МАКАРЕНКО ИГОРЬ ЕВГЕНЬЕВИЧ БИОЛОГИЧЕСКИЕ

На правах рукописи
МАКАРЕНКО ИГОРЬ ЕВГЕНЬЕВИЧ
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ
СОЕДИНЕНИЙ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ,
ОБЛАДАЮЩИХ ИНКРЕТИНОПОДОБНЫМ ДЕЙСТВИЕМ
03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
2016
2
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении
высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный
медицинский университет им. И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения
Российской Федерации
Научный руководитель:
Доктор медицинских наук, профессор
Макаров Валерий Геннадьевич
Официальные оппоненты:
Антонов Виктор Георгиевич, доктор медицинских наук, Федеральное государственное
бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования «Военномедицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской
Федерации, кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики, доцент
кафедры
Субботина Татьяна Федоровна, доктор медицинских наук, доцент, Государственное
бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
«Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П.
Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Отдел биохимии
Научно-исследовательского центра, Лаборатория биохимического мониторинга,
заведующая лабораторией
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная
химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской
Федерации
Защита состоится « » ______ 2016 г. в __ часов на заседании Диссертационного
совета Д 001.022.03 на базе Федерального государственного бюджетного научного
учреждения «Институт экспериментальной медицины» (197376, Санкт-Петербург, ул.
Акад. Павлова, д. 12) по адресу: 197376, Санкт- Петербург, Каменноостровский пр., д.
69/71
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного
бюджетного учреждения «Институт экспериментальной медицины» по адресу: 197376,
Санкт-Петербург,
ул.
Акад.
Павлова,
д.
12,
и
на
сайте
http://www.iemrams.spb.ru/russian/dissov03.htm
Автореферат разослан « » ____________ 2016 г
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук
Хныченко Людмила Константиновна
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
В настоящее время заболевания, обусловленные патологией углеводного обмена
(сахарный диабет, метаболический синдром), являются социально значимой проблемой.
Данные заболевания, в частности, сахарный диабет (СД) демонстрируют
стремительную распространенность. Число больных СД в России в 2000 году
составляло 2,067 млн., а в 2010 году уже было зарегистрировано 3,16 млн. случаев
(Дедов И.И. и др. 2013). Ежегодно количество больных СД возрастает на 6-10% и
удваивается в течение 12-15 лет (Сунцов Ю.И. и др., 2011). Примерно 90% от общего
числа больных сахарным диабетом приходится на II тип болезни (СД2). Кроме того
развитие СД2 сопровождается возникновением сопутствующих заболеваний:
артериальной гипертензией, ангиопатией, ожирением, дислипопротеинемией.
В настоящее время для лечения СД2 используют комбинированную терапию.
Золотой стандарт терапии СД2 включает прием метформина с препаратами
сульфонилмочевины. Однако на фоне применения данной комбинации не достигается
полного контроля гипергликемии, может отмечаться чрезмерная гипогликемия и даже
наблюдается увеличение массы тела (Nauck M. et al., 2009). Кроме того применение
препаратов сульфонилмочевины может способствовать развитию сердечнососудистых
осложнений (Недосугова Л. В., 2013).
В связи с вышеперечисленным продолжается поиск биохимических мишеней для
коррекции патологии углеводного обмена, в частности для лечения СД2.
В последние годы особое внимание во всем мире уделяется изучению роли гормонов
и гормоно-подобных веществ желудочно-кишечного тракта в регуляции секреции
инсулина. Одним из наиболее перспективных гормоноподобных веществ, влияющих на
гомеостаз глюкозы является глюкагонподобный пептид 1 (ГПП-1), а именно его
наиболее активной формы ГПП-1(7-36) амид (Green B. D., Flatt P. R., 2007).
Повышение уровня ГПП-1 приводит к увеличению синтеза и секреции инсулина в
кровь, замедляет опорожнение желудка, вызывает чувство сытости и снижает риск
развития артериальной гипертензии. ГПП-1 ингибирует секрецию глюкагона и
повышает количество β клеток поджелудочной железы, стимулируя их неогенез и
тормозя апоптоз (Perfetti R., Hui H. 2004; Chon S. et al, 2014). Поэтому актуальным
является поиск новых веществ, реализующих свое действие посредством
инкретиноподобного эффекта. В настоящее время одним из основных источников для
получения биологически активных веществ являются гидробионты. В связи с богатым
аминокислотным и минеральным составом гидробионты успешно применяются как
средства стимулирующие работу мозга, регулирующие сахар крови, оказывающие
иммуномодулирующий эффект (Zhang Y. J. et al., 2013).
Степень разработанности темы исследования
Особенностью ГПП-1 является его короткий период жизни (4-5 минут) в силу
быстрой инактивации посредством фермента ДПП-4 (Hansen L. et al., 1999).
Большинство
существующих
на
настоящей
момент
ингибиторов
дипептидилпептидазы 4 типа (ДПП-4) синтетического происхождения, их применение
приводит к 90-100% ингибированию фермента, что является не желательным, поскольку
ДПП-4 играет роль в множестве естественных биохимических процессов организма, в
частности, в активации иммунной системы и противораковом иммунитете, что
4
увеличивает риск развития онкологических заболеваний поджелудочной и щитовидной
железы на фоне их применения (Mentlein R., 1999; Vangoitsenhoven R., et al., 2012).
Кроме того полное ингибирование ДПП-4 значительно снижает образование
активного метаболита ГПП-1(9-36)амид, который подавляет продукцию глюкозы
печенью за счет дефосфорилирования гликогенфосфорилазы, а также значительно
потенцирует действие ГПП-1 (7-36) амид.
На сегодняшний день в мире нет зарегистрированных препаратов – ингибиторов
ДПП-4 природного происхождения. Однако есть сообщение о наличии у некоторых
коротких пептидов ингибирующего действия в отношении ДПП-4 (Lan V. T. T. et al.
2014).
Особый интерес для выделения комплекса биологически активных веществ для
лечения диабета представляет морской еж Strongylocentrotus droebachiensis., поскольку в
нем содержится широкий набор пептидов, потенциально обладающих анти ДПП-4
активностью (Liyana-Pathirana C. et al., 2002).
.
Цель исследования
Цель исследования – изучение биологических эффектов соединений природного
происхождения из морского ежа обладающих инкретиноподобным действием, с
последующим установлением их механизмов действия.
Задачи исследования
1.
Оценить ингибирующее действие стандартизированных экстрактов
зеленого морского ежа S. droebachiensis в отношении фермента ДПП-4 плазмы крови
крыс in vitro с последующим изучением реализации их влияния в условиях in vivo на
модели экспериментального сахарного диабета. Выбрать наиболее перспективный
стандартизированный экстракт.
2.
Изучить влияние наиболее перспективного экстракта зеленого морского
ежа на активность фермента ДПП-4 (рекомбинантного человеческого и нативного
крысиного), установить основные кинетические показатели, отражающие характер
ингибирования (Vmax, Km), определить тип ингибирования и видовые особенности
активности фермента. Оценить интенсивность и сроки реализации ингибирования ДПП4 исследуемым веществом в живом организме.
3.
Изучить влияние экстракта зеленого морского ежа на уровень глюкозы,
артериальное давление и атерогенный индекс в условиях экспериментального
метаболического синдрома.
4.
Изучить противовоспалительные свойства экстракта зеленого морского
ежа, как возможного механизма восстановления функции инсулинового рецептора,
снятия инсулинорезистентности.
5.
Оценить возможное негативное влияние экстракта зеленого морского ежа
на основные биохимические показатели при длительном (360 дней) ежедневном
введении интактным лабораторным животным.
Научная новизна исследования
В ходе данной работы было рассмотрено восемь стандартизированных экстрактов
зеленого морского ежа Strongylocentrotus droebachiensis с точки зрения наличия у них
инкретиноподобного действия, реализованного посредством ингибирования ДПП-4. С
использованием современных биохимических методов выбрано одно перспективное
5
соединение (КЛС-073). У данного соединения был проведен углубленный анализ
инкретиноподобных механизмов действия.
Была проведена валидация методики определения активности ДПП-4 in vitro с
использованием рекомбинантного человеческого фермента и фермента, содержащегося
в плазме крови крыс. Впервые было доказано наличие у экстракта икры зеленого
морского ежа S. droebachiensis ингибирующего действия в отношении активности
фермента ДПП-4 и противовоспалительной активности посредством ингибирования
фосфорилирования МАРК р-38.
