«Утверждаю» ___________________ Председатель Ученого совета проф. И.А. Горлинский ОТЧЕТ старшего преподавателя кафедры биохимии по программе поддержки молодых ученых СПбГУ Татьяны Вячеславовны Никитиной за 2008/2009 учебный год Научно-исследовательскую работу проводила в научной группе доцента кафедры биохимии, к.б.н. Л.И. Тищенко в рамках темы «Роль экспрессии генов малых стабильных РНК в пролиферации и апоптозе опухолевых клеток человека». Целью научно-исследовательской работы является изучение роли и механизмов регуляции экспрессии генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III (генов класса III) в пролиферирующих и апоптотических опухолевых эукариотических клетках. Задачи на 2008/2009 учебный год: (1) оценить взаимосвязь между уровнем экспрессии различных генов класса III – инициаторной тРНКiMet, тРНКHis и представителей молодых субсемейств Alu (AluYa5 и AluYb8) и физиологическим статусом клеток гистиоцитарной лимфомы человека U937 (стадии: покоя G0, пролиферации и апоптоза); (2) изучить метилирование повторов AluYb8 в геноме клеток U937 методом MethyLight. РЕЗУЛЬТАТЫ Для исследования изменения содержания нетранслируемых РНК-продуктов транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой III, при различных физиологических состояниях клетки использовали в качестве модели культуру клеток гистиоцитарной лимфомы человека U937, находящихся в состоянии покоя, пролиферации или апоптоза. Перевод клеток U937 в состояние покоя (фаза G0 клеточного цикла) проводили культивированием клеток U937 в отсутствии сыворотки в течение 48 ч. Через 2 ч после добавления в культуру покоящихся клеток 10 % сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (FBS) большая часть клеток достигала поздней фазы G1 клеточного цикла. Индукцию апоптоза проводили при помощи обработки клеток U937 ингибитором ДНКтопоизомеразы I – камптотецином – в концентрации 4 мкг/мл. Апоптоз, вызванный 1 камптотецином, был детектирован по появлению в цитоплазматической фракции клеток U937 высокомолекулярных фрагментов ДНК (от 750 до 10000 п.н.), что является характерным признаком для клеток этой линии. Исследование содержания инициаторной тРНКiMet1 и тРНКHis в тотальной РНК клеток U937, находящихся в состоянии покоя, пролиферации и апоптоза, индуцированного камптотецином, методом ОТ-ПЦР «в конечной точке» показало, что: (1) содержание инициаторной тРНКiMet1 повышалось примерно в 1,5 раза в апоптотических клетках (рис. 1, а, дорожки 7 и 9), по сравнению с контрольными клетками, культивируемыми без добавления камптотецина (рис. 1, а, дорожки 6 и 8); (2) содержание тРНКHis было примерно одинаково при всех исследованных состояниях клеток: бессывороточное голодание (рис. 1, б, дорожка 2), пролиферация (рис. 1, б, дорожки 3, 4, 6 и 8) и апоптоз (рис. 1, б, дорожки 5, 7 и 9). Похожие результаты были получены методом количественной ОТ-ПЦР «в реальном времени» (рис. 2, а. – для тРНКiMet1 и б. – тРНКHis). Рис. 1. Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР «в конечной точке» в 2 % агарозном геле. а. – амплификация с использованием праймеров к тРНКiMet1; б. – амплификация с использованием праймеров к тРНКHis. 1 – маркер длин фрагментов DNA Ladder 1 kb (Fermentas); 2 – клетки после 48 ч бессывороточного голодания; 3 – клетки после 2 ч с 10% FBS; 4 – клетки после 4 ч с 10% FBS; 5 – клетки после 2 ч с камптотецином (4 мкг/мл); 6 – клетки после 6 ч с 10% FBS; 7 – клетки после 4 ч с камптотецином (4 мкг/мл); 8 – клетки после 8 ч с 10% FBS; 9 – клетки после 6 ч с камптотецином (4 мкг/мл); 10 – контроль: проба без кДНК. Во все пробы брали одинаковое количество кДНК. Внизу приведены денситограммы гелей (получены с помощью программы ScionImage for Windows). На рисунке представлены репрезентативные результаты одного из трех повторных экспериментов. Ранее нами были получены данные о повышенном содержании инициаторной тРНКiMet1 в тотальной РНК клеток эпидермоидной карциномы человека А431 при апоптозе, индуцированном ЭФР в высокой концентрации (100 нг/мл) (Nikitina e.a., Цитология. 