими дисморфизмами (группа 1б) Ооциты без дисморфизмов (группа 2) Оценка морфологии ооцитов Беременность +* Анеуплоидия – (бластомер) Беременность -* ПГС FISH (на 3-и сутки) *Беременность: **Параметры раннего эмбриогенеза: - доля биохимических беременностей; - частота оплодотворения ооцитов; -доля клинических беременностей; -доля эмбрионов различных классов -доля потерь беременности до 12 недель (А,В,С,D) на 3-и сутки гестации; культивирования; - доля живорождений. - доля эмбрионов, остановившихся в развитии на ранних этапах (до 3-х суток культивирования); - доля циклов с отменой ПЭ по причине отсутствия эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки. Рисунок 5. Дизайн исследования для задачи 5. 2.6. Дизайн исследования для задачи 6 Для оценки клинико-экономической эффективности ПГС в исходах программ ВРТ у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов было проведено проспективное когортное исследование (Рисунок 6). Ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами (группа 1) Ооциты с экстрацитоплазматическими дисморфизмами (группа 2) Оценка морфологии ооцитов ПГС+ Беременность +* ПГС- Беременность -* ПГС FISH (на 3-и сутки) Рисунок 6. Дизайн исследования для задачи 6. 48 Группу 1а(1) составили пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, прошедшие ПГС, группу 1а(2) - пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, не прошедшие ПГС, группу 1б(1) - пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитами, прошедшие ПГС, группу 1б(2) - пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитами, не прошедшие ПГС. Первичной конечной точкой данного этапа исследования явилась клинико-экономическая эффективности ПГС у пар с дисморфизмами ооцитов. 2.7. Критерии включения в исследование Критериями включения в исследование были: нормальный кариотип супругов; отсутствие противопоказаний к ВРТ у женщин, в том числе отсутствие наружного генитального эндометриоза III-IV степени, хронического эндометрита, образований яичников, пороков развития внутренних половых органов, миомы матки крупных размеров; базальный уровень ФСГ менее 12 мМЕ/мл; подписанное информированное согласие на участие в исследовании. Критерием невключения в исследование было: наличие тяжелой формы патозооспермии у мужчины (концентрация сперматозоидов менее 6 х 1 000 000/мл, наличие менее 4% морфологически нормальных сперматозоидов по строгим критериям Крюгера, а также наличие азооспермии). Критериями исключения из исследования были: развитие синдрома гиперстимуляции яичников средней или тяжелой степени в изучаемом цикле ЭКО; 49 другие причины и осложнения, требующие отмены переноса эмбрионов в изучаемом цикле. 2.8. Расчет объема выборки Расчет объема выборки был произведен с помощью программы STATISTICA 10 (США). Для решения задачи 2 (выявление факторов риска появления дисморфизмов ооцитов) объем выборки определялся количеством изучаемых факторов риска (предполагалось изучение 17 предикторов). Принимая во внимание, что максимальное число предикторов, включенных в модель, не должно быть больше, чем число исходов, деленное на значение от 5 до 20, для изучения 17 факторов риска необходимо включить минимум 85 человек в каждую группу – всего 255 человек. Для решения задачи 3 (оценка исходов ВРТ в зависимости от наличия и вида дисморфизмов ооцитов) расчет объема выборки был основан на данных литературы о частоте наступления беременности у супружеских пар с наличием или отсутствием дисморфизмов ооцитов [144]. Для получения валидных данных при принятии уровня альфа 0,05 и уровня достоверности исследования 90%, с учетом возможного 15% выбывания пациенток из исследования, необходимо включить по 62 пациентки в каждую группу, всего – 186 пациенток. Для решения задачи 4 (определение числа копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах) расчет объема выборки не производился. Исследование носило пилотный характер, и в него были включены все неоплодотворившиеся зрелые ооциты пациенток, подписавших информированное согласие на участие в исследовании. Для решения задачи 5 (оценка риска анеуплоидии эмбрионов в зависимости от наличия и вида дисморфизма ооцитов) расчет объема выборки был основан на данных литературы о частоте анеуплоидии в 50 эмбрионах в зависимости от наличия или отсутствия дисморфизмов ооцитов [145]. При принятии уровня альфа 0,05 и уровня достоверности исследования 90% необходимо было включить по 22 пациентки в каждую группу, всего 66 пациенток. Для решения задачи 6 количество ПГС-циклов определялось этическими аспектами исследования, а именно наличием дополнительных показаний для проведения ПГС, информированным согласием пациентки на проведение ПГС. Исходя из данных литературы об эффективности ПГС в выявлении эмбрионов с анеуплоидиями [146], у пациенток с отсутствием имплантации в анамнезе, частота наступления беременности после циклов ПГС составляет 34%, без проведения ПГС – 3%. При принятии уровня альфа 0,05 и уровня достоверности исследования 80% достаточно включения 24 пациенток в каждую группу – всего 72 женщины. Таким образом, в зависимости от результатов морфологической оценки ооцитов, а также проведения ПГС были сформированы следующие группы пациентов. Для решения задач 1, 2 и 3 были включены 343 супружеские пары: группа 1а (n=139) - пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов; группа 1б (n=97) пациентки - с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов; группа 2 (n=107) - пациентки с морфологически нормальными ооцитами. Для решения задачи 4 у 198 женщин с их информированного согласия для исследования числа копий мтДНК было отобрано 343 ооцита, не оплодотворившихся в программах ВРТ: группа 1а (n=126) - ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами; группа 1б (n=108) - ооциты с экстрацитоплазматическими дисморфизмами; группа 2 (n=109) - морфологически нормальные ооциты. Для решения задачи 5 были включены 84 супружеские пары: 51 группа 1а (n=28) - пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, прошедшие ПГС; группа 1б (n=28) - пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, прошедшие ПГС; группа 2 (n=28) - пациентки с морфологически нормальными ооцитами, прошедшие ПГС. Для решения задачи 6 были включен 112 супружеских пар: группа 1а(1) (n=28) - пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, прошедшие ПГС; группа 1а(2) (n=139) - пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, не прошедшие ПГС; группа 1б(1) (n=28) – пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, прошедшие ПГС; группа 1б(2) (n=97) – пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, не прошедшие ПГС. 2.9. Методы исследования Перед вступлением в программу ЭКО все пациентки были обследованы в амбулаторных условиях. Обследование включало обязательные методы исследования, специальные методы исследования, а также исследования по медицинским показаниям. Все обследования в рамках проводимого исследования, за исключением ультразвукового исследования (УЗИ) органов малого таза, проводились однократно (Таблица 1). Обязательные исследования для обоих супругов включали: определение антител к бледной трепонеме в крови (RW), антител класса M, G к вирусу иммунодефицита человека 1, 2 (ВИЧ 1,2), к антигену вирусного гепатита В и С (HBs-Ag, HCV); 52 микроскопическое исследование отделяемого половых органов на аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, на грибы рода кандида, паразитологическое исследование на атрофозоиты трихомонад; исследование соскоба из цервикального канала на хламидии, микоплазму и уреаплазму методом полимеразной цепной реакции (ПЦР); исследование соскоба из цервикального канала на вирус простого герпеса 1, 2, цитомегаловирус методом ПЦР; Определение кариотипа супругов, медико-генетическое консультирование. Обязательные исследования для женщин включали: Общеклинический анализ крови; биохимический анализ крови; гемостазиограмму; определение групповой и резус-принадлежности крови; общий анализ мочи; количественный анализ антител класса M, G к вирусу краснухи в сыворотке крови; цитологическое исследование соскоба эндоцервикса и экзоцервикса; ультразвуковое исследование органов малого таза на 5-8 день менструального цикла; флюорографию; электрокардиографию (ЭКГ); заключение терапевта о наличии или отсутствии противопоказаний для проведения программы ЭКО/ПЭ; УЗИ молочных желез (до 35 лет) или маммографию (после 35 лет); УЗИ щитовидной железы; гормоны крови (на 2-3 день менструального цикла): ЛГ, ФСГ, эстрадиол, тиреотропный гормон (ТТГ), свободный тироксин (Т4св), дегидроэпиандростерон-сульфат, пролактин, соматоторопный гормон, кортизол, тестостерон, АМГ; 53 Обязательные исследования для мужчины включали: анализ эякулята. Исследования по показаниям включали: исследование состояние матки, проходимости маточных труб (гистеросальпингография, гистероскопия и лапароскопия); консультации смежных специалистов (эндокринолога, уролога). Специальные методы исследования включали: ПГС методом FISH с изучением 13, 18, 21, X и Y хромосом; определение числа копий мтДНК в ооцитах, неоплодотворившихся в программах ЭКО/ИКСИ. Таблица 1. 5-6 недель после переноса 2 недели после переноса 4-5-е сутки после пункции 3-е сутки после пункции 2-е сутки после пункции 3 недели после переноса Клин. анализ крови Гемостазиограмма RW,ВИЧ,HBs, HCV Группа, Rh крови Гормоны крови Мазок на флору ПЦР - ИППП Цитология мазка Спермограмма УЗИ малого таза Морфологическая оценка ооцитов Определение числа копий мтДНК Морфологическая оценка эмбрионов ПГС – FISH метод Перенос эмбрионов ß-ХГ УЗИ Аспирация фолликулов Перед вступлением в программу Схема обследования пациентов во время проведения исследования Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х 54 2.9.1 Общеклинические методы обследования При первичной консультации производили сбор анамнестических данных у пациенток, который включал возраст, этническую принадлежность, место проживания, образование, наличие или отсутствие работы, наличие профессиональных вредностей, курения и других «вредных привычек», семейное положение. Полученные данные вносили в индивидуальную карту пациента. При первичном осмотре измеряли рост, вес пациентки, артериальное давление (АД) и пульс, оценивали состояние и распределение подкожной жировой клетчатки (наличие ожирения, стрий), проводили осмотр и пальпацию молочных желез, щитовидной железы и органов брюшной полости. Большое внимание уделяли оценке акушерско-гинекологического анамнеза: оценивали менструальную функцию, наличие или отсутствие нарушений менструального цикла в анамнезе, паритет, число своевременных и преждевременных родов в анамнезе, число самопроизвольных прерываний беременности на ранних сроках гестации, наличие осложнений во время беременности и родов. Также выясняли перенесенные гинекологические заболевания, объем перенесенных оперативных вмешательств на органах малого таза. Оценивали наличие перенесенных инфекционных и соматических заболеваний, оперативных вмешательств. У каждой женщины был собран семейный анамнез. У каждой женщины уточняли данные о продолжительности бесплодия, а также о проведенных диагностических и лечебных мероприятиях. Отмечали наличие или отсутствие программ ВРТ в анамнезе, а также их особенности (дата и время проведения ВРТ, протокол стимуляции суперовуляции, количество полученных ооцитов, количество полученных эмбрионов и их качество, качество эмбрионов при переносе в полость матки, исход программы). 55 Во время гинекологического исследования проводили осмотр наружных половых органов, оценку их развития и анатомических особенностей, а затем осмотр шейки матки в зеркалах. При бимануальном исследовании органов малого таза оценивали размеры, форму и консистенцию тела матки, подвижность и наличие болезненности при пальпации, наличие опухолевидных образований в области придатков матки, а также наличие спаечного процесс в малом тазу. Сбор анамнеза у мужчины проводили в рамках медико-генетического консультирования с заполнением индивидуальной карты пациента. Уточняли возраст пациента, наличие или отсутствие профессиональных вредностей, наличие соматических и инфекционных заболеваний в анамнезе. Также оценивали анамнез бесплодия у пациента, количество браков и наличие детей в предыдущих браках, длительность бесплодия и произведенные методы лечения. 2.9.2. Ультразвуковое исследование органов малого таза УЗИ органов малого таза выполняли в отделении функциональной диагностики ФГБУ «НЦАГиП им. В. И. Кулакова» Минздрава России (заведующий - профессор А.И. Гус). Впервые УЗИ проводили в первую фазу (5-8 день) менструального цикла, предшествующего циклу стимуляции функции яичников. Оценивали размер и структуру тела матки, толщину и структуру эндометрия, размеры и объем яичников, количество антральных фолликулов в обоих яичников, наличие или отсутствие объемных образований в полости малого таза. Впоследствии УЗ-мониторинг проводили на 2-3 день менструального цикла, в день начала стимуляции функции яичников, на 6-й день стимуляции функции яичников, и затем ежедневно до введения триггера овуляции. Во время УЗ-мониторинга проводили оценку динамики фолликулогенеза и ответа эндометрия на стимуляцию функции яичников, для своевременной 56 возможности коррекции дозы вводимых экзогенно гонадотропинов, а также с целью определения даты введения антагониста гонадотропин-рилизинг гормона (ант-ГнРГ) и даты введения триггера овуляции, а значит и даты трансвагинальной пункции яичников. В дальнейшем УЗИ органов малого таза выполняли на 21 день после ПЭ в полость матки при наличии положительного результата ß-хорионического гонадотропина (ß-ХГ), с целью визуализации плодного яйца в полости матки. Повторное УЗИ органов малого таза проводили через 5-6 недель после ПЭ в полость матки с целью определения сердцебиения эмбриона. 2.9.3. Гормональное исследование Целью гормонального исследование перед программой ЭКО явилась оценка овариального резерва и функционального состояния эндокринной системы. Для этого проводили анализ крови пациенток в научно- диагностической лаборатории ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (заведующий - к.м.н. Т.Ю. Иванец). Для этого использовался радиоиммунологический метод определения концентрации гормонов в крови (тест-системы «Hoffmann – La Roche, Ltd.» Швейцария). Гормональное исследование фолликулярной фазы (2-3 осуществлялось день в менструального период цикла) ранней в цикле, предшествующем стимуляции функции яичников. 2.9.4. Исследование эякулята Пациентам перед вступлением в программу ЭКО/ИКСИ проводили анализ эякулята. Эякулят собирался путем мастурбации после 3-4 дней полового воздержания в стерильный пластмассовый контейнер для сбора эякулята.При анализе эякулята определяли характеристики клеточных элементов: концентрацию сперматозоидов, их подвижность, наличие 57 морфологических изменений сперматозоидов, количество лейкоцитов, а также количество и типы незрелых клеток сперматогенеза [147]. Также эмбриолог оценивал объем спермы, цвет, время разжижения и вязкость эякулята, pH (Таблица 2). Таблица 2. Нормативные показатели спермограммы (ВОЗ, 2010) [148] Показатель Норматив, единицы измерения Общий объем эякулята ≥ 1,5 мл рH ≥ 7,2 Концентрация ≥ 15 млн/мл сперматозоидов Общее количество ≥ 39 млн сперматозоидов Время разжижения < 60 минут Подвижность Общая подвижность сперматозоидов ≥ 40% сперматозоидов Сперматозоиды с прогрессивным движением ≥ 32% Морфология ≥ 4 % нормальных форм Жизнеспособность ≥ 58% живых сперматозоидов сперматозоидов Концентрация < 1 млн/мл лейкоцитов Антиспермальные < 50% сперматозоидов, ассоциированных с АСАТ антитела(АСАТ) Для оценки патологии эякулята руководствовались следующими критериями: аспермия – отсутствие эякулята; азооспермия – отсутствие сперматозоидов в эякуляте; олигозооспермия – снижение концентрации сперматозоидов ниже <15 млн/мл; астенозооспермия – снижение подвижности сперматозоидов ниже нормальных значений (общая подвижность <40%, сперматозоиды с прогрессивным движением <32%); 58 тератозооспермия – повышение количества сперматозоидов с аномальной морфологией (˃96%); олигоастенотератозооспермия — сочетание олигозооспермии, астенозооспермии и тератозооспермии; астенотератозооспермия (АТ) – сочетание астенозооспермии и (ОТ) – сочетание олигозооспермии и (ОА) – сочетание олигозооспермии и тератозооспермии; олиготератозооспермия тератозооспермии; олигоастенозооспермия астенозооспермии. 2.9.5. Стимуляция функции яичников и трансвагинальная пункция фолликулов Стимуляцию функции яичников проводили по протоколу с ант-ГнРГ, модифицированному протоколу с ант-ГнРГ, «короткому» протоколу с агонистами гонадотропин рилизинг-гормона (а-ГнРГ), «длинному» протоколу с а-ГнРГ. У части пациенток ооциты были получены в результате проведения программы ЭКО в естественном цикле, без стимуляции функции яичников. Стимуляция функции яичников проводилась во всех типах протоколов препаратами рекомбинантного ФСГ или комбинированного препарата рекомбинантного ФСГ и ЛГ. Доза препарата подбиралась индивидуально в зависимости от возраста пациентки, наличия в анамнезе оперативных вмешательств на яичниках, данных гормонального исследования и количества антральных фолликулов по данным УЗисследования. После проведения УЗ-мониторинга при необходимости производилась коррекция дозы препаратов гонадотропинов. При проведении протокола с ант-ГнРГ введение экзогенных гонадотропинов начинали со 2-3 дня менструального цикла. При достижении лидирующим фолликулом диаметра 14 мм начинали введение ант-ГнРГ с 59 целью предупреждения эндогенных паразитарных пиков ЛГ. Затем препарат ант-ГнРГ вводили ежедневно, включая день назначения триггера овуляции. При проведении модифицированного протокола перед началом введения гонадотропинов вводили препарат ант-ГнРГ с целью синхронизации фолликулярного пула. В протоколах с ант-ГнРГ триггер овуляции вводили при достижении лидирующими фолликулами диаметра 17 мм. В качестве триггера овуляции использовали человеческий хорионический гонадотропин (ХГ) в дозе 8 000 – 10 000 МЕ, а при риске развития синдрома гиперстимуляции яичников (при наличии более 15 доминантных фолликулов в обоих яичниках в день назначения триггера овуляции) – а-ГнРГ в дозе 0,2 мг или сочетание а-ГнРГ с низкими дозами ХГ (1500 МЕ). При проведении «длинного» протокола с а-ГнРГ введение а-ГнРГ в виде дейли-форм ежедневно начинали с 21-го дня менструального цикла, предшествующего началу стимуляции функции яичников, а введение гонадотропинов начинали со 2-3 дня менструального цикла. При проведении «короткого» протокола с а-ГнРГ введение а-ГнРГ в виде дейли-форм ежедневно начинали одновременно с введением гонадотропинов со 2-3 дня менструального цикла. В протоколах с а-ГнРГ триггер овуляции вводили при достижении лидирующими фолликулами диаметра 17 мм, в качестве триггера овуляции использовали ХГ в дозе 8 000 – 10 000 МЕ. При проведении программы ЭКО в естественном цикле УЗ-мониторинг осуществляли на 4-5 и 7-8 дни менструального цикла с целью визуализации доминантного фолликула, а затем ежедневно для определения времени назначения триггера овуляции. Триггер овуляции, в качестве которого применяли ХГ в дозе 3 000 МЕ, назначали при диаметре доминантного фолликула 17 мм. Трансвагинальную пункцию (ТВП) яичников осуществляли в малой операционной с применением кратковременного внутривенного обезболивания. ТВП и аспирацию фолликулярной жидкости производили 60 под ультразвуковым контролем, с использованием одноразовых пункционных игл. Полученную фолликулярную жидкость помещали в стерильные подогретые пробирки, содержащие 0,5 мл гепарина (2500 ЕД/мл). 2.9.6. Морфологическая оценка ооцитов и оплодотворение Просмотр аспирированной фолликулярной жидкости осуществлялся эмбриологом под контролем стереомикроскопа. Определяли количество полученных ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК), после чего ооциты отмывали от фолликулярной жидкости и крови, а затем помещали в стерильные планшеты с культуральной средой для периода предварительной инкубации в течение 2-3 часов. После окончания предварительной инкубации производили денудирование ооцитов, то есть механическое и энзимное удаление клеток кумулюса из препарата. Вначале ОКК помещали на 20 секунд в раствор гиалуронидазы, затем отмывали от фермента в буферной среде и оставляли на 30 минут в исходной культуральной среде. Оставшиеся клетки кумулюса удаляли механическим путем. После энзимной и механической обработки ооцитов оценивали степень зрелости клеток: если в цитоплазме клетки визуализируется ядро и отсутствует полярное тельце - ооцит находится на стадии зародышевого пузырька (GV-germinal vesicle), что соответствует профазе первого мейотического деления; если в цитоплазме клетки отсутствует ядро и отсутствует полярное тельце - ооцит находится на стадии метафазы первого мейотического деления (MI); наличие полярного свидетельствует о тельца завершении в перивителлиновом процессов созревания пространстве ооцита и достижения второго мейотического деления (MII). На данном этапе эмбриолог проводил морфологическую оценку ооцитов и выявление цитоплазматических и экстрацитоплазматических 61 дисморфизмов. К цитоплазматическим дисморфизмам относили наличие в цитоплазме ооцита центральной гранулярности, вакуолей различного диаметра, аномальных агрегатов ГЭР, рефрактерных телец, а также цитоплазмы темного цвета. Центральная гранулярность представляет собой темную губчатую зернистую область в цитоплазме ооцита. Вакуоли - это цитоплазматические включения, окруженные мембраной и содержащие жидкость. Аномальные агрегаты ГЭР располагаются в центральной части ооцита и представляют собой круглые полупрозрачные образования. Рефрактерные тельца – это мелкие светлые включения в цитоплазме ооцита, как правило, множественные. Темный цвет цитоплазмы - значительное изменение цвета всей цитоплазмы ооцита. К экстрацитоплазматическим дисморфизмам относили изменение ширины перивителлинового пространства и наличие в нем гранулярности, аномалии первого полярного тельца, а также деформацию или утолщение зоны пеллюцида ооцита. Параллельно с очисткой ооцитов производили центрифугирование, флотирование и обработку спермы супруга. Все зрелые ооциты подвергали оплодотворению методом ИКСИ. После проведения оплодотворения методом ИКСИ ооциты переносили в культуральную среду для дальнейшего культивирования. Нормальное оплодотворение регистрировали при наличии двух симметричных по размеру пронуклеусов в цитоплазме через 16-18 часов после проведения ИКСИ. В случае наличия одного или трех и более пронуклеусов в цитоплазме оплодотворение расценивали как аномальное. При отсутствии пронуклеусов в цитоплазме ооцита ооцит считали неоплодотворившимся. Этап культивирования был произведен с использованием сред культивирования COOK (Австралия). 