Автореферат (420 kb PDF) - Институт экологии и генетики

На правах рукописи
АНАНЬИНА Людмила Николаевна
НАФТАЛИНМЕТАБОЛИЗИРУЮЩИЙ КОНСОРЦИУМ
МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫЙ ИЗ ЗАСОЛЕННОЙ ПОЧВЫ
03.00.07 Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пермь – 2007
2
Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и
генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь
Научный руководитель:
кандидат биологических наук Плотникова Елена Генриховна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Октябрьский Олег Николаевич
доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна
Ведущая организация:
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
Защита состоится «26»
октября
2007 г. в 1200 часов на заседании
диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики
микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс:
(342) 2446711.
Автореферат размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов
УрО РАН (http:/www.iegm.ru).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики
микроорганизмов УрО РАН.
Автореферат разослан «25» сентября 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
чл.-корр. РАН
Ившина Ирина Борисовна
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Широкое применение в промышленности,
присутствие в побочных продуктах коксо-, газо- и нефтеперерабатывающих
производств, образование при сгорании различных органических материалов
(каменного угля, нефти, газа, древесины, мусора и др.) привело к повсеместному
распространению полициклических ароматических углеводородов в окружающей
среде. Физико-химические свойства соединений этого класса (гидрофобность,
высокая сорбционная способность и стабильность) способствуют их аккумуляции в
природных
экосистемах.
Кроме
того,
полициклические
ароматические
углеводороды обладают токсичным, мутагенным, тератогенным и канцерогенным
действиями на живые организмы. Все вышеперечисленное послужило причиной
выделения соединений этого класса в категорию приоритетных поллютантов
(Mumtaz et al., 1995). Основную роль в разложении соединений данного класса в
природе играет микробная деструкция (Sutherland et al., 1995). В настоящее время
накоплен большой объем информации о способности бактерий использовать ряд
полициклических
ароматических
углеводородов
в
качестве
единственного
источника углерода и энергии (Kanaly, Harayama, 2000; Habe, Omori, 2003).
Наиболее изученными являются бактериальные генетические и биохимические
системы катаболизма нафталина, который используется в качестве модельного
соединения для изучения систем деструкции полициклических ароматических
углеводородов (Боронин и др., 1989; Yen, Serdar, 1988; Bosch et al., 1999; Laurie et
al., 1999; Jones et al., 2003; Parales, 2003; Kulakov et al., 2000, 2005).
В ряде случаев загрязнение экосистем полициклическими ароматическими
углеводородами сопровождается засолением, которое может иметь природное или
антропогенное происхождение, сформированное в результате разработки нефтяных
месторождений и работы соледобывающих предприятий. В этих условиях
ведущими факторами формирования микробиоценозов становятся соленость среды
и поллютант. Микроорганизмы и их сообщества, способные к деструкции
полициклических ароматических углеводородов при высокой солености среды,
описаны в единичных сообщениях (Звягинцева и др., 2001; Плотникова и др., 2001;
Mille et al., 1991; Dýaz et al., 2000; Hedlud et al., 2001; Kasai et al., 2002; Abed et al.,
2006). Остаются малоизученными взаимодействия внутри таких сообществ, а
4
также
механизмы
регуляции
их
состава,
метаболической
активности
и
устойчивости к высокому содержанию солей. Проведение исследований в этой
области внесет существенный вклад в разработки новых стратегий биоремедиации
экстремальных экосистем.
Цель работы – исследование нафталинметаболизирующего консорциума
микроорганизмов, выделенного из засоленной почвы.
Задачи исследования
1. Выделить
стабильное/устойчивое
сообщество
микроорганизмов,
способное использовать нафталин в качестве единственного источника углерода и
энергии в присутствии высоких концентраций хлорида натрия.
2. Определить таксономическое положение бактерий сообщества на основе
принципов полифазной таксономии.
3. Изучить взаимоотношения бактерий в консорциуме при росте на
нафталине в условиях высокой солености.
4. Исследовать
галотолерантных
и
осмопротекторные
грамотрицательных
соединения
умеренно
грамположительных
галофильных
бактерий,
изолированных из консорциума.
Научная
новизна.
Определен
состав
консорциума
бактерий,
осуществляющего разложение нафталина в условиях высокой солености среды (до
9 % хлорида натрия). Установлено, что в консорциум входят галотолерантные
бактерии-деструкторы нафталина и галотолерантные, умеренно галофильные
бактерии, не способные осуществлять разложение данного полициклического
ароматического углеводорода. Показано, что катаболизм нафталина в консорциуме
осуществляют актинобактерии рода Rhodococcus. На основании филогенетической
обособленности и фенотипических отличий описаны новый род и вид Salinicola
socius sp. nov., gen. nov., новые виды Rhodococcus naphthalenivorans sp. nov. и
Thalassospira permense sp. nov. Показано, что представители родов Salinicola и
Rhodococcus при высокой осмолярности среды накапливают глутамат, эктоин и
гидроксиэктоин, выступающие в роли внутриклеточных осмопротекторов. Для
представителей
рода
описывается
впервые.
протокооперативных
Rhodococcus
подобная
Экспериментально
взаимоотношений
в
комбинация
обосновано
консорциуме
осмопротекторов
присутствие
между бактериями-
5
деструкторами нафталина и бактериями-спутниками.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные
уточняют классификацию семейства Halomonadaceae и расширяют знания о
разнообразии бактерий сообщества техногенных засоленных почв (г. Березники,
Пермский край). Результаты исследований могут служить основой для разработки
методов мониторинга биоразнообразия данного микробиоценоза. Результаты,
касающиеся
механизмов
функционирования
консорциума
разлагающего полициклические ароматические
микроорганизмов,
углеводороды при высокой
солености среды, могут быть использованы для усовершенствования методов
биоремедиации
экстремальных
экосистем.
Создана
рабочая
коллекция
галотолерантных/галофильных бактерий, перспективных для использования в
биотехнологии. Материалы диссертации используются в лекционных курсах на
кафедрах микробиологии и иммунологии, ботаники и генетики растений
Пермского государственного университета.
Положения, выносимые на защиту
1. Выделенное
из
засоленной
сообщество
микроорганизмов
включающей
галотолерантные
почвы
является
нафталинметаболизирующее
многокомпонентной
бактерии-деструкторы
нафталина,
системой,
умеренно
галофильные и галотолерантные бактерии-спутники.
2. На основании фенотипических характеристик и филогенетического
анализа
описаны
новые
таксоны
Salinicola socius
sp.
nov.,
gen.
nov.,
Rhodococcus naphthalenivorans sp. nov. и Thalassospira permense sp. nov.
3. В выделенном из засоленной почвы нафталинметаболизирующем
консорциуме
бактерий
галотолерантными
формируются
взаимовыгодные
бактериями-деструкторами
отношения
нафталина
и
между
умеренно
галофильными бактериями-спутниками.
4. Умеренно галофильные бактерии-спутники и галотолерантные бактериидеструкторы нафталина в условиях высокой солености среды накапливают
низкомолекулярные органические соединения (осмопротекторы).
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены и
обсуждены на Международной научно-практической конференции «Проблемы и
перспективы
реабилитации
техногенных
экосистем»,
Астрахань,
2004;
6
II Международной
конференции
«Микробное
биоразнообразие:
состояние,
стратегия сохранения, биологический потенциал», Пермь-Казань-Пермь, 2005; 9-й10-й Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука ХХI
века», Пущино, 2005, 2006; Всероссийской молодежной школе-конференции
«Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005; Всероссийской
молодежной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология»,
Москва-Пущино, 2006; IV Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и
перспективы развития», Москва, 2007.
