ЭКО и ИКСИ - Global Fertility Academy
реклама
Предлагаем вашему вниманию главу 3. Эта глава называется «ЭКО и ИКСИ: технические аспекты». Автор темы: Hilde Van de Velde, PhD 1 В этой презентации рассмотрены две вспомогательные репродуктивные технологии — экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИКСИ). Эти методы применяются во всем мире, чтобы помочь семейным парам зачать ребенка. Вначале приведен обзор истории развития методов ЭКО и ИКСИ. Также презентация содержит теоретическую часть, касающуюся биологических аспектов репродукции, главным образом определенных этапов процесса оплодотворения. Кроме того, описываются некоторые технические аспекты этих методов. И, наконец, объясняется, какая из репродуктивных технологий будет наилучшим вариантом лечения у той или иной пары. 2 Бесплодие в семейной паре может быть следствием различных нарушений у каждого из партнеров. При женском бесплодии применяется метод ЭКО, а при мужском бесплодии — ИКСИ. Причинами бесплодия у женщин могут быть — овуляторные нарушения, отсутствие матки, непроходимость или отсутствие маточных труб, эндометриоз, гормональные нарушения , возраст. С этими проблемами возможно справиться, используя стандартный метод экстракорпорального оплодотворения. Бесплодие у мужчин может быть связано с плохим качеством спермы, а также — как и у женщин — с эндокринными нарушениями. С этими проблемами можно справиться, используя инъекцию сперматозоида в цитоплазму ооцита. В некоторых парах бесплодными могут быть оба партнера. 3 На слайде показаны различия между двумя методами ВРТ. При ЭКО ооцит оплодотворяется тысячами сперматозоидов, полученными из эякулята. Согласно предложению ВОЗ, нижней границей нормы качества спермы для ЭКО является наличие в образце после обработки 500 000 подвижных сперматозоидов с поступательным движением. С другой стороны, ИКСИ используется при плохом качестве спермы в эякуляте — при тяжелой олигозооспермии (низкой концентрации) и/или тяжелой астенозооспермии (низкой подвижности) и/или тяжелой тератозооспермии (плохой морфологии). 4 Впервые ЭКО было выполнено в 1959 г. в опытах на кроликах. Через 10 лет Р. Эдвардсом (Edwards) была осуществлена первая процедура ЭКО у человека. Первый ребенок из пробирки, Луиза Браун, родилась в 1978 г., это стало возможным благодаря Р. Эдвардсу (Edwards) и П. Стептоу (Steptoe). В настоящее время Луиза Браун замужем, и в 2006 году у семейной пары родился сын, зачатыйо естественным путем. С 1978 г. более 3 миллионов детей по всему миру родились при помощи стандартного метода ЭКО. 5 Основным принципом ЭКО является расположение подвижных сперматозоидов в непосредственной близости от яйцеклетки для того, чтобы произошло оплодотворение. Следовательно, при этом имитируется естественный процесс оплодотворения, так как сперматозоид должен самостоятельно проникнуть в ооцит, и отбор наилучшего сперматозоида происходит естественным путем. 6 В процессе ЭКО преодолеваются три естественных барьера. Первый барьер — это комплекс клеток кумулюса и лучистого венца, окружающих ооцит. Этот комплекс содержит полимеризованную гиалуроновую кислоту, которая расщепляется под действием фермента гиалуронидазы, выделяемого погибающими или погибшими сперматозоидами. Сперматозоид должен подвергнуться капацитации и иметь интактную акросому (подробно описывается в главе 5 модуля «ВРТ — основная подготовка»). 7 После того как сперматозоид проходит через комплекс клеток кумулюса и лучистого венца, он встречается со вторым барьером: прозрачной оболочкой (zona pellucida, ZP) ооцита. Эта оболочка имеет толщину 8–15 мкм и содержит гликопротеины (главным образом ZP-3). Только сперматозоид с нормальной морфологией и интактной акросомой способен прикрепиться к гликопротеину ZP-3. Акросома сперматозоида содержит протеолитический фермент для расщепления прозрачной оболочки. После прикрепления сперматозоида к прозрачной оболочке происходит акросомная реакция с высвобождением содержимого акросомы. Эта реакция, по всей вероятности, продолжается всего 10–15 минут (Harper и соавт., 2008). Ферменты расщепляют прозрачную оболочку, и сперматозоид может теперь попасть в перивителлиновое пространство. 