62 2.9.7. Исследование числа копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах Ооциты, неоплодотворившиеся после проведения ИКСИ, в которых не наблюдались признаки дробления через 40 часов после оплодотворения, отбирали для исследования числа копий мтДНК. В асептических условиях с использованием инвертированного микроскопа ооциты отмывали в стерильном фосфатно-солевом буфере (phosphatebufferedsaline, PBS), а затем помещали в индивидуальные пробирки, содержащие PBS. Определение абсолютного числа копий мтДНК осуществляли с помощью метода ПЦР в реальном времени. Для этого из каждого отдельного ооцита выделяли ДНК. Клетки лизировали буфером с додецил сульфатом натрия (sodium dodecylsulfate, SDS) (10мМ EDTA, 1% SDS, 50мМ Tris-HCl, pH 7,5) в течение 5 минут. После этого осуществляли осаждение ДНК изопропанолом в присутствии дрожжевой тРНК (YeasttRNA, Ambion) в качестве соосадителя при -20ºС в течение 30 минут. Далее осадок промывали 70º этанолом, высушивали, и ресуспендировали в воде. Весь объём (10 микролитров) полученного раствора ДНК сразу использовали для проведения ПЦР. Для подсчёта копий мтДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и зонда к митохондриальному гену субъединицы 1 NADHдегидрогеназы (NADHdehydrogenase, subunit 1) (прямой праймер: CCACATCTACCATCACCCTC; обратный праймер: TAGAATAAATAGGAGGCCTAGGTT; зонд: R6G ATC ACC GCC CCG ACC TTA GCT CTC A BHQ1). Для получения результата ПЦР в виде абсолютного числа копий гена субъединицы 1 NADHдегидрогеназы во время каждого запуска использовали калибровочные растворы плазмид (107 копий/10 мкл, 105 копий/10 мкл, 103 копий/10 мкл) с заклонированным соответствующим ампликоном. Реакцию проводили в амплификаторе Real- TimePCRDetectionSystemCFX96 (BioRad, США) с набором для ПЦР (М-428, Синтол, Россия) по следующей программе: 95ºС - 3 мин, (60ºС-30 сек/95ºС-10 63 сек) 45 циклов. Детекцию флуоресценции осуществляли в канале, соответствующем флуорохрому зонда (R6G). Полученные данные флуоресценции были пересчитаны в абсолютное количество копий при помощи программного обеспечения амплификатора CFX96 BioRad. 2.9.8. Морфологическая оценка эмбрионов Морфологическую оценку эмбрионов проводили через 72 часа после аспирации ооцитов. Оценивали количество имеющихся бластомеров, симметричность дробления, а также процент суммарной фрагментации цитоплазмы [149]. Учитывая морфологические характеристики эмбрионов, эмбрионы были классифицированы на 4 группы: класс А - размер бластомеров примерно одинаков, фрагментации цитоплазмы нет или фрагментация не превышает 5%; класс В - размер бластомеров примерно одинаков, фрагментация не более 10%; класс С - бластомеры отличаются по размеру, фрагментация 10%-25%; класс D - бластомеры значительно отличаются по размеру, фрагментация более 25%. 2.9.9. Преимплантационный генетический скрининг ПГС проводили по следующим показаниям: старший репродуктивный возраст супругов; привычное невынашивание беременности; наличие неэффективных попыток ЭКО в анамнезе. 64 Процедура ПГС состояла из трех этапов: биопсия бластомера, фиксация исследуемых клеток на предметном стекле, а затем молекулярно- цитогенетическая диагностика единичных клеток. Биопсию бластомеров проводили на третий день культивирования эмбрионов in vitro (через 72 часа после аспирации фолликулов), если в эмбрионе визуализировалось как минимум шесть бластомеров. В нашем исследовании биопсии подвергали исключительно один бластомер. Биопсию осуществляли с помощью микроманипулятора Narishiga (Япония), а для рассечения блестящей оболочки использовали лазерную пушку Fertilase (Германия). Для аспирации бластомера использовали микропипетку Cook (Австралия). Подготовку ядра для гибридизации in situ проводили согласно протоколу, рекомендуемому фирмой-производителем. Выделение ядра из бластомера производили с использованием 10 мкл гипотонического раствора, помещенного на предметное стекло. Гипотонический раствор состоял из 1% Твина 20 (1мл), 0,01 % раствора HCl (0,1 мл), дистиллированной воды (8,9 мл). Для фиксациии ядер бластомеров использовали метанол-уксусный раствор (3:1). Фиксацию проводили при комнатной температуре. Далее процесс гибридизации in situ состоял из следующих этапов: 1. Дегидратация препаратов с ядрами в серии восходящих спиртов 70 , 80, 96 по 2 минуты в каждом. 2. Экспозиция препарата в раствор пепсина при 37оС в течение 3 минут. 3. Помещение препарата в раствор 2xSSC при 37оС на 4 минуты. 4. Повторная фиксация ядер бластомеров в метанол-уксусном растворе (3:1) в течение10 минут. 5. Помещение стекла с ядрами в раствор 2xSSC при 37оС на 4 минуты. 6. Дегидратация в серии восходящих спиртов 70, 80, 96 по 2 минуты в каждом. 7. Высушивание препаратов на воздухе. 65 8. Добавление ДНК зондов для 5 хромосом к высушенным образцам (использовались ДНК-зонды фирмы Abbot к 13 (SpectrumRed), 18 (SpectrumAqua), 21 (SpectrumGreen), X (SpectrumBlue), Y (SpectrumGold) хромосомам). 9. Помещение препарата на термоплату при 75С на 10 мин и помещение предметного стекла с препаратом во влажную камеру на ночь и инкубирование при температуре 42С. 10. Постгибридизационная отмывка препарата в 0,4Х SSC (рН 7,0-7,5) при 73С в течение 1 минуты и последующая отмывка в растворе 2Х SSC/0,1% NP-40 при комнатной температуре в течение 30 секунд. 11. Нанесение на препарат противовыцветающего реагента Antifade. Анализ препаратов после процедуры FISH проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 фирмы Zeiss при увеличении 100Х10, оборудованным соответствующим набором фильтров (Orange, Green, Aqua, Blue, Gold). 2.9.10. Перенос эмбрионов в полость матки и ведение посттрансферного периода Перенос эмбрионов в полость матки осуществляли на 4 или 5 сутки культивирования с помощью «мягкого» катетера Wallace (Германия) или Cook (Австралия). В полость матки переносили один или два эмбриона. При наличии большего количества эмбрионов высокого качества по морфологическим характеристикам, производили витрификацию эмбрионов. После проведения ТВП яичников всем пациенткам для поддержки лютеиновой фазы индуцированного цикла назначали микронизированный прогестерон интравагинально в дозе 600 мг/сутки. При этом, если в качестве триггера овуляции был использован а-ГнРГ, или сочетание а-ГнРГ с ХГ в дозе 1500 МЕ, для поддержки лютеиновой фазы назначали также препараты 66 эстрогенов (эстрадиола валерат в дозе 4-6 мг/сутки) и препарат ХГ (Хорагон 1500 МЕ внутримышечно в день ТВП). Через 14 дней после ПЭ в полость матки определяли концентрацию ßХГ в сыворотке крови пациентки. Тест на беременность считали положительным, если уровень ß-ХГ составлял более 20 МЕ/л. Через 21 день после ПЭ проводили диагностику клинической беременности, и при визуализации плодного яйца в полости матки регистрировали клиническую беременность. При положительном результате на ß-ХГ и последующем его падении без визуализации плодного яйца в полости матки регистрировали биохимическую беременность. 2.10. Статистическая обработка полученных данных Статистическая обработка данных выполнялась на индивидуальном компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пaкета статистических программ «Statistica V10» (США), SPSS Statistics 22 (США) и «SAS V8” (США). Для качественных данных определяли доли и риски (%). Для сравнения категориальных данных в двух и более группах, а также для оценки значимых различий между ними использовали тест χ2. Тест χ2 проводили после построения таблиц сопряженности. Для небольших выборок был применен точный критерий Фишера. Для сравнения бинарных данных мерой сравнения явилось отношение шансов (ОШ) с доверительным интервалом 95% (95% ДИ). Метод логистической регрессии и построение ROC-кривых с расчетом площади под кривой (AUC – от англ. – Area Under the Curve) использовался при расчете скорректированного ОШ (ОШкор) для контроля множественных конфаундеров. Вначале при анализе количественных данных в группах сравнения определяли вид распределения данных (тест Колмогорова-Смирнова, графический анализ данных). При нормальном виде распределения данных 67 определяли среднее значение со стандартным отклонением, для оценки различий в группах применяли методы параметрической статистики (t-тест для сравнения данных в 2-х группах или ANOVA для сравнения данных в нескольких группах). При ненормальном распределении данных определяли медиану с интерквартильным размахом, для оценки различий в группах применяли методы непараметрической статистики (тест Манна-Уитни для сравнения данных в двух группах или тест Крускала-Уаллиса для сравнения данных в нескольких группах). Зависимые данные оценивались с помощью коэффициента корреляции. Корреляционный анализ проводился с использованием непараметрического корреляционного критерия Спирмена. Различия между статистическими величинами считали статистически значимыми при уровне достоверности p <0,05. Анализ затраты-эффективность ПГС у пар с различными дисморфизмами ооцитов у пациенток был проведе с помощью программы TreeAge Pro Inc (США). Была построена модель принятия решений. Устойчивость модели была вначале проверена путем одностороннего анализа чувствительности для каждой из включенных в модель, а замтем двустороннего анализа чувствительности по взаимному влиянию различных критериев на изучаемый исход [150]. Были использованы строгие критерии отбора пациенток с целью уменьшения ошибки выборки. Оценка воздействующего фактора и исхода была едина для всех включенных в исследование пациентов. Были использованы идентичные методы диагностики (на базе одних и тех же лабораторий) с целью уменьшения информационной ошибки исследования. 68 Глава 3. ИСХОДЫ РЕПРОДУКТИВНЫХ ПРОГРАММ ТЕХНОЛОГИЙ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ У ПАЦИЕНТОК С РАЗЛИЧНЫМИ ДИСМОРФИЗМАМИ ООЦИТОВ 3.1. Клинико-анамнестические характеристики пар, включенных в исследование В соответствии с целью исследования и поставленными задачами нами были отобраны 343 супружеские пары с бесплодием различного генеза, соответствующие критериям включения и подписавшие добровольное информированное согласие на участие в исследование. Для решения задач 1, 2 и 3 в зависимости от результатов морфологической оценки ооцитов во время проведения процедуры ИКСИ на основании метода подбора пар в исследование были включены следующие пациентки (Рисунок 7). Пациентки с бесплодием, обратившиеся в отделение ВРТ n=530 Пациентки, не подходящие по критериям включения n=110 Пациентки с бесплодием, обратившиеся в отделение ВРТ n=420 Группа №1а: Пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов n=140 Группа №1б: Пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов n=140 Группа №2: Пациентки с нормальными ооцитами n=140 Исключены из исследования n=1 Исключены из исследования n=43 Исключены из исследования n=33 Группа №1а: n=139 Группа №1б: n=97 Группа №2: n=107 Рисунок 7. Профиль набора пациенток для включения в исследование. 69 Были сформированы следующие группы пациенток: группа 1 (n=236) – пациентки с дисморфизмами ооцитов: группа 1а (n=139) - пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов; группа 1б (n=97) – пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов; группа 2 (n=107) – пациентки с морфологически нормальными ооцитами. С целью выявления возможных конфаундеров были проанализированы клинико-анамнестические характеристики групп. Средний возраст пациенток составил 35,4±5,6 лет, 33,8±4,5 лет и 31,8±4,7 лет в группах 1а, 1б и 2, соответственно (p<0,0001). При анализе антропометрических данных было выявлено различие в показателях веса и, как следствие, ИМТ женщин. Средний вес составил 66,2±12,9 кг, 64,7±11,5 кг и 62,2±10,0 в группах 1а, 1б и 2, соответственно (р=0,0298). Индекс массы тела был выше у пациенток с дисморфизмами и составил 24,1±4,5 кг/м2, 23,2±3,9 кг/м2 и 22,6±3,6 кг/м2, соответственно (р=0,0302) (Таблица 3). Больше всего женщин с избыточной массой тела (≥26 кг/м2) отмечалось в группе 1а – 43 женщины (30,9%). В группе 1б избыточную массу тела имели 13 пациенток (13,4%), в группе 2 – 17 (15,9%). Таблица 3 Антропометрические данные пациенток, включенных в исследование Группы Средний рост женщин, см 1а 165,8±6,0 р*уровень Средний вес женщин, кг 66,2±12,9 р*уровень ИМТ женщин Группа 0,5932 0,0298 24,1±4,5 (n=139) Группа 1б 166,7±6,2 64,7±11,5 23,2±3,9 (n=97) Группа 2 165,7±5,1 62,2±10,0 22,6±3,6 (n=107) Данные представлены как среднее±стандартное отклонение; *ANOVA р*уровень 0,0302 70 Социально-экономические характеристики (уровень образования, семейное положение, наличие или отсутствие работы, место проживания), а также наличие вредных привычек у пациенток (курение) не различались в группах сравнения. При оценке менструальной функции (возраст менархе, длительность менструального цикла, продолжительность менструального кровотечения) не было выявлено статистически значимых различий между группами (р<0,05). Отмечалось более позднее начало половой жизни в группах 1а и 1б (19,7±3,9 лет и 19,1±3,5 лет, соответственно) по сравнению с группой 2 (18,3±2,0 лет) (р=0,0115). Нормальный менструальный цикл отмечался у 90,1 % изученных пациенток. У 9,1% пациенток имели место нарушения менструального цикла в виде олигоменореи. Олигоменорея отмечалась у 14 пациенток (10,1%) в группе 1а, у 8 пациенток (8,3%) в группе 1б и у 12 пациенток (11,2%) в группе 2 (р=0,7755) (Таблица 4). Комбинированные оральные контрацептивы (КОК) с лечебной или контрацептивной целью применяли 9 пациенток (6,5%) в группе 1, 11 пациенток (11,3%) в группе 2 и 13 пациенток (12,2%) в группе 3 (р=0,2593). Таблица 4 Особенности менструального цикла пациенток, включенных в исследование Группа Группа (n=139) Группа (n=97) Группа (n=107) р*-уровень Возраст менархе 1а 13,3±1,3 Длительность цикла 28,9±3,6 Длительность менструации 4,9±1,1 Дебют половой жизни 19,7±3,9 1б 13,1±1,3 28,8±3,5 4,9±0,9 19,1±3,5 2 13,2±1,3 28,7±3,5 5,0±1,1 18,3±2,0 0,8239 0,9566 0,7359 0,0115 Данные представлены как средние ± стандартное отклонение; *ANOVA При оценке гинекологической заболеваемости пациенток была выявлена более высокая распространенность миомы матки у пациенток с дисморфизмами ооцитов. Миому матки в анамнезе имели 37 пациенток 71 (26,6%) в группе 1а, 24 пациентки (24,7%) в группе 1б, 14 пациенток (13,1%) в группе 2 (р=0,0281). Также обращала на себя более высокая, хотя и не статистически значимая, распространенность наружного генитального эндометриоза и аденомиоза, а также хронического сальпингофоорита у пациенток с дисморфизмами ооцитов. Наружный генитальный эндометриоз (малые формы эндометриоза, по данным лапароскопии) или аденомиоз имели 42 пациентки (30,2%) в группе 1а, 31 пациентка (32,0%) в группе 1б, 25 пациенток (23,4%) в группе 2 (р=0,3411). Хронический сальпингоофорит имели 97 пациенток (69,8%) в группе 1а, 71 пациентка (73,2%) в группе 1б и 69 пациенток (64,5%) в группе 2 (р=0,3946). Распространенность синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) не отличалась значимо в группах сравнения, однако у женщин в группе 1б отмечалась более высокая по сравнению с другими группами распространенность СПКЯ при наличии избыточной массы тела (ИМТ≥25 кг/м2). В группе 1б СПКЯ при наличии избыточной массы тела имели 6 пациенток (6,2%), в группе а1 – 2 пациентки (1,4%), в группе 2 – 2 пациентки (1,9%) (р=0,0762). Среди патологии шейки матки в анамнезе доминировали хронические цервициты, а также внутриэпителиальное поражение низкой степени (LSIL). Перенесенные инфекции, передающиеся половым путем (ИППП), включали хламидиоз, микоуреаплазмоз и трихомониаз. Все инфекционные и воспалительные заболевания органов малого таза, гиперпластические процессы эндометрия, патология шейки матки были пролечены до вступления женщины в программу ВРТ (Таблица 5). При анализе данных о частоте оперативных вмешательств на органах малого таза (сальпингоовариолизис, тубэктомия, миомэктомия, резекция яичников, хирургическое лечение эндометриоза) не было выявлено статистически значимых различий между группами (Таблица 6). 72 Таблица 5 Структура гинекологической заболеваемости у пациенток, включенных в исследование Показатели Прием КОК в анамнезе, % Эндометриоз/аденомиоз, % Хронический сальпингоофорит, % Миома матки, % СПКЯ, % СПКЯ с ИМТ≥25 Полип эндометрия/гиперплазия эндометрия в анамнезе, % Патология шейки матки в анамнезе, % ИППП в анамнезе, % Группа 1а (n=139) 9 (6,5%) 42 (30,2%) 97 (69,8%) 37 (26,6%) ОШ1* 95% ДИ 0,5 [0,2;1,2] 1,4 [0,8;2,5] 1,3 [0,7;2,2] 2,4 [1,2;4,7] 0,5 [0,2;1,4] 0,8 [0,1;5,5] 8 (5,7%) 2 (1,4%) 3 (2,2%) 4 (2,9%) 29 (20,9%) Группа 1б (n=97) 11 (11,3%) 31 (32%) 71 (73,2%) 24 (24,7%) 9 (9,3%) 6 (6,2%) ОШ2* 95% ДИ 0,9 [0,4;2,2] 1,5 [0,8;2,9] 1,5 [0,8;2,7] 2,2 [1,05;4,5] 0,9 [0,3;2,3] 3,4 [0,7;17,6] 0,8 [0,1;5,8] 3 (3,1%) 1,1 [0,1;8,5] 0,8 [0,1;4,2] 0,7 [0,4;1,3] 6 (6,2%) 1,7 [0,4;8,4] 0,8 [0,4;1,5] 22 (22,7%) Группа 2 (n=107) 13 (12,2%) 25 (23,4%) 69 (64,5%) 14 (13,1%) 11 (10,3%) р**уровень 0,2593 0,3411 0,3946 0,0281 0,3914 2 (1,9%) 0,0762 3 (2,8%) 0,8980 4 (3,7%) 0,4396 30 (28,0%) 0,4084 * ОШ1 – отношение шансов в группе 1 по сравнению с группой 3, ОШ2 – отношение шансов в группе 2 по сравнению с группой 3; **χ2-тест Таблица 6 Структура перенесенных оперативных вмешательств на органах малого таза Вид операции Cальпингоовариолизис Группа 1а Группа 1б Группа 2 р*(n=139) (n=97) (n=107) уровень n % n % n % 81 58,3 58 59,8 58 54,2 0,6986 Тубэктомия 30 21,6 21 21,7 24 22,4 0,9855 Резекция яичников 32 23,0 29 29,9 20 18,7 0,1663 Консервативная миомэктомия 13 9,4 8 8,3 5 4,7 0,3723 Операции на яичниках 82 в целом 59,0 60 61,9 62 58,0 0,8413 Хирургическое лечение эндометриоза 9,4% 9 9,3 14 13,1 0,4244 * χ2-тест 13 73 Продолжительность бесплодия была погранично выше у пациенток в группах 1а и 1б и составила 5,8±4,0; 6,6±4,2 и 5,2±3,6 в группах 1а, 1б и 2, соответственно (р=0,0554). При оценке акушерского анамнеза (общее число беременностей, число своевременных и преждевременных родов, число самопроизвольных и искусственных прерываний беременности) не было выявлено значимых различий в изучаемых группах (Таблица 7). Среднее число беременностей было сопоставимо в 3-х группах и составило 1,2, 1,0 и 1,4 беременностей, соответственно. В структуре исходов беременностей у пациенток группы 1а преобладали искусственные аборты (37,0%) и самопроизвольные прерывания беременности до 22 недель гестации (30,1%). У пациенток группы 1б преобладали самопроизвольные прерывания беременности в сроке до 22 недель гестации (33,6%), а также эктопические беременности (24,8%) и своевременные роды (23,8%). У пациенток группы 2 преобладали своевременные роды (29,1%), самопроизвольные прерывания беременности в сроке до 22 недель гестации (27,7%), а также искусственные аборты (24,3%). Число попыток ЭКО в анамнезе, а также число беременностей после ЭКО статистически значимо не различались между группами. Структура сопутствующих экстрагенитальных заболеваний у пациенток, включенных в исследование, представлена в таблице 8. По полученным данным о структуре экстрагенитальной патологии у изученных пациенток не было выявлено статистически значимых различий. Структура заболеваний легких была представлена хроническим бронхитом и бронхиальной астмой, а верхних дыхательных путей – хроническим тонзиллитом, хроническим фарингитом или хроническим трахеитом. В структуре сердечно-сосудистых заболеваний определяли пролапс митрального клапана и эссенциальную артериальную гипертонию. Среди заболеваний желудочно-кишечного тракта наблюдались хронический гастрит и хронический некалькулезный холецистит. Заболевания мочевыделительной 74 системы были представлены хроническим циститом, хроническим пиелонефритом или мочекаменной болезнью. Таблица 7 Акушерский анамнез пациенток, включенных в исследование Группа 1а Группа 1б (n=139) (n=97) Средняя продолжительность 5,8±4,0 6,6±4,3 бесплодия (лет)* Число пациенток с первичным 64 (46,0%) 51 (52,6%) бесплодием Число пациенток с вторичным 75 (54,0%) 46 (47,4%) бесплодием Общее число беременностей 173 101 Группа 2 (n=107) 5,2±3,6 Число беременностей на 1 пациентку* Общее число беременностей после ЭКО Число беременностей после ЭКО на 1 пациентку* Общее число срочных родов р**уровень 0,0554 53 (49,5%) 0,6080 54 (50,5%) 148 1,2±2,0 1,0±1,5 1,4±2,2 17 7 11 0,1±0,4 0,1±0,4 0,1±0,4 31 24 43 0,6192 0,3993 Число срочных родов на 1 0,2±0,6 0,3±0,6 0,4±0,9 0,3793 пациентку* Общее число преждевременных 2 2 2 родов в сроке до 37 недель гестации Число преждевременных родов в 0,01±0,12 0,02±0,14 0,02±0,14 0,9316 сроке до 37 недель гестации на 1 пациентку* Общее число самопроизвольных 52 34 41 прерываний беременности до 22 недель гестации Число самопроизвольных 0,4±0,8 0,4±0,8 0,4±0,8 0,6974 прерываний беременности до 22 недель гестации на 1 пациентку* Общее число искусственных 64 16 36 прерываний беременности Число искусственных прерываний 0,5±1,6 0,2±0,4 0,3±0,9 0,4334 беременности на 1 пациентку* Общее число эктопических 24 25 26 беременностей Число эктопических 0,2±0,5 0,3±0,6 0,2±0,6 0,6637 беременностей на 1 пациентку* Общее число попыток ЭКО в 124 94 80 анамнезе Число попыток ЭКО в анамнезе 0,9±1,1 1,0±1,2 0,8±1,2 0,1104 на 1 пациентку* *Данные представлены как средние ± стандартное отклонение, **χ2-тест для сравнения категориальных данных и ANOVA для сравнения непрерывных данных 75 Среди заболеваний эндокринной системы определяли патологию щитовидной железы в виде гипотиреоза, в основном аутоиммунного генеза. К заболеваниям глаз относили аномалии рефракции, а именно миопию слабой или средней степени, а также миопический астигматизм. Аллергические заболевания были представлены поллинозом, атопическим бронхитом или крапивницей. Таблица 8 Структура экстрагенитальной патологии у пациенток, включенных в исследование Заболевания Группа 1а (n=139) n % Группа 1б Группа 2 Всего (n=97) (n=107) n % n % n % р*уровень Заболевания легких 8 5,8 10 10,3 5 4,7 23 6,7 0,7457 Заболевания верхних дыхательных путей Заболевания сердечнососудистой системы Заболевания желудочнокишечного тракта Заболевания мочевыделительной системы Эндокринные заболевания 7 5,0 4 4,1 8 7,5 19 5,5 0,5470 7 5,0 3 3,1 3 2,8 13 3,8 0,6045 22 15,8 10 10,3 13 12,2 45 13,1 0,4372 12 8,6 3 3,1 5 4,7 20 5,8 0,1675 13 9,4 17 17,5 13 12,2 43 12,5 0,1736 Заболевания глаз 4 2,9 1 1,0 2 1,9 7 2,0 0,6072 Аллергические заболевания *χ2-тест 21 15,1 13 13,4 17 15,9 51 14,9 0,8785 3.2. Клинико-лабораторное обследование супружеских пар, включенных в исследование Перед включением в программу ЭКО/ИКСИ все включенные в исследование супружеские пары были обследованы согласно протоколу. С целью выявления возможных конфаундеров мы также проанализированы лабораторные данные всех пациенток. При статистической оценки 76 клинического и биохимического анализа крови, гемостазиограммы, а также данных общего анализа мочи значимых различий в группах сравнения выявлено не было. Результаты флюорографии органов грудной клетки, УЗИ молочных желез или маммографии, УЗИ щитовидной железы, ЭКГ, мазка на флору из влагалища, а также цитологического исследования шейки матки у всех исследуемых женщин были в пределах нормы и не отличались в изучаемых группах. Сравнительная оценка гормонального статуса пациенток представлена в таблице 9. Таблица 9 Лабораторные характеристики пациенток, включенных в исследование Группа 1а (n=139) 6,8±2,6 р**уровень 0,2806 Группа 1б (n=97) 6,8±2,8 р**уровень 0,3452 Группа 2 (n=107) 6,5±2,4 р***уровень 0,4265 ЛГ, мЕд/мл 4,9±2,1 0,4593 4,9±2,1 0,4203 5,2±2,7 0,9618 АМГ, нг/мл 2,33±2,1 0,0039 2,37±2,6 0,0136 3,66±3,3 0,0041 336,9±147,8 0,4574 325,1±168,2 0,2621 352,5±166,6 0,4455 СТГ, мМЕ/л 3,6±6,3 0,1430 2,2±3,5 0,9731 2,2±3,4 0,5526 ТТГ, мЕд/л 1,8±1,02 0,7204 1,9±1,2 0,5680 1,8±0,9 0,9903 Тироксин, пмоль/л 13,9±3,2 0,0093 14,3±2,8 0,0856 15,0±2,4 0,0138 Эстрадиол, пмоль/л 174,1±104,1 0,7694 180,7±90,5 0,8516 178,1±91,4 0,4736 Тестостерон,нмоль/л 1,5±0,8 0,8852 1,7±0,9 0,2050 1,5±0,8 0,6036 17-ОН, нмоль/л 2,4±1,8 0,8259 2,1±1,2 0,4423 2,3±1,7 0,9282 ДГЭАС, мкмоль/л 4,5±2,7 0,4570 4,8±2,5 0,9442 4,8±2,2 0,3613 Кортизол, нмоль/л 400,9±167,1 0,6121 370,3±152,7 0,4135 389,5±134,5 0,5042 Показатели* ФСГ, мЕд/мл Пролактин, мЕд/л *данные представлены как средние ± стандартное отклонение; **t-тест; ***ANOVA При оценке гормонов, измеренных однократно перед вступлением в программу ЭКО/ИКСИ на 3-й день менструального цикла, было выявлено, что уровень АМГ и свободного тироксина был значимо выше у пациенток группы 2 по сравнению с группами 1а и 1б (Рисунок 8). Уровень АМГ составил (2,33±2,1) нг/мл в группе 1а, (2,37±2,6) нг/мл в группе 1б и (3,66±3,3) нг/мл в группе 2 (р=0,0041). Уровень Т4 составил (13,9±3,2) пмоль/л в группе 1а, (14,3±2,8) пмоль/л в группе 1б и (15,0±2,4) пмоль/л в 77 группе 2 (р=0,0138) (Таблица 9). Другие лабораторные показатели не отличались в группах сравнения. Единицы измерения: для АМГ - нг/мл, для Т4 - пмоль/л Ящик: среднее значение; усы - стандартное отклонение 20 18 AMH: KW-H(2;211) = 10,9788; p = 0,0041 T4: KW-H(2;290) = 8,5646; p = 0,0138 AMH T4 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 1 0 2 Группы пациенток: 1 - группа 1а, 2 - группа 1б, 0 - группа 2 Рисунок 8. Коробочный график, отражающий средний уровень АМГ и Т4 у пациенток с наличием и отсутствием дисморфизмов ооцитов. 