ПРЕИМПЛАНТАЦИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ____________________ ГРУППА КОМПАНИЙ МАТЬ и ДИТЯ ______________________ Настоящее и перспективы АПРЕЛЬ 2014 МОСКВА Содержание. • Преимплантационная генетическая диагностика. Виды. • Биопсия эмбрионов. Техника. Полярные тельца, бластомеры, трофектодерма. • Методы ПГД. Прошлое. Настоящее. Перспективы. • Результаты собственных наблюдений. • Выводы. 2 Введение • Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) – это комплекс мероприятий, позволяющих исследовать генетический статус эмбриона еще до его попадания в полость матки и наступления беременности. 3 Виды ПГД • ПГД хромосомного дисбаланса (скрининг анеуплоидий, транслокации) • ПГД моногенных заболеваний • ПГД+HLA типирование • ПГД болезней с поздней манифестацией • ПГД при высокой вероятности развития онкологических заболеваний 4 ПГД хромосомного дисбаланса (скрининг анеуплоидий, транслокации) • Наличие изменений в кариотипе супругов. • Старший репродуктивный возраст • Привычное невынашивание • Мужской фактор бесплодия • 3 и более неудачных попытки ЭКО в анамнезе (при переносе эмбрионов хорошего качества). 5 ПГД хромосомного дисбаланса (скрининг анеуплоидий, транслокации) Изменения в кариотипе: - Численные аномалии хромосом (45X0, 47 XXY) - Структурные перестройки (робертсоновские 45XY t13:14(q10;q10) и реципрокные (46XX t7:9 (p14;q31) транслокации, инверсии) - Изменение количества гетерохроматина на плече одной или нескольких хромосом (9qh+, 16qh+, 21qh+ и др.) 6 ПГД при робертсоновских и реципрокных транслокациях. Munne S. et al. reviewing of PGD in ART, 2010 7 Проблемы программ ПГД. • Низкая настороженность врачей районных консультаций. • Недостаточный уровень грамотности пациентов. • Отсутствие программ дородового скрининга. • Консервативная тактика ведения пациентов. 8 ПГД моногенных заболеваний. ЗАЧАТИЕ АБОРТ БЕРЕМЕННОСТЬ ПРЕНАТАЛЬНАЯ ПРЕНАТАЛЬНЫЙ ДИАГНОСТИКА СКРИНИНГ 9 ПГД моногенных заболеваний. • Медико-генетическое консультирование. • Подтверждение носительства заболевания в семье. • Создание уникальной диагностической панели для каждого случая. • Отработка методик на единичных клетках. • ПГД. • Пренатальная диагностика!!! 10 ПГД онкологических заболеваний. • Рак молочной железы и рак яичников мутации генов BRCA1 и BRCA2 • Рак щитовидной железы наличие протоонкогена RET • Рак почки мутации гена VHL (синдром ХиппельЛандау) 11 ПГД болезней с поздней манифистацией. • Хорея Хантингтона • Болезнь Паркинсона • Болезнь Альцгеймера • Шизофрения • Сахарный диабет II типа • Эпилепсия 12 Показания к ПГД с HLA типированием Тяжелые заболевания системы кроветворения, требующие трансплантации HLA совместимых ГСК донора. Талассемия Анемия Фанкони Синдром Вискота-Элдрихта Анемия Даймонд-Блэкфанд Х-сцепленный гипер IgM синдром Х-сцепленная адренолейкодистрофия Х-сцепленная гипогидротическая дисплазия с иммунодефицитом Апластическая анемия эктодермальная Для таких заболеваний, как острый лимфолейкоз. 13 Биопсия эмбрионов. Техника. Полярные тельца, бластомеры, трофектодерма. 14 Способы локального разрушения блестящей оболочки • Механический хэтчинг (блестящая оболочка надсекается Т- или Х-образно с помощью острой стеклянной микроиглы) • Химический хэтчинг (с помощью кислого раствора Тирода, рН 2.2) • Лазерный хэтчинг. 15 Варианты хетчинга: Механический • Технически сложен • Занимает много времени • Необходим третий микроинструмент • Дешевизна 16 Варианты хетчинга: химический • Эмбриотоксичен • Технически сложен • Занимает много времени • Дешевизна 17 Варианты хетчинга: лазерный • Прост в применении • Занимает мало времени • Позволяет работать с высокой точностью • Вызывает изменение температуры среды • Требуется дорогостоящее оборудование 18 Стадии развития эмбриона человека. 