По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 2 статьи
в рецензируемых журналах.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 165 страницах
машинописного текста, содержит 12 таблиц и 29 рисунков. Диссертация состоит из
введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех
глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой
литературы, включающего 229 литературных источника, из них 28 на русском
языке и 201 зарубежный, и приложений.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа
выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики
микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме
«Биохимические и генетические системы трансформации сложных органических
соединений бактерий, перспективных для биотехнологии» (номер государственной
регистрации НИР 0120.0406511). Исследования поддержаны грантами РФФИ
(№04-04-96042-р_урал_а, №07-04-96078-р_урал_а), Программой интеграционных
фундаментальных исследований, выполняемых в УрО РАН совместно с учеными
СО РАН (проект «Микробные сообщества экстремальных экосистем»).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение консорциума микроорганизмов. Образцы почвы отобраны на
расстоянии 10 м от солеотвала калийного комбината ОАО «Уралкалий»
(г. Березники, Пермский край). Для получения накопительной культуры 1 г почвы
вносили в колбу объемом 250 мл, содержащую 100 мл минеральной среды
Раймонда (Розанова, Назина, 1982), нафталин (1 г/л), NaCl (6 %) и инкубировали на
7
термостатируемом шейкере УВМТ-12-250 при 100 об/мин и 28°С до появления
микробного роста. Исследования проводили с сообществом (консорциумом)
микроорганизмов, полученным путем многократных пересевов накопительной
культуры
и
культивирования
при
вышеперечисленных
условиях,
обозначенным SMB3.
Бактериальные
штаммы.
Чистые
культуры
микроорганизмов
из
консорциума бактерий выделяли на полноценной агаризованной среде Раймонда,
содержащей 5 г/л триптона, 2,5 г/л дрожжевого экстракта и 30 г/л NaCl
(Плотникова и др., 2001). В работе использовали галотолерантные бактериидеструкторы нафталина родов Rhodococcus и Arthrobacter, а также умеренно
галофильные бактерии сем. Halomonadaceae, изолированные ранее из засоленных
почв (Алтынцева, 2001; Плотникова и др., 2001, 2006).
Ростовые характеристики консорциума микроорганизмов, смешанных
культур микроорганизмов (модельные эксперименты) и штаммов-деструкторов
изучали в периодических культурах, выращивая в колбах объемом 250 мл на
орбитальном шейкере УВМТ-12-250 (100 об/мин) при 28оС. В опытах по
культивированию
консорциума
SMB3
на
разных
субстратах
(нафталине,
салицилате, гентизате и ацетате), а также при изучении ростовых характеристик
смешанных культур микроорганизмов (модельные эксперименты) концентрация
субстратов составляла 0,5 г/л. В экспериментах по исследованию кинетики роста
штаммов-деструкторов и консорциума микроорганизмов в условиях разной
солености среды (0-9 % NaCl) концентрация нафталина была равна 1 г/л.
Определение биомассы проводили путем измерения оптической плотности (ОП540)
культуральной
жидкости
на
спектрофотометре
UV-Visible
BioSpec-mini
(«Shimadzu», Япония) в кювете с длиной оптического пути 0,5 см. Поскольку
бактерии
консорциума
характеристиками,
проведен
четко
подсчет
различались
макроморфологическими
колониеобразующих
единиц
(КОЕ)
морфотипов колоний в составе микробного консорциума. КОЕ определяли
методом серийных разведений с последующим высевом и подсчетом колоний на
агаризованной полноценной среде Раймонда, содержащей 3 % NaCl. Расчет
удельной скорости роста (µ), времени удвоения (td) и длительности lag-фазы (Tl)
производили по стандартным формулам (Нетрусов и др., 2005).
8
Определение
таксономического
положения
микроорганизмов.
Морфологические и физиолого-биохимические признаки бактерий исследовали
согласно стандартным методикам (Методы общей бактериологии, 1983). Для
определения энзиматической активности использовали тест-системы «СИБ»
(Нижний Новгород, Россия) в соответствии рекомендациям производителя.
Наличие миколовых кислот выявляли методом тонкослойной хроматографии
(Goodfellow, Minnikin, 1985). Изомер диаминопимелиновой кислоты в продуктах
кислотного
гидролиза
клеточных
стенок
определяли
методом
бумажной
хроматографии (Becker, 1964). Препараты клеточных стенок получали по методу,
описанному (Schleifer, Kandler, 1972). Состав жирных кислот целых клеток и
хинонов определяли по описанным ранее методам (Zhilina et al., 1997).
Нуклеотидный состав ДНК определяли по температуре ее тепловой денатурации
(Owen, Lapage, 1976). Выделение тотальной ДНК проводили описанным ранее
методом (Current protocols in molecular biology, 1995). Предварительную
группировку штаммов бактерий осуществляли методами ДНК-типирования REPПЦР, BOX-ПЦР и ARDRA (Versalovic et al., 1994; Scortichini et al., 2002).
Определение
нуклеотидной
амплифицированного
с
последовательности
эубактериальными
гена
праймерами
27F
16S
и
рРНК,
1492R
в
термоциклере «My Cycler» («Bio-Rad», США), проводили с применением набора
реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit («Beckman Coulter», США) на
автоматическом ДНК-секвенаторе CEQ 2000 XL DNA Analysis System («Beckman
Coulter», США) (Гавриш и др., 2004). Последовательности 16S рДНК выравнивали
с помощью программы CLUSTAL W (Thompson et al., 1994). Построение
филогенетического древа производили с помощью пакета программ TREECON
(Van de Peer, DeWachter, 1994).
Денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГГЭ). Структуру
консорциума микроорганизмов исследовали методом ДГГЭ фрагментов гена
16S рРНК, амплифицированных с применением эубактериальных праймеров 27F и
518R (Tiirola et al., 2002). Праймер 27F включал 40 нуклеотидный GC-хвост
(5`-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3`) на 5`-конце.
Электрофорез был выполнен на DcodeTM Universal Mutation System («Bio-Rad»,
США) согласно протоколу (Muyzer et al, 1993)
9
Выделение и анализ осмопротекторов. Выделение осмопротекторов
проводили из клеток, выращенных в минеральной среде Раймонда с разной
соленостью и глюкозой в качестве субстрата. Спектры ЯМР регистрировали на
импульсном Фурье-спектрометре ЯМР типа WP80SY («Bruker», Германия)
(Хмеленина и др., 2000).
Статистическая
обработка.
Повторность
опытов
трехкратная.
При
статистической обработке определяли среднюю арифметическую, стандартное
отклонение, доверительный интервал, достоверность результата. Для обработки
результатов использовали статистический модуль Exсel 5.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Рост сообщества бактерий в присутствии различных концентраций
хлорида натрия. Исследование влияния солености среды на рост сообщества
бактерий в минеральной среде Раймонда с нафталином в качестве единственного
источника углерода и энергии показало, что максимальные значения оптической
плотности культуры наблюдаются при 3 % NaCl и в отсутствие соли. Увеличение
концентрации хлорида натрия в среде культивирования до 9 % приводит к
снижению
показателей
ростовых
характеристик.
При
более
высоких
концентрациях соли увеличения оптической плотности не зафиксировано (рис. 1).
ОП 540
0,6
1
0,5
Рис. 1. Динамика роста сообщества
бактерий
в
минеральной среде Раймонда с
нафталином
при
разных
концентрациях NaCl.
2
3
0,4
0,3
4
0,2
1 – без соли, 2 – 3 %, 3 – 6 %,
4 - 7,5 %, 5 - 9 %.