8 В перивителлиновом пространстве сперматозоид должен преодолеть третий барьер: цитоплазматическую мембрану ооцита — оолемму. Слияние сперматозоида и ооцита приводит к высвобождению внутриклеточного кальция в ооците (индуцируется сперматозоидным фактором активации фосфолипазы C-zeta) и, как следствие, к выталкиванию кортикальных гранул в перивителлиновое пространство (кортикальная реакция). Гранулы содержат протеиназы, которые меняют структуру гликопротеинов ZP-3 и ZP-2, в результате чего прозрачная оболочка становится непроницаемой для других сперматозоидов (зонная реакция). Таким образом, полностью предотвращается риск оплодотворения более чем одним сперматозоидом (полиспермии). После кортикальной реакции структура цитоскелета ооцита меняется, и сперматозоид поглощается ооцитом путем фагоцитоза. Dozortsev D. и соавт., 1997 9 Для выполнения ЭКО сперму необходимо обработать. Эта процедура подробно описана в главе 2 «Обработка спермы для ЭКО и ИКСИ. Замораживание спермы» модуля «Эмбриология». При обработке удаляется семенная жидкость, чтобы произошла капацитация спермы. Капацитация повышает проницаемость цитоплазматической мембраны и активность сперматозоидов, а также подготавливает их к акросомной реакции. Кроме того, производится отбор подвижных сперматозоидов по градиенту плотности (90–45 %). Удаляются посторонние клетки — лейкоциты, незрелые сперматозоиды, эпителиальные клетки, а также фрагменты клеток. Sapienza и соавт., 1993 10 При ЭКО ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК), полученные после пункции фолликулов (описано в главе 1 данного модуля — «Пункция фолликулов и качество ооцитов»), культивируются в микрокаплях культуральной среды для оплодотворения in vitro, содержащей глюкозу, присутствие которой необходимо для оплодотворения. Сперматозоиды (обработанные согласно описанию в главе 2) добавляют к каждому ооциту, и гаметы культивируются вместе до утра. Через шестнадцать часов после оплодотворения выполняется денудация ооцитов путем повторного переноса пипеткой. Ооциты несколько раз промываются, чтобы удалить клетки кумулюса и лучистого венца, а также сперматозоиды. После этого выполняется дальнейшее культивирование в культуральной среде для дробления, содержащей пируват и не содержащей глюкозу. В это время можно оценить зрелость ооцитов и проверить, произошло ли оплодотворение. 11 На практике ОКК после получения культивируются в покрытых маслом каплях культуральной среды для оплодотворения in vitro объемом 25 мкл. Проверка идентификации гамет и объема взвеси сперматозоидов, подлежащей добавлению к каждому ооциту (1–5 микролитов, которые содержат 5000– 20 000 подвижных сперматозоидов с поступательным движением), выполняется двумя сотрудниками. 12 Сперматозоиды добавляются к ОКК после 13:00 часов, чтобы не пропустить время, когда становятся видимыми пронуклеусы — примерно через 19 часов после добавления сперматозоидов. Процедура выполняется в ламинарном потоке воздуха с визуализацией под стереомикроскопом с 10–40-х кратным увеличением. 