Впервые в условиях патологии углеводного обмена (СД2, метаболический
синдром)
у стандартизированного экстракта икры зеленого морского ежа S.
droebachiensis доказано выраженное антигипергликемическое действие.
Впервые у экстракта икры морского ежа выявлен антигипертензивный эффект,
связанный с увеличением синтеза оксида азота в эндотелии сосудов.
Научно-практическая значимость
Валидированная методика оценки ингибирующей активности веществ в
отношении дипептидилпептидазы 4-го типа с использованием рекомбинантного
человеческого фермента внедрена в научно-производственную практику ООО
«Технология лекарств» как метод скрининга новых кандидатов в лекарственные
средства. Материалы диссертации вошли в учебные программы и используются в
лекционных курсах и на практических занятиях кафедр биологической и общей химии и
фармакологии ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова.
Методология и методы исследования
Методология исследования включала оценку биохимических эффектов и механизмов
действия соединений природного происхождения, обладающих инкретиноподобным
действием «in vivo» и «in vitro».
Модели «in vivo» включали исследование влияния стандартизированных экстрактов
на основные биохимические звенья патологии углеводного обмена в условиях
экспериментальной модели сахарного диабета второго типа у мышей, метаболического
синдрома у спонтанно гипертензивных крыс (крысы линии SHR), оценку
ингибирующего действия в отношении фермента ДПП-4 при однократном
внутрижелудочном введении крысам.
Биохимические механизмы действия стандартизированного экстракта устанавливали
в условиях in vitro на заранее валидированных методиках с использованием в качестве
хроматогенного субстрата глицил-L-пролин-п-нитроанилида.
Клеточная линия аденокарциномы легкого человека (A549) была использована для
оценки возможного цитотоксического действия стандартизированного экстракта. Для
анализа влияния на ЛПС-индуцированное фосфорилирование MAP-киназ использовали
клеточную линию моноцитов человека U937 с последующим разделением белков
клеточного лизата методом гель-электрофореза и определения фосфорилированных
форм белков p38 методом Вестерн-блот.
Положения, выносимые на защиту
1.
Установлено ингибирующее действие стандартизированного экстракта
икры морского ежа S. droebachiensis КЛС-073 в отношение активности ДПП-4 плазмы
крови крыс. Применение КЛС-073 в условиях экспериментального сахарного диабета
оказало выраженное антигипергликемическое действие.
6
2.
Изучено влияние перспективного экстракта зеленого морского ежа КЛС073 на основные кинетические показатели, отражающие характер ингибирования ДПП-4
(Vmax=0,0105 о.е./мин, Km=0,842 мМ). Определен тип ингибирования – конкурентный.
Доказано, что в отношении рекомбинантного человеческого фермента ДПП-4 КЛС-073
проявляет более выраженное ингибирующее действие. Введение экстракта КЛС-073 в
организм экспериментальных животных привело к равноэффективному ингибированию
ДПП-4 в дозах 10-100 мг/кг (на 25% в течение суток после введения).
3.
В условиях экспериментального метаболического синдрома у КЛС-073
установлено выраженное антиатерогеное и антигипергликемическое действие. Показана
способность КЛС-073 оказывать антигипертензивный эффект за счет увеличения
синтеза NO.
4.
В условиях in vitro, на модели LPS-индуцированного воспаления
установлена противовоспалительная активность КЛС-073 – ингибирование
фосфорилирования МАРК р-38, что ведет к восстановлению функции инсулинового
рецептора, снятия инсулинорезистентности.
5.
В условиях длительного (360 дней) ежедневного введения КЛС-073
аутбредным мышам в дозах 2-20 мг/кг было установлено отсутствие у
стандартизированного экстракта влияния на основные биохимические показатели крови,
что позволяет предположить его относительную безопасность при длительном
применении.
Степень достоверности и апробация материалов исследования
Степень достоверности определяется достаточным для статистической обработки
данных количеством экспериментальных животных 145 крыс и 460 мышей в
экспериментах in vivo, постановкой нескольких параллелей в экспериментах на
клеточных линиях и in vitro.
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на XVII
Международном съезде «Phytopharm 2013», 61-ом Международном конгрессе
«International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural
Product Research 2013», IV Всероссийской конференции с международным участием
«Профилактическая медицина 2014», Российской научной конференции «Фармакология
экстремальных состояний 2015», XIX Международном съезде «Phytopharm 2015».
Апробация диссертации прошла на межкафедральном заседании от 28 мая 2015 года
Государственного
бюджетного
образовательного
учреждения
высшего
профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский
университет имени И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения Российской
Федерации.
Личное участие автора в выполнении исследования
Исследования были выполнены на базе кафедры биологической и общей химии
СЗГМУ им. И.И. Мечникова. Автор лично осуществлял планирование экспериментов и
их непосредственное выполнение, статистическую обработку полученных результатов,
обсуждение, написание статей, тезисов и докладов, диссертации и автореферата.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания
материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований и их
обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 148
7
страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 таблицами, 30 схемами и
рисунками. Список литературы включает 203 источника.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1 представляет собой обзор литературы, посвященный биохимическим
аспектам развития сахарного диабета второго типа, роли глюкагоноподобного пептида 1
(7-36) амид в коррекции патологических состояний углеводного обмена.
Глава 2 отражает основные методы и экспериментальные модели исследования,
которые были использованы при выполнении диссертационной работы.
Глава 3 содержит результаты собственных исследований и их обсуждение.
Глава 4 содержит заключение о выполненной работе.
Глава 5 содержит выводы, научно-практические рекомендации и список
использованной литературы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования
В качестве объекта исследования использовали восемь стандартизированных
экстрактов зеленого морского ежа S. droebachiensis. Исследуемые объекты были
получены, разными методами экстракции из разных частей ежа: внутренних органов
(КЛС-070; КЛС-074; КЛС-075); икры (КЛС-071; КЛС-070; КЛС-073); целомической
жидкости (КЛС-076; КЛС-077).
По результатам первых двух этапов исследования только КЛС-073 проявил действие
в отношении ингибирования активности ДПП-4 in vitro и in vivo.
КЛС-073 – комплекс из гонад морских ежей S. droebachiensis, предварительно
очищенный от балластных веществ смесью хлороформа и этанола, выделен экстракцией
этанолом при комнатной температуре с последующей лиофилизацией. КЛС-073
содержит природные биологически активные вещества в следующих количествах:
сложные липиды, свободные жирные кислоты и стерины 45-70%, из них
фосфолипиды - 8-20%; пептиды и аминокислоты - 25-40%; каротиноиды и токоферолы
около 2,0%. При помощи иммуноферментного анализа (PG Screening EIA Kit, Cayman)
было установлено содержание в КЛС-073 простаноидов в количестве 300-400 пг/мг
экстракта.
Определение активности ДПП-4 in vitro, расчет константы Михаэлиса (Кm)
Определение активности ферментов ДПП-4 (рекомбинантного человеческого
фермента и фермента плазмы крови крыс) проводили с использованием в качестве
хромогенного субстрата глицил-L-пролин-п-нитроанилида, из которого под действием
ДПП-4 образуются дипептид
глицил-L-пролин (Гли-Про) и п-нитроанилид. В
присутствии ингибиторов ДПП-4 концентрация продуктов реакции снижается.
Аналитическую часть исследования проводили в 96-луночных планшетах. В ряды
лунок вносили 20 мкл плазмы крови крыс или раствора фермента (0,025 МЕ/мл) и 40
мкл рабочего буферного раствора. Затем во все лунки добавляли 40 мкл раствора
субстрата (1 мкмоль/мл) для начала реакции, после чего планшет инкубировали 30 мин
при 37 ºС. В течение этого времени измеряли оптическую плотность реакционной смеси
при 405 нм каждые 5 минут. После определения оптической плотности вычисляли %
ингибирования фермента стандартизированными экстрактами и стандартным объектом.
8
Для определения константы Михаэлиса (Кm) проводили аналогичные манипуляции,
с использованием разной концентрации субстрата (0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1,2 и 1,8
мкмоль/мл.). Строили зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации
субстрата (S, мкмоль/мл) для образцов без ингибитора и с добавлением ингибитора
(КЛС-073). По характеру зависимостей делали вывод о типе ингибирования.
Для расчѐта Км применяли графический способ, используя двойные обратные
координаты Лайнуивера-Берка, т.е. строили зависимости 1/v от 1/[S].