3.3. Особенности протоколов стимуляции суперовуляции у пациенток в изучаемых группах С целью выявления возможных конфаундеров были проанализированы особенности протоколов стимуляции функции яичников у женщин в трех группах. Было выявлено, что частота назначения различных протоколов стимуляции суперовуляции не отличалась статистически значимо в группах сравнения, однако доля протоколов с агонистами была выше в группе 1б по сравнению с группами 1а и 2 (9,3% по сравнению с 5,1% и 3,8%) (р=0,0004). Длительность стимуляции суперовуляции существенно не различалась в группах, также, как и частота использования различных препаратов гонадотропинов. В группах 1а и 1б была выявлена незначительно более 78 высокая суммарная доза назначаемых препаратов гонадотропинов по сравнению с группой 2. Что касается триггера овуляции, то у пациенток в группе 1б отмечалось более частое применение а-ГнРГ в качестве триггера овуляции по сравнению с группами 1а и 2 (14,4% по сравнению с 8,6% и 7,5%) (р=0,0985) (Таблица 10). Таблица 10 Особенности протоколов стимуляции овуляции в группах сравнения Группа 1а (n=139) Показатели Вид протокола Короткий с ант-ГнРГ, % Модифицированный короткий с ант-ГнРГ, % Длинный с аг-ГнРГ, % Короткий с аг-ГнРГ, % ЭКО в естественном цикле, % Вид ГТ ФСГ, % ФСГ/ЛГ, % Длительность стимуляции, дней* Суммарная доза гонадотропинов, МЕ* Триггер овуляции Препараты ХГ, % Препараты аг-ГнРГ, % Сочетание ХГ и аг-ГнРГ, % 118 8 6 1 126 (90,6%) Группа 1б (n=97) 72 10 95 82 (84,5%) 4 9 7 (5,1%) (9,3%) 5 6 (6,2%) 6 (4,3%) 72 (51,8%) 61 (43,9%) 8,7±2,6 2191,5±1340,9 122 (87,8%) 12 (8,6%) 5 (3,6%) Группа 2 (n=107) 45(46,4%) 46 (47,4%) 8,9±2,9 2198,5±1438,6 81 (83,5%) 14 (14,4%) 2 (2,1%) 5 3 1 100 (93,4%) 4 (3,8%) р***уровень 0,1387 0,0834** 3 (2,8%) 62 (57,9%) 41 (38,3%) 0,5530 8,6±2,1 0,0897 1895,0±1156,4 0,1065 0,0970** 92 (86%) 8 (7,5%) 7 (6,5%) 0,2287 0,0985** *данные представлены как средние ± стандартное отклонение; **сравнение группы 2 с группой 3; ***χ2-тест для сравнения категориальных данных и ANOVA для сравнения непрерывных данных 3.4. Многофакторный анализ шансов развития дисморфизмов ооцитов в зависимости от изученных предикторов Мы провели многофакторный анализ оценки шансов развития цитоплазматических и экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов в зависимости от влияния клинико-анамнестических, лабораторных и 79 ятрогенных предикторов. В модель были включены факторы, выделенные в ходе проведения однофакторного анализа (Таблица 11). Таблица 11 Предполагаемые факторы риска развития дисморфизмов ооцитов в программах ВРТ Группа 1 (n=236) 34,7±5,2 163 (69,1%) 73 (30,9%) 23,7±4,2 173 (73,3%) 63 (26,7%) 2,35±2,4 164 (69,5%) 72 (30,5%) 14,1±3,04 149 (63,1%) 87 (36,9%) Показатели Возраст, лет* <38 лет ≥38 лет ИМТ* <26 ≥26 АМГ, нг/мл* ≤1,6 нг/мл >1,6 нг/мл Т4св, пмоль/л* ≤14 пмоль/л >14 пмоль/л Суммарная доза гонадотропинов, МЕ* <1800 МЕ ≥1800 МЕ Миома матки, % 2194,4±1378,9 ОШ 95% ДИ р**уровень 4,3 [2,1;8,8] <0,0001 1,9 [1,06;3,5] 0,0214 1,9 [1,2;3,1] 0,0011 2,3 [1,5;3,7] 0,0129 1,8 [1,1;2,9] 2,3 61 (25,8%) [1,2;4,4] Продолжительность 5,2±3,6 1,06 6,1±4,1 бесплодия, лет* [1,01;1,13] *данные представлены как средние ± стандартное отклонение; **log-регрессия. На 115 (48,7%) 121 (51,3%) Группа 2 (n=107) 31,8±4,7 98 (91,6%) 9 (8,4%) 22,6±3,6 90 (84,1%) 17 (15,9%) 3,66±3,3 58 (54,2%) 49 (45,8%) 15,0±2,4 45 (42,1%) 62 (57,9%) 1895,0±1156,4 развитие 68 (63,5%) 39 (36,5%) 14 (13,1%) цитоплазматических дисморфизмов 0,0108 0,0080 0,0462 ооцитов в однофакторном анализе значимое влияние оказывали возраст пациентки, ИМТ, уровень АМГ и уровень Т4св. Единственным возможным конфаундером явилось наличие миомы матки (Таблицы 5-10). Все указанные переменные были представлены в виде бинарных данных с определением порогов отсечки, при которых созданная модель была максимально достоверной. Порогами отсечки с максимальной площадью под кривой (AUC) был возраст женщин 38 лет, ИМТ – 25, уровень АМГ – 1,4 нг/мл, уровень Т4св – 13 пмоль/л. В созданной модели с помощью метода логистической регрессии было выявлено, что значимое влияние на развитие цитоплазматических дисморфизмов ооцитов оказывали лишь возраст 80 женщин и уровень Т4св. ОШкор развития цитоплазматических дисморфизмов ооцитов при возрасте пациентки более 38 лет и уровне Т4 св менее 13 пмоль/л составило 5,6 (95% ДИ=2,7; 11,9). В полученной модели AUC составила 71,5%. (Рисунок 9А). При включении в модель выше указанных предикторов в виде непрерывных величин была получена следующая формула прогноза развития цитоплазматических дисморфизмов ооцитов у пациенток программ ВРТ в зависимости от возраста и уровня Т4св (Формула 1). Exp [-2,35+0,14*Возраст-0,15*T4св] Р(ЦД)= (------------------------------------------------)*100% 1+Exp [-2,35+0,14*Возраст-0,15*Т4св] где Р (ЦД) – вероятность развития цитоплазматических дисморфизмов в ооцитах, Exp – экспонента, возраст – возраст женщины в годах, T4св – уровень свободного тироксина в пмоль/л Формула 1. Вероятность получения ооцитов с цитоплазматическими нарушениями у пациенток программ ВРТ. На развитие экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов в однофакторном анализе значимое влияние оказывали возраст пациентки и уровень АМГ, погранично значимое влияние оказывали а-ГнРГ (в виде триггеров овуляции или в протоколах с а-ГнРГ). Единственным возможным конфаундером было наличие миомы матки (Таблицы 5-10). Порогами отсечки с максимальной AUC был возраст 38 лет, уровень АМГ – 2,2 нг/мл. В созданной модели с помощью метода логистической регрессии было выявлено, что значимое влияние на развитие экстрацитоплазматических нарушений в ооцитах оказывали влияние лишь уровень АМГ и применение а-ГнРГ. ОШкор развития экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов при уровне АМГ пациентки менее 2,2 нг/мл и применения а-ГнРГ в циклах ЭКО составило 2,2 (95% ДИ=1,2; 4,2). В полученной модели AUC составила 61,8%. (Рисунок 9Б). Таким образом, была получена следующая формула прогноза развития экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов у 81 пациенток программ ВРТ в зависимости от уровня АМГ и назначения а-ГнРГ (Формула 2). Exp [-2,61+0,79*(АМГ<2,2)+0,99*(а-ГнРГ+)] Р(ЭД)= (----------------------------------------------------------------)*100% 1+Exp [-2,61+0,79*(АМГ<2,2)+0,99*(а-ГнРГ+)] где Р(ЭД) – вероятность развития экстрацитоплазматических дисморфизмов в ооцитах, Exp – экспонента, АМГ <2,2 –включается в формулу при условии, что АМГ<2,2 нг/мл, а-ГнРГ+ включается в формулу при условии использования а-ГнРГ в качестве триггеров овуляции или в протоколе стимуляции овуляции Формула 2. Вероятность получения ооцитов с экстрацитоплазматическими нарушениями у пациенток программ ВРТ. A Б AUC=0,715 AUC=0,618 Рисунок 9. ROC-кривые зависимости развития цитоплазматических дисморфизмов ооцитов от возраста пациенток и уровня Т4 св (А), и экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов от уровня АМГ и назначения а-ГнРГ в программах ВРТ (Б). При учете влияния факторов риска на развитие как цитоплазматических, так и экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов в однофакторном анализе значимое влияние оказывали возраст пациентки, ИМТ, уровень 82 АМГ, уровень Т4 и суммарная доза вводимых гонадотропинов в циклах стимуляции. Возможными конфаундерами были наличие миомы матки и продолжительность бесплодия (Таблица 11). Порогами отсечки с максимальной AUC был возраст 38 лет, ИМТ – 26, уровень АМГ – 1,6 нг/мл, уровень Т4 – 14 пмоль/л, суммарная доза гонадотропинов – 1800 МЕ. В созданной модели с помощью метода логистической регрессии было выявлено, что значимое влияние на суммарное развитие дисморфизмов ооцитов оказывали влияние возраст и уровень Т4. ОШ кор развития дисморфизмов ооцитов при возрасте пациентки более 38 лет и уровне Т4 менее 14 пмоль/л составило 4,1 (95% ДИ=1,9; 8,3). В полученной модели AUC составила 67,5%. При включении в модель возраста и Т4 в виде непрерывных величин была получена следующая формула прогноза развития дисморфизмов ооцитов у пациенток программ ВРТ в зависимости от возраста и уровня Т4 (Формула 3). Exp [-1,91+0,14*Возраст-0,13*T4св] Р(Д)= (------------------------------------------------*100% 1+Exp [-1,91+0,14*Возраст-0,13*Т4св] где Р(Д) – вероятность развития дисморфизмов в ооцитах, Exp – экспонента, возраст – возраст женщины в годах, T4 - уровень свободного тироксина в пмоль/л Формула 3. Вероятность получения ооцитов с дисморфизмами у пациенток программ ВРТ. 3.5. Характеристика оогенеза, раннего эмбриогенеза и исходов программ ВРТ у пациенток в группах сравнения В результате 343 циклов ЭКО+ИКСИ было получено 2134 ОКК. В группе 1а было получено 815 ОКК (в среднем 5,9±3,9 на 1 пациентку), в группе 1б - 589 ОКК (6,1±4,5 на 1 пациентку), в группе 2 - 730 ОКК (6,8±3,8 на 1 пациентку) (р=0,5510). Из них зрелых ооцитов было получено 1793 (688 в группе 1а (84,4%), 476 в группе 1б (80,8%), 629 в группе 2 (86,2%)), 83 незрелых - 274 (101 в группе 1а (12,4%), 86 в группе 1б (14,6%), 87 в группе 2 (11,9%)), дегенеративных - 67 (26 в группе 1а (3,2%), 27 в группе 1б (4,6%), 14 в группе 2 (1,9%)) (Таблица 12). При проведении сравнительного анализа было выявлено, что максимальное число зрелых ооцитов на 1 пациентку было получено в группе 2: 5,9±3,4 в группе 2, 5,0±3,5 и 4,9±3,4 в группах 1а и 1б, соответственно (р=0,0207). Среднее количество незрелых и дегенеративных ооцитов не различались в группах сравнения. Таблица 12 Характеристика полученных ооцитов в группах сравнения Параметры оогенеза Группа (n=139) 1а Группа (n=97) 1б Группа 2 (n=107) р***уровень Число полученных ооцит- 815 589 730 кумулюсных комплексов Среднее число ооцит- 5,9±3,9 6,1±4,5 6,8±3,8 0,0551 кумулюсных комплексов на 1 пациентку* Число зрелых ооцитов** 688 (84,4%) 476 (80,8%) 629(86,2%) Среднее число зрелых 5,0±3,5 4,9±3,4 5,9±3,4 0,0207 ооцитов на 1 пациентку* Число незрелых ооцитов** 101 (12,4%) 86 (14,6%) 87 (11,9%) Среднее число незрелых 0,7±1,3 0,9±1,5 0,8±1,3 0,8915 ооцитов на 1 пациентку* Число дегенеративных 26 (3,2%) 27 (4,6%) 14 (1,9%) ооцитов** Среднее число 0,2±0,6 0,3±0,6 0,1±0,4 0,2519 дегенеративных ооцитов на 1 пациентку* *Данные представлены как средние ± стандартное отклонение; **Данные представлены как абсолютные значения и %; ***ANOVA Далее все зрелые ооциты подвергались оплодотворению методом ИКСИ. Морфологическую оценку ооцитов осуществлял эмбриолог во время проведения процедуры ИКСИ с помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse TE300 (общее увеличение 400х). Из 688 зрелых ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами 310 (45,1%) имели центральную гранулярность цитоплазмы (Рисунок 10А), 76 (11,0%) - вакуоли различного размера (Рисунок 10Б), 155 (22,5%) - 84 аномальные агрегаты ГЭР в цитоплазме (Рисунок 10В), 84 (12,2%) рефрактерные тельца (Рисунок 10Г), 63 (9,2%) - темную цитоплазму. А Б 10 мкм 10 мкм Г В 10 мкм 10 мкм Рисунок 10. Цитоплазматические дисморфизмы ооцитов (собственные данные): А - центральная гранулярность цитоплазмы ооцита; Б - вакуоли в ооцитах; В - аномальные агрегаты ГЭР в ооцитах; Г - рефрактерные тельца в ооцитах. Из 476 зрелых ооцитов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами 189 (39,7%) имели дебрис в перивителлиновом пространстве (Рисунок 11А), 122 (25,6%) - широкое перивителлиновое пространство (Рисунок 11Б), 48 (10,1%) - снижение тургора, 5 (1,1%) - аномалии строения первого полярного тельца (Рисунок 11В и Г), 50 (10,5%) - деформацию зоны пеллюцида (Рисунок 11Д), 62 (13,0%) - утолщение зоны пеллюцида (Рисунок 11Е). 85 Б А 10 мкм В 10 мкм Г 10 мкм 10 мкм Д Е 10 мкм 10 мкм Рисунок 11. Экстрацитоплазматические дисморфизмы ооцитов (собственные данные): А - дебрис в перивителлиновом пространстве; Б - широкое перивителлиновое пространство и агрегаты ГЭР в цитоплазме; В - гигантское полярное тельце; Г - мультифрагментированное полярное тельце; Д утолщение и деформация зона пеллюцида; Е - утолщение зоны пеллюцида. 86 Структура различных цитоплазматических и экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов представлена на рисунке 12. А Б 9,2% 45,1% 12,2% 13,0% 25,6% 10,5% 1,1% 22,5% 11,0% 39,7% 10,1% Центральная гранулярность Вакуоли Агрегаты ГЭР Рефрактерные тельца Темная цитоплазма Расширенное перивителлиновое пространство Дебрис в перивителлиновом пространстве Снижение тургора Аномалии строения первого полярного тельца Деформация зоны пеллюцида Утолщение зоны пеллюцида Рисунок 12. Структура дисморфизмов ооцитов у обследуемых пациенток (А – цитоплазматические, Б – экстрацитоплазматические). Частота оплодотворения ооцитов существенно различалась между группами и была минимальной при наличии цитоплазматических дисморфизмов. Так, в группе 1а нормальное оплодотворение было отмечено в 575 ооцитах (83,6%), в группе 1б - в 416 ооцитах (87,4%), в группе 2 - в 556 ооцитах (88,4%) (р=0,028). Среди ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами наименьшую частоту оплодотворения имели ооциты с темной цитоплазмой (77,8%), а наибольшую частоту - ооциты с рефрактерными тельцами в цитоплазме (86,9%). Среди ооцитов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами наименьшую частоту оплодотворения имели ооциты со снижением тургора цитоплазмы (81,3%) и аномалиями строения первого полярного тельца (80,0%), а наибольшую частоту - ооциты с широким перивителлиновым пространством (90,9%) (Рисунок 13). 87 А Б 2pn – оплодотворившиеся ооциты, 0pn – неоплодотворившиеся ооциты Рисунок 13.Частота оплодотворения ооцитов с различными дисморфизмами (А - цитоплазматические, Б -экстрацитоплазматические). Таким образом было получено 1547 эмбрионов: 575 в группе 1а, 416 в группе 1б и 556 в группе 2. При оценке морфологических характеристик эмбрионов, полученных из ооцитов с различными морфотипами, были выявлены существенные различия между группами. Для каждой группы производилась оценка доли эмбрионов разных классов (А, В и С) на 3-и сутки культивирования, а также доли эмбрионов, остановившихся в развитии на раннем этапе культивирования. 88 Эмбрионов класса А было получено 268 (46,6%) в группе 1а, 219 (52,6%) в группе 1б и 365 (65,7%) в группе 2 (р<0,0001). Соответственно по группам было получено 214 (37,2%), 150 (36,1%) и 152 (27,3%) эмбрионов класса В (р=0,0008); 66 (11,5%), 43 (10,3%) и 29 (5,2%) эмбрионов класса С (р=0,0005). Остановка дробления в первые 72 часа после оплодотворения произошла у 27 (4,7%), 4 (1%) и 10 (1,8%) по группам соответственно (р=0,0004). Таким образом, наибольшее число качественных эмбрионов было получено у женщин в группе 2, а максимальное число эмбрионов класса С и остановившихся в развитии - у пациенток группы 1а (Рисунок 14). Рисунок 14. Характеристика полученных эмбрионов в группах сравнения. В группе 2 не было ни одного цикла с отменой ПЭ по причине отсутствия эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки. При этом 8 циклов ЭКО/ИКСИ в группе 1а (5,8%) и 7 циклов ЭКО/ИКСИ в группе 1б (7,2%) завершились отменой ПЭ в полость матки (р=0,0246). Частота наступления клинической и биохимической беременности также существенно различалась в группах сравнения. Частота биохимической беременности в группе 1а составила 27,3% (38 женщин), в группе 1б - 39,2% 89 (38 женщин), а в группе контроля - 57,0% (61 женщина) (р˂0,0001). Клиническая беременность наступила у 34 женщин группы 1а (24,6%), у 38 женщин в группе 1б (39,2%) и у 60 женщин в группе контроля (56,1%) (р˂0,0001). На наступление беременности помимо наличия дисморфизмов ооцитов влияли возраст пациентки, количество программ ЭКО в анамнезе, а также тип выбранного протокола, препарат для стимуляции функции яичников и число полученных зрелых ооцитов. Мы провели многофакторный анализ оценки шансов наступления клинической беременности анамнестических в особенностей зависимости пациенток, от влияния особенностей клиникопротокола стимуляции, а также наличия или отсутствия дисморфизмов ооцитов. В модель были включены факторы, выделенные в ходе однофакторного анализа. Грубое отношение шансов (ОШгр) наступления беременности между группами составило 1,46 (95% ДИ 1,09; 1,95). При этом ОШ кор наступления беременности с учетом возраста, числа зрелых ооцитов и выбора препарата для стимуляции функции яичников составило 1,37 (95% ДИ 1,02; 1,85). ОШгр наступления беременности у женщин с цитоплазматическими дисморфизмами по сравнению с группой контроля составило 3,9 (95% ДИ 2,27; 6,73), а ОШкор с учетом числа зрелых ооцитов - 3,69 (95% ДИ 2,12; 6,14). ОШгр наступления беременности у женщин с экстрацитоплазматическими дисморфизмами по сравнению с группой контроля составило 1,4 (95% ДИ 1,06; 1,86), а ОШкор с учетом выбора препарата для стимуляции функции яичников - 1,42 (95% ДИ 1,07; 1,89). Частота самопроизвольных прерываний беременностей была выше у пациенток с дисморфизмами ооцитов. Было диагностировано 35 потерь беременности в сроке до 10 недель гестации: 11 – в группе 1а (32,4% от общего числа беременностей в этой группе), 11 - в группе 1б (29,0% от общего числа беременностей в этой группе), 13 - в группе 2 (21,7% от общего 90 числа беременностей в этой группе) (р=0,4554). В группе 1а также было проведено 1 прерывание беременности во II триместре гестации в связи с наличием у плода синдрома Дауна по результатам амниоцентеза и генетического исследования околоплодных вод. Всего в группе 1а беременность закончилась родами у 22 женщин. При этом родилось 23 ребенка: у 21 женщины родилось по одному ребенку, у одной родилась двойня. В группе 1б беременность закончилась родами у 27 женщин. При этом родилось 28 детей: у 26 женщин родилось по одному ребенку, у одной родилась двойня. В группе 2 беременность закончилась родами у 47 женщин. При этом родилось 50 детей: у 44 женщин родилось по одному ребенку, у трех женщин родились двойни. Одни из родов двойней закончились преждевременно на сроке 35 недель гестации. Таким образом, в группах пар с дисморфизмами ооцитов у женщин отмечалось статистически значимо меньше число живорождений по сравнению с контрольной группой. Частота живорождений в группе 1а составила 15,8% (22 из 139), в группе 1б 27,8% (27 из 97), в группе 2 - 43,9% (47 из 107) (р<0,0001) (Рисунок 15). 57,0% 56,1% 60% 50% 40% 30% 20% 43,9% 39,2% 39,2% 27,8% 27,3% 24,6% 15,8% 10% 0% Группа 1а Группа 1б Группа 2 Частота наступления биохимической беременности Частота наступления клинической беременности Частота живорождения Рисунок 15. Исходы программ ВРТ в группах сравнения. 91 ОШ живорождения при наличии цитоплазматических дисморфизмов ооцитов по сравнению с морфологически нормальными ооцитами составило 4,2 (95% ДИ=0,13; экстрацитоплазматических 0,45). ОШ живорождения дисморфизмов ооцитов по при наличии сравнению с морфологически нормальными ооцитами составило 2,0 (95% ДИ=0,26; 0,92). Нами также были оценены перинатальные исходы в группах сравнения. Всего родился 101 ребенок, из них 56 мальчиков и 45 девочек. Все дети родились живыми, у одной из пациенток группы 1 родился ребенок с синдромом Дауна. Все остальные дети родились без генетической патологии и пороков развития. Средняя масса тела новорожденных составила 3327,2±119,4 грамм в группе 1а, 3320,8±109,5 грамм в группе 1б, 3340,5±87,6 в группе 2 (р>0,05). Средняя длина тела новорожденных составила 51,1±2,6 в группе 1а, 50,9±3,3 в группе 1б, 51,5±2,9 в группе 2 (р>0,05). Оценка по шкале Апгар составила 7,8±0,9 баллов на 1-й минуте и 8,4±0,9 баллов на 5-й минуте в группе 1а, 7,9±0,7 баллов и 8,5±0,5 баллов в группе 1б, соответственно, 7,8±0,5 баллов и 8,5±0,5 баллов в группе 2, соответственно. 92 Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕЗА ВЛИЯНИЯ ДИСМОРФИЗМОВ НА ИСХОДЫ ПРОГРАММ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ 4.1. Изучение числа копий митохондриальной ДНК в ооцитах человека с различными дисморфизмами Для решения задачи 4 у 198 женщин с их информированного согласия для исследования числа копий мтДНК было отобрано 343 ооцита, не оплодотворившихся после проведения ИКСИ. Критериями отбора ооцитов для исследования служили отсутствие в цитоплазме пронуклеусов через 1820 часов после оплодотворения, а также отсутствие дробления через 40 часов после оплодотворения. В зависимости от морфологической оценки ооцитов эмбриологом во время проведения ИКСИ ооциты были разделены на 3 группы: группа 1а (n=126) – ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов; группа 1б (n=108) – ооциты с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов; группа 2 (n=109) – морфологически нормальные ооциты. При сравнении клинико-анамнестических данных пациенток было выявлено, что в группах 1а и 1б ооциты были получены от пациенток более старшего возраста по сравнению с группой 2: 33,9±4,8 лет, 33,1±5,1 лет и 31,9±4,4 лет для групп 1а, 1б и 2 соответственно (p=0,0169). ИМТ, частота назначения различных протоколов стимуляции, длительность стимуляции суперовуляции, суммарная доза назначаемых препаратов гонадотропинов, тип гонадотропинов и препаратов, используемых в качестве триггера овуляции, не различались в группах сравнения. Структура 93 цитоплазматических и экстрацитоплазматических дисморфизмов изученных ооцитов представлена на рисунке 16. A 23,1% 14,3% Б 14,8% 16,7% 46,8% 10,2% 15,8% 4,6% Центральная гранулярность Вакуоли Аномальные агрегаты ГЭР Рефрактерные тельца 53,7% Широкое перивителлиновое пространство Дебрис в перивителлиновом пространстве Аномалии первого полярного тельца Деформация зоны пеллюцида Утолщение зоны пеллюцида Рисунок 16. Распределение дисморфизмов среди изученных ооцитов (А - цитоплазматические, Б - экстрацитоплазматические). Данные распределения числа копий мтДНК представлены на рисунке 17. Распределение числа мтДНК всех изученных ооцитов находилось в диапазоне от 5 440 до 9 800 000 копий. Медиана распределения составила 2 000 000 с интерквартильным размахом от 813 000 до 3 300 000 копий. Мы провели сравнение ооцитов с дисморфизмами с морфологически нормальными ооцитами, а также ооцитов с различными дисморфизмами между собой. Число копий мтДНК ооцитов в группе 1а статистически значимо различалось от группы 1б и группы 2 (p<0,0001). При этом значимых различий между группами 1б и 2 выявлено не было. В группе 1а число копий мтДНК составило 1 300 000 (263 500 - 2 325 000), в группе 1б 2 000 000 (1 350 000 – 4 150 000), в группе 2 – 2 500 000 (1 400 000 - 4 000000) (p<0,0001) (Рисунок 17). Среди ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами минимальное число копий было выявлено у ооцитов с агрегатами ГЭР: 505 000 (105 000 – 1 600 000) копий, максимальное – у ооцитов с рефрактерными тельцами: 2 350 000 (1 600 000 – 3 300 000) копий 94 (р=0,0137) (Таблица 13). Среди ооцитов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами значимой разницы в числе копий мтДНК у ооцитов с различными видами дисморфизмов выявлено не было (р=0,1211). 