13 Метод ИКСИ развивался в несколько этапов. Вначале Cohen и соавт. и Tucker и соавт. разработали технику частичного рассечения прозрачной оболочки. Они механическим путем вскрывали прозрачную оболочку, что позволяло сперматозоидам проникать в перивителлиновое пространство. Таким образом, преодолевался барьер из клеток кумулюса и лучистого венца и барьер прозрачной оболочки. На втором этапе развития метода подвижные сперматозоиды (3–20) вводились в перивителлиновое пространство при помощи стеклянной иглы. Эта техника разработана Laws-King и соавт. (1987) и Palermo и соавт. (1992). И, наконец, впервые сперматозоид был введен непосредственно внутрь яйцеклетки при помощи иглы в Центре репродуктивной медицины Университетской клиники г. Брюсселя (CRG of UZ Brussel). Первый ребенок в результате применения ИКСИ родился в 1992 г.; соответствующая статья была опубликована в 1993 г. Palermo и соавт. Этот метод революционным образом изменил репродуктивную медицину. 14 При ИКСИ на каждый зрелый ооцит требуется всего лишь один сперматозоид. ИКСИ рекомендуется в двух следующих ситуациях: 1) неудачные попытки оплодотворения в двух или более циклах ЭКО 2) плохое качество спермы вследствие тяжелой олигозооспермии и/или тяжелой астенозооспермии и/или тяжелой тератозооспермии. 15 Сперматозоиды можно свободно выделить из эякулята, полученного путем мастурбации, а при нарушениях эякуляции – путем вибростимуляции, при параплегии – при помощи электростимуляции. Для ИКСИ можно использовать сперматозоиды не только из эякулята. Возможно получение сперматозоидов из яичка и из придатка яичка (описывается в главе 4 данного модуля – «Практическое ведение пациентов, нуждающихся в ЭКО, с применением методик ТЕЗЕ/ТЕЗА/ПЕЗА: свежие и замороженные образцы»). 16 При ИКСИ преодолеваются все три барьера, которые сперматозоид должен пройти в процессе естественного оплодотворения и обычного ЭКО: клетки кумулюса и лучистого венца удаляются, чтобы определить зрелость ооцитов до инъекции и чтобы можно было выполнить инъекцию сперматозоида. Денудация ооцитов выполняется в два этапа (описанных Van de Velde и соавт.), при помощи фермента гиалуронидазы на первом этапе и механически, путем переноса пипеткой, на втором этапе. Два других барьера, прозрачная оболочка и оолемма, преодолеваются путем прямой инъекции в ооцит. Nagy et al., 1995 (a) Nagy et al., 1995 (b) Van de Velde et al., 1997 Van de Velde et al., 1998 17 Для оплодотворения путем ИКСИ сперматозоид должен быть жизнеспособным. Единственным прямым способом определения жизнеспособности является оценка подвижности. Принято относить активноподвижные сперматозоиды с поступательным движением к классу А, малоподвижные с поступательным движением — к классу В, малоподвижные с отсутствием поступательного движения — к классу С, и неподвижные сперматозоиды — к классу D (подробно описывается в главе 2 данного модуля). 18 Даже при неподвижности сперматозоидов возможны несколько вариантов лечения. Оплодотворение невозможно только при некрозооспермии, когда сперматозоиды нежизнеспособны. Для оценки жизнеспособности сперматозоидов можно провести эозиновый тест на жизнеспособность. Однако тест является инвазивным, и эти сперматозоиды нельзя использовать для инъекции. Существует четыре процедуры отбора жизнеспособных неподвижных сперматозоидов: 1) тест иммобилизации хвоста или метод механического контакта для отбора жизнеспособных сперматозоидов, представлен de Oliveira и соавт. в 2004 г.; 2) обработка пентоксифиллином для активации сперматозоидов — метод описан Terriou и соавт. в 2000 г.; 3) набухание хвостов сперматозоидов в гипоосмотической среде, которая представляет собой культуральную среду, разбавленную водой в равных соотношениях (тест HOS); 4) нагревание хвоста сперматозоида лазерным ударом [лазерный отбор неподвижных сперматозоидов (laser assisted immotile sperm selection, LAISS)]. 