Модель стрептозотоцин-никатинамид индуцированного сахарного диабета
Экспериментальный сахарный диабет моделировали однократной инъекцией
стрептозотоцина (60 мг/кг внутрибрюшинно) с предварительным, за 15 минут,
введением никотинамида (внутрибрюшинно, 210 мг/кг). Животные были распределены
на 14 экспериментальных групп по 10 голов в каждой: 1 группа - интактная; 2 группа контрольная (патология без лечения), была разделена на 2 подгруппы а и б ( группа 2а в
качестве плацебо получала кукурузное масло, 2б раствор метилцеллюлозы); с 3 по 11
группы получали КЛС-071, КЛС-072 и КЛС-073 в трех дозах ( экстракты растворяли в
кукурузном масле); 13 и 14 группы препаратов сравнения – метформин и ситаглиптин
(растворяли в 0,25% водном растворе метилцеллюлозы). Объекты исследования вводили
животным ежедневно в течении 14-ти дней, начиная с 10-го дня после индукции
патологии. Оценка действия исследуемых веществ (ИВ) включала в себя определение
уровня глюкозы крови в динамике (до, на 5 и 10 день введения) и постмортальное
определение концентрации восстановленного глутатиона (ВГ), малонового диальдегида
(МДА) и стабильных метаболитов оксида азота (СМОА) в плазме крови животных.
Определение глюкозы проводили с помощью глюкометра OneTouch Horizоn. Метод
определения глюкозы электрохимический, в основе которого биосенсорный глюкозо –
оксидазный принцип. Линейный диапазон измерения 1,1 – 33,3 ммоль/л.
МДА определяли в сыворотке крови. Принцип метода основан на реакции МДА с
тиобарбитуровой кислотой, которая при высокой температуре и кислом значении рН
протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса. Оптическую
плотность раствора определяли на планшетном спектрофотометре при длине волны 532
нм. Предварительно методика определения была валидирована в условиях нашей
лаборатории. Линейный диапазон методики - 0,67 – 3,77 мкмоль/мл анализируемого
раствора. Предел обнаружения 0,045 мкмоль/мл. С целью попадания в линейный
диапазон перед измерениями пробы разводили в 6 раз.
ВГ определяли в гемолизате эритроцитов. Для определения ВГ использовали метод,
основанный на способности кислоторастворимых тиоловых группировок при
взаимодействии с
5,5’-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой) (реактив Элмана)
образовывать окрашенное соединение – тио-2-нитробензойную кислоту. Оптическую
плотность раствора определяли на планшетном спектрофотометре при длине волны 412
нм. Предварительно методика определения была валидирована в условиях нашей
лаборатории. Линейный диапазон методики - 0,1 – 0,8 ммоль/л. анализируемого
раствора. Предел обнаружения - 0,02 ммоль/л.
Уровень стабильных метаболитов оксида азота (СМОА) определяли в плазме крови,
в качестве антикоагулянта использовали гепарин. Принцип метода основан на реакции
NO с раствором хлорида ванадия (III), 10%-ном реактивом Грисса и 5% HCl. Количество
СМОА определяли по продукту реакции (нитрат калия) спектрофотометрически при
длине волны 525 нм. Предварительно методика определения была валидирована в
9
условиях нашей лаборатории. Линейный диапазон методики - 60 – 600 мкмоль/л.
Предел обнаружения - 5,4 мкмоль/л.
Определение ингибирующей активности КЛС-073 in vivo
Исследование ингибирующей активности проводили при внутрижелудочном
введении стандартизированного экстракта (КЛС-073) и контрольного вещества
(ситаглиптин) аутбредным крысам-самцам. Было сформировано 8 групп животных по 10
голов в каждой: 1 и 2 - контрольные группы; с 3 по 6 группы получавшие КЛС-073 в
четырех дозах: 0,1 мг/кг, 1,0 мг/кг, 10 мг/кг и 100 мг/кг; 7 и 8 группы получали препарат
сравнения ситаглиптин в дозах 10 и 100 мг/кг соответственно.
В качестве растворителя для КЛС-073 использовали кукурузное масло, для препарата
сравнения ситаглиптин – 0,25% водный раствор метилцеллюлозы.
Для исключения влияния растворителей на активность ДПП-4, контрольной группе 1
вводили кукурузное масло, контрольной группе 2 0,25% раствор метилцеллюлозы.
Объемы для введения во всех группах составили 10 мл/кг.
Активность ДПП-4 оценивали в плазме крови животных до введения, через 1, 6 и 24
часа после введения КЛС-073 и стандартного объекта. Кровь для анализа отбирали из
хвостовой вены в объеме 0,5 мл в пластиковые эппендорфы с гепарином (15 мкл в
каждом) на льду. Затем центрифугировали в течение 15 минут (1800 g, 4 ºС).
Полученную плазму крови замораживали (-20 ºС), после чего использовали для
определения активности фермента. В ряды лунок вносили 20 мкл плазмы и 40 мкл
рабочего буферного раствора. Затем во все лунки добавляли 40 мкл 1 мМ раствора
субстрата для начала реакции. После чего планшет инкубировали 30 мин при 37 ºС. В
течение этого времени измеряли оптическую плотность реакционной смеси при 405 нм
каждые 5 минут. После определения оптической плотности вычисляли %
ингибирования фермента.
Модель экспериментального метаболического синдрома на крысах линии SHR
Экспериментальную патологию моделировали на спонтанно гипертензивных
животных (крысы линии SHR) однократной внутрибрюшинной инъекцией
стрептозотоцина (60 мг/кг внутрибрюшинно) с предварительным, за 15 минут,
введением никотинамида (внутрибрюшинно, 210 мг/кг). Животные были распределены
на 7 групп по 10 голов в каждой: 1 группа – интактная (Wistar-Kyoto); 2 – контрольная
(крысы линии SHR+моделирование патологии); с 3 по 5 группы получали КЛС-073 в
трех дозах: 0,37 мг/кг, 0,74 мг/кг и 1,11 мг/кг; 6 и 7 группы получали соответственно
препараты сравнения метформин и ситаглиптин в дозе 100 мг/кг.
Исследуемые вещества вводили по лечебно-профилактической схеме на протяжение
34-х дней. Введение начинали за 7 дней до индукции патологии.
Эффективность действия исследуемых веществ оценивали по уровню глюкозы
крови животных (с 6-го дня после индукции патологии еженедельно), влиянию на
артериальное давление (16-й и 30-й дни исследования), с помощью биохимического
исследования сыворотки крови (постмортально), а также при помощи гистологической
оценки
и морфометрического измерения диаметра панкреатических островков
Лангерганса.
Артериальное давление измеряли с помощью системы неинвазивного измерения
артериального давления у крыс (AD Instruments, Австралия) и программы LabChart 7.
Измерение проводили трижды с усреднением полученных результатов.
10
Состояние липидного профиля крови определяли
по концентрации общего
холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ), ХС липопротеидов высокой плотности (ХС
ЛПВП), ХС липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП) и при помощи расчета
индекса атерогенности.
Морфологическое исследование гистологических препаратов проводилось при
помощи светооптического микроскопа Axioscope A1 (Carl Zeiss, Германия).
Морфометрические параметры оценивали с помощью программы «Видеотест» (v. 3,
Россия).
Оценка влияния КЛС-073 на ЛПС-индуцированное фосфорилирование МАРК р-38
Исследование проводили на клеточной линии U937, полученной из Российской
коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. КЛС-073 тестировали в
фармакологически обоснованной (10 мкг/мл) и максимально возможной in vitro
концентрации (150 мкг/мл). Для индукции фосфорилирования МАРК р38 использовали
Липополисахарид (ЛПС) (эндотоксин из Escherichia coli серотипа 055:B5; Sigma) в
конечной концентрации 1 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали
специфический ингибитор МАР-киназ p38 субстанцию SB 203580, в концентрации 10
мкМ.
Электрофоретическое разделение белков проводили методом диск-электрофореза в
полиакриламидном геле в присутствии SDS (SDS-PAGE).
Для специфического выявления белков на иммуноблоте использовали
поликлональные кроличьи антитела против фосфорилированных по триптофану и
тирозину p38 (Cell Signaling Technology, США). В качестве вторичных антител
применяли козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов кролика и
конъюгированные с пероксидазой хрена (GAR-HRP, Cell Signaling Technology, США).
Хемилюминесцентное излучение регистрировали экспонированием на рентгеновскую
плѐнку CEA RP NEW (CEA AB, Швеция).