5
0,1
0
0
50
100
150
200
250
300
Часы
Выявленный ингибирующий эффект повышенных концентраций хлорида
натрия на рост бактерий в процессе разложения токсичных ксенобиотиков, в том
числе
полициклических
ароматических
углеводородов,
отмечен
многими
исследователями (Звягинцева и др., 2001; Плотникова и др., 2001; Mille et al., 1991).
Характеристика
бактерий
сообщества
SMB3.
Из
исследуемого
бактериального сообщества, культивированного в жидкой минеральной среде на
нафталине в присутствии 6 % NaCl, выделено семь штаммов бактерий,
10
обозначенных как SMB31, SMB32, SMB33, SMB34, SMB35, SMB37 и SMB38.
Изолированные штаммы отличаются между собой и от выделенных ранее из почв
района
солеразработок
бактериальных
изолятов
по
фенотипическим
и
генотипическим характеристикам (ДНК-профилю REP-, BOX-ПЦР и ARDRA).
Штаммы охарактеризованы по способности к росту на нафталине и
полноценной среде при различных концентрациях NaCl (табл. 1). Установлено, что
в состав сообщества входят штаммы, которые разлагают нафталин, как в
отсутствие, так и в присутствии хлорида натрия (штамм SMB37 – до 7,5 %, штамм
SMB38 – до 9 %), а также штаммы, не деградирующие данное соединение (табл. 1).
Изоляты SMB32, SMB33, SMB37 и SMB38 способны к росту на полноценной среде
Раймонда без NaCl и в его присутствии – до 10 %, а штамм SMB34 растет при
концентрации
хлорида
Вышеперечисленные
натрия
бактерии
до
8%
отнесены
в
к
среде
культивирования.
группе
галотолерантных
микроорганизмов. Штаммы SMB31 и SMB35 растут на полноценной
среде
Таблица 1.
Рост бактерий в присутствии разных концентраций хлорида натрия
Содержание NaCl (%),
минеральная среда
Штамм
с нафталином**
0
3
8
10
17
30
0
7,5
8
9
SMB31
–
+++
+++
+++
++
+
–
–
–
–
SMB32
+++
+++
+++
+
–
–
–
–
–
–
SMB33
+++
+++
+++
++
–
–
–
–
–
–
SMB34
+++
+++
+++
–
–
–
–
–
–
–
SMB35
+
+++
+++
+++
++
+
–
–
–
–
SMB37
+++
+++
+++
+
–
–
+++
+
–
–
SMB38
+++
+++
+++
+
–
–
+++
+++
++
+
Примечание. * – рост на полноценной агаризованной среде Раймонда, ** – рост в жидкой
минеральной среде Раймонда с нафталином, «–» – нет роста, «+» – «+++» – активность роста.
Содержание NaCl (%),
полноценная среда *
Раймонда при 30 % NaCl, для оптимального роста изолятов необходимо
присутствие 3-10 % NaCl в среде культивирования. Таким образом, согласно
классификации Кашнера изоляты SMB31 и SMB35 являются умеренными
галофилами (Кашнер, 1981; Ventosa et al., 1998).
Таксономическая характеристика умеренно галофильных бактерий
семейства Halomonadaceae. Умеренно галофильные бактерии SMB31 и SMB35
отличаются друг от друга по морфологическим и физиолого-биохимическим
признакам (табл. 2).
11
Филогенетический
анализ,
основанный
на
сравнении
нуклеотидных
последовательностей гена 16S рРНК, показал, что штаммы занимают обособленное
положение
внутри
семейства
Halomonadaceae
(рис.
2).
Изолят
SMB31
группируется с Halomonas taeanensis (уровень сходства 16S рДНК – 99,8 %), а
штамм SMB35 образует периферическую ветвь в подкластере, включающем роды
Halomonas, Cobetia и Chromohalobacter (значение «bootstrap» – 76 %). Уровни
сходства 16S рДНК изолята SMB35 и видов рода Halomonas находятся в пределах
от 90,6 % до 95,1 %. Наиболее высокие величины сходства – 95,0-95,1 % –
обнаружены с тремя видами рода Halomonas – H. pacifica, H. taeanensis и
H. ventosae, не входящими ни в группу Halomonas sensu stricto (I группа), ни в
наиболее многочисленную группу галомонад (II группа) и не группирующимися
друг с другом (рис. 2). В целом ряде классов микроорганизмов, в том числе
протеобактерий, подобные величины сходства 16S рДНК квалифицируются как
межродовые (Takeuchi et al., 2001; Evtushenko, Takeuchi, 2003; An et al., 2006).
Штамм
SMB35
обладает
существенными
характеристиками,
дифференцирующими его от видов Halomonas sensu stricto, близкородственных
видов
рода
Halomonas
и
от
представителей
других
родов
семейства
Наlomonadaceae, среди которых необходимо выделить содержание Г+Ц-пар в
ДНК, подвижность и характер расположения жгутиков, диапазон концентраций
хлорида натрия, при которых возможен рост, способность гидролизовать крахмал,
желатину, твин 80 и мочевину (табл. 2, 3).
Выявленные
фенотипические
отличия,
а
также
филогенетическая
обособленность штамма SMB35 дают основание для выделения нового рода и
вида, для которого предлагается название Salinicola socius gen. nov., sp. nov.
Нуклеотидная последовательность 16S рДНК штамма Salinicola socius SMB35T
(1433 п.н.) депонирована в GenBank под номером DQ 979342.
Штамм SMB31 на данном этапе работы идентифицирован как Halomonas sp.
H. halmophila ATCC 19717 T (AJ306889)
H. almeriensis M8 T (AY858696)
100
T
94 H. elongata ATCC 33173 (M93355)
H. eurihalina ATCC 49336 T (L42620)
H. maura DSM 13445 T (AJ271864)
T
77
100 H. salina ATCC 49509 (AJ2434470)
H. halophila DSM 4770 T (M93353)
H. organivorans G-16.1 T (AJ616910)
63
H. koreensis SS20 T (AY382579)
H. pacifica DSM 4742 T (L42616)
H. cupida DSM 4740 T (L42615)
50
H.ventosae AI 12T (AY268080)
57
H. halodenitrificans DSM 735 T (L04942)
91
H. alimentaria DSM 15356 T (AF211860)
H. campaniensis 5AGT T (AJ515365)
H. campisalis ATCC 700597 T (AF054286)
H. halocynthiae DSM 14573 T (AJ417388)
H. subglaciescola DSM 4683 T (AJ306892)
100
H. halodurans DSM 5160 T (L42619)
T
92 H. boliviensis DSM 15516 (AY245449)
100 H. neptunia DSM 15720 T (AF212202)
99
100
H. variabilis DSM 3051T (AJ306893)
H. sulfidaeris DSM 15722 T (AF212204)
100
T
100 H. venusta DSM 4743 (AJ306894)
H. hydrothermalis DSM 15725 T (AF212218)
69
H. magadiensis DSM 15367T (X92150)
100
T
(AJ306888)
100 H. aquamarina DSM 30161
T
50 H. meridiana DSM 5425 (AJ306891)
H. axialensis DSM 15723 T (AF212206)
H. pantelleriense DSM 9661 T (X93493)
79
H. muralis DSM 14789 T (AJ320530)
H. desiderata DSM 9502 T (X92417)
H. marisflavi DSM 15357 T (AF251143)
T
100 Ch. salexigens DSM 3043 (AJ295146)
Ch. israelensis ATCC 4398 5 T (AJ295144)
100
Ch. sarecensis DSM 15547 T (AY373448)
97
Ch. marismortui ATCC 17056 T (X87219)
Chromohalobacter sp. SMB17
Ch. canadensis ATCC 43984 T (AJ295143)
H. anticariensis FP35 T (AY489405)
Cobetia marina DSM 4741 T (AJ306890)
76
100
100
Группа II
Группа I
100
Halomonas sensu stricto
12
0.02
SMB31
H. taeanensis DSM 16463 T (AY671975)
Salinicola socius SMB35 T(=ВКМ В-2397 Т) (DQ 979342)
Zymobacter palmae DSM 10491 T (D14555)
Carnimonas nigrificans CTCBS1 T (Y13299)
T
P. putida DSM 291 (Z76667)
88
Рис. 2. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода
neighbor-joining, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей
16S рДНК. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100
нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления,
определенная с помощью «bootstrap»-анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены
значения выше 50 %).