19 На результаты ИКСИ может влиять качество гамет. Несмотря на то, что метод ИКСИ является наилучшим вариантом лечения для пар с мужским бесплодием, он не решает всех проблем. Как сообщалось Nagy и соавт. в 1995 г., результаты ИКСИ не зависят от таких трех параметров спермы, как концентрация, подвижность и морфология. Также, согласно сообщению De Vos и соавт., морфология инъецируемого сперматозоида не оказывает значимого влияния на результат цикла ИКСИ. Однако отбор сперматозоидов с лучшими морфологическими характеристиками под 1500-кратным увеличением — так называемая «инъекция морфологически отобранного сперматозоида в цитоплазму ооцита», или ИМСИ, может давать более высокие показатели частоты наступления беременности, как сообщалось Antinori и соавт. в 2008 г. В частности, наличие вакуолей в акросоме может влиять на исход беременности после ИКСИ. Этот вопрос более подробно рассматривается в главе 14 данного модуля [«Особые методики: ИМСИ - инъекция морфологически отобранного сперматозоида в цитоплазму ооцита)»]. Если сперматозоид не в состоянии активировать ооцит, можно использовать иономицин, чтобы индуцировать выделение кальция (что в норме происходит при оплодотворении и индуцируется сперматозоидным фактором активации фосфолипазы С-zeta). Данный метод, описанный Heindrickx и соавт. (2005) может использоваться у пациентов с глобозооспермией (сперматозоиды с круглой головкой, без акросомы) и при повторных неудачных попытках оплодотворения путем ИКСИ. 20 20 Качество ооцитов может также влиять на результаты ИКСИ (более подробно описывается в главе «Получение ооцитов и качество ооцитов») — а именно наличие скопления гладкого эндоплазматического ретикулума (Ebner и соавт., 2008), вакуолей (Ebner и соавт., 2005), грануляции (Kahraman и соавт., 2000) и липофусциновых телец (Otsuki и соавт., 2007). 21 Если пациентам проводится преимплантационная генетическая диагностика, рекомендуется использовать ИКСИ, а не стандартное ЭКО по двум следующим причинам: 1) чтобы избежать неудачных попыток оплодотворения; 2) чтобы избежать (при проводимой впоследствии ПЦР) контаминации окружающими клетками кумулюса и лучистого венца, а также сперматозоидами, добавляемыми к кумулюс-ооцитарным комплексам при процедуре стандартного ЭКО. Чтобы избежать контаминации сперматозоидами при ИКСИ, используется весьма ограниченное количество сперматозоидов, а инъекционная микропипетка во время процедуры ИКСИ тщательно промывается. 22 Процедура ИКСИ проводится под инвертированным микроскопом при большом увеличении (400-хкратном). Для процедуры используются два набора инструментов, по одному для каждой руки: 1) гидравлический или электрический микроманипулятор, позволяющий выполнять микроманипуляции в трех измерениях; 2) инъектор, который можно использовать для инъекций небольшого объема при ИКСИ и для аспирации бластомера при преимплантационной генетической диагностике (описывается в главе «Основы генетической диагностики и биопсии эмбрионов»). 23 На рисунке показан инвертированный микроскоп с двумя наборами манипуляторов и инъекторов. 24 Для осуществления ИКСИ важно правильно центрировать микроприсоску и инъекционную микропипетку под инвертированным микроскопом при большом увеличении (400х). Принято располагать микроприсоску в положении 9 часов, а инъекционную микропипетку — в положении 3 часов. 25 Для денудации ооцитов перед ИКСИ производится ферментативное удаление кумулюсных клеток при помощи 10–40 МЕ/мл гиалуронидазы [желательно рекомбинантной, не содержащей компонентов животного происхождения (de Vos и соавт., 2008)]. После непродолжительного переноса пипеткой ооциты переводятся в культуральную среду, не содержащую гиалуронидазу, и оставшиеся клетки лучистого венца удаляются механически, путем повторного переноса пипеткой небольшого диаметра. 26 Чашка Петри для ИКСИ готовится таким образом, чтобы можно было последовательно выполнить инъекции в несколько ооцитов (обычно 8 ооцитов в 8 каплях объемом 5 микролитов располагаются в форме квадрата, состоящего из 9 капель, как показано на рисунке). Центральная капля содержит поливинилпирролидон (ПВП) и сперматозоиды. Инъекция выполняется в покрытой маслом культуральной среде с буфером Hepes. ПВП используется для того, чтобы контролировать движение инъекционной микропипетки, замедлять сперматозоиды с высокой подвижностью и чтобы создать условия для перемещения подвижных сперматозоидов, и, следовательно, для их отбора. Если сперматозоиды добавляются с одной стороны капли ПВП (например, в области 6 часов), их можно извлекать с другой стороны (например, в области 3 часов). 