Оценку полученных результатов производили путем сканирования рентгеновской
пленки на сканере Epson Perfection V330 Photo и последующего измерения
относительной плотности проявленных полос с использованием программного
обеспечения Scion Image.
Оценка влияния КЛС-073 на основные биохимические показатели при его
длительном (360 дней) ежедневном введении лабораторным животным
С целью установления возможного негативного влияния КЛС-073 на основные
биохимические показатели, препарат внутрижелудочно вводили аутбредным мышам
обоего пола на протяжении 360-ти дней. Было сформировано 4 группы животных по 80
голов в каждой. Биохимические показатели крови определяли на биохимическом
анализаторе «А-25» (Испания) с использованием реагентов фирмы BioSystems
(Испания) в сыворотке крови без следов гемолиза. Для исследования использовали
венозную кровь, которую отбирали из вены в чистую пластмассовую пробирку. Для
получения сыворотки кровь центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Полученная
сыворотка переносилась во вторичные пробирки, которые затем загружали в
анализатор.
Определяемые параметры: аминотрансферазы (АЛТ и АСТ); билирубин; щелочная
фосфатаза; креатинин; мочевина; общий белок; альбумин; глобулины; холестерин;
триглицериды; глюкоза.
11
Статистическая обработка результатов
Для всех данных была применена описательная статистика: данные проверены на
соответствие закону нормального распределения. Проверку на соответствие закону
нормального распределения осуществляли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Все
данные имели нормальное распределение, для них были подсчитаны среднее значение и
стандартная ошибка среднего, которые вместе со значением n (количество наблюдений)
представлены в итоговых таблицах. Межгрупповые различия анализировались с
использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), предназначенного
для сравнения нескольких выборок (групп) и вычисления общего уровня значимости
различий. Вывод по результатам ANOVA касается общего различия всех сравниваемых
средних без конкретизации, какие именно выборки различаются. Для идентификации
пар выборок, отличающихся друг от друга средними значениями, используются
апостериорные критерии парных сравнений (Post Hoc). В данной работе применяли
апостериорный критерий Тьюки – критерий подлинной значимости (Honestly Significant
Difference, HSD), как наиболее распространенный и рекомендуемый в литературе тест
(Zar J.H. 2010). Различия были определены при 0,05 уровне значимости.
Обработку графиков и расчет IC50 проводили методом наименьших квадратов
(регрессионным анализом) по уравнению y = P1*x/(P2 + x). Где значение Р2
соответствует IC50, а Р1 выражает предельное значение величины ингибирующей
активности.
Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Statistica
6.0 (StatSoft, Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Оценка активности исследуемых веществ в отношении ДПП-4 плазмы крови
крыс in vitro
Первым этапом исследования было определение влияния исследуемых экстрактов
зеленого морского ежа S. droebachiensis в отношении активности ДПП-4,
содержащегося в плазме крови крыс.
Дипептидилпептидаза 4 (ДПП-4)(EC: 3.4.14.5)– сериновая протеаза, фермент,
отвечающий за быструю инактивацию инкретинов. Под действием данного фермента
происходит инактивация ГПП-1 (9-36)амид, в результате чего значительно снижаются
его биологические эффекты.
В данной модели были изучены экстракты, полученные из разных органов зеленого
морского ежа S. Droebachiensis разными экстрагентами: из внутренних органов зеленого
морского ежа (КЛС-070;КЛС-074; КЛС-075); икры (КЛС-071;КЛС-070; КЛС-073);
целомической жидкости (КЛС-076; КЛС-077).
В качестве препарата сравнения использовали специфический ингибитор ДПП-4 (S)этилпиперидин-3-карбоксилат ((S)-Ethyl piperidine-3-carboxylate; S-ЭПК). Экстракты
тестировали в широком диапазоне концентраций: 2,5, 5, 10, 20 и 40 мкг/мл.
Ингибирующая активность исследуемых веществ представлена в таблице 1.
12
Таблица 1
Ингибирующее действие исследуемых веществ в отношении фермента ДПП-4
плазмы крови крыс
Исследуемый SIC50, мкг/мл
ЭПК объект
КЛС-070
н/и
КЛС-071
112,3±10,2
КЛС-072
73,4±7,8
КЛС-073
30,4±7,8
КЛС-074
н/и
КЛС-075
н/и
КЛС-076
н/и
КЛС-077
н/и
S-ЭПК
2,3±0,4
Примечание: н/и - отсутствие ингибирующего действия.
Как видно из таблицы 1, ингибирующее действие специфического ингибитора ДПП4 – S-ЭПК соответствует литературным данным (Chen P. et al, 2011), что говорит об
адекватности использованной методики. Влияние на активность ДПП-4 проявили
только три исследуемых экстракта: КЛС-071, КЛС-072 и КЛС-073.
Важно отметить, что экстракты полученные из внутренних органов и целомической
жидкости морского ежа не оказали влияния на активность ДПП-4. Все три экстракта,
обладающих ингибирующим действием в отношении ДПП-4, были получены из икры
зеленого морского ежа с помощью различных экстрагентов. КЛС-071 был получен
путем экстракции хлороформ/этанол, для получения КЛС-072 КЛС-071 подвергался
экстракции 70% этанолом, для КЛС-073 – 95 % этанолом.
Оценка активности исследуемых веществ в условиях патологии углеводного
обмена (модель стрептозотоцин-никотинамид индуцированного сахарного диабета)
Исследование активности соединений оценивали в условиях патологии углеводного
обмена. Была выбрана модель стрептозотоцин-никотинамид индуцированного
сахарного диабета, как наиболее близкая по патогенезу сахарного диабета у людей.
Стрептозотоцин (2-диокси-D-глюкоза, производное N-метил N-нитрозомочевины)
является токсином, который обладает тропностью к различным тканям, в частности к
поджелудочной железе. Попадая в β-клетки островков Лангерганса поджелудочной
железы, стрептозотоцин стимулирует образование свободных радикалов, что в свою
очередь ведет к алкилированию ядерной ДНК и запрограммированной гибели β-клеток.
Введение никотинамида, за счет антиоксидантного действия, способствует
панкреопротекции, благодаря чему в условиях данной модели у животных развивается
периферическая инсулинорезистентность с частичным сохранением функции
поджелудочной железы (Ковалева М.А. и др., 2012). Таким образом, данная модель
характеризует биохимические нарушения, развивающиеся не только при
инсулинонедостаточности, но и при инсулинорезистентности, что наблюдается и у
большинства людей после стадии манифестации сахарного диабета второго типа.
Экстракты (КЛС-071; КЛС-072 и КЛС-073) вводили в дозах 0,2, 2 и 20 мг/кг.
Препараты сравнения (метформин, ситаглиптин) в дозе 100 мг/кг. Результаты
определения уровня глюкозы крови у животных натощак представлены в таблице 2.
13
Таблица 2
Динамика изменения уровня глюкозы в периферической крови экспериментальных
животных (M±m, ммоль/л)
Группа
n
1
Интактная
10
4,6±0,2
День исследования
10
День
15
индукции
патологии
4,7±0,3
4,6±0,4
2а+2б
Контроль
20
4,8±0,4
10,7±0,5*
10,8±0,4*
11,7±0,4*
3
КЛС-071 (0,2 мг/кг)
10
4,5±0,5
12,1±0,5*
10,5±0,3*
10,2±0,5*
4
КЛС-071 (2 мг/кг)
10
4,3±0,3
11,1±0,5*
10,8±0,5*
11,2±0,4*
5
КЛС-071 (20 мг/кг)
10
4,6±0,3
11,5±0,6*
11,3±0,5*
11,1±0,4*
6
КЛС-072 (0,2 мг/кг)
10
4,7±0,2
11,2±0,7*
10,4±0,3*
11,0±0,5*
7
КЛС-072 (2 мг/кг)
10
4,5±0,2
10,7±0,4*
10,5±0,4*
11,0±0,7*
8
КЛС-072 (20 мг/кг)
10
4,2±0,5
10,4±0,5*
10,7±0,5*
10,6±0,4*
9
КЛС-073 (0,2 мг/кг)
10
4,4±0,3
11,3±0,5*
10,5±0,6*
9,8±0,4*
10
КЛС-073 (2 мг/кг)
10
4,5±0,3
10,4±0,5*
8,9±0,5*#
8,2±0,3*#
11
КЛС-073 (20 мг/кг)
10
4,4±0,4
10,7±0,8*
9,2±0,5*#
8,5±0,4*#
12
метформин (100 мг/кг)
10
4,7±0,3
9,6±0,7*
7,7±0,5*#
6,4±0,4*#
13
ситаглиптин (100 мг/кг)
10
4,5±0,2
9,7±0,7*
8,7±0,4*#
7,7±0,5*#
№
п/п
0
24
4,8±0,2
Примечания
1) * - различия статистически значимы по сравнению с интактной группой (ANOVA,
критерий Тьюки, p<0,05.);
2) # - различия статистически значимы по сравнению с группой Контроль (ANOVA,
критерий Тьюки, p<0,05.).