1,2E7 Медиана; Интерквартильный размах; Выбросы; Экстремальные значения Размах без выбросов; 1E7 Копии мтДНК 8E6 6E6 4E6 2E6 0 Копии мтДНК: KW-H(2;343) = 30,3208; p = 0,00000 -2E6 3 1 2 Группы пациенток: 1 - группа 1а, 2 - группа 1б, 3 - группа 2 Рисунок 17. Число копий мтДНК в ооцитах с цитоплазматическими дисморфизмами (1), экстрацитоплазматическими дисморфизмами (2) и с отсутствием дисморфизмов (3). Таблица 13 Число копий мтДНК в ооцитах с различными цитоплазматическими дисморфизмами Группа Число ооцитов Среднее значение Стандартное отклонение Медиана Центральная гранулярность Вакуоли 59 1’737’341 1’795’534 1’200’000 20 1’778’790 2’188’078 1’400’000 Аномальные агрегаты ГЭР Рефрактерные тельца 29 1’235’126 1’775’019 505’000 18 2’704’500 2’219’409 2’350’000 p=0,0137, тест Крускала-Уаллиса Интеркварт ильный размах 229’0002’300’000 284’0002’150’000 105’0001’600’000 1’600’0003’300’000 Минимуммаксимум 7’9707’600’000 10’4009’100’000 5’4408’000’000 212’0009’800’000 95 Мы проанализировали факторы, способные оказать влияние на число копий мтДНК в ооцитах. Качество спермы не оказывало влияние на мтДНК. Среднее число копий в ооцитах, оплодотворенных фертильной спермой, составило 2 702 237 ± 2 165 088, а в ооцитах, оплодотворенных спермой мужчин с олигоастенотератозооспермией - 2 387 334 ± 2 130 754 (р=0,2600). Возраст пациенток не оказывал влияния на число копий мтДНК в ооцитах (r=-0,057, p=0,2960), также, как и ИМТ женщин (r=0,037, p=0,4950). Ятрогенные факторы (частота назначения различных протоколов стимуляции, длительность стимуляции суперовуляции, суммарная доза назначаемых препаратов гонадотропинов и вид триггера овуляции) не влияли на число копий мтДНК. 4.2. Клинико-анамнестические характеристики супружеских пар, включенных в исследование Для решения задачи 5 в исследование были включены 84 супружеские пары с различными морфологическими аномалиями ооцитов, прошедшие молекулярно-цитогенетическое исследование эмбрионов перед переносом эмбрионов в полость матки. В зависимости от морфологической оценки ооцитов эмбриологом во время проведения ИКСИ пациентки были разделены на 3 группы: группа 1а (n=28) - пациентки с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, прошедшие ПГС; группа 1б (n=28) - пациентки с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, прошедшие ПГС; группа 2 (n=28) - пациентки с морфологически нормальными ооцитами, прошедшие ПГС. С целью выявления возможных конфаундеров были проанализированы клинико-анамнестические характеристики пациенток указанных групп. 96 Средний возраст включенных в исследование пациенток был выше у пациенток с дисморфизмами ооцитов и составил 38,7±6,8, 35,7±5,3 и 32,1±4,9 в группах 1а, 1б и 2, соответственно (р=0,0002). При анализе антропометрических данных было выявлено различие в показателях веса и, как следствие, ИМТ женщин. Средний вес составил 66,1±9,6 кг, 65,5±8,4 кг и 58,5±8,9 в группах 1а, 1б и 2, соответственно (р=0,0032). ИМТ был выше у пациенток с дисморфизмами и составил 23,9±3,2 кг/м2, 23,3±3,1 кг/м2 и 21,3±3,1 кг/м2, соответственно (р=0,0302) (Таблица 14). Таблица 14 Антропометрические данные пациенток, включенных в исследование Группы Средний рост женщин, см р*уровень Средний р*вес уровень женщин, кг ИМТ женщин Группа 1 166,1±4,3 0,1948 66,1±9,6 0,0032 23,9±3,2 (n=28) Группа 2 168,0±5,2 65,5±8,4 23,3±3,1 (n=28) Группа 3 165,6±5,7 58,5±8,9 21,3±3,1 (n=28) Данные представлены как среднее±стандартное отклонение; *ANOVA р*уровень 0,0091 Социально-экономические характеристики (уровень образования, семейное положение, наличие или отсутствие работы, место проживания), а также наличие вредных привычек у пациенток (курение) не различались в группах сравнения. При оценке менструальной функции (возраст менархе, длительность менструального цикла, продолжительность менструального кровотечения) не было выявлено статистически значимых различий между группами (р<0,05). Отмечалось более позднее начало половой жизни в группах 1а и 1б (20,6±3,4 лет и 19,1±2,6 лет, соответственно) по сравнению с группой 2 (18,4±2,0 лет) (р=0,0115). Нормальный менструальный цикл отмечался у 96,4 % изученных пациенток. У 3,6% пациенток имели место нарушения менструального цикла 97 в виде олигоменореи. Олигоменорея отмечалась у 1 пациентки (3,6%) в группе 1а и у 2 пациенток (7,2%) в группе 2 (р=0,3545) (Таблица 15). Комбинированные оральные контрацептивы (КОК) с лечебной или контрацептивной целью применяли 2 пациентки (7,2%) в группе 1а, 1 пациентка (3,6%) в группе 1б и 2 пациентки (7,2%) в группе 2 (р=0,8084). Таблица 15 Особенности менструального цикла пациенток, включенных в исследование Группа Возраст Длительность Длительность менархе цикла менструации Группа 1 (n=28) 12,8±1,4 28,7±3,2 5,2±0,9 Группа 2 (n=28) 13,1±1,2 28,6±1,2 4,6±1,0 Группа 3 (n=28) 12,9±1,3 28,8±2,1 5,1±1,2 р*-уровень 0,5761 0,9396 0,0745 Данные представлены как средние ± стандартное отклонение; *ANOVA Дебют половой жизни 20,6±3,4 19,1±2,6 18,4±2,0 0,0115 При оценке гинекологической заболеваемости пациенток была выявлена более высокая распространенность хламидийной инфекции и ИППП в анамнезе у пациенток группы 1а. Хламидийную инфекцию в анамнезе имели 9 пациенток (32,1%) в группе 1а, 2 пациентки (7,1%) в группе 1б и 2 пациентки (7,1%) в группе 2 (р=0,0015). ИППП в анамнезе имели 15 пациенток (55,6%) в группе 1а, 9 пациенток (32,1%) в группе 1б и 7 пациенток (25,0%) в группе 2 (р=0,0504). Перенесенные инфекции, передающиеся половым путем, включали хламидиоз, микоуреаплазмоз и трихомониаз. Все инфекционные и воспалительные заболевания органов малого таза, гиперпластические процессы эндометрия, патология шейки матки были пролечены до вступления женщины в программу ВРТ (Таблица 16). При анализе данных о частоте оперативных вмешательств на органах малого таза (сальпингоовариолизис, тубэктомия, резекция яичников) не было выявлено статистически значимых различий между группами (Таблица 17). 98 Таблица 16 Структура гинекологической заболеваемости у пациенток, включенных в исследование Группа 1а (n=28) 2 (7,1%) Показатели Прием КОК в анамнезе, % Эндометриоз/аденомиоз, % Группа 1б (n=28) 1 (3,6%) 9 (32,1%) 17 (60,7%) 7 (25,0%) Группа 2 (n=28) 2 (7,1%) 7 (25,0%) Хронический 21 (75,0%) 16 (57,1%) сальпингоофорит, % Хламидийная инфекция в 2 (7,1%) 9 (32,1%) 2 (7,1%) анамнезе, % Миома матки, % 5 (17,9%) 6 (21,4%) 5 (17,9%) ИППП в анамнезе, % 15 (55,6%) 9 (32,1%) 7 (25,0%) СПКЯ, % 2(7,1%) 0 2 (7,1%) Полипы/гиперплазия 1 (3,6%) 0 0 эндометрия в анамнезе,% *данные представлены как среднее±стандартное отклонение; **χ2-тест р**-уровень 0,8084 0,7870 0,3365 0,0015 0,9256 0,0504 0,3499 0,3634 Таблица 17 Структура перенесенных оперативных вмешательств на органах малого таза Вид операции Группа (n=28) N % Cальпингоовариолизис Тубэктомия 17 4 60,7 14,3 13 2 46,4 7,1 14 6 50,0 21,4 0,5377 0,3114 Резекция яичников 6 21,4 4 14,3 3 10,7 0,5288 60,7 13 46,4 14 50,0 0,5377 Операции на яичниках в 17 целом 1а Группа 1б Группа (n=28) (n=28) n % n % 2 р*уровень * χ2-тест Продолжительность бесплодия статистически значимо не различалась между группами и составила 3,8±2,3, 4,5±2,9 и 3,8±2,3 лет в группах 1а, 1б и 2, соответственно (р=0,3719). При оценке акушерского анамнеза (общее число беременностей, число своевременных и преждевременных родов, число самопроизвольных и искусственных прерываний беременности) не было выявлено значимых различий в изучаемых группах (Таблица 18). 99 Таблица 18 Акушерский анамнез пациенток, включенных в исследование Группа 1а Группа 1б (n=28) (n=28) Группа 2 (n=28) р**уровень 3,8±2,3 4,5±2,9 3,8±2,3 0,3719 5 (17,9%) 8 (28,6%) 9 (32,1%) 0,4490 23 (82,1%) 20 (71,4%) 19 (67,9%) 94 76 69 Число беременностей на 1 3,3±3,2 пациентку* Общее число беременностей 10 после ЭКО Число беременностей после ЭКО 0,4±0,7 на 1 пациентку* 2,7±2,8 2,5±2,8 11 4 0,4±1,0 0,1±0,4 Общее число срочных родов 34 18 Средняя продолжительность бесплодия (лет)* Число пациенток с первичным бесплодием Число пациенток с вторичным бесплодием Общее число беременностей 29 0,4617 0,5231 Число срочных родов на 1 1,0±1,2 1,2±1,3 0,6±1,1 0,1730 пациентку* Общее число преждевременных 2 0 1 родов в сроке до 37 недель гестации Число преждевременных родов в 0,1±0,3 0 0,04±0,19 0,3589 сроке до 37 недель гестации на 1 пациентку* Общее число самопроизвольных 32 19 30 прерываний беременности до 22 недель гестации Число самопроизвольных 1,1±1,1 0,7±1,2 1,1±1,3 0,9086 прерываний беременности до 22 недель гестации на 1 пациентку* Общее число искусственных 30 17 11 прерываний беременности Число искусственных прерываний 1,1±3,2 0,6±1,7 0,4±0,9 0,1308 беременности на 1 пациентку* Общее число эктопических 1 6 9 беременностей Число эктопических 0,04±0,19 0,2±0,6 0,3±0,7 0,2134 беременностей на 1 пациентку* Общее число попыток ЭКО в 39 36 28 анамнезе Число попыток ЭКО в анамнезе 1,4±1,9 1,3±1,7 1,0±1,4 0,7542 на 1 пациентку* *Данные представлены как средние ± стандартное отклонение, **χ2-тест для сравнения категориальных данных и ANOVA для сравнения непрерывных данных 100 Среднее число беременностей было сопоставимо в 3-х группах и составило 3,3, 2,7 и 2,5 беременностей, соответственно. В структуре исходов беременностей у пациенток группы 1а преобладали самопроизвольные прерывания беременности в сроке до 22 недель гестации (34,0%), искусственные прерывания беременности (31,9%) и своевременные роды (30,9%). У пациенток группы 1б преобладали своевременные роды (44,7%), самопроизвольные прерывания беременности в сроке до 22 недель гестации (25,0%) и искусственные прерывания беременности (22,4%). У пациенток группы 2 преобладали самопроизвольные прерывания беременности в сроке до 22 недель гестации (43,5%), своевременные роды (26,1%) и искусственные прерывания беременности (15,9%). Число попыток ЭКО в анамнезе, а также число беременностей после ЭКО статистически значимо не различались между группами. Структура сопутствующих экстрагенитальных заболеваний у пациенток, включенных в исследование, представлена в таблице 19. Таблица 19 Структура экстрагенитальной патологии у пациенток, включенных в исследование Заболевания Группа 1а (n=28) n % Группа 1б Группа 2 Всего (n=28) (n=28) n % n % n % р*уровень Заболевания легких 2 7,1 2 7,1 0 0 4 4,8 0,3499 Заболевания верхних дыхательных путей Заболевания сердечнососудистой системы Заболевания желудочнокишечного тракта Заболевания мочевыделительной системы Эндокринные заболевания 0 0 0 0 2 7,1 2 2,4 0,1288 2 7,1 1 3,6 0 0 3 3,6 0,3545 4 14,3 6 21,4 3 10,7 13 15,5 0,5288 1 3,6 1 3,6 3 10,7 5 6,0 0,4271 2 7,1 2 7,1 4 14,3 8 9,5 0,5754 Заболевания глаз 1 3,6 0 0 1 3,6 2 2,4 0,5991 Аллергические заболевания 4 14,3 4 14,3 6 21,4 14 16,7 0,7097 *χ2-тест 101 По полученным данным о структуре экстрагенитальной патологии у изученных пациенток не было выявлено статистически значимых различий. Структура заболеваний легких была представлена хроническим бронхитом и бронхиальной астмой, а верхних дыхательных путей - хроническим тонзиллитом, хроническим фарингитом или хроническим трахеитом. В структуре сердечно-сосудистых заболеваний определяли пролапс митрального клапана и эссенциальную артериальную гипертонию. Среди заболеваний желудочно-кишечного тракта наблюдались хронический гастрит и хронический некалькулезный холецистит. Заболевания мочевыделительной системы были пиелонефритом представлены или хроническим мочекаменной циститом, болезнью. Среди хроническим заболеваний эндокринной системы определяли патологию щитовидной железы в виде гипотиреоза, в основном аутоиммунного генеза. К заболеваниям глаз относили аномалии рефракции, а именно миопию слабой или средней степени. Аллергические заболевания были представлены поллинозом, атопическим бронхитом или крапивницей. Все указанные показатели сравниваемых групп были оценены на предмет конфаундинга и учтены при оценке результатов ЭКО в многофакторном регрессионном анализе. 4.3. Клинико-лабораторное обследование супружеских пар, включенных в исследование Перед включением в программу ЭКО/ИКСИ все включенные в исследование супружеские пары были обследованы согласно протоколу. С целью выявления возможных конфаундеров мы также проанализированы лабораторные данные всех пациенток. При статистической оценки клинического и биохимического анализа крови, гемостазиограммы, а также данных общего анализа мочи значимых различий в группах сравнения выявлено не было. Результаты флюорографии органов грудной клетки, УЗИ 102 молочных желез или маммографии, УЗИ щитовидной железы, ЭКГ, мазка на флору из влагалища, а также цитологического исследования шейки матки у всех исследуемых женщин были в пределах нормы и не отличались в изучаемых группах. Сравнительная оценка гормонального статуса пациенток представлена в таблице 20. Таблица 20 Лабораторные характеристики пациенток, включенных в исследование Группа 1а Группа 1б Группа 2 р**-уровень (n=28) (n=28) (n=28) ФСГ, мЕд/мл 6,8±2,1 6,3±2,6 6,6±2,4 0,7945 ЛГ, мЕд/мл 5,2±2,4 5,2±2,4 6,2±3,9 0,3434 АМГ, нг/мл 2,4±1,9 2,2±1,2 3,1±3,0 0,0269 Пролактин, мЕд/л 257,8±126,3 286,7±140,7 313,1±161,1 0,3987 СТГ, мМЕ/л 4,5±6,6 3,1±4,6 3,0±5,6 0,7928 ТТГ, мЕд/л 1,8±0,9 1,7±1,0 1,8±0,9 0,8577 Т4св, пмоль/л 14,9±3,0 14,8±1,3 14,6±1,7 0,9100 Эстрадиол, пмоль/л 157,3±59,1 162,2±66,7 183,1±63,0 0,3309 Тестостерон, нмоль/л 1,1±0,6 1,4±0,6 1,4±0,8 0,2608 17-ОН, нмоль/л 1,5±0,8 2,6±2,1 2,0±1,1 0,1555 ДГЭАС, мкмоль/л 4,5±2,2 4,5±1,4 5,1±1,8 0,6242 Кортизол, нмоль/л 360,6±191,4 377,8±155,5 357,5±87,6 0,9145 *данные представлены как средние ± стандартное отклонение; **ANOVA Показатели* При оценке гормонов, измеренных однократно перед вступлением в программу ЭКО/ИКСИ на 3-й день менструального цикла, было выявлено, что уровень АМГ был значимо выше у пациенток группы 2 по сравнению с группами 1а и 1б (Рисунок 18). Уровень АМГ составил (2,4±1,9) нг/мл в группе 1а, (2,2±1,2) нг/мл в группе 1б и (3,1±3,3=0) нг/мл в группе 2 (р=0,0269). Другие лабораторные показатели не отличались в группах сравнения. 103 12 Среднее значение; Среднее±стандартное отклонение; Среднее±1,96 стандартных отклонений 10 8 АМГ, нг/мл 6 4 2 0 -2 AMH: F(2;63) = 3,83034715; p = 0,0269 -4 0 1 2 Группы пациенток: 1 - группа 1а, 2 - группа 1б, 0 - группа 2 Рисунок 18. Коробочный график, отражающий средний уровень АМГ у пациенток в группах сравнения. 4.4. Особенности протоколов стимуляции суперовуляции у пациенток в изучаемых группах С целью выявления возможных конфаундеров были проанализированы особенности протоколов стимуляции функции яичников у женщин в трех группах. Было выявлено, что частота назначения различных протоколов стимуляции суперовуляции не отличалась статистически значимо в группах сравнения, также, как и частота использования различных препаратов гонадотропинов. Суммарная доза гонадотропинов была выше у пациенток с дисморфизмами ооцитов и составила 2619,6±1180,9, 2565,2±1087,7 и 1741,1± 863,2 МЕ в группе 1а, 1б и 2, соответственно (р=0,0330). Длительность стимуляции суперовуляции была погранично выше у пациенток с 104 дисморфизмами ооцитов и составила 9,4±2,6, 8,9±1,5 и 8,0±2,5 дней, соответственно (р=0,0896). Частота назначения различных препаратов в качестве триггера овуляции не различалась в группах сравнения (Таблица 21). Таблица 21 Особенности протоколов стимуляции овуляции в группах сравнения Группа 1а (n=28) Показатели Вид протокола Короткий с ант-ГнРГ, % Модифицированный короткий с ант-ГнРГ, % Длинный с аг-ГнРГ, % ЭКО в естественном цикле, % Вид ГТ ФСГ, % ФСГ/ЛГ, % Длительность стимуляции, число дней* Суммарная доза ГТ, МЕ* Триггер овуляции Препараты ХГ, % Препараты аг-ГнРГ, % Сочетание ХГ и аг-ГнРГ, % 23 3 26 (92,8%) 1 (3,6%) Группа 1б (n=28) 22 2 23 24 (85,8%) 1 (3,6%) 4 (14,2%) 0 9 (33,4%) 17 (63,0%) 11 (39,3%) 17 (60,7%) 9,4±2,6 Группа 2 (n=28) 2619,6± 1180,9 8,9±1,5 2565,2± 1087,7 25 (89,3%) 3 (10,7%) 0 25 (89,3%) 3 (10,7%) 0 р***уровень 24 (85,8%) 1 0,5400 2 (7,1%) 2 (7,1%) 15 (53,6%) 11 (39,3%) 0,4220 8,0±2,5 0,0896 1741,1± 863,2 0,0330 22 (78,6%) 5 (17,9%) 1 (3,6%) 0,5616 *данные представлены как средние ± стандартное отклонение; * χ2-тест для сравнения категориальных данных и ANOVA для сравнения непрерывных данных 4.5. Характеристика оогенеза, раннего эмбриогенеза и исходов программ ВРТ у пациенток в группах сравнения Для оценки анеуплоидных влияния эмбрионов морфологии ооцитов на риск мы провели сравнение групп получения пациентов, прошедших ПГС. В результате 84 циклов ЭКО+ИКСИ+ПГС было получено 643 ОКК. В группе 1а было получено 181 ОКК (в среднем 6,5±3,9 на 1 пациентку), в группе 1б было получено 220 ОКК (7,9±4,4 на 1 пациентку), в группе 2 было получено 242 ОКК (8,6±5,0 на 1 пациентку) (р=0,1833). Из них зрелых ооцитов было получено 578 (161 в группе 1а (89,0%), 189 в группе 1б 105 (85,9%), 228 в группе 2 (94,2%)), незрелых – 65 (20 в группе 1а (11,0%), 31 в группе 1б (14,1%), 14 в группе 2 (5,8%)). При проведении сравнительного анализа было выявлено, что среднее количество незрелых ооцитов было погранично выше у пациенток с дисморфизмами ооцитов (0,7±1,2 в группе 1а, 1,1±1,4 в группе 1б, 0,5±0,9 в группе 2, р=0,0870). Хотя среднее число ОКК и зрелых ооцитов было выше у пациенток группы 2, статистически значимых различий между группами выявлено не было (Таблица 22). Таблица 22 Характеристика полученных ооцитов в группах сравнения Параметры оогенеза Группа (n=28) 1а Группа (n=28) 1б Группа 2 (n=28) Число полученных ооцит- 181 220 242 кумулюсных комплексов Среднее число ооцит- 6,5±3,9 7,9±4,4 8,6±5,0 кумулюсных комплексов на 1 пациентку* Число зрелых ооцитов** 161 (89,0%) 189 (85,9%) 228(94,2%) Среднее число зрелых 5,6±3,7 6,8±3,6 8,1±4,8 ооцитов на 1 пациентку* Число незрелых ооцитов** 20 (11,0%) 31 (14,1%) 14 (5,8%) Среднее число незрелых 0,7±1,2 1,1±1,4 0,5±0,9 ооцитов на 1 пациентку* *Данные представлены как средние ± стандартное отклонение; **Данные как абсолютные значения и %; ***ANOVA р***уровень 0,1833 0,1025 0,0870 представлены Далее все зрелые ооциты подвергались оплодотворению методом ИКСИ. Морфологическую оценку ооцитов осуществлял эмбриолог во время проведения процедуры ИКСИ с помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse TE300 (общее увеличение 400х). Всего в изученных группах было получено 529 эмбрионов: 140 в группе 1а, 173 в группе 1б и 216 в группе 2. Среднее число эмбрионов было погранично выше у пациенток с морфологически нормальными ооцитами и составило 5,0±3,1, 6,2±3,2 и 7,7±4,7 в группах 1а, 1б и 2, соответственно (р=0,0530). Среднее число эмбрионов хорошего качества (эмбрионы классов А и В, суммарно) было выше у пациенток с морфологически нормальными ооцитами и составило 4,4±2,8, 5,3±2,8 и 6,8±4,1 в группах 1а, 1б и 2, 106 соответственно (р=0,0282). Среднее число эмбрионов плохого качества, к которым относились эмбрионы класса С, а также эмбрионы, прекратившие дробление, не различалось в группах сравнения, что может быть связано с небольшим объемом выборки (таблица 23). Таблица 23 Характеристика раннего эмбриогенеза в группах сравнения Параметры эмбриогенеза Группа 1а (n=28) полученных 140 Группа 1б (n=28) 173 Группа 2 (n=28) 216 р***-уровень Число эмбрионов Среднее число эмбрионов 5,0±3,1 6,2±3,2 7,7±4,7 0,0530 на 1 пациентку* Число эмбрионов 124 (88,6%) 148 (85,6%) 190 (88,0%) хорошего качества Среднее число эмбрионов 4,4±2,8 5,3±2,8 6,8±4,1 0,0282 хорошего качества на 1 пациентку* Число эмбрионов плохого 16 (11,4%) 25 (14,4%) 26 (12,0%) качества Среднее число эмбрионов 0,6±0,9 0,9±1,6 0,9±1,7 0,9583 плохого качества* *Данные представлены как средние ± стандартное отклонение; **Данные представлены как абсолютные значения и %; ***ANOVA После проведения морфологической оценки всем эмбрионам, имеющим более 5 бластомеров и менее 50% фрагментации, была проведена биопсия. В общей сложности ПГС был проведен для 368 эмбрионов (98 эмбрионов в группе 1, 126 эмбрионов в группе 2 и 144 в группе 3). Максимальное число анеуплоидных эмбрионов было получено в группе 1а - 67 (68,4%), затем в группе 1б - 49 (38,9%) и в группе 2 - 45 (31,3%) (р<0,0001). ОШгр получения эмбриона с анеуплоидией при наличии цитоплазматических дисморфизмов составило 4,7 (95% ДИ=2,7; 8,3), при наличии экстрацитоплазматических дисморфизмов 1,3 (95% ДИ=0,8; 2,3), при наличии дисморфизмов в целом 2,4 (95% ДИ=1,5; 3,7). Мы также проанализировали число эмбрионов, в которых не наблюдалось дальнейшего дробления после проведения биопсии. Число 107 эмбрионов, остановившихся в развитии, составило в группе 1а - 25 (25,5%), в группе 1б - 19 (15,1%), в группе 2 - 7 (4,9%) (р<0,0001). Для анализа факторов, способных оказать влияние на развитие анеуплоидии в эмбрионах, мы провели сравнение группы с анеуплоидными эмбрионами (группа А, n=161) и с эуплоидными эмбрионами (группа Б, n=207). Группы различались статистически значимо по возрасту пациенток, ИМТ и уровню АМГ пациенток, от которых были получены эмбрионы. Также в группе анеуплоидных эмбрионов отмечалась большая доля курящих женщин, а также женщин, перенесших хламидийную инфекцию и ИППП в анамнезе. Дозы вводимых ГТ были выше в группе анеуплоидных эмбрионов. Качество спермы не оказывало влияние на развитие анеуплоидии эмбрионов (Таблица 24). Таблица 24 Характеристики групп эуплоидных и анеуплоидных эмбрионов Группа Б Группа А (n=207) (n=161) 33,2±6,3 36,0±6,3 21,9±2,8 22,8±2,9 3,9±3,2 2,7±1,7 4 (1,9%) 17 (10,6%) 19 (9,2%) 30 (18,6%) 61 (29,5%) 76 (47,2%) 2311,6±1047,2 1978,7±869,9 Показатели р**уровень <0,0001 0,0060 0,0003 0,0004 0,0080 0,0004 0,0009 Возраст, лет* ИМТ* АМГ, нг/мл* Курение, % Хламидийная инфекция в анамнезе, % ИППП, % Суммарная доза ГТ, МЕ* Оплодотворение субфертильной 128 (79,5%) 161 (77,8%) 0,6892 спермой, % *данные представлены как средние ± стандартное отклонение; ** χ2-тест для сравнения категориальных данных t-тест для сравнения непрерывных данных; группа А – анеуплоидные эмбрионы, группа Б – эуплоидные эмбрионы На получение анеуплоидных эмбрионов из ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами по сравнению с морфологически нормальными ооцитами влияли те же факторы, за исключением хламидийной инфекции в анамнезе. На получение анеуплоидных эмбрионов из ооцитов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами по сравнению с морфологически нормальными ооцитами влияли возраст пациенток, уровень АМГ, курение и ИППП в анамнезе. В виду сильной корреляции между 108 возрастом пациенток и уровнем АМГ в модели включали только возраст пациенток как возможный конфаундер развития анеуплоидии эмбрионов. ОШкор получения анеуплоидных эмбрионов при наличии каких-либо дисморфизмов ооцитов с учетом выявленных конфаундеров (возраста, ИМТ и хламидийной инфекции в анамнезе) составило 1,7 (95% ДИ=1,05; 2,7). ОШкор получения анеуплоидных эмбрионов при наличии цитоплазматических дисморфизмов по сравнению с нормальными ооцитами с учетом выявленных конфаундеров (возраста, ИМТ и длительности стимуляции) анеуплоидных составило 3,6 эмбрионов (95% при ДИ=1,8; наличии 7,2). ОШкор получения экстрацитоплазматических дисморфизмов по сравнению с нормальными ооцитами с учетом выявленных конфаундеров (возраста пациенток) составило 1,3 (95% ДИ=0,7; 2,1). Среди ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами было 36 ооцитов с центральной гранулярностью, 4 ооцита с вакуолями, 23 ооцита с агрегатами ГЭР, 9 ооцитов с рефрактерными тельцами и 26 ооцитов с темным цветом цитоплазмы. Среди ооцитов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами было 59 ооцитов с дебрисом в перивителлиновом пространстве, 38 ооцитов имели расширенное перивителлиновое пространство и 29 ооцитов с утолщением и/или деформацией зоны пеллюцида. Число анеуплоидных эмбрионов, полученных из ооцитов с различными видами дисморфизмов, представлено в таблице 25. Максимальная доля анеуплоидных эмбрионов наблюдалась у эмбрионов, полученных из ооцитов с вакуолями (100%), темной цитоплазмой (73,1%), центральной гранулярностью (66,7%) и агрегатами ГЭР (65,2%). Учитывая малое количество наблюдений ооцитов с вакуолями, данные нельзя считать достоверными. Таким образом, максимальное число анеуплоидных эмбрионов было получено из ооцитов с агрегатами ГЭР и центральной гранулярностью, а также с темной цитоплазмой. 