2004. Т. 46. № 5. С. 437-441). Мы предполагаем, что повышенное содержание инициаторной тРНК (по сравнению с примерно постоянным содержанием тРНК, участвующих в элонгации, например, тРНКHis) необходимо клеткам, переходящим в 2 состояние апоптоза, для того, чтобы они могли быстро начать синтез белков, участвующих в реализации программы клеточной гибели, которые не синтезируются в пролиферирующих клетках. Рис. 2. Содержание тРНКiMet1 (а) и тРНКHis (б) в тотальной РНК клеток U937, находящихся в состоянии покоя, пролиферации и в апоптозе. Заштрихованные столбцы соответствуют пробам без камптотецина, серые – пробам с камптотецином. Стадия клеточного цикла и время инкубации после добавления камптотецина указаны под каждым столбцом; r – соотношение содержания исследуемой РНК в экспериментальной пробе и в контроле (клетках после культивирования с 10% FBS в течение 2 ч); для каждого столбца указано стандартное отклонение. Для обозначенных * пар столбцов уровень значимости p<0,05. На следующем этапе работы мы изучили изменение содержания продуктов экспрессии Alu-повторов, принадлежащих к самым молодым субсемействам – AluYa5 и AluYb8, в клетках U937 при переходе к апоптозу. Это было необходимо для проверки гипотезы о том, что короткие диспергированные повторы SINE, к которым относятся Aluповторы человека, и их РНК-продукты могут играть определенную роль в реакции клетки на сильные цитотоксические повреждения и, возможно, обеспечивать реализацию апоптозного пути. В качестве объекта исследования были выбраны субсемейства AluYa5 и AluYb8, так как они являются наиболее многочисленными представителями молодого семейства AluY в геноме человека, сохраняют функциональный внутригенный промотор 3 для РНК-полимеразы III и, как полагают, могут быть транскрипционно активными и распространяться по геному путем ретротранспозиции, используя ферментативный аппарат последовательностей L1 (представителей длинных диспергированных повторов LINE у человека) (Schmid. Nat. Genet. 2003. Vol. 35. P. 15-16). Рис. 3. Содержание AluYa5-РНК (а) и AluYb8-РНК (б) в тотальной РНК клеток U937, находящихся в состоянии покоя, пролиферации и в апоптозе. Пояснения см. в подписи к рис. 2. Методом количественной ОТ-ПЦР «в реальном времени» было показано, что содержание как AluYa5-РНК (рис. 3, а), так и AluYb8-РНК (рис. 3, б) значительно возрастало (в 4-10 раз) в апоптотических клетках U937, по сравнению с пролиферирующими клетками. Анализ кривых плавления продуктов ПЦР, полученных амплификацией с праймерами к последовательности AluYa5, показал присутствие целого ряда слившихся друг с другом пиков (рис. 4, а). Это объясняется тем, что для амплификации использовались праймеры, подобранные к консервативным участкам последовательности AluYa5, которые также присутствуют в других последовательностях, принадлежащих к различным субсемействам молодого семейства AluY (например, AluYb8, AluYb9, AluY, AluYc1, AluYg6, AluYa4, AluYa8). Поэтому продукты ПЦР в реальном времении в этом случае являются гетерогенными и представлены ДНК-копиями, соответствующими фрагментам различных Alu-повторов и имеющими разные 4 температуры плавления, но одинаковые размеры (что было подтверждено электрофоретическим разделением продкутов ПЦР в агарозном геле). Очевидно, что представленные на рис. 3, а данные относятся не только к AluYa5-РНК, но и к РНК других перечисленных субсемейств. Для амплификации AluYb8-кДНК использовались праймеры, комплементарные уникальным участкам этой последовательности, которые присутствуют также у AluYb9 (которая отличается от AluYb8 лишь одной нуклеотидной заменой и распространена в геноме человека и в значительно меньшей степени) и отсутствуют у последовательностей, принадлежащих к другим субсемействам AluY. Поэтому в этом случае продукт ПЦР был представлен однородными последовательностями AluYb8/9 с одинаковой температурой плавления, при денатурации которых на кривой плавления присутствовал один четкий пик (рис. 4, б). Таким образом, наши данные свидетельствуют, что в апоптотических клетках U937 существенно повышается содержание Alu-РНК, синтезируемых с Alu-повторов, принадлежащих к целому ряду молодых субсемейств. Рис. 4. Кривые плавления продуктов амплификации кДНК, полученных методом ПЦР в присутствии специфичных праймеров для последовательности AluYa5 (а) и AluYb8 (б). По оси абсцисс указана температура (°С), по оси ординат – отрицательная величина скорости изменения флуоресценции SYBR Green I пробе. Имеющиеся в настоящее время сведения позволяют выдвинуть несколько рабочих гипотез о роли SINE и SINE-транскриптов при программируемой клеточной гибели (см. обзор: Никитина, Тищенко. Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 4. С. 547-558): (1) активная ретротранспозиция SINE, приводящая к встраиванию этих последовательностей в новые области генома и, в результате, к нарушению нормальной экспрессии генов, генотоксическому стрессу и, как следствие, к запуску апоптозных путей; (2) специфичная регуляция аппарата трансляции с участием SINE-РНК, обеспечивающая подавление 5 тотального синтеза белка и осуществление синтеза специфических (про-апоптотических) белков; (3) регуляция Alu-РНК активности про-апоптотического белка – протеинкиназы PKR, регулируемой двухцепочечными РНК; (4) Alu-РНК могут способствовать переходу клетки к апоптозу, активируя внутриклеточные системы неспецифического иммунитета (например, систему интерферона β), аналогично действию экзогенных вирусных РНК. Выяснение точной роли SINE и SINE-транскриптов в апоптозе остается актуальной проблемой для будущих исследований. Рис. 5. Содержание метилированных и неметилированных последовательностей AluYb8 в геномной ДНК клеток U937, находящихся в состоянии покоя, пролиферации и в апоптозе. Стадия клеточного цикла и время инкубации после добавления камптотецина указаны под каждым столбцом. Известно, что в пролиферирующих клетках содержание Alu-РНК очень низкое, в отличие от некоторых других РНК-продуктов генов класса III, прежде всего – тРНК и 5S рРНК. С другой стороны, показано, что в апоптотических клетках содержание тРНК 6 (кроме инициаторной тРНК) снижается, а согласно нашим данным, количество Alu-РНК значительно повышается. Невыясненным остается механизм, позволяющий клетке одновременно снижать синтез тРНК и повышать синтез Alu-РНК, при том, что гены обеих этих групп РНК имеют одинаковые промоторы. Одним из возможных механизмов является изменение метилирования последовательностей генов. Для проверки этой гипотезы мы исследовали метилирование AluYb8-повторов методом MethyLight. Было показано, что доля последовательностей AluYb8, метилированных в областях, комплементарных праймерам, составляла 92±6%, а неметилированных - 7±5%. Эти показатели не зависят от физиологического состояния клеток (рис. 5). Таким образом, повышение экспрессии Alu-повторов не сопровождается снижением уровня метилирования их последовательности. Следует отметить, что метод MethyLight позволяет исследовать метилирование лишь части CpG-сайтов Alu-повтора, а именно – CpG-сайтов, расположенных в участках, комплементарных используемым для ПЦР праймерам. Кроме того, в нашей работе были исследованы участки Alu-повторов, не включающие в себя промотор. Можно предположить, что влияние на транскрипцию будет оказывать метилирование именно CpG-сайтов, входящих в состав промотора, так как именно с промотором связываются базальные транскрипционные факторы TFIIIB и TFIIIC, которые затем привлекают в транскрипционный комплекс РНК-полимеразу III. Более того, недавно полученные данные свидетельствуют, что на транскрипцию генов класса III с внутригенным промотором (а именно – гена EBER-1 вируса Эпштейна-Барра) существенное влияние оказывает метилирование CpG-сайтов, расположенных не внутри гена, а в 5’-фланкирующей области. Можно предположить, что и в случае Alu-повторов достаточно высокий уровень метилирования, показанный в нашей работе, не препятствует экспрессии тех копий AluYb8, которые имеют гипометилированные 5’-фланкирующий области. Таким образом, в данной работе мы показали, что при переходе клетки к апоптозу в ней повышается содержание некоторых РНК-продуктов