Моделирование патологии, как и ожидалось, вызвало развитие гипергликемии, о чем
свидетельствует статистически значимое увеличение концентрации глюкозы в
периферической крови на 10-й день эксперимента во всех группах, по отношению к
интактной группой животных (таблица 2).
Применение обоих препаратов сравнения в течение двух недель привело к снижению
уровня глюкозы крови, что подтверждает механизм формирования патологии на данной
модели. У КЛС-071 и КЛС-072 во всех тестируемых дозах не было отмечено эффектов в
отношении нормализации уровня глюкозы, определяемой натощак. На фоне введения
КЛС-073 в дозе 0,2 мг/кг была отмечена тенденция к снижению уровня глюкозы.
Применение экстракта в дозах 2,0 и 20 мг/кг, к 24 дню исследования привело к
статистически значимому по сравнению с контролем снижению уровня глюкозы
периферической крови на
30 и 29 % соответственно. Важно отметить, что
использование доз экстракта 2,0 и 20 мг/кг оказало равноэффективное действие. Одним
из характерных патобиохимических нарушений, ассоциированных с развитием
сахарного диабета, является активация перекисного окисления липидов и нарушения в
антиоксидантной системе. В контрольной группе животных уровень ВГ, МДА и СМОА
14
достоверно отличались от интактных животных (таблица 3), что соответствует
биохимическим показателям при развитии патологии у людей (Шаманшурова З.М.,
2009), а также на других моделях СД (Liu L. et al., 2012)..
Таблица 3
Влияние исследуемых препаратов на антиоксидантную систему крови и перекисное
окисление липидов плазмы крови экспериментальных животных (M±m)
День исследования
№
Группа
n
ВГ,
МДА,
СМОА,
п/п
ммоль/л
мкмоль/л
мкмоль/л
Интактная
1
10
0,60±0,04
11,1±0,4
137,4±9,7
2а+2б Контроль
20 0,26±0,05*
19,0±1,1*
213,8±13,0*
3
КЛС-071 (0,2 мг/кг)
10
0,22±0,04*
18,1±1,0*
220,8±10,2*
4
КЛС-071 (2 мг/кг)
10
0,32±0,06*
19,8±0,9*
211,2±12,3*
5
КЛС-071 (20 мг/кг)
10
0,44±0,06*#
17,2±1,1*
197,2±10,3*
6
КЛС-072 (0,2 мг/кг)
10
0,28±0,05*
18,4±0,9*
209,2±11,2*
7
КЛС-072 (2 мг/кг)
10
0,30±0,06*
20,0±0,8*
200,1±14,3*
8
КЛС-072 (20 мг/кг)
10
0,31±0,04*
19,5±1,2*
189,9±16,1*
9
КЛС-073 (0,2 мг/кг)
10
0,39±0,6*
16,3±1,2*
279±10,1*#
10
КЛС-073 (2 мг/кг)
10
0,66±0,05#
9,4±0,6*#
458,7±29,9*#
11
КЛС-073 (20 мг/кг)
10
0,52±0,05#
11,3±0,05#
384,2±25,4*#
12
метформин (100 мг/кг)
10
0,57±0,06#
11,4±0,5#
197,4±15,3*
ситаглиптин (100 мг/кг)
13
10 0,52±0,07#
12,7±0,6*# 379,8±23,4*#
Примечания
1) * - различия статистически значимы по сравнению с интактной группой (ANOVA,
критерий Тьюки, p<0,05.);
2) # - различия статистически значимы по сравнению с группой Контроль (ANOVA,
критерий Тьюки, p<0,05.).
На фоне применения препаратов сравнения метформин, ситаглиптин, а также
исследуемой субстанции КЛС-073 (в дозах 2,0 и 20 мг/кг) была отмечена нормализация
уровня ВГ и МДА, что свидетельствует о наличии у данных веществ выраженной
антиоксидантной активности.
Экстракт КЛС-071 в максимальной дозе (20,0 мг/кг) проявил слабовыраженный
антиоксидантный эффект, заключающийся в увеличение уровня ВГ. Значения МДА и
СМОА практически не отличались от контрольной группы.
Введение экспериментальным животным КЛС-072 во всех тестируемых дозах не
оказало действия на антиоксидантную систему крови экспериментальных животных.
Таким
образом
в
ходе
проведения
эксперимента
у
исследуемых
стандартизированных экстрактов КЛС-071 и КЛС-072 не было выявлено
15
инкретиномиметического действия, дальнейшее изучение биологических эффектов и
механизмов действия этих объектов не проводилось.
На фоне введения животным экстракта КЛС-073, наряду с нормализацией системы
перекисного окисления липидов, было отмечено достоверное увеличение концентрации
СМОА выше уровня контрольных животных. Аналогичная картина наблюдалась при
применении специфического ингибитора ДПП-4 ситаглиптина.
В условиях развития сахарного диабета одним из основных неблагоприятных
факторов является вазоконстрикция, которая ведет не только к спазму периферических
сосудов и развитию диабетической стопы, но и повышению артериального давления.
Увеличение синтеза NO является одним из механизмов антигипертензивного действия
инкретиномиметиков. Данный эффект описан для инкретиномиметиков (Liu L. et al.,
2012) и является одним из основных механизмов их антигипертензивного действия
(Pereira D. M. et al., 2013; Hirata K. et al., 2009). Установление данного эффекта у КЛС073, позволило предположить у него наличие антигипертензивного действия.
Результаты определения ингибирующей активности КЛС-073 в отношении
активности ДПП-4: рекомбинантного человеческого и нативного крысиного
Оценку ингибирующего действия КЛС-073 проводили для рекомбинантного
человеческого фермента ДПП-4 и фермента, содержащегося в плазме крови крыс. В
качестве препарата сравнения использовали специфический ингибитор ДПП-4 S-ЭПК.
Пример графика расчета ингибирующей активности приведен в рисунке 1.
Ингибирующая активность, %
70
60
50
y = P1*x/(P2 + x)
40
P1=95± 12
P2=20± 5
30
20
10
0
0
10
20
30
40
Концентрация, мкг/мл
Рисунок 1 – Расчет IC50 ингибирующей активности субстанции КЛС-073
Ингибирующая активность исследуемых веществ представлена в таблице 4.
Таблица 4
Значения IC50 исследуемых препаратов, мкг/мл (M± m)
Препарат
КЛС-073
S-ЭПК
IC50, мкг/мл
Рекомбинантный
Фермент плазмы крови
человеческий фермент
крыс
20,4±5,4
33,8±11,6
2,1±0,3
1,8±0,28
16
Как видно из данных приведенных в таблице 4, ингибирующее действие, полученное
при тестировании КЛС-073 в отношении плазмы крови крыс, сопоставимо с
первоначальными результатами (30,4±7,8 в первом исследовании, 33,8±11,6 в
повторном).
Полученные значения влияния КЛС-073 на активность рекомбинантного
человеческого фермента ДПП-4, фермента плазмы крови крыс были сопоставимы с
действием специфического ингибитора S-ЭПК.
Важно отметить, что в отличие от контрольного вещества КЛС-073 проявляет более
выраженную ингибирующую активность в отношении рекомбинантного человеческого
фермента. Данный фермент является полным гомологом человеческого ДПП-4, в то
время как крысиный лишь на 84.9 % (Misumi Y. Et al.1992). Благодаря чему можно
предположить, что при введении КЛС-073 человеку будет получен более выраженный
эффект.
Результаты определения константы Михаэлиса (Кm)
Для определения константы Михаэлиса проводили измерение скорости реакции при
разной концентрации субстрата и постоянной концентрации ингибитора (КЛС-073).
После чего полученные результаты логарифмировали, строили уравнения зависимости
скорости реакции от концентрации субстрата.
