Исследование искусственного воспроизводства африканского

Зыонг В.Х.1, Тхам Т.Т.Н.2, Нгуен В.К.3
Аспирант, Тхаингуенский университет, Тхаингуен, Вьетнам; 2кандидат, Биотехническая
академия, Ханой, Вьетнам; 3кандидат, доцент, Биотехническая академия, Ханой, Вьетнам
1
ИССЛЕДОВАНИЕ ИСКУССТВЕННОГО ВОСПРОИЗВОДСТВА
АФРИКАНСКОГО СОМА (CLARIAS GARIEPINUS) ФОРМИРОВАНИЕ
ГОЛОГО ЭМБРИОНА ДЛЯ ДНК-МИКРОУКОЛА
Aннотация
Искусственное воспроизводство не только имеет большое значение в получении
мальков на рыбозаводах, но и в лабораторных условиях. В этой работе мы проводим
опыты искусственного оплодотворения африканского сома, используя стимуляторы
половых продуктов LRH-A и гипофиза сазана. Коэффициент икрометания рыб
составляет 100%, коэффициент оплодотворенных икринок и вылупленных личинок
соответственно составляют 87,3% и 65,1%. Оплодотворенные икринки обладают
клейкостью за счет хориона. Для подготовки к ДНК-микроуколу убираем хорион с
помощью трипсина, оптимальная концентрация которого составляет 0,05% в течение
1-ой минуты. Коэффициент вылупления икринок, очищаемых от хориона с помощью
энзима является 17,5%.
Ключевые слова: Африканский сом, голый эмбрион, искусственное оплодотворение,
ДНК-микроукол.
Keywords: African catfish, naked embryo, artifition reproduction, DNA-microinjection
Введение
Исследование искусственного оплодотворения некоторых популярных видов рыб в
рыбозаводах были проведены давно. Африканский сом является новым объектом таких
исследований. В отличии от других видов рыб сом обитает в грунте , в водохранилищах
не созревает. Поэтому для получения половых продуктов стимулируют производителей.
Для получения голого эмбриона, являющегося материалом трансформации генов,
снимают оболочку хорион с помощью трипсина.
Материал и методы
Материал
Производители (Clarias gariepinus) , выращиваемые в Институте исследований рыб
и аквакультуры 1
Стимулятор половых желез LRH-A (Luteotropin Releasing Hormone Analog), DOM
(domperidone) Китая.
Мозг сазана (Государственная компания сервиса и аквакультуры).
Методы исследований
Определение пола сома и выбор половозрелых особей.
Самцы и самки легко различимы по внешним признакам: У самцов конец
семяпровода видоизменен в виде острой колючки, которая называется половой колючкой.
У самок половое отверстие округлое.
Половозрелый самец имеет хорошо выраженную и выпученную наружу половую
колючку. Половозрелая самка имеет большое мягкое брюшко, наружная часть полового
отверстия чуть жестче и при легком отцеживании по брюшку течет икра. Производители
берутся в возрасте с 8-12 месяцев.
Стимулирование половых продуктов сома.
Стимулятором является гипофиз сазана или LRH-A вместе с DOM. Доза
стимулятора зависит от условия сезона и температуры воды. Количество гипофиза для
стимулирования самок составляет 12мг/кг рыбы, для самцов равна одной третьи
количества для самок. Доза стимулятора для самок 30µг LRH-A и 3-5мг DOM/1кг массы
рыбы. Для самцов 5µг LRH-A и 5мг DOM/1кг массы рыбы.
Для получения потомства клариевых сомов в искусственных условиях самкам применяют
двукратную инъекцию гипофиза: предварительную - в количестве 1/3 общей дозы
гипофиза и через 4-6 часов разрешающую - 2/3 общей дозы. Для самцов – однократную
инъекцию. Впрыскивать можно в одно из следующих мест : в основание грудных
плавников, в брюшко и в туловищную мускулатуру. Туловищная мускулатура является
наиболее безопасным и легким местом для инъекции. После 8-15 часов с момента
впрыскивания производители становятся половозрелыми.
Искусственное оплодотворение
Вылавливаемая самка держится в хлопковом полотенце, затем икры отцеживаются
из брюшка до тех пор, пока вся икры не вымечет в чистую посуду. Из самца невозможно
получить молоки, их можно получить только путем отцеживания, а вскрывания рыбы .
Полученные молоки и икру помещают в сухую посуду, так как в воде спермии и икры
активизируются и сохраняют подвижность в течение 1-2мин. При оплодотворении
добавляется вода (300мл/ликры), перемешиваем смесь спермиев и икры в течение 3 – 5
минут.
Получение голого эмбриона.
Оплодотворенную икру после обесклеивания помещаются а чашку Петри,
содержащую раствор holtfreter и раствор трипсина с концентрацией 0,01%; 0,05%; 0,1%
(w/v) в течение 1-2 мн. Это процесс отмывания оболочки хориона.