транскрипции РНК-полимерзы III – инициаторной тРНКiMet1 и Alu-РНК, синтезируемых с Alu-повторов молодых субсемейств. Мы полагаем, что данное изменение необходимо для реализации клеткой апоптотического пути, и что названные РНК-продукты, синтезируемые РНК- полимеразой III, могут играть важную роль в изменении физиологического статуса клетки, используя различные механизмы: активация синтеза de novo проапоптотических белков (тРНКiMet), нарушение структуры геномной ДНК при активации ретротранспозиции Alu, регуляция трансляции мРНК путем взаимодействия Alu-РНК с рибосомами и протеинкиназой PKR, активация внутриклеточных систем 7 неспецифического иммунитета под действием Alu-РНК. Однако все приведенные гипотезы требуют проведения дополнительных исследований с целью тщательной проверки. Также представляется важным дальнейшее изучение механизмов регуляции транскрипции генов инициаторной тРНКiMet1 и Alu-повторов, так как имеющиеся данные свидетельствуют, что уровень экспрессии различных генов, транскрибируемых РНКполимеразой III, различается в апоптотических клетках: он может как повышаться (в случае генов инициаторной тРНКiMet1 и Alu-повторов), так и снижаться (гены тРНК, участвующих в элонгации трансляции, гены 5S рРНК). Поэтому представляется необходимым выявить те факторы, которые определяют указанные различия в транскрипции каждой конкретной группы генов класса III. Наиболее перспективным нам кажется изучение уровня метилирования ДНК и доступности для связывания транскрипционных факторов промоторных и 5’-фланкирующих участков Alu-повторов, принадлежащих к молодым субсемействам, а также выявление специфичных белковых факторов, которые могут участвовать в регуляции транскрипции Alu-последовательностей в апоптотической клетке. Данные наших исследований были представлены на 12ой Пущинской школеконференции молодых ученых «Биология – наука 21го века» (Пущино, 2008 г) и опубликованы в 1 статье и 1 тезисах доклада на конференции. Публикации: Статья: Никитина Т.В., Гао Л., Карпачева К.Е., Тищенко Л.И. Изменение экспресии генов тРНК и Alu-повторов молодых субсемейств Ya5 и Yb8, транскрибируемых РНКполимеразой III, в клетках человека U937 при апоптозе, индуцированном камптотецином. // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. Вып. 1. 2009. С. 49-60. Тезисы: Карпачева К.Е., Гао Л., Никитина Т.В., Тищенко Л.И. Усиление экспрессии генов молодых субсемейств AluY в опухолевых клетках человека при апоптозе. // Материалы 12ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21го века». 2008.С. 30. Грант: Выигран грант DAAD и Роснауки на проведение исследования по теме «Исследование роли метилирования и доступности ДНК для связывания с транскрипционными факторами и РНК-полимеразой III в регуляции экспрессии молодых субсемейств Alu в клетках рака простаты человека» в лаборатории урологии под руководством профессора В.А. Шульца при Клинике Университета Генриха Гейне (Дюссельдорф, Германия) (шифр проекта: 1.2.97.2009; номер контракта заказчика: 2.2.2.3/8175) 8 Педагогическая нагрузка: 1. чтение курса лекций магистрам 1 курса «Трансляция – рибосомальный синтез белка» – 18 ч; 2. чтение курса лекций магистрам 2 курса «Разделы функциональной геномики» – 18 ч; 3. проведение практических занятий у магистров 2 курса (маг. программа «Молекулярная биология гена») по функциональной геномике - 18 ч. 4. проведение практических занятий у магистров 1 курса (маг. программа «Молекулярная биология гена») по курсу «Компьютерные технологии для анализа биомолекул» – 12 ч; 5. проведение практикума у магистров 1 курса «Методы анализа генома» – 36 ч; 6. спецсеминары по магистерской программе «Молекулярная биология гена» (1 и 2 курс магистратуры) – 30 ч; 7. рецензирование магистерских диссертаций и выпускных квалификационных работ бакалавров. Отчет заслушан и утвержден на заседании кафедры биохимии 8 мая 2009 г (протокол № 16). 8 мая 2009 г. ст. преподаватель, к.б.н. Т.В. Никитина секретарь кафедры биохимии, доцент, к.б.н. Е.В. Романовская заведующий кафедрой биохимии СПбГУ, проф. Е.Г. Скворцевич 9