19 Генетический материал для исследования. •1 и 2 полярные тельца •Бластомеры •Трофектодерма 20 Биопсия полярного тела. www.glowm.com 21 Биопсия бластомера. 22 Техника биопсии ТЭ Вариант 1: Эмбрион с уже имеющимся отверстием в zona pellucida с выступающими клетками вдали от ВКМ • Захват и тракция выступающих клеток биопсийной пипеткой • Отделение клеток с помощью лазера • Механическое отделение клеток с помощью пипеткихолдинга J.Taylor, NewLife, Epsom, UK, Research Instruments 23 Техника биопсии ТЭ Вариант 2: Бластоциста без выступающих клеток/начала хэтчинга • Перфорация zona pellucida с помощью лазера • Культивирование бастоцисты с контролем начала хетчинга • Использование тонкой пипетки для биопсии (14µm) J.Taylor, NewLife, Epsom, UK, Research Instruments 24 Техника биопсии ТЭ Вариант 3: ВКМ расположена непосредственно в месте вылупления или около него • Расширение имеющегося отверстия zona pellucida • Второе отверстие в zona pellucida на расстоянии от вылупляющейся ВКМ • Полный хетчинг бластоцисты J.Taylor, NewLife, Epsom, UK, Research Instruments 25 Биопсия трофектодермы. 26 Проблемы • Техническая сложность выполнения • Слишком короткое время для проведения генетического анализа, выход за рамки «окна имплантации» • Малое количество либо отсутствие бластоцист на 5-6 сутки культивирования • На 2010 год примерно 90% случаев PGD выполнено на 3-сутки (Harper et al., 2010) 27 Условия • Отработанная современная лабораторная технология культивирования эмбрионов до 5-х суток • Лазерная установка • Высокоэффективная технология криоконсервации биологического материала (витрификация) • Обученный персонал • Адекватные методы генетического анализа (PCR, FISH, CGH) 28 Преимущества • Большее количество клеток для анализа • Меньшая травматизация эмбриона (Treff N.R., Ferry K.M. et al., 2011), отсутствие риска фатальных последствий для эмбриона в следствие его «полярности» • Меньшее количество эмбрионов на биопсию, работа с заведомо развивающимися эмбрионами 29 Биопсия эмбрионов. День 3 или 5? 30 Биопсия эмбрионов. День 3 или 5? 31 Методы ПГД. Прошлое. Настоящее. Перспективы. 32 Методы ПГД. Флуоресцентная гибридизация in situ Преимущества: Самый распространенный метод исследования Имеются готовые коммерческие наборы, высокая воспроизводимость результатов. Недостатки: Существенные ограничения метода. Токсичность. Необходимость заказа специфических зондов для диагностики транслокаций. Сложности с интерпретацией результатов. Относительная дороговизна. Невозможность проведения ПГД моногенных заболеваний. 33 Методы ПГД. Количественная флуоресцентная ПЦР. Преимущества: Возможность выполнения всех видов ПГД Дешевизна расходных материалов Скорость выполнения исследований. Возможность одновременного проведения ПГС и ПГД. Недостатки: Отсутствие коммерческих наборов. Необходимость валидации метода. Высокая доля интеллектуального труда 34 Методы ПГД. Сравнительная геномная гибридизация (aCGH) Преимущества: Возможность молекулярного кариотипирования эмбрионов Возможность выявления протяженных дупликаций и делеций Наличие коммерческих продуктов Конкуренция производителей (относительно невысокая стоимость оборудования) Недостатки: Невозможность диагностики моногенных заболеваний. Ограничение по количеству анализируемых эмбрионов. Высокая стоимость расходных материалов. 35 Методы ПГД. Next Generation Sequencing (NGS), aSNP Преимущества: Возможность молекулярного кариотипирования эмбрионов Возможность выявления микро и макро перестроек (от 10 п.