109 Таблица 25 Доля анеуплоидных эмбрионов, полученных из ооцитов с различными видами дисморфизмов по сравнению с морфологически нормальными ооцитами Вид дисморфизма ооцитов Ооциты с центральной гранулярностью, n=36 Ооциты с вакуолями, n=4 Ооциты с агрегатами ГЭР, n=23 Ооциты с рефрактерными тельцами, n=9 Ооциты с темной цитоплазмой, n=26 Ооциты с дебрисом в перивителлиновом пространстве, n=59 Ооциты с расширенным перивителлиновым пространством, n=38 Ооциты с утолщением ZP, n=29 Нормальные ооциты, n=144 Анеуплоидные Эуплоидные эмбрионы эмбрионы 12 (33,3%) 24 (66,7%) 0 4 (100%) 8 (34,8%) 15 (65,2%) 4 (44,4%) 5 (55,6%) 7 (26,9%) 19 (73,1%) 32 (54,2%) 27 (45,8%) 15 (39,5%) р*уровень <0,0001 0,0040 0,0016 0,1315 <0,0001 33 (60,5%) 0,0497 0,3374 7 (24,1%) 45 (31,25%) 22 (75,9%) 0,4460 99 (68,75%) референс 2 группа А – эмбрионы с анеуплоидиями, группа Б – эуплоидные эмбрионы; * χ -тест Структура хромосомных аномалий представлена в таблице 26. Наиболее частыми типами анеуплоидий являлись полисомии хромосом. Следует отметить, что распространенность всех видом полисомий была значительно выше у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов. Таблица 26 Структура хромосомных нарушений у эмбрионов Группы 1а n=98 1б n=126 2 n=144 n 4 9 8 13 % 4,1% 7,1% 5,6% n 7 7 6 13 1а n=98 1б n=126 2 n=144 n 0 0 0 % 0% 0% 0% n 1 4 0 13 1а n=98 1б n=126 2 n=144 χ2-тест, руровень n 22 9 7 % 22,4% 7,1% 4,9% 0,0008 n 23 9 7 Моносомия (%) 18 21 % n % 7,1% 5 5,1% 5,6% 7 5,6% 4,2% 4 2,8% Нуллисомия (%) 18 21 % n % 1,0% 0 0% 3,2% 1 0,8% 0% 0 0% Полисомия (%) 18 21 % n % 22 23,4% 22,4% 7,1% 15 11,9% 4,9% 15 10,4% 0,1743 0,0003 n 64 106 125 Х/Y (норма) % 65,3% 84,1% 86,8% Х/Y n 8 7 8 % 8,2% 5,6% 5,6% Х/Y n 26 13 11 % 26,5% 10,3% 7,6% 0,0003 110 В группе 2 во всех циклах ЭКО/ПГС был произведен перенос эмбрионов в полость матки. При этом в группе 1а у 14 пациенток (50%), а в группе 1б у 2 пациенток (7,1%) перенос не был произведен вследствие отсутствия эмбрионов без хромосомных аномалий (р<0,0001). Несмотря на проведение ПГС и отбор эуплоидных эмбрионов для переноса в полость матки, частота наступления беременности у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами была значительно ниже, чем у пациенток с морфологически экстрацитоплазматическими нормальными дисморфизмами ооцитами ооцитов. или Клиническая беременность была диагностирована в 3 случаях в группе 1а (10,7%), в 9 случаях в группе 1б (32,1%) и в 8 случаях в группе 2 (28,6%) (р=0,1307). При этом в расчете на цикл переноса эмбрионов частота наступления беременности была сопоставима в группах сравнения и составила 21,0% в группе 1а, 34,6% в группе 1б и 28,6% в группе 2 (р˃0,05). В группе 1б было диагностировано 5 потерь беременности (55,6% от общего числа беременностей в данной группе), в группе 2 было диагностировано 4 потери беременности (50% от общего числа беременностей в данной группе) (р=0,0732). В группе 1а все беременности пролонгировались и закончились родами. В группе 1б беременность закончилась родами у 4 пациенток, в группе 2 беременность закончилась родами у 4 пациенток. Все беременности были одноплодными, и всего родилось 11 детей, из них 6 мальчиков и 5 девочек. Все дети родились живыми, без генетической патологии и пороков развития. Средняя масса тела новорожденного в группе 1а составила 3236,2±298,4 г, средний рост 50,7±1,6 см, в группе 1б - 3238,4±278,2 г и 50,5±1,5 см, соответственно, в группе 2 - 3234,4±286,5 г и 50,4±1,4 см, соответственно. Оценка по шкале Апгар на 1-й и 5-й минуте составила в группе 1а - 7,8±0,2 и 8,6±0,4 баллов, соответственно, в группе 1б - 7,7±0,3 и 8,8±0,2 баллов, соответственно, в группе 2 - 7,8±0,2 и 8,8±0,2 баллов, соответственно. 111 4.6. Преимплантационный генетический скрининг у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов у пациенток: анализ затраты-эффективность Согласно данным Кохрановского обзора, в настоящее время нет убедительных данных, свидетельствующих об эффективности ПГС для увеличения частоты наступления беременности и живорождения. Несмотря на то, что источником анеуплоидного эмбриона с большей вероятностью является ооцит с аномальным хромосомным набором, а дисморфизмы ооцитов ассоциированы с повышенной частотой анеуплоидии клеток, все зрелые ооциты подвергаются оплодотворению, а культивирование и морфологическая оценка эмбрионов производится без связи с исходной морфологией ооцита. При анализе научных публикаций нами не было найдено данных, демонстрирующих целесообразность проведения ПГС у данной категории пациенток. В связи с этим для решения задачи 6 мы провели исследование по сравнению клинико-экономической эффективности ЭКО с последующей пренатальной генетической диагностикой и ЭКО с ПГС методом FISH для предотвращения рождения детей с анеуплоидиями у пар с различными дисморфизмами ооцитов у пациенток. Нами была создана модель принятия решений (TreeAge Pro Inc), в которой было проведено сравнение 2-х стратегий: рутинного ЭКО и ЭКО с ПГС методом FISH у бесплодных пар с дисморфизмами ооцитов у женщин для определения минимальной стоимости одного живорождения на одного пациента, проходящего вышеуказанное лечение бесплодия. В модель включались пары с наличием эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки. Допущением модели была возможность применения одного цикла ЭКО со свежими эмбрионами без криоконсервации эмбрионов. Данные самопроизвольного биохимического по вероятности выкидыша, скрининга, риска частоте наступления беременности, анеуплоидии по амниоцентеза и данным прерывания 112 беременности во 2-м триместре в группах ЭКО и ЭКО/ПГС у пар с различными видами дисморфизмами ооцитов были получены из результатов собственных наблюдений (Таблицы 27-29). Таблица 27 Вероятности исходов ЭКО и ЭКО/ПГС у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов Показатели Беременность после ЭКО Беременность после ЭКО/ПГС* С/в после ЭКО С/в после ЭКО/ПГС* Повышенный риск анеуплоидии по данным пренатального скрининга в 1 триместре в циклах ЭКО Повышенный риск анеуплоидии по данным пренатального скрининга в 1 триместре в циклах ЭКО/ПГС* Ложно-отрицательный результат скрининга (рождение ребенка с анеуплоидией при отрицательном результате скрининга) в циклах ЭКО Ложно-отрицательный результат скрининга (рождение ребенка с анеуплоидией при отрицательном результате скрининга) в циклах ЭКО/ПГС* *ПГС методом FISH; **р - вероятность р** 0,244 0,143 0,324 0,000 0,044 0,000 0,046 0,000 Таблица 28 Вероятности исходов ЭКО и ЭКО/ПГС у пациенток с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов Показатели Беременность после ЭКО Беременность после ЭКО/ПГС* С/в после ЭКО С/в после ЭКО/ПГС Повышенный риск анеуплоидии по данным пренатального скрининга в 1 триместре в циклах ЭКО Повышенный риск анеуплоидии по данным пренатального скрининга в 1 триместре в циклах ЭКО/ПГС* Ложно-отрицательный результат скрининга (рождение ребенка с анеуплоидией при отрицательном результате скрининга) в циклах ЭКО Ложно-отрицательный результат скрининга (рождение ребенка с анеуплоидией при отрицательном результате скрининга) в циклах ЭКО/ПГС* *ПГС методом FISH; **Р - вероятность р** 0,391 0,346 0,290 0,556 0,000 0,000 0,000 0,000 Понятие «дисморфизмы ооцитов» включало наличие у пациенток 100% ооцитов с патологией цитоплазмы или экстрацитоплазматическими нарушениями. К цитоплазматическим дисморфизмам относили центральную 113 гранулярность цитоплазмы, вакуоли, рефрактерные тельца, аномальные агрегаты гладкого эндоплазматического ретикулума (ГЭР) в цитоплазме клетки, а также наличие темной цитоплазмы. К экстрацитоплазматическим дисморфизмам относили расширенное перивителлиновое пространство и наличие в нем дебриса, а также наличие деформации или утолщения зоны пеллюцида. Критерием включения со стороны супруга явилось наличие фертильной или субфертильной спермы, с целью минимизации влияния отцовских анеуплоидий на хромосомный набор эмбриона. Таблица 29 Вероятности исходов ЭКО и ЭКО/ПГС у пациенток с различными дисморфизмами ооцитов (цитоплазматическими и экстрацитоплазматическими) Показатели Беременность после ЭКО Беременность после ЭКО/ПГС* С/в после ЭКО С/в после ЭКО/ПГС Повышенный риск анеуплоидии по данным пренатального скрининга в 1 триместре в циклах ЭКО Повышенный риск анеуплоидии по данным пренатального скрининга в 1 триместре в циклах ЭКО/ПГС* Ложно-отрицательный результат скрининга (рождение ребенка с анеуплоидией при отрицательном результате скрининга) в циклах ЭКО Ложно-отрицательный результат скрининга (рождение ребенка с анеуплоидией при отрицательном результате скрининга) в циклах ЭКО/ПГС* *ПГС методом FISH; **Р - вероятность р** 0,305 0,275 0,306 0,455 0,020 0,000 0,021 0,000 В анализе были учтены только прямые затраты на проведение ЭКО и ЭКО/ПГС. Под затратами понималась непосредственная стоимость медицинских услуг, а также стоимость койко-дней при проведении различных лечебных процедур в условиях стационара. Стоимость ЭКО в свежем цикле рассчитывалось как норматив финансовых затрат на 1 случай применения процедуры за счет средств обязательного медицинского страхования (ОМС) в 2014 году [151]. Стоимость всех остальных процедур рассчитывалась по прайсу ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Стоимость ПГС включала 114 стоимость биопсии бластомеров и FISH-диагностики по пяти хромосомам. Стоимость пренатального скрининга в 1-ом триместре включала стоимость ультразвукового (УЗ) исследования и исследования биохимических маркеров крови (Таблица 30). Стоимость амниоцентеза включала стоимость процедуры, а также стоимость 1 койко-дня в дневном стационаре, определение кариотипа по амниотической жидкости, консультацию врачагенетика и УЗ-контроль при проведении амниоцентеза. Прерывание беременности в 1 триместре гестации состояло из хирургического аборта и пребывания в стационаре в течение 2-х койко-дней. Прерывание беременности во 2 триместре включало 5 койко-дней в стационаре и гистологическое исследование тканей плода. Устойчивость созданной модели была проверена путем анализа чувствительности с учетом размаха вероятностей и стоимости процедур от средних показателей (Таблицы 27-30). Таблица 30 Стоимость различных медицинских услуг при оказании медицинской помощи по лечению бесплодия методом вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) Наименование Число пациенто-дней медицинской или койко-дней/ процедуры стоимость (руб.) ЭКО ПГС методом FISH Пренатальный скрининг в 1 триместре беременности Амниоцентез и 1 койко-день/2 200 пренатальный рублей генетический скрининг Хирургический аборт в 2 койко-дня/6 600 1-м триместре рублей беременности Прерывание 5 койко-дней/17 500 беременности во 2 рублей триместре *цены в рублях 2014 г. Стоимость Стоимость процедуры анестезии (руб.) (руб.) 113 109 75 800 6 400 - Общая стоимость (руб.) 113 109 75 800 6 400 19 500 - 19 500 13 100 5 400 18 500 35 500 5 400 40 900 115 4.7. Клинико-экономический анализ эффективности ПГС для пар с дисморфизмами ооцитов у пациенток Для пар с дисморфизмами ооцитов (как цитоплазматическими, так и экстрацитоплазматическими) вероятность иметь здорового ребенка при применении одного цикла ЭКО составила 20% по сравнению с 16% для пар при применении одного цикла ЭКО/ПГС (Рисунок 19). ■ – точка принятия решения; ● - точка вероятности; ◄- конечная точка Рисунок 19. Дерево решений для модели эффективности ЭКО по сравнению с ЭКО/ПГС у пар с цитоплазматическими и экстрацитоплазматическими дисморфизмами у женщин. Учитывался один цикл ЭКО со свежими эмбрионами по сравнению с одним циклом ЭКО/ПГС методом FISH. Вероятность родить ребенка с анеуплоидией составила 0,8% в циклах ЭКО и 0% в циклах ЭКО/ПГС. Средняя стоимость лечения методом ЭКО для пациенток с дисморфизмами ооцитов составила 116 446 руб. по сравнению со 192 480 руб. при лечении методом ЭКО/ПГС. Средняя стоимость лечения методом ЭКО для рождения одного здорового ребенка составила 573 625 руб., при лечении методом ЭКО/ПГС – 1 173 658 руб. (Таблица 31). В этой 116 группе пациентов стоимость лечения бесплодия методом ЭКО или ЭКО/ПГС в расчете на рождение одного здорового ребенка отличалась на 51%. Мы провели аналогичный анализ для пар с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов. Вероятность иметь здорового ребенка при применении одного цикла ЭКО составила 15% по сравнению с 21% для пар при применении одного цикла ЭКО/ПГС, а вероятность родить ребенка с анеуплоидией составила 1,4% в циклах ЭКО и 0% в циклах ЭКО/ПГС (Рисунок 20). ■ – точка принятия решения; ● - точка вероятности; ◄- конечная точка Рисунок 20. Дерево решений для модели эффективности ЭКО по сравнению с ЭКО/ПГС у пар с цитоплазматическими дисморфизмами у женщин. Учитывался один цикл ЭКО со свежими эмбрионами по сравнению с одним циклом ЭКО/ПГС методом FISH. Средняя стоимость лечения методом ЭКО для пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов составила 116 065 руб. по сравнению со 190 278 руб. при лечении методом ЭКО/ПГС. При этом средняя стоимость лечения методом ЭКО для рождения одного здорового 117 ребенка составила 733 766 руб., при лечении методом ЭКО/ПГС – 889 149 руб. В этой группе пациентов стоимость лечения бесплодия методом ЭКО или ЭКО/ПГС в расчете на рождение одного здорового ребенка отличалась на 13% (Таблица 31). Для пар с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов вероятность иметь здорового ребенка при применении одного цикла ЭКО составила 28% по сравнению с 15% для пар при применении одного цикла ЭКО/ПГС, а вероятность родить ребенка с анеуплоидией составила 0% в циклах ЭКО и 0% в циклах ЭКО/ПГС (Рисунок 21). ■ – точка принятия решения; ● - точка вероятности; ◄- конечная точка Рисунок 21. Дерево решений для модели эффективности ЭКО по сравнению с ЭКО/ПГС у пар с экстрацитоплазматическими дисморфизмами у женщин. Учитывался один цикл ЭКО со свежими эмбрионами по сравнению с одним циклом ЭКО/ПГС методом FISH. Средняя стоимость лечения методом ЭКО для пар с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов составила при этом 116 983 руб. по сравнению со 193 451 руб. при лечении методом ЭКО/ПГС. 118 При этом средняя стоимость лечения методом ЭКО в расчете на одного здорового ребенка составила 420’802 руб., при лечении методом ЭКО/ПГС – 1 256 175 руб. В этой группе пациентов стоимость лечения бесплодия методом ЭКО или ЭКО/ПГС в расчете на рождение одного здорового ребенка отличалась на 66,5% (Таблица 31). Таблица 31 Основные результаты лечения бесплодия методом ЭКО при применении одного цикла со свежими эмбрионами и одного цикла с размороженными эмбрионами Исходы ЭКО У пар со всеми видами дисморфизмов ооцитов Вероятность рождения здорового ребенка 0,203 Стоимость лечения (руб.) 116 446 Стоимость лечения/вероятность рождения здорового 573 625 ребенка (руб.) У пар с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов Вероятность рождения здорового ребенка 0,150 Стоимость лечения (руб.) 116 065 Стоимость лечения/вероятность рождения здорового 773 766 ребенка (руб.) У пар с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов Вероятность рождения здорового ребенка 0,278 Стоимость лечения (руб.) 116 983 Стоимость лечения/вероятность рождения здорового 420 802 ребенка (руб.) *ПГС методом FISH Мы провели анализ чувствительности ЭКО/ПГС* 0,164 192 480 1 173 658 0,214 190 278 889 149 0,154 193 451 1 256 175 для модели с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, как наиболее устойчивой модели. Данная модель была чувствительна к изменению вероятности наступления беременности и рождения эуплоидного ребенка при применении ЭКО/ПГС и стоимости ЭКО/ПГС (Таблица 32). Таблица 32 Односторонний анализ чувствительности лечения бесплодия методом ЭКО и ЭКО/ПГС методом FISH у пар с цитоплазматическими дисморфизмами у женщин с указанием вероятностей величин, при которых обе стратегии были одинаково эффективны Переменная в модели Беременность при ЭКО/ПГС Стоимость ЭКО/ПГС Исходная вероятность 0,214 188’909 руб. Гипотетическая вероятность 0,261 126’238 руб. 119 ЭКО/ПГС стала бы доминирующей стратегией, если бы вероятность наступления беременности возросла до 26,1% по сравнению с исходной вероятностью 21,4%, а стоимость ее снизилась до 126 238 руб. по сравнению с исходными 188 909 руб. (Рисунок 22). Порогом отсечки является частота наступления беременности в циклах ЭКО/ПГС 26,1% и стоимость ЭКО/ПГС 126’238 руб. а Рисунок 22. Односторонний анализ чувствительности лечения бесплодия в циклах ЭКО и ЭКО/ПГС методом FISH у пациентов с наличием цитоплазматических дисморфизмов ооцитов у женщин в зависимости от частоты наступления беременности в циклах ЭКО/ПГС (а) и стоимости ЭКО/ПГС (б). 120 Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Бесплодие в браке является важной медико-социальной проблемой во всем мире, а распространенность бесплодия неуклонно увеличивается. Изменения в репродуктивном поведении как мужчин, так и женщин, отнесение деторождения на старший репродуктивный возраст, приводит к увеличению потребности в применении методов ВРТ. В свою очередь результативность программ ЭКО, а именно вероятность рождения живого здорового ребенка, определяется, в первую очередь, качеством эмбриона. На протяжении последнего десятилетия в клиническую практику были внедрены методики, позволяющие проводить культивирование эмбрионов до стадии бластоцисты с возможностью последующей различных витрификации. методов Также генетического преимплантационной стадии. стало возможным исследования Следует применение эмбрионов отметить на появление высокотехнологичных операций с использованием микрохирургической техники в андрологии, бесперспективных позволяющие пациентов с получить азооспермией. потомство Тем не у ранее менее, все вышеперечисленные достижения в области репродуктивной медицины не способны влиять на исходное качество как сперматозоидов, так и ооцитов. При этом, несмотря на то, что ооцит определяет не только половину генома будущего эмбриона, а, значит, вероятность рождения ребенка без генетической патологии, но и потенциал развития эмбриона на ранних этапах дробления, проблема оценки качества ооцитов изучена недостаточно. Наиболее достоверным критерием качества ооцита является его способность к оплодотворению и формированию эмбриона, способного к имплантации, наступлению беременности и рождению здорового ребенка. Оценка молекулярных, клеточных и генетических характеристик ооцитов человека затруднена, и морфологическая оценка является наиболее простым 121 и доступным методом. Тем не менее, в клинической практике морфологии ооцита уделяется значительно меньше внимания, чем выбору сперматозоида для проведения процедуры ИКСИ или селекции эмбриона для переноса в полость матки. В основном морфологическая оценка ооцита сводится к определению степени зрелости путем визуализации первого полярного тельца клетки. В ряде научных исследований, проведенных в начале 2000-х годов, было отмечено, что аномалии морфологии ооцитов человека встречаются более чем в половине циклов ВРТ, и при их наличии вероятность наступления беременности значительно снижается [122], [127], [140]. В качестве вероятных причин развития данных осложнений рассматриваются генетические или метаболические нарушения в ооцитах с дисморфизмами. При этом данных, доказывающих патогенез подобных нарушений, а также исследований по выявлению факторов риска и выработке мер по их коррекции недостаточно. В связи с этим, нами было проведено трехэтапное исследование, основной целью которого было повышение эффективность программ ВРТ у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов у женщин на основании морфологической оценка ооцитов, определения числа копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах, а также проведения клинико-экономического анализа применения ПГС у данной категории пациенток. Цель исследования основывалась на гипотезе о том, что у пар с дисморфизмами ооцитов у женщин повышена частота метаболических и генетических нарушений в ооцитах, что влияет как на хромосомный набор эмбриона, так и его метаболическую компетентность. Так как дробление эмбриона является энергозависимым процессом, а энергетический потенциал эмбриона определяется исключительно возможностями митохондрий ооцита, второй гипотезой исследования было то, что ооциты с дисморфизмами имеют снижение числа митохондрий. Пары с повышенным риском рождения детей с хромосомной патологией нуждаются в проведении генетического 122 скрининга, поэтому третьей гипотезой исследования было то, что проведение ПГС у пар с дисморфизмами ооцитов у женщин повышает эффективность циклов ЭКО и снижает риск генетических заболеваний у потомства. На первом этапе нашего исследования у супружеских пар с различными дисморфизмами ооцитов у женщин мы провели проспективное исследование случай-контроль для выявления возможных факторов риска развития дисморфизмов ооцитов у пациенток программ ЭКО. Также нами была проведена оценка эмбриологических и клинических исходов ЭКО у данной категории пациенток в зависимости от различных дисморфизмов ооцитов. Так как цитоплазматические и экстрацитоплазматические дисморфизмы определенно имеют различные механизмы формирования, было решено рассматривать их как отдельные формы патологии. Поэтому в зависимости от морфологической оценки ооцитов были выделены группы с цитоплазматическими и экстрацитоплазматическими дисморфизмами. Группу сравнения составили пары с морфологически нормальными ооцитами. Для выявления возможных факторов риска дисморфизмов ооцитов нами был проведен однофакторный, а затем многофакторный анализ для оценки валидности созданной модели. На развитие цитоплазматических дисморфизмов ооцитов по данным однофакторного анализа оказывали влияние возраст пациенток, ИМТ, уровень АМГ и Т4. При проведении многофакторного анализа значимое влияние имели лишь возраст пациенток и уровень Т4. Согласно полученным данным, у женщин 38 лет и старше с уровнем Т4 менее 13 пмоль/л в 5,6 раз чаще получают ооциты с дисморфизмами цитоплазмы. Следует отметить высокую точность созданной модели, так как площадь под ROC-кривой составила 71,5%. На развитие экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов по данным однофакторного анализа влияли возраст пациентки, уровень АМГ и применение а-ГнРГ для десенситизации гипоталамо-гипофизарно- яичниковой системы или в качестве триггера овуляции. При проведении 123 многофакторного анализа существенную роль играли только уровень АМГ и применение а-ГнРГ. Согласно полученным данным, у женщин с уровнем АМГ менее 2,2 нг/мл и при применении а-ГнРГ в циклах ВРТ в 2,2 чаще получают ооциты с экстрацитоплазматическими дисморфизмами. Площадь под ROC-кривой составила 61,8%. Полученные результаты не согласуются с некоторыми исследованиями, в которых не было выявлено корреляции между возрастом пациенток, их гормональным профилем, и появлением дисморфизмов [1], [152], [153]. При этом в большинстве исследований, приведенных ниже, были получены данные, подтверждающие наши наблюдения. Возраст является известным фактором риска неудач ЭКО, что связано, прежде всего, с анеуплоидиями гамет и полученных эмбрионов [154]. Существуют данные о том, что ооциты с хромосомными аномалиями часто имеют те или иные цитоплазматические дисморфизмы [155]. Наши данные согласуются с данными, полученными в исследовании Fancsovits et al. (2012), в котором более старший возраст пациенток коррелировал с появлением в цитоплазме ооцитов различных аномалий [124]. Избыточная масса тела является одной из причин нарушений менструальной функции и снижения фертильности, что может быть связано с явлением окислительного стресса в различных клетках, в том числе ооцитах [24]. ИМТ пациенток влияет на эффективность программ ВРТ, а также коррелирует с вариабельностью ответа на гормональную стимуляцию и качеством эмбрионов. Были получены данные о снижении уровня АМГ у женщин с ожирением [156]. Наши данные согласуются с исследованием Setti A. et al. (2012), в котором ИМТ коррелировал с количеством полученных ооцитов, но не с наличием дисморфизмов [118]. Хотя в нашем исследовании женщин с избыточной массой тела (ИМТ>25) было больше всего в группе с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, данный фактор не показал статистической значимости при проведении многофакторного анализа. 