13
Таблица 2.
Признак
–
+
+
+
+
–
F
Полярное, 1
SMB35
+
–
–
–
–
–
–
–
F
н.д.
SMB31
+
н.д.
н.д.
н.д.
–
+
–
–
+
н.д.
Перитрихиальное
H. taeanensisА
–
+
–
–
+
67,5
0,5-3,0
0,0-20,0
5,0-10,0
–
–
–
–
–
+
–
–
+
О
Перитрихиальное
H. pacifica Г
–
–
–
–
–
74,3
6,0-9,0
3,0-15,0
6,0-10,0
+
+
+
–
–
–
–
–
+
н.д.
н.д.
H. ventosaeБ
+
+
–
+
+ (в)
60,5
3,0-8,0
0,0-20,0
5,0-10,0
+
–
+ (в)
+ (в)
–
+
–
–
Латеральное
или полярное,
несколько
– (в)
O (в)
+
+
+
+
–
62,9
7,5
3,0-25,0
5,0-10,0
–
–
+ (в)
– (в)
–
– (+)
–
– (в)
+
O
Латеральное
–
–
–
–
–
63,5
7,5
5,0-25,0
6,0-10,0
–
–
–
–
–
–
–
–
–
н.д.
–
–
–
–
–
–
65,7
7,5
0,5-25,0
5,0-10,0
+
–
+
+
+
+
–
+
–
O
–
Признаки, дифференцирующие штамм SMB35 и штамм SMB31 от видов рода Наlomonas, имеющих наиболее высокое
сходство по 16S рДНК (H. pacifica, H. taeanensis, H. ventosae), типового вида H. elongatа и видов,
близких к H. elongatа (H. halmophila, H. almeriensis, H. eurihalina)
Расположение жгутиков,
количество
–
–
–
+
+
н.д.
н.д.
н.д.
65,0
10,0-12,0
1,0-25,0
7,0-10,0
H. almeriensis В H. eurihalina Г
Оксидаза
O/F тест (глюкоза)
Гидролиз:
желатины
мочевины
крахмала
твина 80
–
–
+
+
+
+
н.д.
3,0-10,0
3,0-30,0
6,0-7,0
H. halmophila Г
β-галактозидаза
–
+
–
–
+
63,0
3,0-10,0
0,5-30,0
6,0-8,0
H. elongata Г
Фенилаланиндезаминаза
Образование Н2S
Восстановление нитратов до
нитритов
Образование кислоты:
L-арабиноза
глюкоза
инозит
сахароза
сорбит
ДНК Г+Ц (мол. %)
Оптимум NaCl, %*
Пределы NaCl, %
Пределы рН**
Примечание. «+» – положительная реакция, «–» – отрицательная реакция, «н.д.» – нет данных, «в» – вариабельно, * – %, вес/объем, ** – для
штаммов SMB31, SMB35 использовали буферные системы, в других случаях рН доводили HCl и NaOH, А – цит. по Lee J.-C. с соавт., 2005, Б – цит.
по Martinez-Canovas M.J. с соавт., 2004, В – цит. по Martínez-Checa F. с соавт., 2005, Г – цит. по Mata J.A. с соавт., 2002; Arahal D.R., Ventosa А., 2006.
В скобках приведены вариабельные результаты цит. по Arahal D.R., Ventosa А., 2006.
14
Таблица 3.
Фенотипические признаки, дифференцирующие штамм SMB35 от других
родов семейства Наlomonadaceae
Признак
SMB35
ChromohalobacterА
Cobetia Б
Белый, желтый,
кремовый,
Цвет колоний
Желтый
Кремовый
коричневый, черный
(от желтого до темнокоричневого)
Подвижность
+
+
+
Полярное,
Расположение жгутиков,
Перитрихиальное,
субполярное,
Полярное, 1
2-5
количество
перитрихиальное
(перитрихиальное)
Оксидаза
–
в (–)
–
O/F (глюкоза)
F
O* (О)
O
Гидролиз:
желатины
+
–
–
крахмала
+
–
–
твина 80
+
–
–
мочевины
+
в (–)
+
Фенилаланиндезаминаза
–
–* (–)
–
Восстановление нитратов
–
в (+)
–
до нитритов
ДНК Г+Ц (мол. %)
63,0
56,1-65,0 (62,1-64,9)
62,0-64,0
Оптимум NaCl, % (в./об.)
3,0-10,0
7,5-10,0 (10,0)
5,0
Carnimonas В Zymobacter Г
Белый
Молочнобелый
–
+
–
Перитрихиальное
+
н.д.
–
F**
–
+
–
–
+
–
–
н.д.
н.д.
–
–
–
56,0±0,3
4,0
55,4-56,2
н.д.
Пределы NaCl, % (в./об.)
0,5-30,0
0,0-30,0 (1,0-30,0)
0,5-20,0
0,0-8,0
н.д.
Пределы рН***
Рост при 5°С
Рост при 42°С
6,0-8,0
–
–
4,5-10,0 (5,0-10,0)
в (+)
+
5,0-10,0
–
+
н.д.
–
–
3,0-10,0
–
–
Примечание. «+» – положительная реакция, «–» – отрицательная реакция, «в» – вариабельно,
«н.д.» – нет данных, * - данные для ряда видов отсутствуют, ** – факультативный анаэроб,
сбраживает ряд сахаров до этанола, *** – для штамма SMB35 использовали буферные системы, в
других случаях рН доводили HCl и NaOH, А – цит. по Arahal D.R., Ventosa А., 2006; Quillaguaman J.
с соавт., 2004; Prado B. с соавт., 2006; Peconek J. с соавт., 2006, в скобках приведены характеристики
типового вида рода Chromohalobacter marismortui цит. по Ventosa A. с соавт., 1989, Б - цит. по
Arahal D.R. с соавт., 2002, В – цит. по Garriga M. с соавт., 1998, Г – цит. по Okamoto T. с соавт., 1993.
Таксономическая характеристика галотолерантной бактерии семейства
Rhodospirillaceae. У штамма определена последовательность гена 16S рРНК,
составляющая 1391 п.н. Филогенетический анализ показал, что штамм является
членом
семейства
Rhodospirillaceae
и
стабильно
группируется
вместе
с
представителем хемоорганотрофного рода – Thalassospira lucentensis, с которым
имеет наиболее высокий уровень сходства 16S рДНК (96,7 %) (рис. 3).
Подобно филогенетически близкому организму Thalassospira lucentensis
штамм SMB34 является аэробом, хемоорганотрофом, клетки представляют собой
оксидазо- и каталазоположительные, подвижные за счет одного полярного
15
жгутика, изогнутые палочки. Среди преобладающих жирных кислот присутствует
гексадекановая кислота.
Вместе
с
тем,
изолят
обладает
физиолого-биохимическими
и
хемотаксономическими признаками, четко дифференцирующими его от вида
Thalassospira lucentensis. Наиболее значимыми из них являются наличие
нитратредуктазы, положительная реакция в тесте Хью-Лейфсона, концентрации
хлорида натрия (0-8 %), при которых возможен рост, преобладающие жирные
кислоты
(циклопропаннонадекановая,
ω9-октадеценовая,
циклопропангептадекановая, гексадекановая кислоты).