Далее строили зависимость скорости ферментативной реакции (v, о.е./мин) от
концентрации субстрата (S, мкмоль/мл) для образцов без ингибитора и с добавлением
ингибитора.
Для определения типа ингибирования и расчѐта Кm применяли графический
способ, используя двойные обратные координаты Лайнуивера-Бэрка, т.е. строили
зависимости 1/v от 1/[S]. По характеру зависимостей делали вывод о типе
ингибирования Результаты определения представлены на рисунке 2 и в таблице 5
1
2
Рисунок 2 – Графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации
субстрата в присутствии ингибитора (КЛС-073) (1) и отсутствии (2) для плазмы крови
крыс
17
Таблица 5
Кинетические показатели реакции ингибирования КЛС-073 ДПП-4
Показатель
Vmax, о.е./мин
Km, мМ
Реакция без ингибитора
0,0105
0,486
Реакция с ингибитором
(КЛС-073)
0,0105
0,842
Как видно из рисунка 2 и данных представленных в таблице 5, внесение в систему
ингибитора (КЛС-073) не повлияло на максимальную скорость реакции (0,0105 о.е./мин
против 0,0105 о.е./мин без добавления ингибитора). При этом расчетное значение Кm на
фоне использования КЛС-073 увеличилось с 0,486 мМ без ингибитора, до 0,842 мМ при
внесениеи в систему КЛС-073. Полученные характеристики ферментативной реакции
(увеличение Кm при одинаковой Vmax) характерны для конкурентных ингибиторов.
Результаты определения ингибирующей активности КЛС-073 in vivo на интактных
животных
Результаты определения активности ДПП-4 плазмы крови животных после
однократного внутрижелудочного введения исследуемых веществ представлены на
рисунке 3.
Рисунок 3 – Ингибирующая активность исследуемых веществ
Ингибирующая активность кукурузного масла и 0,25% раствора метилцеллюлозы на
всех временных точках (1, 6 и 24 часа) была практически равна нулю. На основании
этого был сделан вывод, что введение выбранных носителей для препаратов не влияет
на активность ДПП-4.
18
Введение препарата ситаглиптин в дозе 100 мг/кг привело к 90% ингибированию в
течение первых 6 часов и 20% через 24 часа после введения. Полученные данные
согласуются с литературными (Wang A. Et al, 2012). Таким образом метод, выбранный
нами для определения ингибирующей активности ДПП-4, является адекватным.
Однократное применение КЛС-073 в дозе 0,1 мг/кг не оказало влияния на активность
фермента ДПП-4. Введение экстракта в дозах 1 и 10 мг/кг в течение первых 6 часов
оказало равноэффективное действие, снижая активность ДПП-4 в среднем на 25%.
Данный эффект сохранялся в течении суток, через 24 часа после введения превосходил
действие ситаглиптина в дозе 10 мг/кг (15%) и был сопоставим с эффектом
ситаглиптина в дозе 100 мг/кг.
Оценка эффективности КЛС-073 в условиях экспериментального
метаболического синдрома
Данные о влиянии исследуемых веществ на уровень глюкозы крови
экспериментальных животных приведены в таблице 5.
Таблица 6
Концентрация глюкозы в крови экспериментальных животных (ммоль/л), M ± m, n=10
День введения препаратов/ день развития
Базовая
патологии
Группа
линия
13/6
20/13
27/20
34/27
Интактная
4,8±0,1
6,3±0,4
5,1±0,2
4,4±0,1
4,4±0,1
(Wistar-Kyoto)
Контроль
4,8±0,1
26,4±2,5*
21,4±1,7*
22,9±2,5*
18,0±2,8*
(SHR +STZ)
КЛС-073, 0,37 мг/кг
4,7±0,2
22,6±2,8*
20,0±3,1* 11,8±2,9*# 10,4±2,9*#
КЛС-073, 0,74 мг/кг
5,1±0,2
19,5±3,6*
15,3±4,2*
7,4±2,2*#
6,7±0,8*#
КЛС-073, 1,11 мг/кг
5,0±0,3
20,3±3,2*
15,5±3,4*
7,2±3,2*#
7,1±0,3*#
метформин, 100 мг/кг
4,6±0,2
26,0±2,3*
18,5±3,0* 11,8±2,4*# 7,8±2,6*#
ситаглиптин, 100 мг/кг
5,2±0,4
20,1±3,0*
17,6±2,9* 10,5±3,1*# 7,4±2,8*#
Примечания
1) * - различия статистически значимы по сравнению с интактной группой (ANOVA,
критерий Тьюки, p<0,05.);
2) # - различия статистически значимы по сравнению с группой Контроль (ANOVA,
критерий Тьюки, p<0,05.).
В условиях экспериментального метаболического синдрома также было
подтверждено наличие у КЛС-073 выраженного антигипергликемического действия.
Максимально выраженным данное действие было зафиксировано при применении КЛС073 в дозах 0,74 и 1,11 мг/кг (таблица 5).
Следует отметить, что выявленное антигипергликемическое действие КЛС-073 было
равноэффективно с обоими препаратами сравнения, которые применялись в дозах 100
мг/кг.
Результаты морфометрического исследования представлены в таблице 7.
19
Таблица 7
Морфометрия островков Лангерганса, мкм, M±m, n=10
Средний диаметр островков
Группа
Интактная (Wistar-Kyoto)
294,1 ± 36,3
Контроль (SHR +STZ)
144,2 ± 20,9*
КЛС-073, 0,37 мг/кг
122,9 ± 21,2*
КЛС-073, 0,74 мг/кг
212,7 ± 26,7#
КЛС-073, 1,11 мг/кг
243,7 ± 36,9#
метформин, 100 мг/кг
178,2 ± 17,9*
ситаглиптин, 100 мг/кг
207,6±17,0*#
Примечания:
1) * - различия статистически значимы по сравнению с интактной группой (ANOVA,
критерий Тьюки, p<0,05.);
2) # - различия статистически значимы по сравнению с группой Контроль (ANOVA,
критерий Тьюки, p<0,05.).
Морфометрическое исследование диаметра панкреатических островков
Лангерганса показало, что в контрольной группе животных диаметр островков был
статистически значимо ниже относительно интактной группы (почти в 2 раза).
Статистически значимое уменьшение диаметра островков Лангерганса наблюдали
в группах животных, получавших КЛС-073 в дозе 0,37 мг/кг и препарат сравнения
метформин в дозе 100 мг/кг.
На фоне применения экстракта КЛС-073 в дозах 0,74 и 1,11 мг/кг, а также
препарата сравнения ситаглиптин в дозе 100 мг/кг диаметр островков Лангерганса был
значительно больше, чем в контрольной группе и достоверно не отличался от интактной
группы, что свидетельствует о восстановлении инсулярного аппарата поджелудочной
железы. Поскольку исследуемые препараты начали вводить животным после
моделирования патологии (после разрушения β-клеток), полученные результаты
подтверждают наличие у инкретиномиметиков (КЛС-073, ситаглиптин) способности
стимулировать неогенез клеток поджелудочной железы.
Важно отметить, что в группах животных, получавших КЛС-073 в дозах 0,74 и
1,11 мг/кг, на фоне восстановления поджелудочной железы у животных наблюдалась
гипергликемия натощак, что говорит о ее развитии не только за счет инсулиновой
недостаточности, но и за счет периферической инсулинорезистентности, что еще раз
подтверждает адекватность выбранной нами модели метаболического синдрома.
Важным показателем сахарного диабета является развитие дислипопротеинемии, и,
как ее следствие, увеличение индекса атерогенности. Определение содержания общего
холестерина и липопротеинов высокой плотности проводили на 34-й день исследования,
результаты расчета индекса атерогенности представлены в таблице 8.
20
Таблица 8
Индекс атерогенности экспериментальных животных, M ± m, n=10
Индекс
Группа
атерогенности
Интактная (Wistar-Kyoto)
0,92±0,09
Контроль (SHR +STZ)
1,65±0,48 *
КЛС-073, 0,37 мг/кг
1,39±0,34
КЛС-073, 0,74 мг/кг
0,72±0,02#
КЛС-073, 1,11 мг/кг
метформин, 100 мг/кг
ситаглиптин, 100 мг/кг
0,81±0,14#
1,14±0,35
0,73±0,16#
Примечания
1) * - различия статистически значимы по сравнению с интактной группой (ANOVA, критерий
Тьюки, p<0,05.);
2) # - различия статистически значимы по сравнению с группой Контроль (ANOVA, критерий
Тьюки, p<0,05.).