124 АМГ продуцируется гранулезными клетками яичников и является доказанным количественным маркёром овариального резерва. Снижение уровня АМГ у женщин репродуктивного возраста менее 1,0 нг/мл сопряжено с истощением фолликулярного пула и имеет плохое прогностическое значение для стимуляции овуляции и исходов ВРТ. В нашем исследовании уровень АМГ был значимо ниже у пациенток с дисморфизмами, особенно с экстрацитоплазматическими нарушениями в ооцитах. В исследовании Ebner et al. (2006) проводилось изучение влияния лабораторных характеристик на морфологию ооцитов, а также на последующее развитие эмбрионов [152]. Была выявлена сильная связь между уровнем АМГ и наличием цитоплазматических дисморфизмов в клетке, при этом уровни других половых гормонов существенно не различались между группами. В нашем исследовании уровень АМГ оказывал более сильное влияние на риск экстрацитоплазматических дисморфизмов, чем возраст женщины. Возможно, это связано с дисфункцией клеток гранулезы, которое на ранних стадиях не приводит к клинически значимому снижению овариального резерва, но нарушает формирование экстрацитоплазматических структур ооцитов. Гипотиреоз является распространенным заболеванием у женщин репродуктивного возраста, и проявляется повышением уровня ТТГ и последующим снижением функций щитовидной железы. Данное заболевание негативно влияет на репродуктивную функцию женщины и сопряжено с высокой частотой различных осложнений гестационного периода. При анализе научных публикаций нами не было выявлено данных о влиянии гипотиреоза на морфологию ооцитов в циклах ВРТ. В нашем исследовании уровень ТТГ не различался значимо в группах пациенток, однако была выявлена значимая разница в уровне Т4, который был выше у пациенток контрольной группы. При этом порог уровня Т4, ниже которого вероятность получения ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами была максимально высокой, составил 13 пмоль/л. Возможно, незначительное повышение гормонов щитовидной железы является в нашей выборке более 125 чувствительным признаком формирования цитопплазматических дисморфизмов. Влияние различных протоколов стимуляции на морфологию ооцитов было проанализировано в исследовании Cota et al. (2012) [119]. Авторы не обнаружили сколь-нибудь значимого влияния данного фактора на оогенез. При этом следует отметить, что в исследовании доля протоколов с а-ГнРГ была значительно больше, чем в нашем исследовании, а объем выборки в целом был меньше. Также нами не было найдено данных, свидетельствующих о негативном влиянии дозы вводимых гонадотропинов или длительности стимуляции на морфологию ооцитов. По данным литературы, замена триггера с препаратом ХГ на а-ГнРГ при риске развития синдрома гиперстимуляции яичников также не влияет на качество полученных ооцитов [157], [158]. Тем не менее, в нашем исследовании применение а-ГнРГ играло значительную экстрацитоплазматических дисморфизмов стимуляции существенно суперовуляции роль в ооцитов. не развитии Длительность различалась в группах сравнения, также, как и частота использования различных препаратов гонадотропинов, что согласуется с данными литературы. Но при этом пациентки с дисморфизмами ооцитов получили более высокую суммарную доза назначаемых препаратов гонадотропинов по сравнению с группой контроля. В протоколах стимуляции а-ГнРГ используются для десенситизации гипоталамо-гипофизарной системы и предотвращения промежуточных пиков ЛГ. Тем не менее, применение данной группы препаратов сопровождается начальным периодом стимуляции и повышением синтеза эндогенных гонадотропинов и стероидных гормонов. Вероятно, изменения концентрации эстрогенов в периферической крови, происходящие в периоде селекции примордиальных фолликулов экстрацитоплазматических (то структур есть в ооцита), периоде формирования вызывают нарушения пролиферации и секреции клеток гранулезы, что приводит к появлению 126 морфологических аномалий ооцитов. Возможно, подобный механизм реализуется при назначении а-ГнРГ в качестве триггера овуляции для созревания ооцитов, так как изменение пика ЛГ способствует появлению аномалий строения первого полярного тельца. После морфологической оценки полученных в ходе проведения исследования ооцитов мы сравнили эмбриологические характеристики (частоту нормального оплодотворения, морфологию полученных эмбрионов) и клинические исходы в группах сравнения. По полученным данным, ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имели значительно более низкую частоту оплодотворения и худшее качество полученных эмбрионов. Также в данной группе было больше всего эмбрионов, прекративших дробление на ранних этапах культивирования. Полученные данные согласуются с результатами других исследований, согласно которым наличие различных цитоплазматических дисморфизмов отрицательно коррелирует с частотой оплодотворения и качеством полученных эмбрионов [1], [3], [129]. Цитоплазматические дисморфизмы ооцитов являются косвенными признаками цитоплазматической незрелости клетки, то есть асинхронизации созревания ядра и подготовки органелл клетки к оплодотворению. Низкая частота оплодотворения ооцитов с цитоплазматическими аномалиями может быть связана как с механическим смещением веретена деления и нарушением архитектоники цитоскелета, так и со структурными нарушениями органелл, приводящими к метаболическим нарушениям в клетке. На ранних этапах эмбриогенеза, когда собственный геном эмбриона не подвергается репликации, дробление происходит за счет накопленных в процессе оогенеза протеинов аккумулируются в ооците [159]. и питательных веществ, которые Мы предполагаем, что ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имеют нарушенный потенциал к формированию полноценного эмбриона за счет метаболических нарушений на молекулярном уровне, которые невозможно диагностировать с помощью световой микроскопии. 127 Ооциты с экстрацитоплазматическими дисморфизмами имели несколько меньшую частоту оплодотворения (87,4%) по сравнению с морфологически нормальными ооцитами (88,4%). Тем не менее, в данной группе по сравнению с контрольной был ниже процент эмбрионов класса А (52,6% и 65,7%, соответственно) и выше процент эмбрионов класса С (11,5% и 5,2%, соответственно). Относительно влияния экстрацитоплазматических дисморфизмов на частоту оплодотворения и качество эмбрионов в литературе нет единого мнения. Наши данные не согласуются с исследованиями Lasiene et al. (2009) и Ubaldi et al. (2008), в которых частота оплодотворения ооцитов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами была значительно ниже, чем в группе контроля [139], [161]. В исследовании Chamayou et al. (2006) при оплодотворении ооцитов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами были получены эмбрионы более низкого качества, чем в контрольной группе. При этом частота наступления беременности в обеих группа существенно не различалась [138]. Большинство исследователей экстрацитоплазматические придерживаются аномалии строения мнения, являются что только фенотипическими особенностями клеток, не нарушая их потенциал к оплодотворению и дальнейшему развитию [159]. Частота наступления как биохимической, так и клинической беременности в нашем исследовании была существенно ниже у пациенток с дисморфизмами ооцитов. С помощью метода логистической регрессии с учетом выявленных конфаундеров нами было рассчитано скорректированное отношение шансов наступления беременности, которое составило 3,69 (95% ДИ: 2,12; 6,14) для цитоплазматических дисморфизмов и 1,42 (95% ДИ: 1,07; 1,89) для экстрацитоплазматических дисморфизмов. Полученные данные свидетельствуют о том, что у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов шансы наступления беременности в 3,7 раза ниже, чем у пациенток с морфологически нормальными ооцитами, что является статистически значимым. Обращала на себя внимание более высокая, хотя 128 статистически не значимая, распространенность потерь беременности в I триместре у пациенток с дисморфизмами ооцитов. Также одна беременность в этой группе была прервана по причине наличия анеуплоидии у плода. В результате выше описанных данных частота живорождений была существенно ниже у женщин с дисморфизмами ооцитов, в первую очередь с цитоплазматическими дисморфизмами, и составила 15,8% в группе 1а, 27,8% в группе 1б и 43,9% в группе 2. Несмотря на проведение пренатального скрининга, в группе пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов был рожден один ребенок с анеуплоидией. Таким образом, в ходе проведенного анализа было выявлено, что ооциты с дисморфизмами могут быть причиной формирования эмбрионов низкого качества. Причиной низкой частоты оплодотворения и нарушений ранних этапов дробления эмбриона могут быть нарушения функции органелл ооцитов. Одной из наиболее вероятных причин негативных исходов циклов ЭКО у пациенток с дисморфизмами ооцитов является наличие хромосомных аномалий в клетках с дисморфизмами. На втором этапе нашего исследования мы проанализировали число копий мтДНК в неоплодотворившихся ооцитах человека, имеющих различные морфологические особенности. В нашем исследовании распределение числа копий мтДНК было несколько выше, чем в проведенных ранее, тем не менее во всех подобных работах отмечается крайне широкий диапазон между минимальными и максимальными значениями [101], [115], [161]. По результатам нашего исследования, число копий мтДНК существенно различалось не только между ооцитами различных пациенток, имеющих особенности анамнеза и протокола стимуляции суперовуляции, но и между ооцитами одной когорты, что согласуется с данными проведенных ранее работ [9]. Тем не менее, в нашем исследовании были получены данные о том, что в некоторых ооцитах число копий мтДНК превышает 5х106 степени, хотя в большинстве исследований содержание мтДНК в клетке не превышает 3х106-4х106. Мы можем 129 предложить несколько объяснений широкому диапазону полученных значений. Во-первых, это может быть связано с генетической гетерогенностью исследуемой популяции. Нельзя не отметить, что мы исследовали ооциты декретированной группы пациенток, а именно пациенток с бесплодием, проходящих лечение методом ВРТ. С этической точки зрения исследовать ооциты здоровых фертильных женщин является неприемлемым. Кроме того, исследованию подвергались ооциты, которые не смогли завершить нормальное оплодотворение. Мы можем подозревать что оплодотворение не произошло вследствие низкой фертильности спермы, однако достоверная причина отсутствия оплодотворения в клетке остается неизвестной. Мы не можем достоверно утверждать, является ли увеличение мтДНК в ооцитах приспособительной реакцией клетки, вариантом нормы или проявлением патологических процессов в клетке. Возможно, различное число мтДНК в ооцитах одной когорты является следствием неравномерного расхождения митохондрий между клетками в процессе митотического деления на стадии образования оогоний. Созревание ооцита in vivo является результатом длительной и тщательной селекции. Стимуляция функции яичников подавляет натуральную селекцию и приводит к созреванию большой группы ооцитов, которые потенциально содержат различное число митохондрий, а часть из них в естественных условиях должна была подвергнуться апоптозу. Необходимо также учесть, что число копий мтДНК в клетке достаточно достоверно отражает количество органелл в клетке, но не их функциональные возможности. Мы предполагаем, что активная репликация мтДНК в созревающем ооците могла быть реакцией на снижение функции имеющихся митохондрий. Изучались ооциты, полученные в результате стимуляции функции яичников, при этом в литературе имеются данные, что явления окислительного стресса могут быть следствием экзогенной стимуляции яичников гонадотропинами [162]. 130 Наконец, по этическим соображениям для исследования отбирались исключительно клетки, не имеющие перспектив для дальнейшего культивирования, а именно не имеющие пронуклеусов, и не начавшие дробление через 40 часов после ИКСИ. Поэтому мы не можем быть уверены, что в процессе культивирования не происходит репликации мтДНК. По нашим данным нарушение морфологии ооцитов связано со снижением числа митохондрий в клетке. При этом наименьшее число копий мтДНК наблюдалось у ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами по сравнению с морфологически нормальными ооцитами или ооцитами с экстрацитоплазматическими дисморфизмами. Снижение числа копий мтДНК по сравнению с морфологически нормальными клетками наблюдалось в ооцитах с агрегатами ГЭР, центральной гранулярностью и вакуолями. Минимальное число копий мтДНК определялось в ооцитах с аномальными агрегатами ГЭР. По данным Nottola et al. (2007), в ооцитах с аномальными агрегатами ГЭР могут визуализироваться морфологически аномальные митохондрии подковообразной или кольцевидной формы [163]. Точный механизм образования аномальных агрегатов ГЭР неизвестен. Наиболее вероятной гипотезой является нарушение структуры цитоскелета, который играет важную роль в реорганизации ГЭР в процессе созревания ооцита. Снижение числа, и, как следствие, функции митохондрий может быть одной из причин негативных исходов ЭКО у пациенток с агрегатами ГЭР [3], [131]. Наличие центральной гранулярности цитоплазмы ооцита негативно влияет на исходы программ ВРТ, что связано с высоким уровнем анеуплоидии в клетках с данным дисморфизмом [122], [114]. Тем не менее, не исключено наличие метаболических изменений в ооцитах с центральной гранулярностью цитоплазмы, которые могут оказывать как прямое негативное влияние на развитие эмбриона, так и вызывать нарушения формирования веретена деления, что может быть одной из причин формирования анеуплоидии во время второго мейотического деления. 131 Потенциал развития ооцитов с вакуолями в цитоплазме зависит от количества и размеров вакуолей. Ооциты с крупными вакуолями имеют значительно более низкую частоту оплодотворения [127]. Одним из возможных механизмов негативного влияния вакуолей в ооцитах на ранние этапы эмбриогенеза, помимо механического смещения веретена деления и нарушения архитектоники цитоскелета, может быть нарушение функции митохондрий. По полученным нами данным, ооциты с центральной гранулярностью цитоплазмы и ооциты с вакуолями характеризовались примерно сходным числом копий мтДНК, более высоким, чем у ооцитов с агрегатами ГЭР, но значительно более низким, чем у морфологически нормальных ооцитов. Число копий дисморфизмами мтДНК было в ооцитах значительно с экстрацитоплазматическими выше, чем в ооцитах с цитоплазматическими аномалиями, и не отличалось от морфологически нормальных клеток. Между различными типами экстрацитоплазматических дисморфизмов также не было выявлено существенных различий в распределении числа копий мтДНК. Полученные нами данные свидетельствуют об отсутствии снижения количества митохондрий в ооцитах с экстрацитоплазматическими аномалиями. Мы также провели анализ факторов, способных влиять на число копий мтДНК в исследуемых клетках. мтДНК сперматозоида не оказывает существенного влияния на содержание мтДНК в ооцитах, потому что подвергается деградации после оплодотворения. Кроме того, число мтДНК в одном сперматозоиде является незначительным и составляет около 100 копий [108], [113]. Для предотвращения попадания клеток кумулюса в исследуемый препарат мы отбирали неоплодотворившиеся ооциты после механического и энзимного очищения, а также осуществляли визуальный контроль в процессе отмывания ооцита перед переносом в стерильную пробирку. 132 Клинические характеристики пациенток, такие как возраст и масса тела, могут оказывать потенциальное влияние на число копий мтДНК в ооцитах вследствие явлений окислительного стресса у пациенток с избыточной массой тела и ожирением [162], а также накоплением мутаций мтДНК или снижением способности к репликации мтДНК в ооцитах женщин старшего репродуктивного возраста [99]. Однако в нашем исследовании число копий мтДНК ооцитов не коррелировало с возрастом и ИМТ донировавших их пациенток. Ятрогенные факторы также не оказывали влияние на число митохондрий в неоплодотворившихся ооцитах. При этом нами не было найдено публикаций, анализирующих корреляцию между особенностями протоколов стимуляции и числом копий мтДНК в ооцитах человека, а влияние стимуляции функции яичников на явления окислительного стресса в ооцитах является спорным [164]. Таким образом, в ходе проведенного анализа было выявлено, что ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имеют более низкое число копий мтДНК по сравнению с морфологически нормальными ооцитами и ооцитами в экстрацитоплазматическими аномалиями. Снижение числа копий мтДНК в ооцитах уменьшает функциональные возможности не только самой клетки, но и эмбриона на ранних этапах развития. Эмбрионы, полученные при оплодотворении ооцитов с низким числом копий мтДНК, могут иметь низкий потенциал для продукции энергии на том этапе, когда происходит активное дробление, а собственные митохондрии эмбриона еще не синтезируется. Также нарушение функции митохондрий может приводить к дефектам формирования веретена деления, что повышает вероятность возникновения анеуплоидии в процессе мейотического деления. Таким образом, снижение количества, и, как следствие, нарушение функции митохондрий в ооцитах с цитоплазматическими дисморфизмами может быть одной из причин негативных исходов ЭКО у данной категории пациенток. На третьем этапе нашего исследования у супружеских пар с различными дисморфизмами ооцитов у женщин был оценен риск выявления 133 различных типов анеуплоидии хромосом 13, 18, 21, X и Y в ядрах бластомеров и проведен анализ результатов программ ВРТ в зависимости от наличия и вида дисморфизмов. Для оценки влияния дисморфизмов ооцитов на риск получения анеуплоидных эмбрионов мы провели сравнение групп пациенток с различными дисморфизмами, а также группы пациенток с морфологически нормальными ооцитами, прошедших ПГС. В группе пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов был выявлен статистически значимый более высокий уровень анеуплоидии в эмбрионах (68,4%) по сравнению с группой экстрацитоплазматических дисморфизмов (38,9%) и группой морфологически нормальных ооцитов (31,3%) (р<0,0001). Затем с помощью метода конфаундеров логистической было рассчитано регрессии с учетом скорректированное ОШ выявленных получения анеуплоидных эмбрионов в зависимости от наличия и вида дисморфизма ооцитов, которое составило 3,6 (95% ДИ=1,8; 7,2) для цитоплазматических дисморфизмов и 1,3 (95% ДИ=0,7; 2,1) для экстрацитоплазматических дисморфизмов. Полученные данные свидетельствуют о том, что шансы развития анеуплоидии эмбрионов у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов в 3,6 раза выше по сравнению с пациентками, имеющими морфологически нормальные ооциты. Помимо морфологии ооцита, на риск возникновения анеуплоидного эмбриона при проведении однофакторного анализа влияли возраст пациентки, ИМТ, уровень АМГ, курение в анамнезе, наличие хламидийной инфекции и ИППП в анамнезе, а также суммарная доза гонадотропинов в изучаемом цикле ЭКО. При применении многофакторного анализа влияние имели только возраст, ИМТ, уровень АМГ, хламидийная инфекция в анамнезе и суммарная доза гонадотропинов. Поскольку в нашей выборке уровень АМГ и суммарная доза гонадотропинов находились в сильной корреляции с возрастом пациентки, мы не включали данные факторы в регрессионную модель. 134 Высокая доля анеуплоидии в ооцитах женщин старшего репродуктивного возраста является общепризнанным фактом и обусловлен, вероятнее всего, длительным временным промежутком между блоком первого мейотического деления и овуляторным циклом [165], [37], [38]. Избыточная масса тела и ожирение являются причинами снижения фертильности пациенток, однако в литературе нет единого мнения о возможном влиянии ожирения на частоту анеуплоидии в ооцитах. Существует гипотеза, что нарушение функции митохондрий в ооцитах пациенток с ожирением может приводить к нарушению формирования веретена деления, повышая частоту возникновения ошибок мейоза [24]. Пациентки с ожирением имеют не только более низкую частоту наступления беременности, но и более высокий процент ранних репродуктивных потерь [166], тем не менее роль анеуплоидии в возникновении данных осложнений не доказана [167]. При анализе научных публикацией нами не было найдено данных о влиянии хламидийной инфекции и ИППП на возникновение анеуплоидии в ооцитах. Возможно, развитие функциональных и органических изменений в ткани яичника на фоне иммунопатологических реакций, развивающихся на фоне хронического воспаления, способствует возникновению ошибок мейоза. Качество спермы в нашем исследовании не влияло на риск возникновения анеуплоидного эмбриона, что может свидетельствовать об отсутствии влияния отцовских анеуплоидий на хромосомный набор эмбриона. Следует отметить, что наиболее распространенным типом анеуплоидии в нашем исследовании были полисомии хромосом, а распространенность всех видов полисомий была значительно выше у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов. При этом максимальное число анеуплоидных эмбрионов было получено из ооцитов с агрегатами ГЭР и центральной гранулярностью, а также с темной цитоплазмой. Данный 135 феномен возможно объяснить двумя гипотезами. Во-первых, формирование веретена деления в течение созревания ооцита является энергозависимым процессом и требует нормальной функции митохондрий и запаса энергетических субстратов [168]. Как обсуждалось ранее, ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имеют дефицит митохондрий, что может приводить к недостаточной концентрации АТФ в клетке, дефектам формирования веретена деления, и, как следствие, возникновению ошибок мейотического деления. Нарушение формирование веретена деления может сопровождаться феноменом анафазной задержки, который приводит к появлению ооцитов с диплоидным хромосомным набором. Во-вторых, в ооцитах с патологией цитоплазмы может быть нарушена белковосинтетическая функция при вовлечении в патологический процесс гладкого эндоплазматического ретикулума. В свою очередь, повреждения когезионного комплекса могут приводить к потере связи между сестринскими хроматидами и преждевременного расхождению хроматид [169]. Таким образом, пациентки с морфологическими аномалиями ооцитов, в первую очередь с цитоплазматическими дисморфизмами, представляют группу риска по выявлению различных анеуплоидий у эмбрионов в программах ВРТ. Поэтому данной категории пациенток необходимо рекомендовать дополнительное медико-генетическое консультирование с целью решения вопроса о целесообразности проведения молекулярноцитогенетического анализа эмбрионов. Несмотря на проведение ПГС и селекцию эуплоидных эмбрионов, частота наступления беременности различалась в группах сравнения. Частота наступления клинической беременности составила 10,7% в группе пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами, 32,1% в группе пациенток с экстрацитоплазматическими дисморфизмами и 28,6% в группе пациенток с морфологически нормальными ооцитами. 