0.02
Azospirillum doebereinerae GSF71T (AJ238567)
T
Azospirillum largomobile ACM 2041 (X90759)
T
76
Azospirillum oryzae COC8 (AB185396)
T
Azospirillum melinis TMCY 0552 (DQ022958)
98 54
T
Azospirillum lipoferum ATCC 29707 (M59061)
100
T
Azospirillum brasilense Sp7 (X79739)
T
Azospirillum halopraeferens Au4 (X79731)
92
Skermanella parooensis ACM 2045 T (X90760)
T
Azospirillum amazonense DSM 2787 (Z29616)
63
T
Azospirillum irakense KBC1 (Z29583)
79
T
100
Rhodocista pekingensis 3-p (AF523824)
99 Rhodocista centenaria ATCC 43720 T (D12701)
99
T
Rhodospirillum centenum ATCC 43720 (D12701)
T
Inquilinus limosus AU 476 (AY043374)
Defluvicoccus vanus Ben 114T (AF179678)
97
T
Tistrella mobilis TISTR 1108 (AB071665)
T
63
100 Rhodovibrio sodomensis DSI (M59072)
T
Rhodovibrio salinarum ATCC 35394 (M59069)
T
88
Magnetospirillum magnetotacticum MS-1 (Y10110)
T
Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 (Y10109)
100
100
14031T (M59067)
100 Phaeospirillum molischianum ATCC
T
Phaeospirillum fulvum NCIB 11762 (D14433)
100
SMВ34
Thalassospira lucentensis QMT2 T (AF358664)
T
96
Rhodospirillum photometricum DSM 122 (AJ222662)
100
T
Rhodospirillum rubrum ATCC 11170 (D30778)
96
T
Rhodospira trueperi ATCC 700224 (AJ001276)
99
T
Roseospira marina CE2105 (AJ298879)
99
T
Roseospira mediosalina L1-66 (AJ000989)
T
Roseospira navarrensis SE3104 (AJ298880)
63
T
Azorhizobium caulinodans LMG 6465 (X67221)
70
Рис. 3. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода
neighbor-joining, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей
16S рДНК. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100
нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления,
определенная с помощью «bootstrap»-анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены
значения выше 50 %).
16
Основываясь на перечисленных выше данных филогенетического анализа, а
также на существенных отличиях по фенотипическим характеристикам от
известного вида, на настоящем этапе исследований штамм отнесен к новому виду
Thalassospira permense sp. nov.
Определение
таксономического
положения
актинобактерий
рода
Rhodococcus – деструкторов нафталина. Анализ хемотаксономических признаков
грамположительных
штаммов
SMB37
и
SMB38
показал,
что
в
состав
пептидогликана входит мезо-диаминопимелиновая кислота, в клеточной стенке
0.02
R. imtechensis RKJ300 T (AY525785)
R. opacus DSM 43205 T (X80630)
R. percolatus MBS1 T (X92114)
SMB38
67
R. jostii NBRC 16295 T (AB046357)
R. koreensis DNP505 T (AF124343)
53
R. marinonascens DSM 43752 T (X80617)
R. maanshanensis M712 T (AF416566)
90
R. tukisamuensis Mb8 T (AB067734)
72
R. baikonurensis A1-22 T (AB071951)
74
92
R. erythropolis ATCC 4277 T (X81929)
R. globerulus DSM 4954 T (X80619)
R. yunnanensis YIM 70056 T (AY602219)
100
T
100 R. luteus ATCC 35014 (X81932)
R. fascians ATCC 12974 T (X81930)
100
R. equi ATCC 6939 T (X80603)
R. triatomae IMMIB RIV-085 T (AJ854055)
56
R. rhodnii ATCC 35071 T (X81935)
R. kroppenstedtii K-07-23 T
100
R. corynebacterioides DSM 20151 T (X80615)
R. phenolicusG2P T(AY533293)
R. aetherovorans 10bc312 T (AF447391)
100
60
R. ruber DSM 43338 T (X80625)
R. zopfii ATCC 51349 T (X81934)
57
R. coprophilus ATCC 29080 T (X81928)
R. rhodochrous DSM 43241 T (X79288)
90
SMB37
51
R. gordoniae W4937 T (AY233201)
100
R. pyridinovorans PDB9 T (AF173005)
R. roseus ATCC 271 T (X81921)
Corynebacterium diphtheriae NCTC 11397 T (X84248)
Подкластер R. erythropolis
R. wratislaviensis NCIMB 13082 T (Z37138)
Подкластер R. rhodochrous
88
79
78
Рис. 4. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода
neighbor-joining, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей
16S рДНК. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100
нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления,
определенная с помощью «bootstrap»-анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены
значения выше 50 %).
17
Таблица 4.
Признаки, дифференцирующие штамм SMB37 от близкородственных видов
рода Rhodococcus
R. rhodochrous А
Оранжевыекрасные
R. pyridinivorans Б
Светлооранжевый
R. gordoniae В
Розовыйкоралловый
+
–
–
–
–
–
–
+
+
+
–
–
–
+
+
+
+
–
+
+
+
–
10
–
–
в
–
+
–
7
–
–
–
–
+
+
+
+
–
+
+
5
Признак
SMB37
Цвет колоний
Розовый
Гидролиз:
крахмала
мочевины
Образование Н2S
Восстановление нитратов
до нитритов
Образование кислоты:
арабиноза
галактоза
ксилоза
мальтоза
маннит
сахароза
Рост в среде с NaCl, %*
н.д.
Примечание. «+» – положительная реакция, «–» – отрицательная реакция, «н.д.» – нет
данных, «в» - вариабельно, * – %, вес/объем, А – цит. по Нестеренко О.А. и др., 1985, Б - цит. по
Yoon J.-H. с соавт., 2000, В – Jones A.L. с соавт., 2004.
выявлены
миколовые
кислоты.
Бактериальные
культуры
характеризуются
жизненным циклом кокк-палочка-кокк. Филогенетический анализ нуклеотидных
последовательностей 16S рДНК штаммов SMB37 и SMB38, составляющих
1272 п.н. и 1400 п.н., соответственно, выявил их принадлежность к роду
Rhodococcus. Данные филогенетического анализа 16S рДНК штамма SMB38
показывают, что он имеет высокий уровень сходства с R. jostii (99,6 %) в
подкластере R. erythropolis. На данном этапе исследований штамм SMB38
идентифицирован как Rhodococcus sp. (рис. 4).
На филогенетическом древе штамм SMB37 попадает в подкластер
R. rhodochrous, что подтверждается высоким значением «bootstrap»-анализа (90 %)
(рис. 4). Уровень сходства 16S рДНК штамма с видами этой группы составляет
97,8-98,4 %. В литературе имеется достаточно много сообщений (Briglia et
al., 1996; Yoon, Cho et al., 2000; Yoon et al., 2000; Goodfellow et al., 2002, 2004;
Jones et al., 2004), свидетельствующих о том, что виды рода Rhodococcus при
подобных значениях сходства 16S рДНК и даже намного выше – от 99,0 % до
99,5 % – имеют уровень ДНК-ДНК гомологии намного ниже 70 % – значения,
рекомендованного для выделения бактериального вида (Wayne et al., 1987). С
18
учетом вышесказанного и существенных отличий по фенотипическим признакам
(табл. 4), в их числе устойчивость к соли и способность использовать нафталин в
качестве
единственного
источника
углерода
и
энергии,
штамм
SMB37
представляет собой новый вид рода Rhodococcus, с предложенным названием
Rhodococcus naphthalenivorans sp. nov.