На фоне применения КЛС-073 в дозе 0,74 и 1,11 мг/кг, а также препарата
ситаглиптин в дозе 100 мг/кг было отмечено достоверное снижение индекса
атерогенности. Выявленное антиатерогенное действие препаратов характерно для
инкретиномиметиков, в частности, ингибиторов ДПП-4 (Koren S. et al., 2012).
Определение влияния исследуемых веществ на уровень артериального давления
проводили в динамике на 16-й и 30-й день исследования. Результаты определения
представлены в таблице 9.
Таблица 9
Артериальное давление экспериментальных животных (мм.рт.ст.), M ± m, n=10
День введения препаратов / день развития
патологии
Группа
16/9
30/23
САД
ДАД
САД
ДАД
78,1±1,9
140,9±1,0
74,1±0,6
Интактная (Wistar-Kyoto) 145,3±3,0
Контроль (SHR +STZ)
181,7±3,5*
96,8±1,7* 180,3±1,3* 96,0±1,1*
158,7±2,0*#
83,2±1,0*# 152,6±3,3*# 76,9±1,1*#
КЛС-073, 0,37 мг/кг
149,2±2,5#
80,7±1,0# 144,3±1,4# 74,3±0,6#
КЛС-073, 0,74 мг/кг
КЛС-073, 1,11 мг/кг
метформин, 100 мг/кг
ситаглиптин, 100 мг/кг
148,5±1,8#
177,2±3,0*
150,2±2,8#
80,71,0#
140,9±1,3#
91,0±1,4*# 180,9±1,9*
82,8±2,1# 142,7±1,6#
73,7±1,1#
94,4±1,6*
71,5±1,2#
Примечания
1) * - различия статистически значимы по сравнению с интактной группой (ANOVA, критерий
Тьюки, p<0,05.);
2) # - различия статистически значимы по сравнению с группой Контроль (ANOVA, критерий
Тьюки, p<0,05.).
В контрольной группе животных наблюдалось повышенное как систалическое, так
и диастолическое артериальное давление, что свойственно для крыс линии SHR
21
(таблица 9). Применение препарата сравнения метформин не оказало влияния на
артериальное давление. На фоне применения исследуемого экстракта во всех дозах был
выявлен антигипертензивный эффект, сопоставимый с препаратом сравнения
ситаглиптин.
Важно отметить, что на фоне применения препарата метформин, данное действие
выявлено не было. Следовательно оно не может являться следствием только
антигипергликемического действия (которое было установлено у метформина).
Как уже было сказано выше, увеличение синтеза СМОА является одним из
механизмов антигипертензивного действия инкретиномиметиков. При активации ГПП1Р эндотелия сосудов запускается сигнальный путь, который ведет к увеличению
синтеза СМОА, за счет чего наступает миорелаксация. Данный эффект описан для
инкретиномиметиков (Liu L. et al., 2012) и является одним из основных механизмов их
антигипертензивного действия (Pereira D. M. et al., 2013; Hirata K. et al., 2009).
Одной из наиболее актуальных проблем сахарного диабета является развитие
инсулинорезистентности, состояния в ходе которого даже при адекватной выработке
инсулина наблюдается выраженная гипергликемия.
Наиболее частой причиной инсулинорезистентности является развитие хронических
воспалительных процессов в тканях. В частности, в исследовании Moschen было
описано увеличение уровня TNF-α на фоне ожирения, и его снижение при
восстановлении нормальной массы тела (Moschen A. R., et al., 2010).
В составе КЛС-073 было обнаружено большое количество производных
полиненасыщенных жирных кислот (Shikov A. N., et al., 2011), что делает возможным
наличие у него выраженного противовоспалительного действия. Данное предположение
было проверено в эксперименте in vitro.
Результаты оценки влияния КЛС-073 на ЛПС-индуцированное
фосфорилирование МАРК р-38
В качестве агента, запускающего фосфорилирование МАР-киназ, выбран
липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерий Escherichia Coli. Результаты
исследования представлены в рисунке 4.
Рисунок 4 – Влияние стандартизированного экстракта КЛС-073 на ЛПСиндуцированное фосфорилирование МАР-киназы р38
22
Обозначения в рисунке 4:
1) * - различия статистически значимы по сравнению с интактной группой (ANOVA, критерий
Тьюки, p<0,05.);
2) # - различия статистически значимы по сравнению с группой Контроль (ANOVA, критерий
Тьюки, p<0,05.).
Тестирование экстракта КЛС-073 в обеих концентрациях (10 м 150 мкг/мл) выявило
ингибирование фосфорилирования р38. На фоне введения субстанции количество
фосфо-р38 было в среднем в два раза меньше, чем в контроле (рисунок 4), что говорит о
наличии противовоспалительной активности.
В свете развившегося СД2 и метаболического синдрома, выраженное
противовоспалительное действие оказывает положительное влияние на углеводный
обмен. Снижение интенсивности воспаления ведет к снижению фосфорилирования JNK
IRS1 по серину 307. В следствие этого идет восстановление возможности инсулинового
рецептора фосфорилировать тирозин IRS1, что ведет к восстановлению сигнального
пути инсулина, снятию инсулинорезистентности (Aguirre V. et al., 2000).
Таким образом, установленный у КЛС-073 выраженный противовоспалительный
эффект безусловно вносит свой вклад в антигипергликемическое действие экстракта.
Результаты определения влияния КЛС-073 на основные биохимические
показатели при его длительном (360 дней) ежедневном введении лабораторным
животным
Результаты определения биохимических показателей на 361-й день эксперимента
предоставлены в таблицах 10-11.
Таблица 10
Влияние КЛС-073 на основные биохимические показатели периферической крови
мышей-самцов на 361-й день исследования, (M± m, n=10)
Доза, мг/кг
Контрольная
Исследуемые показатели
группа
2 мг/кг
10 мг/кг
20 мг/кг
Креатинин, мг/дл
0,33±0,03
0,36±0,03 0,34±0,03 0,35±0,02
Мочевина, ммоль/л
6,7±0,2
7,0±0,3
6,4±0,3
6,6±0,3
Аспартатаминотрансфераза, Е/л
137,1±6,0
134,5±5,5 133,4±4,5 138,2±4,7
Аланинаминотрансфераза, Е/л
63,2±2,6
66,0±3,4
63,1±2,6
64,6±3,9
Щелочная фосфатаза, Е/л
131,0±6,0
126,7±4,3 130,9±4,8 130,6±5,5
Билирубин общий, мг/дл
3,5±0,2
3,5±0,2
3,5±0,2
3,6±0,2
Холестерин, ммоль/л
2,3±0,1
2,4±0,2
2,4±0,1
2,3±0,2
Триглицериды, ммоль/л
1,12±0,07
1,15±0,06 1,16±0,05 1,10±0,06
Общий белок, г/л
60,7±1,7
61,9±1,2
58,3±2,0
60,8±1,8
Альбумин (А), г/л
17,3±0,5
17,6±0,4
17,0±0,4
17,6±0,5
Глобулины (G), г/л
43,4±1,5
44,3±0,9
41,4±1,6
43,2±1,7
Отношение А/G
0,40±0,01
0,40±0,01 0,41±0,01 0,41±0,02
Глюкоза, мг/дл
140,3±5,2
138,8±4,9 137,0±4,5 137,1±3,8
23
Таблица 11
Влияние КЛС-073 на основные биохимические показатели периферической крови
мышей-самок на 361-й день исследования, (M± m, n=10)
Доза, мг/кг
Контрольная
Исследуемые показатели
группа
2 мг/кг
10 мг/кг
20 мг/кг
Креатинин, мг/дл
0,34±0,03
0,38±0,04 0,36±0,04 0,33±0,03
Мочевина, ммоль/л
6,2±0,3
6,5±0,3
6,8±0,3
6,5±0,3
Аспартатаминотрансфераза, Е/л
144,7±3,5
145,4±4,3 143,3±4,9 142,8±6,7
Аланинаминотрансфераза, Е/л
63,5±3,0
63,8±2,8
63,6±2,3
64,5±3,0
Щелочная фосфатаза, Е/л
131,6±4,6
128,8±5,7 129,9±7,5 134,2±5,4
Билирубин общий, мг/дл
3,4±0,2
3,6±0,2
3,4±0,2
3,6±0,2
Холестерин, ммоль/л
2,4±0,1
2,3±0,1
2,3±0,1
2,5±0,1
Триглицериды, ммоль/л
1,23±0,04
1,14±0,04 1,17±0,05 1,25±0,04
Общий белок, г/л
57,8±1,9
58,6±2,4
61,0±1,4
59,1±1,7
Альбумин (А), г/л
17,0±0,5
17,0±0,5
17,2±0,5
16,8±0,5
Глобулины (G), г/л
40,8±1,4
41,6±2,0
43,8±1,0
42,3±1,3
Отношение А/G
0,42±0,01
0,41±0,01 0,39±0,01 0,40±0,01
Глюкоза, мг/дл
144,6±4,9
148,6±4,1 141,2±4,3 145,5±4,2
Анализ данных биохимических показателей периферической крови показал
отсутствие статистически значимых отличий между контрольной группой и группами,
получавшими КЛС-073 во всех дозах (ANOVA, р<0,05). Таким образом был сделан
вывод об отсутствии у стандартизированного экстракта КЛС-073 влияния на основные
биохимические показатели крови. Что позволяет предположить его относительную
безопасность при длительном применении.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данной работе в качестве объектов исследования были использованы экстракты
зеленого морского ежа S. droebachiensis. Среди рассмотренных субстанций только КЛС073 проявил инкретиноподобное действие. В следствии этого были подробно изучены
его биологические эффекты и механизмы действия.