136 Обращала на себя внимание более низкая частота наступления беременности при применении ЭКО и ПГС, по сравнению с ЭКО, у пациенток с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов и у пациенток с морфологически нормальными ооцитами, что может быть обусловлено несколькими факторами. Во-первых, изучение дробящихся эмбрионов не позволяет исключить мозаичность бластомеров эмбрионов, а также потенциальную способность дробящегося эмбриона к самокоррекции [82], [84]. При этом существует риск как переноса в полость матки анеуплоидного эмбриона, так и прекращения культивирования и не переноса эмбриона с нормальным хромосомным набором. Во-вторых, при применении ПГС методом FISH нельзя исключить наличие анеуплоидии хромосом, не подвергнутых анализу, и переноса в полость матки анеуплоидного эмбриона. Что касается низкой частоты наступления беременности у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами, прошедших ПГС, наиболее вероятным механизмом является наличие метаболических нарушений в ооцитах, что обсуждалось ранее. Несмотря на достаточную клиническую обоснованность проведения ПГС в группах пациенток высокого риска возникновения анеуплоидии у потомства, данная процедура является дорогостоящей, что затрудняет ее внедрение в качества рутинного метода. Для оценки клинико-экономической обоснованности внедрения ПГС методом FISH в клиническую практику нами был проведен клинико-экономический анализ эффективности ПГС в исходах программ ВРТ у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов. Наше исследование является первым исследованием, в котором была применена аналитическая модель принятия решений по выбору более клиникоэкономически выгодной стратегии - ЭКО или ЭКО/ПГС - для диагностики анеуплоидии и рождения здорового потомства у бесплодных пар с дисморфизмами ооцитов у женщин. Анализ показал, что эффективность лечения бесплодия методом ЭКО/ПГС методом FISH не была выше по сравнению с ЭКО в плане 137 рождения здорового потомства у пациенток с экстрацитоплазматическими дисморфизмами: 27,8% при применении ЭКО и лишь 15,4% при применении ЭКО с ПГС. И, наоборот, у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами удалось добиться рождения живого здорового потомства в 21,4% наблюдений при применении ЭКО с ПГС и лишь в 15% случаев при применении ЭКО. Важно, что в отсутствии применения ПГС в этой группе пациентов 1,4% рожденных детей имели те или иные анеуплоидии. Несмотря на высокую эффективность ПГС у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, высокая стоимость данной процедуры не позволила назвать метод ЭКО/ПГС более клинико- экономически эффективной стратегией лечения бесплодия в этой группе больных. При этом следует отметить, что стоимость лечения бесплодия методом ЭКО или ЭКО/ПГС в расчете на рождение одного здорового ребенка у этих пациентов отличалась всего на 13% в отличие от пар с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, у которых дельта в цене составляла 66,5%. Анализ чувствительности показал, что, для того чтобы добиться увеличения клинико-экономической эффективности ЭКО с ПГС по сравнению с ЭКО у пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов у женщин, надо снизить ее стоимость до 126 238 руб. по сравнению с исходными 188 909 руб. При этом следует повысить эффективность ЭКО/ПГС до 26,1% по сравнению с исходными 21,4%. Существует несколько возможных способов повышения эффективности ЭКО/ПГС. Во-первых, как обсуждалось ранее, исследование эмбриона на стадии дробления не позволяет исключить мозаичность бластомеров эмбриона или потенциальную способность эмбриона к самокоррекции, что приводит к риску получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов. ПГС путем анализа клеток трофоэктодермы позволит повысить частоту наступления беременности за счет устранения мозаичности клеток эмбриона. Во-вторых, использование метода FISH не позволяет исключить анеуплоидии хромосом, которые не были подвергнуты диагностике. Следует 138 также учитывать, что анализу подвергаются те хромосомы, аномалии которых ассоциированы с рождением жизнеспособных детей с генетической патологией, в то время аномалии других хромосом сопряжены с гибелью эмбрионов на доимплантационной стадии или прерыванием беременности на ранних сроках. Таким образом, методика FISH позволяет осуществить профилактику рождения детей с хромосомными аномалиями, а применение сравнительной геномной гибридизации, возможно, позволит более существенно повысить частоту наступления беременности после ПГС. Мы рассчитали и провели сравнение показателей приращения затрат (ICER) на проведение ЭКО и ЭКО/ПГС в данной группе пациентов, который составил 18 028,60 руб. Анализ ICER показал, что для достижения дополнительного 1% эффективности (т.е. 1% рождения здоровых детей) при применении ЭКО/ПГС в группе пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами у женщин требуется всего лишь 18 028,60 рублей дополнительных вложений. Наиболее интересной находкой нашего исследования с клинической точки зрения является высокая вероятность рождения ребенка с анеуплоидией при наличии цитоплазматических дисморфизмов ооцитов, составляющая 1,4%, что превышает общепопуляционные значения. Несмотря на то, метод ЭКО/ПГС не является экономически выгодной стратегией для пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, применение ПГС может способствовать профилактике рождения детей с врожденными аномалиями. Следует учитывать, что для упрощения созданной модели мы не включали в анализ расходы на лечение детей с врожденными аномалиями. ЭКО является более клинико-экономически эффективным методом лечения бесплодия у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов у женщин. У пар с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов у женщин ЭКО с применением ПГС методом FISH может быть более выгодной методикой в случае снижения стоимости ПГС. 139 На основании полученных данных нами был разработан алгоритм по ведению пациенток с риском получения ооцитов с морфологическими аномалиями. Расчет индивидуального риска получения ооцитов с различными морфологическими аномалиями Наличие факторов риска дисморфизмов ооцитов: Возраст более 38 лет ИМТ˃25 кг/м2 Уровень АМГ˂1,4 нг/мл Уровень Т4св˂13 пмоль/л Назначение а-ГнРГ Снижение массы тела Консультация эндокринолога При риске получения ооцитов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами - избегать назначения а-ГнРГ Пациентки с бесплодием в программах ВРТ Морфологическая оценка ооцитов перед проведением оплодотворения Цитоплазматические дисморфизмы ооцитов Экстрацитоплазматические дисморфизмы ооцитов ПРЕИМПЛАНТАЦИОННЫЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ Нормальная морфология Рутинная эмбриологическая тактика Избегать оплодотворения ооцитов с агрегатами ГЭР Рисунок 23. Алгоритм ведения пациенток с бесплодием с риском получения морфологически аномальных ооцитов в программах ВРТ 140 ВЫВОДЫ Эффективность программ ВРТ у пар с дисморфизмами ооцитов у 1. женщин, особенно с цитоплазматическими дисморфизмами, ниже по сравнению с парами с морфологически нормальными ооцитами. У пациентов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами беременность наступает в 1,4 раза реже, а живорождение - в 2 раза реже, чем у пациентов без дисморфизмов ооцитов. У пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами беременность наступает в 3,7 раз реже, а живорождение - в 4,2 раза реже, чем у пациентов без дисморфизмов ооцитов. Факторами риска развития дисморфизмов ооцитов у пациентов 2. ВРТ являются старший возраст пациенток, низкий уровень антимюллерова гормона и свободного тироксина, а также применение агонистов гонадотропин рилизинг-гормона в качестве триггера овуляции или в протоколах стимуляции заболевания суперовуляции. (эндометриоз, Различные синдром гинекологические поликистозных яичников, воспалительные заболевания органов малого таза) не оказывают значимого влияния на развитие дисморфизмов ооцитов. 3. низкое Ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имеют более число копий экстрацитоплазматическими мтДНК по сравнению дисморфизмами или с ооцитами с морфологически нормальными ооцитами. Снижение числа и, как следствие, функции митохондрий является одной из возможных причин низкой эффективности программ ВРТ у данной категории пациенток. 4. Дисморфизмы ооцитов, в первую очередь цитоплазматические дисморфизмы, оказывает существенное влияние на развитие хромосомной патологии эмбрионов в программах ВРТ: анеуплоидии 13, 18, 21, X и Y хромосом выявляются у 38,9% эмбрионов, полученных из ооцитов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами, и у 68,4% эмбрионов, 141 полученных из ооцитов с патологией цитоплазмы. Оплодотворение ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами увеличивает риск получения анеуплоидных эмбрионов в 3,6 раза. Наиболее частыми видами хромосомной патологии эмбрионов при этом являются различные полисомии хромосом. 5. При применении экстрацитоплазматическими преимплантационного программ ВРТ дисморфизмами генетического у пациенток ооцитов скрининга с проведение методом FISH не увеличивает эффективность программ ВРТ (наступление беременности, живорождения). При цитоплазматическими применении программ дисморфизмами ВРТ ооцитов у пациенток с проведение преимплантационного генетического скрининга методом FISH увеличивает эффективность программ ВРТ (живорождения - в 1,4 раза) за счет переноса в полость матки эуплоидных по 5-хромосомам эмбрионов, что свидетельствует о клинической обоснованности применения ПГС для лечения бесплодия и профилактики хромосомной патологии плода в данной группе пациентов. 6. Клиническая эффективность преимплантационного генетического скрининга методом FISH у пар с цитоплазматическими дисморфизмами у женщин не сочетается с его клинико-экономической эффективностью, которая может быть достигнута путем повышения эффективности лечения бесплодия в программах ВРТ на 19% и снижения стоимости ПГС на 33%. 142 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Всем пациенткам программ ВРТ следует проводить тщательную морфологическую оценку ооцитов на предмет выявления различных дисморфизмов. Выявление патологии цитоплазмы ооцита является плохим прогностическим фактором в плане его оплодотворения и дальнейшего развития эмбриона. 2. При получении ооцитов с агрегатами гладкого эндоплазматического ретикулума в циклах ВРТ следует отказаться от их оплодотворения вследствие низкой вероятности дальнейшего развития эмбрионов (минимальное число копий мтДНК) и высокого риска получения анеуплоидных эмбрионов (65,2%). 3. Пациенткам с риском развития дисморфизмов ооцитов требуется комплексный подход в коррекции соматических заболеваний и метаболических нарушений, а также дифференцированный подход в выборе подходящего протокола стимуляции суперовуляции. Для расчета индивидуального риска получения ооцитов с различными дисморфизмами в программах ВРТ могут быть использованы разработанные математические модели, включающие оценку клинико-лабораторных и ятрогенных факторов. 4. Пациентки с морфологическими аномалиями ооцитов, в первую очередь с цитоплазматическими дисморфизмами, представляют группу риска по выявлению различных анеуплоидий у эмбрионов в программах ВРТ. Данной категории пациенток необходимо рекомендовать дополнительное медико-генетическое консультирование с целью решения вопроса о целесообразности проведения молекулярно-цитогенетического анализа эмбрионов. 5. Клинико-экономическая эффективность преимплантационного генетического скрининга методом FISH в группе пар с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов у женщин может быть достигнута снижением его 143 стоимости. Полученная вследствие снижения стоимости экономическая выгода назначения данного метода позволит внедрить его в группах пациенток высокого риска по рождению детей с генетической патологией. 144 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 17-ОП - 17-оксипрогестерон А-ГнРГ - агонисты гонадотропин – рилизинг гормона Ант-ГнРГ - антагонисты гонадотропин – рилизинг гормона АДФ - аденозиндифосфат АЗС - астенозооспермия АМГ - антимюллеров гормон АСАТ - антиспермальные антитела АТ - астенотератозооспермия АТФ - аденозинтрифосфат ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии ГнРГ - гонадотропин рилизинг-гормон ГЭР - гладкий эндоплазматический ретикулум ДГЭА-С - дегидроэпиандростерона сульфат ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИКСИ - интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита ИМСИ - интрацитоплазматическая инъекция морфологически нормального сперматозоида ИМТ - индекс массы тела ИППП - инфекции, передаваемые половым путем КОК - комбинированные оральные контрацептивы ЛГ - лютеинизирующий гормон мтДНК - митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота МКБ-10 - Международная классификация болезней десятого пересмотра НЗС - нормозооспермия 145 НЦАГиП - Научный центр акушерства гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова ОА - олигоастенозооспермия ОАТ - олигоастенотератозооспермия ОЗС - олигозооспермия ОКК - ооцит-кумулюсный комплекс ОМС - обязательное медицинское страхование ОТ - олиготератозооспермия ОШ - отношение шансов ОШгр - грубое отношение шансов ОШкор - скорректированное отношение шансов ПГД - преимплантационная генетическая диагностика ПГС - преимплантационный генетический скрининг ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭ - перенос эмбрионов рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота рФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон С/в - самопроизвольный выкидыш СГГ - сравнительная геномная гибридизация СТГ - соматотропный гормон СПКЯ - синдром поликистозных яичников тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота Т - тестостерон ТВП - трансвагинальная пункция ТЗС - тератозооспермия ТТГ - тиреотропный гормон Т4св - тироксин свободный ФСГ - фолликулостимулирующий гормон ХГ - хорионический гонадотропин ЧМГ - человеческий менопаузальный гонадотропин 146 ЭКГ - электрокардиограмма ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение β-ХГ - β-субъеденица хорионического гонадотропина ANOVA - analysis of variance (дисперсионный анализ) AUC - area under curve (площадь под кривой) CGH - comparative genomic hybridization (сравнительная геномная гибридизация) GV - germinal vesicle (Зародышевый пузырек) FISH - fluorescence in situ hybridization (флюоресцентная гибридизация in situ) HBs-Ag - cпецифический антиген вируса гепатита В HCV - вирус гепатита С HLA - human leucocyte antigens (человеческие лейкоцитарные антигены) ICSI - Intracytoplasmic sperm injection (внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита) LSIL - Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (низкая степень внутриэпителиального поражения) M I - metaphase I (метафаза первого мейотического деления) M II - metaphase II (метафаза второго мейотического деления) PB1 - first polar body (первое полярное тельце) PB2 - second polar body (второе полярное тельце) ROC - receiver operating characteristic (операционная характеристика надежности) RW - реакция Вассермана OR - оdds ratio (отношение шансов) 147 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome /L. Rienzi [et al.] // Fertil. Steril. - 2008. - Vol. 90, № 5. - P. 1692–1700. 2. Balaban, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation / B. Balaban, B. Urman // Reprod Biomed Online.- 2006.- Vol. 12. - P. 608–615. 3. The relationship between pregnancy outcome and smooth endoplasmic reticulum clusters in MII human oocytes / J. Otsuki [et al.] // Hum. Reprod.- 2004.- Vol. 19.- P. 1591–1597. 4. Frequency and distribution of chromosome abnormalities in human oocytes / A. Kuliev [et al.] // Cytogenet. Genome Res.- 2005.- Vol. 111.- P. 193–198. 5. Comparative genomic hybridization of oocytes and first polar bodies from young donors/ E. Fragouli [et al.] //Reprod. Biomed. Online.2009.- Vol. 19, № 2.- P. 228–237. 6. The origin of human aneuploidy: Where we have been, where we are going / T. Hassold [et al.] // Hum. Mol. Genet.- 2007.- Vol. 16, № 2.- P. 203–208. 7. In vitro fertilization with preimplantation genetic screening /T. Mastenbroek [et al.] // N Engl J Med.- 2007.- Vol. 357, № 1, P. 9–17. 8. Mitochondrial content reflects oocyte variability and fertilization outcome / T. Santos [et al.] // Fertil. Steril.- 2006.- Vol. 85, № 3.- P. 584-591. 9. Mitochondrial DNA content affects the fertilizability of human oocytes /C. Morgan [et al.] // Mol. Hum. Reprod.- 2001.- Vol. 7, № 5.- P. 425–429. 148 10. Shoubridge, E. The Role of Mitochondrial DNA Copy Number in Mammalian Fertility / E. A. Shoubridge, T. Wai // Biol. Reprod.- 2007.- Vol. 77, № 6.- P. 87–111. 11. Mitochondrial DNA transmission, replication and inheritance: A journey from the gamete through the embryo and into offspring and embryonic stem cells/ J. C. John [et al.] // Hum. Reprod. Update.- 2010.- Vol. 16, № 5.- P. 488–509. 12. Committee for Monitoring Assisted Reproductive Technology (ICMART) and the World Health Organization (WHO) revised glossary of ART terminology / F. Zegers-Hochschild // Fertil. Steril.-2009/- Vol. 92, № 5, P 1520– 1524. 13. National Institute for Health and Care Excellence. Fertility: assessment and treatment for people with fertility problems / D. Barlow [et al.] //NICE CLincal Guide.- 2013.- 274 p. 14. Jose-miller A. B. Infertility / A. B. Jose-miller, J. W. Boyden, K. A. Frey // Am. Fam. Physician.- 2007.- Vol. 75.- P. 849–856. 15. Defining infertility-a systematic review of prevalence studies / S. Gurunath [et al.] // Hum. Reprod. Update.- 2011.- Vol. 17, № 5, P. 575–588. 16. Приказ Министерства здравоохранения РФ от 30 августа 2012 г. N 107н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению". [Электронный ресурс] -2012.- Режим доступа: https://www.rosminzdrav.ru/docs/mzsr/standards/projects/197. 17. Significance of morphological attributes of the early embryo / L. Rienzi [et al.] // Reprod Biomed Online.- 2005.- Vol. 10.- P. 669–681. 18. Contribution of the oocyte to embryo quality / M. A. Sirard [et al.] // Theriogenology.- 2006.- Vol. 65.- P. 126–136. 19. Temporal patterns of embryonic gene expression and their dependence on oogenetic factors / P.De Sousa [et al.] // Theriogenology.- 1998.- Vol. 49, № 97, P. 115–128. 149 20. Bell, C. Genomic RNA profiling and the programme controlling preimplantation mammalian development / C. Bell, M. Calder, A. Watson // Mol. Hum. Reprod.- 2008.- Vol. 14.- P. 691–701. 21. Shah, D. Post Reproductive Health : The Journal of The British Menopause Society Premature menopause – Meeting / D. Shah, N. Nagarajan // Post Reprod. Heal.- 2014.- Vol. 1.- P. 1–7. 22. Trends and outcomes for donor oocyte cycles in the United States /J. F. Kawwass [et al.] // JAMA.- 2013.- Vol. 310, № 22.- P. 2426– 2434. 23. The association between severe obesity and characteristics of failed fertilized oocytes / R. MacHtinger [et al.] // Hum. Reprod.- 2012.Vol. 27, № 11.- P. 3198–3207. 24. Robker, R. L. Inflammatory pathways linking obesity and ovarian dysfunction / R. L. Robker, L. L. Y. Wu, X. Yang // J. Reprod. Immunol.- 2011.- Vol. 88, № 2.- P. 142–148. 25. IVF outcomes in obese donor oocyte recipients: A systematic review and meta-analysis / E. S. Jungheim [et al.] // Hum. Reprod.- 2013.Vol. 28, № 10.- P. 2720–2727. 26. Paternal age and assisted reproductive outcomes in ICSI donor oocytes: is there an effect of older fathers? / R. Beguería [et al.] // Hum. Reprod.- 2-14.- Vol. 0, № 10.- P. 1–9. 27. Gianaroli., L. Sperm and blastomere aneuploidy detection in reproductive genetics and medicine / L. Gianaroli, M. C. Magli, A. P. Ferraretti // J. Histochem. Cytochem.- 2005.- Vol. 53.- P. 261–267. 28. Черных, В. Б. Синдром персистенции мюллеровых протоков: современное состояние проблемы / В. Б. Черных, Л. Ф. Курило // Медицинская генетика.- 2003.- Т. 2, № 3, С. 98–105. 29. Риск вспомогательных анеуплоидии репродуктивных эмбрионов технологий в у программах мужчин с 150 патозооспермией (мета-анализ) / Долгушина Н.В. [и др.] //Акушерство и гинекология.- 2012.- №. 7.- С. 4–13. 30. Frequency of aneuploidy in sperm from patients with extremely severe male factor infertility / L. Gianaroli [et al.] // Hum. Reprod.-2005.- Vol. 20, № 8.Р. 2140–2152. 31. Исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий у супружеских пар с различными видами патозооспермии у мужчин / Н. В. Долгушина [и др.] // Акушерство и гинекология.- 2013.- № 10.- С. 69–75. 32. Влияние уровня анеуплоидии хромосом в сперматозоидах на развитие анеуплоидии эмбрионов и исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий / С. А. Сокур [и др.] // Гинекология.- 2013.- № 6.- С. 38–41. 33. Paternal contribution to aneuploidy in preimplantation embryos / M.C. Magli [et al.] // Reprod Biomed Online -2009.- Vol. 18, № 4. - P. 536–543. 34. Sperm aneuploidy and recurrent pregnancy loss / L. M. Bernandini [et al.] // Reprod. Biomed. Online.- 2004.- Vol. 9, № 3ю- Р. 312–320. 35. The meiotic competence of in-vitro matured human oocytes is influenced by donor age: Evidence that folliculogenesis is compromised in the reproductively aged ovary / K. Volarcik [et al.] // Hum. Reprod.- 1998.- Vol. 13, № 1.- Р. 154–160. 36. Kuliev, A. Meiotic and mitotic nondisjunction: Lessons from preimplantation genetic diagnosis / A. Kuliev, Y. Verlinsky // Hum. Reprod. Update.- 2004.- Vol. 10, № 5.- Р. 401–407. 37. Predicting aneuploidy in human oocytes: Key factors which affect the meiotic process / L. Gianaroli [et al.] // Hum. Reprod.- 2010.- Vol. 25, № 0.- Р. 2374–2386. 38. The cytogenetics of polar bodies: Insights into female meiosis and the diagnosis of aneuploidy / E. Fragouli [et al.] // Mol. Hum. Reprod.- 2011.- Vol. 17, № 5.- Р. 286–295. 151 39. Курило, Л.Ф. Возможности цитогенетического исследования мейоза при мужском бесплодии / Л. Ф. Курило // Цитология и генетика.- 1989.- Т. 23.- С. 63–70. 40. Elder, K. In-vitro fertilization / K. Elder, B. Dale- C.: «Cambridge University Press», 2010.