Брошюра (0.71Мб)
реклама
ТКАНЕВОЕ ТИПИРОВАНИЕ И ДИАГНОСТИКА МУТАЦИЙ на генетических анализаторах HLA-секвенирование • Фрагментный анализ MLPA ГРУППА КОМПАНИЙ «БИОХИММАК» 2012 Технология секвенирования ДНК В последнее время секвенирование ДНК приобретает все большее применение не только в научных исследованиях, но и в клинической диагностике. Метод секвенирования представляет собой процесс установления первичной последовательности нуклеотидов в цепочке ДНК. Наиболее широкое использование нашел способ секвенирования ДНК по Сэнгеру. Для выполнения этого метода используются автоматические генетические анализаторы (секвенаторы), работающие по принципу капиллярного электрофореза нуклеиновых кислот. Сущность метода заключается в том, что при постановке реакции амплификации (секвенирующая ПЦР) помимо обычных нуклеотидов используются дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ddNTP), меченные флуорохромными красителями. Такие ddNTP называются еще «терминаторами», так как при включении их в растущую цепь ДНК в процессе ПЦР они приводят к обрыву амплифицирующейся цепочки. При прохождении фрагментов через датчик считывающего устройства прибора луч лазера возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой «терминатор» в настоящий момент мигрирует через гель. Так как при капиллярном электрофорезе все фрагменты ДНК выстраиваются строго в соответствии со своей длиной (молекулярной массой), то не сложно определить точную последовательность нуклеотидов в анализируемом образце ДНК. В результате постановки секвенирующей ПЦР в присутствии ddNTP получается огромное количество фрагментов ДНК различной длины, каждый из которых заканчивается «терминатором» с флуорохромной меткой, соответствующей определенному азотистому основанию одного из четырех нуклеотидов (аденину, гуанину, тимину или цитозину). После завершения секвенирующей ПЦР образцы загружаются в секвенатор и производится их автоматический электрофорез в капиллярах прибора, заполненных специальным полимером. HLA-генотипирование методом секвенирования Полиморфизм генов HLA-комплекса обусловлен существованием в человеческой популяции огромного разнообразия аллельных вариантов этих генов. Различные аллели отличается друг от друга определенным количеством нуклеотидных замен в гене того или иного локуса HLA. Во всех прочих генетических методах HLA-типирования для определения различных аллельных вариантов генов комплекса гистосовместимости используют либо уникальные праймеры в реакции ПЦР, либо олигонуклеотидные зонды в реакции гибридизации. Метод секвенирования ДНК позволяет напрямую определить первичную последовательность типируемого гена того или иного локуса HLA. Наборы SeCore Для осуществления данной методики HLA-типирования компания «БиоХимМак» предлагает наборы SeCore® HLA SBT Kits (Life Technologies) для определения HLA-генотипа по локусам A, B, Cw, DRB1, DQB1 и DPB1. Наборы существуют в двух форматах: классический (на 25 и 500 тестов) и скрининговый экспресс-набор (на 1536 тестов). Каждый набор состоит из двух компонентов: преПЦР и пост-ПЦР. Принцип метода Секвенирование генов HLA, в отличие от других методов HLAгенотипирования, позволяет проводить определение аллельных вариантов путем прямого сравнения первичных последовательностей нуклеотидов в цепочке ДНК анализируемого образца с консенсусной последовательностью нуклеотидов в соответствующем гене HLA в базе данных. Преимущества метода HLA-типирование методом секвенирования ДНК дает возможность проводить анализ на среднем и высоком разрешении с использованием минимальных количеств ДНК (всего 2-5 мкл ДНК с концентрацией 15-30 нг/мкл для типирования по одному локусу). Области применения • • • • 2 трансплантология онкогематология создание регистров доноров костного мозга популяционные научные исследования Комплект пре-ПЦР реагентов включает в себя: • смесь для постановки локус-специфической ПЦР (AmpMix) • FastStartTM Taq DNA полимеразу Комплект пост-ПЦР реагентов включает в себя: • ExoSap-ITТМдля очистки продуктов ПЦР • набор смесей для постановки секвенирующей ПЦР (SeqMix), содержащих секвенирующие праймеры, нуклеотиды, BigDye терминаторы и термостабильную секвеназу • PPT буфер для преципитации ДНК Группа компаний «БиоХимМак». 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова Необходимое оборудование Для постановки HLA-типирования с наборами SeCore® потребуется следующее оборудование: • 96-луночный амплификатор (термоциклер) с нагреваемой крышкой (например, VeritiTM Thermal Cycler, Applied Biosystems) • автоматический генетический анализатор (секвенатор) (например, ABI 3100, 3730 или 3500 Series Genetic Analyzer, Applied Biosystems) • настольная центрифуга с адаптерами для 96-луночных планшетов • оборудование для гелевого электрофореза ДНК • ПЦР-бокс Этапы выполнения методики Процесс HLA-типирования методом секвенирования ДНК состоит из следующих этапов: • выделение геномной ДНК • постановка локус-специфической ПЦР • очистка продуктов ПЦР с использованием ферментного реагента ExoSap-ITТМ • постановка секвенирующей ПЦР • очистка продуктов ПЦР • проведение капиллярного электрофореза (секвенирование) • анализ полученных данных и интерпретация результатов Вся процедура анализа, включая капиллярный электрофорез образцов на секвенаторе, занимает около 18 часов. Программное обеспечение uTYPE® Обработку полученных результатов секвенирования ДНК проводят с использованием программы интерпретации данных uTYPE® HLA Analysis Software. • программа