В условиях патологии углеводного обмена (экспериментальный сахарный диабет,
метаболический синдром), была показана способность экстракта КЛС-073 оказывать
выраженное антигипергликемическое и антигипертензивное действие, положительно
влиять на основные показатели перекисного окисления липидов: МДА, ВГ. Было
показано, что данное действие основано на ингибировании ДПП-4. Также у КЛС-073
был дополнительно установлен механизм противовоспалительной активности
(ингибирование фосфорилирования МАРК р-38).
При длительном (360 дней)
внутрижелудочном введении КЛС-073 не оказал влияние на основные биохимические
показатели крови экспериментальных животных.
Таким образом в ходе данной работы было показано, что соединения природного
происхождения, полученные из гидробионтов, являются перспективными в плане
поиска эффективных и безопасных соединений для коррекции основных
патобиохимических нарушений, обусловленных развитием сахарного диабета второго
типа и метаболического синдрома.
24
ВЫВОДЫ
1.
Среди 8 протестированных экстрактов зеленого морского ежа S.
droebachiensis только три (полученных из икры морского ежа) обладали ингибирующим
действием в отношении ДПП-4. Реализация данного действия в условиях
экспериментального сахарного диабета была установлена только у КЛС-073, для
которого отмечено выраженное антигипергликемическое действие, а также
положительное влияние на состояния процессов перекисного окисления липидов и
состояние антиоксидантной системы.
2.
Установлено, что в отношении рекомбинантного человеческого фермента
ДПП-4 КЛС-073 проявляет более выраженное ингибирующее действие, чем в
отношении фермента из сыворотки крови крыс.
3.
Тип ингибирования
ДПП-4 с помощью КЛС-073 – конкурентный.
Внесение в систему ингибитора (КЛС-073) не повлияло на максимальную скорость
реакции (0,0105 о.е./мин против 0,0105 о.е./мин без добавления ингибитора). При этом
расчетное значение Кm на фоне использования КЛС-073 увеличилось почти в два раза.
4.
Введение экстракта КЛС-073 в организм экспериментальных животных
привело к равноэффективному ингибированию ДПП-4 в дозах 10-100 мг/кг (на 25% в
течение суток после введения).
5.
В условиях экспериментального метаболического синдрома у КЛС-073
кроме антигипергликемического установлено выраженное антиатерогеное и
антигипертензивное действие.
6.
В условиях in vitro, на модели LPS-индуцированного воспаления
установлена способность КЛС-073 – ингибировать фосфорилирование МАРК р-38, что
может приводить к восстановлению функции инсулинового рецептора и снятию
инсулинорезистентности.
7.
В условиях длительного (360 дней) ежедневного введения КЛС-073
аутбредным мышам в дозах 2-20 мг/кг было установлено отсутствие у
стандартизированного экстракта влияния на основные биохимические показатели крови,
что позволяет предположить его относительную безопасность при длительном
применении.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК
1.
Макаренко, И.Е. Оценка эффективности препарата из гонад морских ежей / И.Е.
Макаренко, Н.М. Фаустова, Г.В. Ванатиев, И.Н. Уракова, О.Н. Пожарицкая, М.Н. Макарова,
В.Г. Макаров, А.Н. Шиков // Фармация – 2015.- №2.- С. 47-50.
2.
Макаренко, И.Е. Оценка безопасности применения препарата КЛС-073 в
качестве инкретиномиметика / И.Е. Макаренко, О.И. Авдеева, Г.В. Ванатиев, Н.М. Фаустова,
И.Н. Уракова, О.Н. Пожарицкая //Биомедицина. – 2015. – №. 2. – С.65-72
3.
Пожарицкая, О.Н. Эффективность стандартизированного экстракта из икры
морских ежей на экспериментальной модели метаболического синдрома / О.Н. Пожарицкая,
А.Н. Шиков, М.Н. Макарова, А.И. Селезнева, И.Е. Макаренко, В.Г. Макаров //
Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2015. – Т.78 – №. 5. – С.13-18.
4.
Pozharitskaya, O.N. Bioactivity and chemical characterization of gonads of green sea
urchin Strongylocentrotus droebachiensis from Barents Sea / O.N. Pozharitskaya, A.N. Shikov, I.
Laakso, T. Seppänen-Laakso, I.E. Makarenko, N.M. Faustova //Journal of Functional Foods. – 2015.
– Vol. 17. – P. 227-234.
25
Прочие работы, опубликованные по теме диссертации
5.
Makarenko, I. E. Effects of lipid extract of sea urchins gonads in metabolic syndrome
animal model / I. E. Makarenko, A. I. Selezneva, O. N. Pozharitskaya, A. N. Shikov, M. N.
Makarova, & V. G. Makarov, // Planta Medica. – Т. 79. – №. 13. – С. PB44.
6.
Makarenko I.E. Acute and chronic toxicity studies of a lipid extract of green sea
urchins gonads in rodents / I.E. Makarenko, O.I. Avdeeva, O.N. Pozharitskaya, M.N. Makarova,
A.N. Shikov // Материалы 17 международного съезда «Фитофарм» 2013. Обзоры по
клинической фармакологии и лекарственной терапии. Санкт-Петербург – 2013. – С. 61.
7.
Kastornova A.E. Immunomodulatory activity of lipophilic extract of strongylocentrotus
droebachiensis on immunosuppressed mice / A.E. Kastornova, I.E. Makarenko, O.N. Pozharitskaya,
M.N. Makarova // Phytopharm 2014 - Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной
терапии. Том 12. - 2014. С. 32.
8.
Макаренко И.Е. Оценка ингибирующей активности природного препарата в
отношении дипептидилпептидазы 4 типа (ДПП-4) in vitro / И.Е. Макаренко, Н.М. Фаустова
В.Г. Макаров
// Фармакология экстремальных состояний - Обзоры по клинической
фармакологии и лекарственной терапии. Том 13. Спецвыпуск. - 2015. – С.105-106.
9.
Макаренко И.Е. Нейропротекторное действие экстракта икры морских ежей в
условиях экспериментального инсульта / И.Е. Макаренко, А.И. Селезнева // Сборник тезисов.
Всероссийская научная конференция с международным участием Фармакологическая
нейропротекция. Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии.2013. – том
11. С. 99
10.
Макаренко И.Е. Оценка ингибирующей активности природного препарата в
отношении дипептидилпептидазы 4 типа (ДПП-4) in vitro / И.Е. Макаренко, Н.М. Фаустова,
В.Г. Макаров
// Фармакология экстремальных состояний - Обзоры по клинической
фармакологии и лекарственной терапии. Том 13. Спецвыпуск. - 2015. – С.105-106.
11.
Afonkina O.V. Study of the substance RLS-073 from the gonads of sea urchins
strongilocentrotus droebachiensis on the activity of the enzyme DPP4 / O.V. Afonkina, I.E.
Makarenko, N.M. Faustova, M.N. Makarova, O.N. Pozharitskaya, V.G. Makarov, A.N. Shikov //
Материалы 19 международного съезда «Фитофарм» 2015. Обзоры по клинической
фармакологии и лекарственной терапии. Санкт-Петербург – 2015. – С. 57-58.