- 12 — 277 p. 41. Gender effects on the incidence of aneuploidy in mammalian germ cells / F. Pacchierotti // Environ. Res.- 2007.- Vol. 104.- P. 46–69. 42. Zenzes, M. Cytogenetics of human oocytes, zygotes, and embryos after in vitro fertilization / M. Zenzes, R. F. Casper // Hum. Genet.1992.- Vol. 88.- P. 367–375. 43. Angell, R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes / R. Angell // Am. J. Hum. Genet.- 1997.- Vol. 61.- P. 23–32. 44. Cdc20 Is Critical for Meiosis I and Fertility of Female Mice / F. Jin [et al.] // PLoS Genet.- 2010.- Vol. 6, № 9.- Р. 1-16. 45. A trisomic germ cell line and precocious chromatid segregation leads to recurrent trisomy 21 conception / J. Cozzi [et al.] // Hum. Genet.1999.- Vol. 104.- P. 23–28. 46. Errors at mitotic segregation early in oogenesis and at first meiotic division in oocytes from donor females: Comparative genomic hybridization analyses in metaphase II oocytes and their first polar body / A. Obradors [et al.] // Fertil. Steril.- 2010.- Vol. 93, № 2.- P. 675–679. 47. Germinal and Somatic Trisomy 21 Mosaicism: How Common is it, What are the Implications for Individual Carriers and How Does it Come About? / M. Hultén [et al.] // Curr. Genomics.-2010.- Vol. 11, № 0.P. 409–419. 48. Баранов В.С., Кузнецова Т.В. Цитогенетика эмбрионального развития человека. / В.С Баранов., Т.В. КузнецоваСанкт-Петербург: Н-Л , 2007. - 78-79 c. 152 49. Munné, S. Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes / S. Munné, D. Wells, J. Cohen // Fertil. Steril.-2010.- Vol. 94, № 2.- P. 408–430. 50. Live vitrification, birth and outcome with single-nucleotide trophectoderm polymorphism biopsy, blastocyst microarray-based comprehensive chromosome screening in infertile patients / W. B. Schoolcraft [et al.] // Fertil. Steril.- 2011.- Vol. 96, № 3.- Р. 638–640. 51. Chromosome mosaicism in day 3 aneuploid embryos that develop to morphologically normal blastocysts in vitro / M. C. Magli [et al.] // Hum. Reprod.2000.- Vol. 15, № 8.- Р. 1781–1786. 52. Chromosomal abnormalities and embryo development in recurrent miscarriage couples / C. Rubio [et al.] // Hum. Reprod.- 2003.- Vol. 18, № 1.- Р. 182–188. 53. Effect of infertility, maternal age, and number of previous miscarriages on the outcome of preimplantation genetic diagnosis for idiopathic recurrent pregnancy loss / J. G. Garrisi [et al.] // Fertil. Steril.- 2009.- Vol. 92, № 1.- Р. 288–295. 54. Comprehensive chromosome screening of polar bodies and blastocysts from couples experiencing repeated implantation failure / E. Fragouli [et al.] // Fertil. Steril.- 2010.- Vol. 94, № 3.- Р. 875–887. 55. Hassold, Т. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy / T. Hassold, P. Hunt // Nat. Rev. Genet.- 2001.- Vol. 2.- P. 280–291. 56. Gardner, R. Control of the Sex Ratio at Full Term in the Rabbit by transferring Sexed Blastocysts / R. Gardner, R. Edwards // Nature.- 1968.-Vol. 218.- P. 346–348. 57. Analysis of the first polar body: preconception genetic diagnosis / Y. Verlinsky [et al.] // Hum. Reprod.- 1990.- Vol. 5.- №. 7.- Р. 826–829. 58. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification / H. Handyside[et al.] // Nature.-1990.- Vol. 344.- P. 768–770. 153 59. Kuliev, A. Thirteen years’ experience of preimplantation diagnosis: report of the Fifth International Symposium on Preimplantation Genetics / A. Kuliev, Y. Verlinsky // Reprod. Biomed. Online.- 2004.- Vol. 8, № 2.- Р. 229–235. 60. ESHRE Preimplantation Genetic Diagnosis Consortium: data collection III (May 2001) / T. Ebner [et al.] // Hum. Reprod.- 2002.- Vol. 17, № 1, Р. 233–246. 61. Detection of chromosomal imbalances in transitional cell carcinoma of the bladder by comparative genomic hybridization / C. Voorter [et al.] // Am. J. Pathol.- 1995.- Vol. 146, № 6.- Р. 1341–1354. 62. Wells, D. Comprehensive chromosomal analysis of human preimplantation embryos using whole genome amplification and single cell comparative genomic hybridization / D. Wells, J. D. Delhanty // Mol. Hum. Reprod.- 2000.- Vol. 6, № 11.- Р. 1055–1062. 63. Pregnancies following pre-conception diagnosis of common aneuploidies by fluorescent in-situ hybridization / Verlinsky Y [et al.] // Hum Reprod.- 1995.- Vol. 10, № 7.- Р. 1923–1927. 64. Polar Body Diagnosis of Common Aneuploidies by FISH /Y. Verlinsky [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet.- 1995.- Vol. 13, № 2.- Р. 2–7. 65. Aneuploidies of chromosomes 1, 4, and 6 are not compatible with human embryos’ implantation / M. C. Magli [et al.] // Fertil. Steril.2010.- Vol. 94, № 6, Р. 2012–2016. 66. Kuliev, A. Polar body-based preimplantation genetic diagnosis for Mendelian disorders / A. Kuliev, S. Rechitsky // Mol. Hum. Reprod.2011.- Vol. 17, № 5.- Р. 275–285. 67. Successful polar body-based preimplantation genetic diagnosis for achondroplasia / G. Altarescu [et al.] // Reprod. Biomed. Online.- 2008.Vol. 16, № 2.- Р. 276–282. 68. Pre-embryonic diagnosis for Sandhoff disease /A. Kuliev [et al.] // Reprod. Biomed. Online.- Vol. 12, № 3.- P. 328–333. 154 69. First pregnancy and life after preimplantation genetic diagnosis by polar body analysis for mucopolysaccharidosis type I / D. Tomi [et al.] // Reprod. Biomed. Online.- 2006.- Vol. 12, № 2.- Р. 215–220. 70. Polar body array CGH for prediction of the status of the corresponding oocyte. Part II: Technical aspects / M. C. Magli [et al.] // Hum. Reprod.- 2011.- Vol. 26, № 0.- P. 3181–3185. 71. Multiple meiotic errors caused by predivision of chromatids in women of advanced maternal age undergoing in vitro fertilisation / A. H. Handyside [et al.] // Hum. Reprod.- 2012.- Vol. 20, № 7.- 742–747. 72. Nicolaidis, P. Origin and mechanisms of non-disjunction in human autosomal trisomies / P. Nicolaidis, M. Petersen // Hum Reprod. -1998.- Vol. 13, № 2.- P. 313–319. 73. Munne, S. Embryonic chromosome abnormalities / S. Munne // Reprod Biomed Online. -2005. -Vol. 10, № 2. - P. 3–6. 74. FISH analysis for chromosomes 13, 16, 18, 21, 22, X and Y in all blastomeres of IVF pre-embryos from 144 randomly selected donated human oocytes and impact on pre-embryo morphology / S. Ziebe [et al.] // Hum. Reprod.2008.- Vol. 18, № 12.- P. 2575–2581. 75. Preimplantation genetic screening reveals a high incidence of aneuploidy and mosaicism in embryos from young women undergoing IVF / E. B. Baart [et al.] // Hum. Reprod.- 2006.- Vol. 21, № 1.- Р. 223–233. 76. Preimplantation Genetic Screening (PGS) with Comparative Genomic Hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages / M. D. Keltz [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet.- 2013.- Vol. 30.- P. 1333–1339. 77. Origins and rates of aneuploidy in human blastomeres / M. Rabinowitz [et al.] // Fertil. Steril.- 2012.- Vol. 97, № 2.- Р. 395–401. 78. Preimplantation aneuploidy testing for infertile patients of advanced maternal age: a randomized prospective trial / W. B. Schoolcraft [et al.] // Fertil. Steril.- 2009.- Vol. 92, № 1.- P. 157–162. 155 79. No beneficial effect of preimplantation genetic screening in women of advanced maternal age with a high risk for embryonic aneuploidy / M. Twisk [et al.] // Hum. Reprod.- 2008.- Vol. 23, № 12.- Р. 2813–2817. 80. Preimplantation genetic screening in women of advanced maternal age caused a decrease in clinical pregnancy rate: a randomized controlled trial / T. Hardarson [et al.] // Hum. Reprod.- 2008. - Vol. 23, № 12.- P. 2806–2812. 81. Anaphase lagging mainly explains chromosomal mosaicism in human preimplantation embryos /E. Coonen [et al.] // Hum. Reprod.- 2004.Vol. 19, № 2.- P. 316–324. 82. Comparison of blastocyst transfer with or without preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in couples with advanced maternal age: a prospective randomized controlled trial / C. Staessen [et al.] // Hum. Reprod.- 2004.- Vol. 19, № 12.- Р. 2849–2858. 83. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential / S. Barbash-Hazan [et al.] // Fertil. Steril.-2009.- Vol. 92, № 3.- P. 890–896. 84. Self-correction of chromosomally abnormal embryos in culture and implications for stem cell production / S. Munné [et al.] // Fertil. Steril.Vol. 84, № 5.- Р. 1328–1334. 85. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: A randomized controlled trial / R. T. Scott [et al.] // Fertil. Steril.- Vol. 100, № 3.- P. 697–703. 86. Schoolcraft, W.B. Clinical application of comprehensive chromosomal screening at the blastocyst stage / W.B. Schoolcraft, E. Fragouli, J. Stevens // Fertil. Steril. -2010.- Vol. 94. - P. 1700–1706. 87. What next for preimplantation genetic screening (PGS)? Experience with blastocyst biopsy and testing for aneuploidy / R. P. S. Jansen [et al.] // Hum. Reprod.- Vol. 23, № 7.- P. 1476–1478. 156 88. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts / S. J. McArthur [et al.] // Fertil. Steril.- 2005.- Vol. 84, № 6, Р. 1628–1636. 89. Preimplantation genetic screening for abnormal number of chromosomes (aneuploidies) in in vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection / M. Twisk [et al.] // Cochrane Database Syst Rev. -2011.- № 2. 90. Margulis, L. The microbes’ contribution to evolution / L. Margulis // Biosystems.- 1975.- Vol. 7.- P. 266–292. 91. Sequence and organisation of the human mitochondrial genome / S. Anderson [et al.] // Nature.- 1981.- Vol. 290.- P. 457–465. 92. Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA /R. M. Andrews [et al.] // Nat. Genet.- 1999.- Vol. 23.P. 147. 93. Hornst, M. Protein import into mitochondria / M. Horst, N. G. Kronidou // Membr. Protein Transp.- 1995.- Vol. 1.- P. 109–143. 94. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model /N. Wang [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.- 2001.- Vol. 98, № 14.Р. 7765–7770. 95. Sathananthan, H. Mitochondrial morphology during preimplantational human embryogenesis / H. Sathananthan, O. Trounson // Hum. Reprod.- 2000.Vol. 15, Suppl. 2.- P. 148–159. 96. Pikó , L. Number of mitochondria and some properties of mitochondrial DNA in the mouse egg / L. Pikó, L. Matsumoto // Dev. Biol.- 1976.Vol. 49.- P. 1–10. 97. Jansen, R. P. Germline passage of mitochondria: quantitative considerations and possible embryological sequelae / R. P. Jansen // Hum. Reprod.- 2000.-Vol. 15, Suppl 2.- P. 112–128. 98. The Role of Mitochondrial DNA Copy Number in Mammalian Fertility / T. Wai [et al.] // Biol of Reprod.- 2010.- Vol. 62.- P. 52–62. 157 99. Quantification of mtDNA in single oocytes , polar bodies and subcellular components by real-time rapid cycle fluorescence monitored PCR / N. Steuerwald [et al.] // Zygote.- 2000.- Vol. 9.- P. 209–215. 100. Mitochondria and human preimplantation embryo development / M. Wilding [et al.] // Reproduction.- 2009.- Vol. 137.- P. 619–624. 101. Van Blerkom, J. Mitochondrial function in the human oocyte and embryo and their role in developmental competence /J. Van Blerkom // Mitochondrion.- 2011.- Vol. 11, № 5.- P. 797–813. 102. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice / N. G. Larsson [et al.] // Nat. Genet.-1998/- Vol. 18.- P. 231–236. 103. Mitochondrial aggregation patterns and activity in human oocytes and preimplantation embryos / M. Wilding [et al.] // Hum. Reprod.2001.- Vol. 16, № 5.- Р. 909–917. 104. Bogenhagen, D. S. Does mtDNA nucleoid organization impact aging? / D. F. Bogenhagen // Exp. Gerontol.- 2010.- Vol. 45, № 7–8.- Р. 473–477. 105. Wai, T. The mitochondrial DNA genetic bottleneck results from replication of a subpopulation of genomes / T. Wai, D. Teoli, E. Shoubridge // Nat. Genet.-2008.- Vol. 40, № 12.- Р. 1484–1488. 106. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes / L. M. Cree [et al.] // Nat. Genet.- 2008.- Vol. 40, № 2.- Р. 249–254. 107. Maternal inheritance of human mitochondrial DNA / R. E. Giles [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.- 1980.- Vol. 77, №. 1.- P. 6715– 6719. 108. Mitochondrial functionality in reproduction: From gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells / J. Ramalho-Santos [et al.] // Hum. Reprod. Update.- 2009.- Vol. 15, № 5.- Р. 553–572. 158 109. The fate of human sperm-derived mtDNA in somatic cells / G. Manfredi [et al.] // Am. J. Hum. Genet.- 1997.- Vol. 61.- P. 953–960. 110. Schwartz, M. Paternal inheritance of mitochondrial DNA / M. Schwartz, J. Vissing // New Engl J Med.- 2002.- Vol. 347, № 8.- P. 576–580. 111. Genotypes from patients indicate no paternal mitochondrial DNA contribution / R. W. Taylor [et al.] // Ann. Neurol.- 2003.- Vol. 54.- P. 521–524. 112. Lack of paternal inheritance of muscle mitochondrial DNA in sporadic mitochondrial myopathies / M. Filosto [et al.] // Ann. Neurol.- 2003.- Vol. 54.- P. 524–526. 113. Degradation of paternal mitochondria after fertilization: implications for heteroplasmy, assisted reproductive technologies and mtDNA inheritance / P. Sutovsky [et al.] // Reprod. Bio. Online.- 2004.- Vol. 8, №1.- P. 24–33. 114. Van Blerkom, J.ATP content of human oocytes and developmental potential and outcome after in-vitro fertilization and embryo transfer / J. Van Blerkom, P. Davis, J. Lee // Hum. Reprod.- 1995.- Vol. 10.- P. 415–424. 115. Murakoshi, Y. Embryo developmental capability and pregnancy outcome are related to the mitochondrial DNA copy number and ooplasmic volume / Y. Murakoshi, K. Sueoka, K. Takahashi // J Assist Reprod Genet.- 2013.Vol. 30.- P. 1367–1375. 116. Low oocyte mitochondrial DNA content in ovarian insufficiency / C. Jacques [et al.] // Hum. Reprod.- 2005.- Vol. 20, № 3.- P. 593–597. 117. Relationship between oocyte abnormal morphology and intracytoplasmic sperm injection outcomes : a meta-analysis /A. S. Setti [et al.] // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol.- 2011.- Vol. 159.- P. 364–370. 118. Body mass index is negatively correlated with the response to controlled ovarian stimulation but does not influence oocyte morphology in ICSI cycles / A. Souza [et al.] // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol.- 2012.- Vol. 163.- P. 175–179. 159 119. GnRH agonist versus GnRH antagonist in assisted reproduction cycles : oocyte morphology / A. M. M. Cota[et al.] // Reprod. Biol. Endocrinol.- 2012-Vol. 12.- P. 10–33. 120. Факторы программах риска развития вспомогательных дисморфизмов репродуктивных ооцитов в технологий / А. Г. Горшкова [и др.] // Акушерство и гинекология.- 2015.- Т. 5, С. 66– 73. 121. Yoldemir, Т. Does the duration of gonadotropin stımulation affect embryo quality on post-retrieval day 3? /T. Yoldemir /Gynecol Endocrinol.-Vol. 27.- P. 324–330. 122. Relationship between granular cytoplasm of oocytes and pregnancy outcome following intracytoplasmic sperm injection / S. Kahraman [et al.] // Hum. Reprod.- 2000.- Vol. 15, № 11.- P. 2390–2393. 123. Intracytoplasmic sperm injection: correlation of oocyte grade based on polar body, perivitelline space and cytoplasmic inclusions with fertilization rate and embryo quality /P. Xia // Hum. Reprod.- 1997.- Vol. 12.- P. 1750–1755. 124. Importance of cytoplasmic granularity of human oocytes in in vitro fertilization treatments / P. Fancsovits [et al.] // Acta Biol. Hung.2012.- Vol. 63, № 2.- P. 189–201. 125. Ubaldi, F. Morphological selection of gametes / F. Ubaldi, L. Rienzi // Placenta.- 2008.- Vol. 29.- P. 115–120. 126. Грубозернистая деструкция цитоплазмы ооцитов в цикле ЭКО / Н. П. Макарова [и др.] // Акушерство и гинекология.- 2012.- Т. 8.- С. 103–105. 127. Ebner, Т. Occurrence and developmental consequences of vacuoles throughout preimplantation development / T. Ebner, M. Moser, M. Sommergruber //Fertil Steril.- 2005.- Vol. 83, № 6.- P. 1635–1640, 2005. 128. An oocyte score for use in assisted reproduction / M. Wilding [et al.] // J Assist Reprod Genet.- 2007.- Vol. 24.- P. 350–358. 160 129. Otsuki, J. Lipofuscin bodies in human oocytes as an indicator of oocyte quality / J. Otsuki, Y. Nagai, K. Chiba / J. Assist. Reprod. Genet.-2007.Vol. 24, № 7.- P. 263–70. 130. The relationship between pregnancy outcome and smooth endoplasmic reticulum clusters in MII human oocytes / J. Otsuki [et al.] // Hum. Reprod.- 2004.Vol. 19, № 7.- P. 1591–1597. 131. Prognosis of oocytes showing aggregation of smooth endoplasmic reticulum / T. Ebner [et al.] // Reprod Biomed Online.- 2008.- Vol. 16.- P 113–118. 132. Ultrastructure of tubular smooth endoplasmic reticulum aggregates in human metaphase II oocytes and clinical implications / R. Sa [et al.] // Fertil Steril.-2011.- Vol. 96, № 1.- P. 143–149. 133. Donor oocyte dysmorphisms and their influence on fertilization and embryo quality / J. Ten [et al.] / Reprod Biomed Online.- 2007.- Vol. 14.- P. 40– 48. 134. Oocyte morphology correlates with embryo quality and pregnancy rate after intracytoplasmic sperm injection / D. Loutradis [et al.] // Fertil. Steril.1999.- Vol. 72.- № 2.- P. 240–244. 135. Perivitelline space granularity : a sign of human menopausal gonadotrophin overdose in intracytoplasmic sperm injection /H. Hassan-Ali [et al.] // Hum. Reprod.- 1998.- Vol. 13, № 12.- P. 3425–3430. 136. Oocyte morphology does not correlate with fertilization rate and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection / P. De Sutter [et al.] // Hum. Reprod.- 1996.- Vol. 11, № 3.- P. 595–597.. 137. Макарова, Н. П. Критерии оценки качества ооцитов в циклах ИКСИ: взгляд клинического эмбриолога / Н. П. Макарова, Е. А. Калинина // Гинекология.- 2012.- Т. 14.- С. 24–28. 138. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos / S. Chamayou [et al.] // Reprod Biomed Online.- 2006.- Vol. 13.- P. 661–667. 161 139. Morphological criteria of oocyte quality / K. Lasiene [et al.] / Medicina (Kaunas).- 2009.- Vol. 45, № 7.- P. 509–515. 140. Coarse granulation in the perivitelline space and IVF-ICSI outcome / J. Farhi [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet.- 2002.- Vol. 19, № 12.- P. 545–549. 141. Oocyte morphology on day 0 correlates with aneuploidy as detected by polar body biopsy and FISH / A. G. Schmutzler [et al.] // Arch. Gynecol. Obstet.- 2014.- Vol. 289, № 2.- P. 445–450. 142. Polar body morphology and spindle imaging as predictors of oocyte quality / L. De santis [et al.] // Reprod Biomed Online.- 2005.- Vol. 11.- P. 36–42. 143. Gabrielsen, A. The impact of the zona pellucida thickness variation of human embryos on pregnancy outcome in relation to suboptimal embryo development . A prospective randomized controlled study / A. Gabrielsen, S. Lindenberg, K. Petersen // Hum. Reprod.- 2001.- Vol. 16, № 10.- P. 2166–2170. 144. Oocyte morphology predicts outcome of intracytoplasmic sperm injection / P. F. Serhal [et al.] // Hum. Reprod.- 1997.- Vol. 12, № 6.- P. 1267–1270. 145. Pronuclear morphology predicts embryo development and chromosome constitution /B. Balaban [et al.] // Hum. Reprod.- 2004.- Vol. 8, № 6.- P. 695–700. 146. Impact of preimplantation genetic diagnosis on IVF outcome in implantation failure patients/ T. Pehlivan [et al.] // Reprod. Biomed. Online.- 2003.- Vol. 6, №2.- Р. 232–237. 147. Сокур, C. А. Оптимизация исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий у супружеских пар с повышенным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах: дисс. канд. мед. наук: 14.01.01/ С. А. Сокур. М., 2012. - 146 с. 162 148. Нерсеян Р.А. Руководство ВОЗ по стандартизованному обследованию и диагностике бесплодных супружеских пар / Р.А. НерсеянМ.: «МедПресс»,1997.- 10 — 91с. 149. Hardy, K. Maintenance of the inner cell mass in human blastocysts from fragmented embryos / K. Hardy, J. Stark, R. M. L. Winston // Biol. Reprod.2003.- Vol. 68.- P. 1165–1169. 150. Преимплантационный генетический скрининг у супружеских пар с патозооспермией: анализ затраты-эффективность / Н. В. Долгушина [и др.] // Акушерство и гинекология.-2014.- Т. 4.- С. 51–61. 151. Постановление Правительства РФ от 18 октября 2013 г. N 932 г. Москва (ред. от 29.05.2014) ‘О программе государственных гарантий бесплатного оказания гражданам медицинской помощи на 2014 год и на плановый период 2015 и 2016 годов’. [Электронный ресурс] - 2013. - Режим доступа: http://www.rg.ru/printable/2013/10/18/zdorovie-dok.html. 152. Basal level of anti-Müllerian hormone is associated with oocyte quality in stimulated cycles / T. Ebner[et al.] // Hum. Reprod.- 2006.- Vol. 21, № 8.- P. 2022–2026. 153. Is the zona pellucida thickness of human embryos influenced by women’s age and hormonal levels? / H. Balakier [et al.] // Fertil. Steril.- 2012/Vol. 98, №1.- P. 77–83. 154. Chromosomal abnormalities in a series of 6733 human oocytes in preimplantation diagnosis for age-related aneuploidies / A. Kuliev [et al.] Reprod. Biomed. Online.- 2003.- Vol. 6, № 1.- P. 54–59. 155. Oocyte morphology on day 0 correlates with aneuploidy as detected by polar body biopsy and FISH / A. G. Schmutzler [et al.] // Arch. Gynecol. Obstet.- 2014.- Vol. 289.- P. 445–450. 156. Inflammatory pathways linking obesity and ovarian dysfunction / N. Yilmaz [et al.] // J. WOMEN’S Heal.- 2009.- Vol. 18, № 5.- P. 5–8. 163 157. Triggering ovulation with gonadotropin-releasing hormone agonists does not compromise embryo implantation rates / B. Acevedo [et al.] // Fertil. Steril.- 2006.- Vol. 86, № 6.- P. 1682–1687. 158. The use of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) agonist to induce oocyte maturation after cotreatment with GnRH antagonist in highrisk patients undergoing in vitro fertilization prevents the risk of ovarian hyperstimulation syndrome: a prospective rando / L. Engmann [et al.] // Fertil. Steril.- 2008.- Vol. 89, №1.- P. 84–91. 159. Severe cytoplasmic abnormalities of the oocyte decrease cryosurvival and subsequent embryonic development of cryopreserved embryos / B. Balaban [et al.] // Hum. Reprod.- 2008.- Vol. 23, № 8.- P. 1778–1785. 160. Mitochondrial DNA content and 4977 bp deletion in unfertilized oocytes / C. C. W. Chan [et al.] // Mol. Hum. Reprod.- 2006.Vol. 11, № 12.- P. 843–846. 161. Agarwal, A. Role of oxidative stress in female reproduction / A. Agarwal, S. Gupta, R. K. Sharma // Reprod. Biol. Endocrinol.- 2005.- Vol. 3.- P. 28. 162. Ultrastructure of human mature oocytes after slow cooling cryopreservation using different sucrose concentrations / S. A. Nottola [et al.] // Hum. Reprod.- 2007.- Vol. 22, № 4.- P. 1123–1133. 163. Oxidative stress in an assisted reproductive techniques setting / A. Agarwal [et al.] // Fertil. Steril.- 2006.- Vol. 86, № 3.- P. 503–512. 164. Aneuploidy across individual chromosomes at the embryonic level in trophectoderm biopsies: changes with patient age and chromosome structure / J. M. Franasiak [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet.- 2014.- Vol. 31.- P. 1501–1509. 165. Does high body mass index increase the risk of miscarriage after spontaneous and assisted conception? A meta-analysis of the evidence / M. Metwally [et al.] // Fertil. Steril.- 2008.- Vol. 90, № 3.- P. 714–726. 164 166. Association of body mass index with embryonic aneuploidy / K. N. Goldman [et al.] // Fertil. Steril.- 2015.- Vol. 103, № 3.- P. 744–748. 167. Array comparative genomic hybridisation on first polar bodies suggests that non-disjunction is not the predominant mechanism leading to aneuploidy in humans / S. Gabriel [et al.] // J. Med. Genet.- 2011.- Vol. 48.- P. 433–437. 168. Kinetochore geometry defined by cohesion within the centromere. / T. Sakuno, K. Tada, Y. Watanabe // Nature.- 2009.- Vol. 458, № 7240. -P. 852– 858.