Штамм SMB32 – представитель группы «Arthrobacter nicotianae».
Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности штамма SMB32,
составляющей 1415 п.н., показал, что он попадает в группу «A. nicotiana» рода
Arthrobacter
со
значением
«bootstrap»-анализа
92 %,
включающую
виды
A. nicotianae, A. sulfureus, A. mysorens, A. uratoxydans, A. protophormiae, A. rhombi,
A. creatinolyticus, A. arilaitensis, A. bergerei, A. ardleyensis, A. psychrolactophilus,
A. kerguelensis и A. gangotriensis. Наиболее высокое значение сходства 16S рДНК
штамм имеет с A. nicotianae (99,5 %), A. mysorens (99,5 %) и A. arilaitensis (99,5 %).
Фенотипические данные, в том числе состав пептидогликана, в котором
выявлены лизин, аланин и глутаминовая кислота в молярном соотношении 1:2:1,5,
соответствующем
А4α типу,
характерного
для
артробактерий
группы
«A. nicotianae», подтверждают результаты филогенетического анализа; сахара
клеточной стенки представлены галактозой, глюкозой, рибозой, целлобиозой и
маннозой.
Ввиду не
выраженности
фенотипических
отличий
изолята
от
филогенетически близких видов, на данном этапе штамм определен как
Arthrobacter sp. (группа «A. nicotianae»).
Штамм Microbacterium sp. SMB33. Филогенетический анализ нуклеотидной
последовательности 16S рДНК штамма SMB33 (1421 п.н.) показал, что он является
членом рода Microbacterium. Наиболее высокий уровень сходства, составляющий
99,1-99,7 %,
изолят
(M. maritypicum,
имеет
с
M. oxydans,
M. hydrocarbonoxydans,
представителями
M. liquefaciens,
M. testaceum,
орнитинсодержащих
M. saperdae,
M. aerolatum,
видов
M. luteolum,
M. keratanolyticum,
M. paraoxydans, M. resistens, M. foliorum) и с одним лизинсодержащим –
M. oleivorans (99,2 %).
Анализ клеточной стенки показал, что в состав пептидогликана входят
орнитин, глутаминовая вместе с гидроксиглутаминовой кислоты, глицин и аланин
в молярном соотношении 1:1,5:2:2. Сахар клеточной стенки – галактоза.
19
Полученные данные согласуются с результатами сравнения нуклеотидных
последовательностей. На данном этапе работы штамм идентифицирован как
Microbacterium sp.
Изучение взаимоотношений бактерий в консорциуме SMB3
Консорциум – это совокупность организмов, функционально связанных друг
с другом (Manual of environmental microbiology, 2002). В представленной работе
исследованы взаимоотношения бактерий-деструкторов и сопутствующих бактерий
в консорциуме SMB3.
Влияние интермедиатов деструкции нафталина на состав консорциума
микроорганизмов. Изучена способность бактерий консорциума использовать в
качестве субстратов промежуточные продукты разложения нафталина. Показано,
что штаммы-деструкторы нафталина рода Rhodococcus способны утилизировать
салицилат, гентизат и ацетат (табл. 5), что предполагает разложение нафталина
родококками через салицилат по гентизиновому пути (Grund et al., 1992;
Di Gennaro et al., 2001; Kulakov et al., 2005). Поскольку бактерии-спутники
способны расти на интермедиатах катаболизма нафталина (табл. 5), проведено
исследование влияния промежуточных метаболитов деструкции нафталина на
структуру консорциума SMB3 методом денатурирующего градиентного гель
электрофореза и подсчетом колониеобразующих единиц. Установлено, что
культивирование консорциума на ацетате, салицилате и гентизате приводит к
элиминации ряда бактерий, в то время как при инкубировании с нафталином в
качестве единственного источника углерода и энергии состав консорциума
стабильно сохраняется (рис. 5, 6).
Наблюдаемое
уменьшение
биоразнообразия
консорциума
при
смене
источника углерода и энергии (нафталина на промежуточные продукты его
метаболизма) можно объяснить сокращением звеньев трофической цепи, что ведет
к конкуренции между бактериальными популяциями, трансформирующими
одинаковый субстрат. Полученные результаты доказывают, что в консорциуме
присутствуют сформированные трофические связи, в которых каждый член
сообщества занимает определенную экологическую нишу.
20
Таблица 5.
Рост бактерий на интермедиатах деструкции нафталина
Штамм
салицилат
(0,5 г/л)
−
+
−
−
−
++
++
Halomonas sp. SMB31
Arthrobacter sp. SMB32
Microbacterium sp. SMB33
Thalassospira permense SMB34
Salinicola socius SMB35
R. naphthalenivorans SMB37
Rhodococcus sp. SMB38
Субстрат
салицилат
гентизат
(0,25 г/л)
−
−
+
−
+
++
−
−
−
−
++
++
++
++
ацетат
++
++
++
++
++
++
++
Примечание. «−» − нет роста, «+» -«++» – активность роста.
Рис. 5. ДГГЭ фрагментов 16S
рДНК
штаммов
бактерий
и
консорциума SMB3, инкубированного
на разных субстратах в минеральной
среде Раймонда в присутствии 7 %
NaCl.
1 – консорциум
SMB3
(нафталин),
2 - консорциум
SMB3
(салицилат),
3 - консорциум
SMB3
(ацетат),
4 - штамм SMB38, 5 – штамм SMB37,
6 - штамм SMB35, 7 - штамм SMB34,
8 - штамм SMB33, 9 - штамм SMB32,
10 - штамм SMB31.
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
КОЕ/мл
1
1,00E+08
5
1,00E+07
1 2
1,00E+06
1
6
6
1,00E+05
7
6
7
3
6
4
4
1,00E+04
1,00E+03
салицилат
гентизат
нафт алин
ацет ат
субстрат
Рис. 6. Количество клеток бактерий консорциума SMB3, выращенного
на разных субстратах в минеральной среде Раймонда в присутствии 7 % NaCl
(стационарная фаза роста).
1 – штамм SMB31, 2 – штамм SMB32, 3 - штамм SMB33, 4 - штамм SMB34,
5 - штамм SMB35, 6 – штамм SMB37, 7 - штамм SMB38.
21
Рост
штамма
Rhodocoсcus
naphthalenivorans
SMB37
в
составе
консорциума и индивидуальной культуре. Исследуемый консорциум бактерий
способен расти на нафталине в присутствии до 9 % NaCl (рис. 1). В то же время из
консорциума выделен штамм-деструктор нафталина R. naphthalenivorans SMB37,
для индивидуальной культуры которого верхним пределом для роста в
минеральной среде Раймонда на нафталине служит концентрация хлорида
натрия 7,5 % (табл. 1).
Сравнительный анализ характера роста штамма-деструктора SMB37 при
культивировании в составе консорциума и индивидуальной культуре показал, что
наиболее высокое значение колониеобразующих единиц штамма в индивидуальной
культуре зафиксировано в присутствии 3 % NaCl (108 КОЕ/мл), в отсутствие соли
значение КОЕ на один порядок ниже (107 КОЕ/мл) (рис. 7). В обоих вариантах
(отсутствие NaCl и 3 % NaCl) количество клеток выше при культивировании
штамма в составе консорциума (108 КОЕ/мл и 109 КОЕ/мл, соответственно). При
выращивании штамма-деструктора SMB37 в составе консорциума SMB3 и
индивидуальной культуре в присутствии 7,5 % NaCl наблюдается значительное
различие в значениях КОЕ: при культивировании штамма SMB37 в составе
консорциума КОЕ на три порядка выше (108 КОЕ/мл), чем при росте в
индивидуальной культуре (105 КОЕ/мл).