27 Перед процедурой ИКСИ, так же как при выполнении стандартного ЭКО, требуется проведение идентификации гамет двумя сотрудниками (принцип двойной проверки). Отбираются сперматозоиды с поступательным движением и с нормальной или близкой к нормальной морфологией. Перед ИКСИ сперматозоид иммобилизуется (сперматозоид блокируется/удерживается за срединную часть хвоста при помощи инъекционной микропипетки и хвост перетирается несколькими движениями таким образом, чтобы головка провернулась над поверхностью пластиковой чашки), так контролируется его положение в инъекционной микропипетке. Движущийся сперматозоид может повредить ооцит. При иммобилизации сперматозоида появляются отверстия в его мембране, и становится возможным высвобождение сперматозоидного фактора активации, фосфолипазы C-zeta, что описал Dozortsev и соавт. в 1997 г. Фосфолипаза C-zeta активирует выделение ооцитами факторов деконденсации хроматина ядра сперматозоида. Следует соблюдать осторожность при манипуляциях со сперматозоидами: при слишком длительном нахожденни в ПВП сперматозоид может утратить сперматозоидный фактор активации. Кроме того, при иммобилизации не следует захватывать сперматозоид вблизи его головки, чтобы не задеть центриоль, так как это может привести к разрушению астера первого митотического деления. Dozortsev et al., 1995 28 Принято помещать ооцит так, чтобы его первое полярное тельце находилось в области 6 или 12 часов. Ооцит фиксируется в нужном положении при помощи микроприсоски в области 9 часов, инъекция выполняется в области 3 часов. Микроприсоска, микропипетка и ооцит должны находиться в фокусе микроскопа под 400-кратным увеличением. Сперматозоид помещается в кончик микропипетки. 29 Инъекцию нужно выполнять непрерывным движением. При проталкивании инъекционной микропипетки в ооцит сразу же прокалывается прозрачная оболочка. В большинстве процедур ИКСИ оолемма остается неповрежденной, и ее следует аккуратно аспирировать. 30 Оолемма разрывается несколькими способами. Тип А — оолемма разрывается при проколе прозрачной оболочки. Тип В — оолемма разрывается после аспирации небольшого объема. Тип С — оолемма разрывается после значительной аспирации. Тип D — оолемма не разрывается, поэтому требуется вновь ввести микропипетку и затем провести аспирацию небольшого объема. Тип Е — оолемма не разрывается, поэтому требуется вновь ввести микропипетку и затем провести значительную аспирацию. 31 После прокола оолеммы сперматозоид аккуратно помещают в ооплазму. Избегайте введения слишком большого количества ПВП в ооцит. Также не следует перемещать пипетку в ооците, так как это может привести к нарушению оплодотворения вследствие физического раздражения мейотического веретена (собственный опыт). Инъекционная микропипетка аккуратно извлекается. 32 Инъекцию сперматозоида желательно выполнять после 13:00 часов, чтобы не пропустить время, когда становятся видимыми пронуклеусы — примерно через 19 часов после инъекции. Nagy и соавт. показали в 1994 г., что большинство пронуклеусов можно наблюдать через 16 часов после инъекции. После инъекции ооциты по одному отмываются и культивируются до самого утра в микрокаплях культуральной среды для дробления объемом 5 мкл (описывается в главе 6 данного модуля, «Культивирование эмбриона»). 