Обсуждение результатов
Выбор производителей
Выбор производителей по морфологическим признакам. Чтобы увеличить
вероятность выбора вынимают из самки несколько икринок с помощью специального
щупа или шприца, с прикрепленной к ней мягкой пластиковой трубой. Взятые икринки
выкладываются на чашку Петри, на них капают EFA (ethanol:formalin:acid acetic по
соотношению 6:3:1). Через несколько минут икра становится прозрачной, а внутренний
желток белого цвета. Хорошая половозрелая самка должна иметь крупные, отделяющиеся
друг от друга икринки, кровеносные капилляры которых очень маленькие или их совсем
нет. Особенно отмечается то, что более 60% икринок являются эксцентрическими.
Искусственное оплодотворение
Производители содержатся в отдельных бассейнах в соотношении 3-5 самок на 1
самца.
Результаты оплодотворения вписываются в таблицу 1
Показатель
Результат
Стимулятор
Гипофиз сазана
LRH-A и DOM
Доза для самок
10г/кг массы рыбы
40µг LRH-A + 4мгDOM/кг рыб
Доза для самцов
3мг/кг массы рыбы
5µг LRH-A + 5мг DOM/кг
массы рыбы
Средняя масса рыб
359г
321,3г
Коэффициент размножения 100%
100%
Время эффекта
15 часов
12 часов
Плодовитость
106.102 икринок/кг
108.782 икры/кг рыб
Коэффициент
87,3%
72,0%
оплодотворения
Таблица 1: Результаты искусственного оплодотворения африканского сома.
В зависимости от определенного вида рыб выбирают соответственные с ними
стимуляторы. В некоторых лабораториях других стран используются Ovaprim или
gonadotropin для стимуляции сомов и получаются положительные результаты. Во
Вьетнаме чаще всего применяют гипофиз сазана или LRH-A и DOM. Гипофизом сазана
также пользуется для искусственного оплодотворения других видов популярных во
Вьетнаме рыб, так как он более безопасный и дает положительные результаты. Однако
трудно определить качество гипофиза и его дозу применения. Использование LRH-A и
DOM при стимуляции сомов дает высокий и стабильный коэффициент размножения.
Также влияет на количество полученных половых продуктов место инъекции. Инъекция в
основание грудных плавников дает высокую эффективность, то есть наибольший быстрый
эффект, но легко инъецируется в сердце рыбы, что проводит к смерти производителей.
Инъекция в туловищные мышцы является более легкой и безопасной.
Образование голого эмбриона.
В отличие от других видов рыб оплодотворенная икра сома имеет клейкую
оболочку, при помощи которой икра прикрепляется к субстрату. Эта оболочка
препятствует ДНК-микроуколу . Отмывают клейкую оболочку с помощью энзима
трипсин, протеаза или ручным способом. При применении энзима необходимо определить
оптимальную концентрацию энзима, которая не влияет на развитие зародыша. Процесс
отмывания хориона проводится с наблюдением под микроскопом. Если в этом процессе
наблюдается разложение оболочки хориона, необходимо быстро остановить его и
многократно перемывать икру
раствором holtfreter. Оптимальная концентрация
составляет 0,05% в растворе holfreter.
Результат отмывания хориона оказывается в таблице 2
Микроукол
Сравнение
Отмывавшие
от Икры с хорионом
хориона икры
Коэффициент
17,5
28,2
65,1
вылупления (%)
Отмывание клейкой оболочки ручным способом проводится под микроскопом с
помощью клещей и стеклянной иглы. Этот процесс легче рарушает клетки, поэтому
качество икринок после снятия оболочки зависит от опытности специалистов. В наших
исследованиях 10%
отмывавших от хориона икринок остаются ненарушенными.
Достоинством ручного способа является то, что икра не подвергается влиянию энзима и
имеет более высокую жизнеспособность (89%), отсутствие уродов.
Заключение
Искусственное оплодотворение африканского сома в лабораторных условиях дает
следующие результаты: коэффициент размножения 100 % ,коэффициент оплодотворения
87,3%, коэффициент вылупления 65,1%
Отмывание клейкой оболочки с помощью трипсина 0,05%
позволяет 17,5%-ам
зародышей расти до мальков.
Литература
1. Adebayo O. T. Reproductive performance of African Clariid Catfish (Clarias gariepinus)
broodstocks on varying maternal stress // Journal of fisheries International. 2006. V.1. Iss. 1. p.
17-20.
2. Adewumi A.A., Olaleye V.F., Adesulu E.A. Egg and sperm quality of the African catfish,
Clarias gariepinus (Burchell) broodstock fed differently heated soybean based diets // Research
Journal of Agriculture and Biological Sciences. 2005. V.1. Iss.1. p.17-22.
3. Olaleye VF A review of reproduction and gamete management in the African Catfish Clarias
gariepinus // Ife Journal of Science. 2005. V.7. Iss.1. p.63-70.