Таким образом, экспериментально обосновано, что на эффективность роста
штамма-деструктора нафталина R. naphthalenivorans SMB37 в условиях высокой
солености среды положительное влияние оказывают другие члены микробного
консорциума SMB3.
КОЕ/мл
1,00E+10
2
2
1,00E+09
2
1,00E+08
1
1
1,00E+07
1
1,00E+06
1,00E+05
Рис.
7.
Количество
клеток
R. naphthalenivorans
SMB37 при культивировании
в
минеральной
среде
Раймонда с нафталином в
присутствии
разных
концентраций
NaCl
(стационарная фаза роста).
1 – индивидуальная культура, 2 - в
составе микробного консорциума.
1,00E+04
без соли
без NaCl
3 % NaCl
7,5 % NaCl
22
Изучение кинетики роста моделированных смешанных культур на
нафталине в условиях высокой солености среды. Для изучения взаимного
влияния
штаммов
в
консорциуме
SMB3
проведены
эксперименты
по
моделированию смешанных культур с использованием штаммов-деструкторов
нафталина R. naphthalenivorans SMB37, Rhodococcus sp. SMB38 и умеренно
галофильного
штамма
Halomonas
sp.
SMB31
в
следующих
вариантах:
R. naphthalenivorans SMB37 и Halomonas sp. SMB31 (I); Rhodococcus sp. SMB38 и
Halomonas sp. SMB31 (II); R. naphthalenivorans SMB37, Rhodococcus sp. SMB38 и
Halomonas sp. SMB31 (III).
Контроль качественного состава смешанных культур бактерий проводили
методом денатурирующего градиентного гель электрофореза (рис. 8). На
электрофореграмме ДГГЭ 16S рДНК ампликонов видно, что в смешанных
культурах вариантов I, II и III присутствует фрагмент 16S рДНК, соответствующий
таковому чистой культуры Halomonas sp. SMB31. В вариантах I и II присутствуют
полосы, четко отличающиеся по положению в геле друг от друга и совпадающие с
полосами фрагментов 16S рДНК штаммов R. naphthalenivorans SMB37 и
Rhodococcus sp. SMB38. В треке варианта III выявлена полоса, соответствующая
слабо разделенным фрагментам 16S рДНК штаммов R. naphthalenivorans SMB37 и
Rhodococcus sp. SMB38.
Результаты ДГГЭ подтверждают экспериментальные данные, полученные на
основе макроморфологических свойств бактерий (подсчет КОЕ). Показано, что
умеренно галофильная бактерия Halomonas sp. SMB31 сохраняется в составе
смешанных культур при культивировании на нафталине и, более того, способна к
эффективному росту (рис. 9А, Б). Совместное культивирование штаммовдеструкторов с
умеренно галофильной культурой Halomonas sp. SMB31
значительно сокращает lag-период, увеличивает удельную скорость роста штамма
Rhodococcus sp. SMB38 и количество клеток штамма R. naphthalenivorans SMB37
(рис. 9В). Полученные данные показывают наличие взаимовыгодных отношений
между бактериями-деструкторами и бактериями-спутниками в исследуемом
консорциуме при выращивании в условиях высокой солености среды. Можно
предположить,
что
подобное
взаимодействие
связано
с
обменом
низкомолекулярными органическими веществами (осмопротекторами) между
23
1
2
3
4
5
6
Рис. 8. ДГГЭ фрагментов 16S рДНК индивидуальных и смешанных
культур бактерий.
1 – смешанная культура варианта III, 2 - смешанная культура варианта II, 3 – смешанная
культура варианта I, 4 - штамм SMB38, 5 – штамм SMB37, 6 – штамм SMB31.
А
Б
SMB37
КОЕ/мл
1,00E+07
SMB31
КОЕ/мл
1,00E+09
1,00E+08
SMB37
1,00E+07
1,00E+06
SMB38
1,00E+06
1,00E+05
SMB31
1,00E+05
1,00E+04
SMB38
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+03
0
100
200
300
0
100
200
Часы
300
400
500
Часы
B
КОЕ/мл
1,00E+09
1,00E+08
1,00E+07
SMB37
SMB38
SMB31
SMB37
SMB38
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
0
100
200
300
400
500
Часы
Рис. 9. Рост моделированных смешанных культур и индивидуальных
культур штаммов-деструкторов в минеральной среде Раймонда на нафталине
в присутствии 7 % NaCl.
Незаштрихованные маркеры – индивидуальные культуры
заштрихованные маркеры – штаммы в смешанных культурах.
штаммов-деструкторов,
бактериями. Известно, что эубактерии в гиперосмотических условиях синтезируют
de novo или поглощают из среды культивирования осмопротекторные соединения,
что позволяет им выживать в подобных условиях (Ventosa et al., 1998;
24
Roberts, 2005). На следующем этапе работы исследована способность бактерий
консорциума к синтезу осмолитов.
Анализ
осмопротекторных
соединений.
Исследуемые
умеренно
галофильные штаммы Halomonas sp. SMB31 и Salinicola socius SMB35 в условиях
высокой осмолярности среды внутриклеточно накапливают эктоин и глутамат.
Следует отметить, что представители разных родов одного семейства существенно
различаются качественным составом осмопротекторных соединений при росте в
присутствии 10 % NaCl: данная концентрация хлорида натрия приводит к
накоплению в клетках штамма SMB35 гидроксиэктоина (табл. 6). Полученные
нами результаты о качественном составе осмопротекторов представителей
семейства
Halomonadaceae
согласуются
с
литературными
данными
(Ono et al., 1999; Calderon et al., 2004; Vargas et al., 2006).
Изучение
осмолитов
штаммов
R.
naphthalenivorans
SMB37
и
Rhodococcus sp. SMB38 выявило накопление в клетках эктоина, гидроксиэктоина и
глутамата (табл. 6). Ранее для R. erythropolis обнаружено накопление глутамата,
аспартата и трегалозы при гиперосмотическом стрессе (Комарова и др., 2002).
Установленный нами комплекс осмопротекторных соединений родококков описан
впервые. В отличие от умеренно галофильного штамма Salinicola socius SMB35 у
галотолерантных изолятов SMB37 и SMB38 гидроксиэктоин обнаружен в клетках,
Таблица 6.
Содержание осмопротекторных соединений у бактерий консорциума SMB3
Штамм
Концентрация
NaCl, %*
Halomonas sp. SMB31
Halomonas sp. SMB31
Salinicola socius SMB35
Salinicola socius SMB35
R. naphthalenivorans SMB37
R. naphthalenivorans SMB37
Rhodococcus sp. SMB38
Rhodococcus sp. SMB38
5
10
5
10
5
8
5
8
Содержание осмопротекторов, % от сухого
веса биомассы
ГидроксиЭктоин
Глутамат
эктоин
7,9
1,4
–
9,2
1,1
–
16,0
2,5
–
9,5
1,6
1,1
0,6
0,4
0,7
0,3
–
0,3
0,6
1,4
1,4
1,2
0,6
2,0
Примечание. * – % (вес/объем) в среде культивирования, «–» – вещество не обнаружено.
выращенных при более низких концентрациях хлорида натрия (5 %). Следует
отметить,
что
с
возрастанием
концентраций
хлорида
натрия
в
среде
25
культивирования в клетках штамма SMB37 снижается содержание осмолитов
(табл. 6), этот факт может объяснить отсутствие роста индивидуальной культуры
штамма на нафталине при высоких концентрациях хлорида натрия (8-9 %), в
сравнении со штаммом SMB38 (табл. 1).