33 Процедурам ИКСИ следует обучаться поэтапно, под наблюдением опытного эмбриолога: На первом этапе изучается манипуляция с гаметами, в частности, микроманипуляция со сперматозоидами. На втором этапе выполняется ИКСИ на созревших в условиях in vitro ооцитах и ооцитах, не оплодотворенных после ЭКО, с использованием образцов спермы умеренного качества. На третьем этапе практикуются на одном или двух ооцитах, полученных от пациентки. На четвертом учатся работать на половине ооцитов, полученных от пациентки. На пятом этапе — работают со всеми ооцитами. И, наконец, следует провести обучение работе в случаях тяжелой олигоастенотератоспермии, включая методы ТЕЗЕ, ТЕЗА и ПЕЗА. 34 Выполнение ИКСИ должно отслеживаться у каждого эмбриолога при помощи системы контроля качества, позволяющей немедленно вмешаться в процесс, если ИКСИ проводится ненадлежащим образом. Эмбриолог должен получать следующие показатели (в расчете на ооцит, в который вводится сперматозоид): частота оплодотворения не ниже 70 %, частота дегенерации менее 10 %, частота активации менее 5 % и частота нарушения оплодотворения менее 5 %. 35 Нижней границей нормы для выполнения ЭКО является наличие в обработанном образце 500 000 подвижных сперматозоидов с поступательным движением. При стандартном ЭКО к каждому ооциту добавляется 5000 подвижных сперматозоидов с поступательным движением. В случаях тератозооспермии можно использовать оплодотворение с высокой концентрацией сперматозоидов, с добавлением к каждому ооциту 20 000 сперматозоидов с поступательным движением. Однако применение этого метода может сопровождаться высокой частотой нарушения оплодотворения. В первых циклах лечения с использованием спермы пограничного качества можно использовать оба метода, ЭКО и ИКСИ, с последующим сравнением ооцитов (полученных в одном цикле) — чтобы выбрать наилучший метод терапии для следующего цикла. В представленном Verheyen и соавт. в 1999 г. исследовании было показано, что при астенозооспермии частота оплодотворения (рассчитанная как процентное отношение количества ооцитов с двумя пронуклеусами 2PN к количеству ОКК) после применения ЭКО значимо ниже, чем после ИКСИ. Частота неудачных попыток оплодотворения после ЭКО составляла 50 % и это убедительно показывает, что применение ИКСИ может предотвратить неудачные попытки оплодотворения в подобных случаях. Что касается трубного бесплодия, Staessen и соавт. в 1999 г. продемонстрировали отсутствие различий по частоте оплодотворения при 36 использовании ЭКО и ИКСИ, следовательно, предпочтительным методом здесь является ЭКО. И, наконец, Tournaye и соавт. в 2002 г. продемонстрировали, что в случаях использования спермы пограничного качества показатели частоты оплодотворения были лучше после ИКСИ, чем после обычного ЭКО. В то же время ИКСИ не имело преимуществ перед ЭКО при оплодотворении высокой концентрацией сперматозоидов. Частота неудачных попыток оплодотворения после ЭКО составляла 25,7 %, а после ЭКО с оплодотворением высокой концентрацией сперматозоидов — только 5,3 %. 36 Итак, из всех методов ВРТ наиболее естественным является ЭКО. Этот метод является наилучшим вариантом лечения при женском бесплодии, если в обработанном образце спермы имеется не менее 500 000 подвижных сперматозоидов с поступательным движением. ИКСИ является наилучшим вариантом лечения при мужском бесплодии, так как здесь нужен только один сперматозоид на одну яйцеклетку. В процессе ИКСИ преодолеваются три естественных барьера: барьер кумулюс-лучистый венец, прозрачная оболочка и оолемма ооцита. ИКСИ является наилучшим вариантом лечения при тяжелой олигозооспермии и/или тяжелой астенозооспермии и/или тяжелой тератозооспермии. 37 Если в первом цикле ВРТ качество используемой спермы представляется слишком плохим, чтобы выполнить ЭКО, особенно при умеренной астенозооспермии и/или тератозооспермии, можно провести и ЭКО, и ИКСИ на полученных в одном цикле ооцитах и сравнить результаты, чтобы избежать неудачных попыток оплодотворения в результате ЭКО. 38 Обзор литературных источников, упоминавшихся в данной главе. 39 40 41 42 43