н.) Возможность одновременной диагностики моногенных заболеваний Низкая себестоимость расходных материалов Недостатки: Высокая стоимость оборудования Необходимость разработки ПО для анализа данных Высокое давление со стороны производителей aCGH 36 aCGH или SNP (NGS) 37 Результаты собственных наблюдений. 2008-2013 38 РЕЗУЛЬТАТЫ. Преимплантационный генетический скрининг Биопсия бластомера Биопсия трофектодермы Всего Пациентов 389 22 Средний возраст пациентов 38±4,7 39 ± 2,9 - Кол-во диагностик 423 26 449 Получено бластомеров/тэ 3192 92 3284 Не получено результатов 62 (1,9%) 3 (3,3 %) Проанализировано эмбрионов(получены данные) 3130 89 3219 Патология 1994 (63,7 %) 53 (59,6 %) 2047 (63,6 %) Норма 1136 (36,3 %) 36 (40,4 %) 1172 (36,4 %) 39 РЕЗУЛЬТАТЫ. ПГД робертсоновских транслокаций. Биопсия бластомера Биопсия трофектодермы Всего Пациентов 34 1 Средний возраст пациентов 34±2,9 38 - Кол-во диагностик 42 1 43 Получено бластомеров/тэ 310 4 314 Не получено результатов 4 (1,2 %) 0 Проанализировано эмбрионов(получены данные) 306 4 310 Патология 238 (78 %) 3(75 %) 241(78 %) Норма 68 (22 %) 1 (25 %) 69(22 %) 40 РЕЗУЛЬТАТЫ. ПГД реципрокных транслокаций. Биопсия бластомера Биопсия трофектодермы Всего Пациентов 48 2 Средний возраст пациентов 33±5,2 34 ± 1,9 - Кол-во диагностик 62 5 67 Получено бластомеров/тэ 414 19 433 Не получено результатов 8 (1,9%) 1 (5,2 %) 9 Проанализировано эмбрионов(получены данные) 406 18 424 Патология 337 (83 %) 16 (78%) 353 ( 82,8 %) Норма 69 (17 %) 4 (22 %) 73 (17,2 %) 41 РЕЗУЛЬТАТЫ. ПГД моногенных заболеваний. Биопсия бластомера Биопсия трофектодермы Всего Пациентов 53 2 Средний возраст пациентов 38±4,4 31,3 - Кол-во диагностик 64 2 67 Получено бластомеров/тэ 349 12 361 Не получено результатов* 26 (7,4 %) 2 28 Проанализировано эмбрионов(получены данные) 323 10 333 Патология 252 (78 %) 7 (70%) 259( 77,7 %) Норма 71 (28 %) 3 (30 %) 74 (22,3%) 42 Другие ПГД Показания PGD+HLA HLA для СД Онко (RET) Пациентов 2 1 1 Средний возраст пациентов 34,5 36 33 Кол-во диагностик 3 2 1 Получено бластомеров/тэ 34 17 7 Не получено результатов* 2 0 0 Проанализировано эмбрионов(получены данные) 32 17 7 Патология 29 (91 %) 12 (70,6 %) 4 (57 %) Норма 3 (9 %) 5 (29,4 %) 3 (43 %) 43 ВЫВОДЫ 44 ВЫВОДЫ Квалифицированное медико-генетическое консультирование позволяет женщине раньше прибегнуть методам ВРТ с ПГД и сохранить репродуктивное здоровье. Для каждой поставленной задачи необходимо использовать определенные методы диагностики, помня об их преимуществах и недостатках. Необходимо коллегиальное принятие решение врачом, эмбриологом и генетиком о выборе метода биопсии в каждом конкретном случае. Диагностика с помощью биопсии трофектодермы дает наиболее полную картину о генетическом статусе эмбриона. 45 НАШИ ПАРТНЕРЫ Клиники ГК Мать и Дитя (ПМЦ, Мать и Дитя, Клиника Здоровья, Мать и Дитя (Уфа) Мать и Дитя (Иркутск), ИДК (Самара»), Мать и Дитя (Санкт-Петербург), Мать и Дитя (Пермь)) Москва (ЗАО «Клиника», Эндокринологический научный центр РАМН, ГОсВРТ ЦКБ РАН, ООО «МЕДЭКО», ООО «МЕДИНВЕСТ», ООО «ЭКО-ЦЕНТР», ЗАО «Поколение NEXT», НЦАГиП им. В.И. Кулакова, ООО «ЛЕРА», ООО МЦ «МирА», ООО «НОВЕЛЛА К», ОАО «МЕДИЦИНА», ООО МЦ «ВРТ», ЦПСиР) Самара (ГБУЗ СО КЦКТ, ООО «Клиника ЭКО» Санкт-Петербург (ООО «МЦРМ») Саратов (ЗАО «Клиника Доктора Парамонова») Краснодар (ООО СП «Эмбрио») Иваново Новокузнецк 46 Контакты Михаил Иванов _________________________________________________________________________ 24 к. 1, Севастопольский проспект, Москва, Россия, 117209 www.mcclinics.com m.ivanov@mospmc.ru МЫ ОТКРЫТЫ К СОТРУДНИЧЕСТВУ. 47