Результаты проведенных исследований бактериального консорциума SMB3
свидетельствуют о наличии трофических связей, поскольку, во-первых, в его
состав входят как бактерии-деструкторы нафталина, так и не утилизирующие это
соединение бактерии-спутники; во-вторых, использование в качестве субстратов
интермедиатов
разложения
нафталина
приводит
к
изменению
структуры
консорциума, в то время как при культивировании на нафталине состав стабильно
сохраняется. Кроме того, нами выявлены и экспериментально обоснованы
взаимовыгодные отношения между бактериями-деструкторами нафталина и
умеренно галофильной бактерией, которые, как предполагается, основаны на
обмене осмопротекторными соединениями.
ВЫВОДЫ
1. Из почвы района
солеразработок выделено сообщество бактерий,
использующее нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии в
присутствии до 9 % NaCl. Установлено, что данное сообщество состоит из двух
галотолерантных штаммов-деструкторов нафталина рода Rhodococcus, а также
галотолерантных бактерий родов Arthrobacter, Microbacterium и Thalassospira и
умеренно галофильных бактерий семейства Halomonadaceae, не способных к
деструкции нафталина (бактерии-спутники).
2. На
основании
филогенетической
обособленности
и
отличий
от
представителей известных родов семейства Halomonadaceae по фенотипическим
признакам описан новый род и вид Salinicola socius sp. nov., gen. nov.
3. В соответствии с данными анализа 16S рДНК и по ряду морфологических,
физиолого-биохимических
признаков
предложен
новый
вид
Rhodococcus
naphthalenivorans sp. nov. Установлено, что штамм R. naphthalenivorans SMB37
растет на нафталине в присутствии до 7,5 % хлорида натрия.
4. Предложен новый вид Thalassospira permense sp. nov., представитель
которого формирует стабильный филогенетический кластер вместе с Thalassospira
lucentensis в семействе Rhodospirillaceae, но принципиально отличается от
26
последнего составом жирных кислот, способностью восстанавливать нитраты,
концентрациями хлорида натрия, при которых возможен рост.
5. В
исследуемом
консорциуме
сформированы
протокооперативные
взаимоотношения между бактериями.
6. Установлено,
что
Halomonas sp. SMB31,
Rhodococcus sp. SMB38
рост
штаммов
Rhodococcus
при
высокой
Salinicola
socius
naphthalenivorans
осмолярности
среды
SMB35,
SMB37,
сопровождается
накоплением в клетках органических осмопротекторов – глутамата, эктоина и
гидроксиэктоина.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1.
Ананьина Л.Н., Алтынцева О.В. Почвенные микробные сообщества,
способные утилизировать нафталин при высоких концентрациях хлорида
натрия//Матер. II Регион. конф. молодых ученых «Современные проблемы
экологии, микробиологии и иммунологии». – Пермь, 2002. – С. 32.
2.
Ананьина Л.Н., Алтынцева О.В., Плотникова Е.Г. Почвенные
галотолерантные бактерии-деструкторы нафталина//Матер. 6-ой Междунар.
Пущинской школы-конф. молодых ученых «Биология - наука ХХI века». –
Пущино, 2002. – С. 4.
3.
Ананьина Л.Н., Алтынцева О.В., Плотникова Е.Г. Сообщество
микроорганизмов, выделенное из почвы, загрязненной отходами производства
"Уралкалий"//Матер. 2-ой Междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых
ученых «Экология и научно-технический прогресс». – Пермь, 2003. – С. 287-290.
4.
Ананьина Л.Н., Алтынцева О.В., Плотникова Е.Г. Галотолерантный
штамм-деструктор нафталина Rhodococcus sp. Б3-8//Матер. 2-ой Регион. конф.
молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей
средой». – Саратов, 2004. – С. 35-36.
5.
Плотникова Е.Г., Ананьина Л.Н., Алтынцева О.В. Природные
микробные ассоциации – как основа для биоремедиации загрязненных
почв//Матер. Междунар. конф. «Проблемы и перспективы реабилитации
техногенных экосистем». – Астрахань, 2004. – С. 43-46.
6.
Рыбкина Д.О., Ананьина Л.Н., Зубрицкий А.В., Плотникова Е.Г.
Экстрахромосомальная
ДНК
у
бактерий-деструкторов
ароматических
соединений//Матер. 5-ой Междунар. многопрофильной конф. молодых ученых и
студентов «Актуальные проблемы современной науки». – Самара, 2004. – С. 31-34.
7.
Ананьина Л.Н., Алтынцева О.В., Плотникова Е.Г. Изучение
сообщества микроорганизмов, выделенного из района солеразработок//Вестник
27
Пермского государственного университета. Серия Биология. – 2005. – Вып. 6. –
С. 109-114.
8.
Ананьина Л.Н., Алтынцева О.В., Плотникова Е.Г. Моделирование
микробных сообществ, осуществляющих деструкцию нафталина в присутствии
высоких концентраций хлорида натрия//Матер. Междунар. конф. «Проблемы
биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». – Саратов,
2005. - С. 7.
9.
Ананьина Л.Н., Гавриш Е.Ю. Галофильные бактерии микробного
сообщества, выделенного из почв района солеразработок//Матер. 9-й Пущинской
школы-конф. молодых ученых «Биология - наука ХХI века». – Пущино, 2005. –
С. 180.
10. Ананьина Л.Н., Гавриш Е.Ю., Евтушенко Л.И., Плотникова Е.Г.
Новый
экстремальный
галотолерантный
грамотрицательный
микроорганизм//Матер. II Междунар. конф. «Микробное разнообразие: состояние,
стратегия сохранения, биологический потенциал». – Пермь-Казань-Пермь,
2005. - С. 9.
11. Ананьина Л.Н., Гавриш Е.Ю., Плотникова Е.Г. Грамотрицательные
галофильные бактерии, выделенные из района солеразработок//Матер. Всерос.
молодежной школы-конф. «Актуальные аспекты современной микробиологии». –
Москва, 2005. – С. 5.
12. Ананьина Л.Н., Алтынцева О.В. Осмопротекторы галофильных
бактерий семейства Halomonadaceae//Матер. 10-й Пущинской школы-конф.
молодых ученых «Биология - наука ХХI века». – Пущино, 2006. – С. 179.
13. Ананьина
Л.Н.,
Плотникова
Е.Г.
Изучение
сообщества
микроорганизмов, способного расти на нафталине в присутствии высоких
концентраций
NaCl,
методом
денатурирующего
градиентного
гельэлектрофореза//Матер. Междунар. школа-конф. «Генетика микроорганизмов и
биотехнология». – Москва-Пущино, 2006. – C. 98.
14. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О., Ананьина Л.Н., Ястребова О.В.,
Демаков В.А. Характеристика микроорганизмов, выделенных из техногенных почв
Прикамья//Экология. – 2006. – № 4. – С. 1-9.
15. Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г., Гавриш Е.Ю., Демаков В.А.,
Евтушенко Л.И. Salinicola socius gen. nov., sp. nov. – новая умеренно галофильная
бактерия
из
ассоциации
микроорганизмов,
утилизирующей
нафталин//Микробиология. – 2007. – Т.76, № 3. – С. 369-376.
16. Ананьина Л.Н., Ястребова О.В., Плотникова Е.Г. Галофильные
бактерии сем. Halomonadaceae//Матер. Междунар. конгресса «Биотехнология:
состояние и перспективы развития». – Москва, 2007. – С. 39.
28
Ананьина Людмила Николаевна
НАФТАЛИНМЕТАБОЛИЗИРУЮЩИЙ КОНСОРЦИУМ
МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫЙ ИЗ ЗАСОЛЕННОЙ ПОЧВЫ
АВТОРЕФЕРАТ