имеет дружественный интерфейс, все окна главного экрана легко изменяются в размере для максимального удобства пользователя В данном программном продукте реализованы сложные алгоритмы обработки информации, которые с использованием интуитивного анализа позволяют облегчить интерпретацию данных секвенирования и с легкостью получить окончательные результаты типирования. Особенности программы uTYPE® HLA Analysis Software: • программа регулярно (ежеквартально) обновляется в соответствии с актуальными базами международной системы IMGT/ HLA Database • коды базы данных IMGT и национальной программы доноров костного мозга (NMDP) встроены в программу и могут быть просмотрены одновременно с данными секвенирования • инструменты поиска, навигации и выравнивания аллельных последовательностей удобно организованы и позволяют с легкостью проводить анализ Информация для заказа Кат. номер Наименование продукта Количество реакций амплификации Количество секвенирующих реакций (области секвенирования) Кол-во тестов 5300025 SeCore® A Locus Sequencing Kit 1 реакция (Single Amplification System) 6 реакций (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev) 25 5310025 SeCore® B Locus Sequencing Kit 2 реакции (Group Specific Set) 6 реакций (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev) 25 5311025D SeCore® B Locus Sequencing Kit 1 реакция (Single Amplification System) 6 реакций (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev) 25 5320025 SeCore® Cw Locus Sequencing Kit 1 реакция (Single Amplification System) 6 реакций (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev) 25 Наборы для секвенирования HLA класса I (25 тестов) Тел.: (495) 647-2740, 932-9214, 939-2421, e-mail:info@biochemmack.ru, www.biochemmack.ru 3 Кат. номер Наименование продукта Количество реакций амплификации Количество секвенирующих реакций (области секвенирования) Кол-во тестов Наборы для секвенирования по HLA класса II (25 тестов) SeCore® DRB1 Locus Sequencing Kit 1 реакция (Single Amplification System) 3 реакции (экзон 2 – Fwd/Rev, кодон 86 – Rev) 25 SeCore® DRB1, DRB3, 4 & 5 Locus Sequencing Kit 11 реакций (Group Specific Set) 3 реакции (экзон 2 – Fwd/Rev,кодон 86 – Rev) 25 5341025D SeCore® DQB1 Locus Sequencing Kit 2 реакции (экзон 2, экзон 3) 4 реакции (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev) 25 5351025 SeCore® DPB1 Locus Sequencing Kit CE 2 реакции (экзон 2, экзоны 3 и 4) 8 реакций (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev, кодон 8 – Fwd, кодон 85 – Rev) 25 5330025 5331025 Наборы для секвенирования HLA класса I (500 тестов) 22000D SeCore® A Locus Sequencing Kit CE 1 реакция (Single Amplification System) 6 реакций (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev) 500 22110D SeCore® B Locus Sequencing Kit 2 реакции (Group Specific Set) 6 реакций (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev) 500 22200D SeCore® Locus Sequencing Kit 1 реакция (Single Amplification System) 6 реакций (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev) 500 Наборы для секвенирования по HLA класса II (500 тестов) 22300D SeCore® DRB1 Locus Sequencing Kit 1 реакция (Single Amplification System) 3 реакции (экзон 2 – Fwd/Rev, кодон 86 – Rev) 500 22410D SeCore® DQB1 Locus Sequencing Kit 2 реакции (экзон 2, экзон 3) 4 реакции (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev) 500 22510D SeCore® DPB1 Locus Sequencing Kit 2 реакции (экзон 2, экзоны 3 и 4) 8 реакций (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev, кодон 8 – Fwd, кодон 85 – Rev) 500 Скрининговые эксресс-наборы A11310 SeCore® Express A Locus (CE) 1 реакция (Single Amplification System) 4 реакции (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev) 1536 A11311 SeCore® Express B Locus (CE) 1 реакция (Single Amplification System) 4 реакции (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev) 1536 A11312 SeCore® Express Cw Locus (CE) 1 реакция (Single Amplification System) 4 реакции (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev) 1536 A11313 SeCore® Express DRB1 Locus (CE) 1 реакция (Single Amplification System) 3 реакции (экзон 2 – Fwd/Rev, кодон 86 – Rev) 1536 A11528 SeCore® Express DQB1 Locus (CE) 1 реакция (Single Amplification System) 4 реакции (экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev) 1536 Наборы для разрешения неоднозначностей (GSSP) A11256ZXX SeCore® GSSP Kit ZXX - 1 реакция 25 Программное обеспечение 4 539991 Программа для интерпретации результатов uTYPE® HLA Analysis Software 53999100 Обновление библиотеки uTYPE® HLA Allele Library Updates Группа компаний «БиоХимМак». 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова Фрагментный анализ MLPA MLPA-анализ является методом выбора для одновременного определения ряда мутаций связанных с тем или иным генетическим заболеванием. Технология MLPA представляет собой мультиплексную лигазно-зависимую амплификацию зондов (от англ. Multiplex ligation-dependent probe amplification – MLPA). Данный метод представляет собой разновидность мультиплексной ПЦР, в результате которой амплифицируются несколько различных мишеней только c одной праймерной пары. Принцип метода Каждый зонд состоит из двух олигонуклеотидов, которые узнают сходные участки ДНК. Один из олигонуклеотидов зонда содержит участок, узнаваемый прямым праймером, второй – обратным. После того как оба олигонуклеотида зонда гибридизуются с комплементарными им участками на молекуле ДНК, происходит их лигирование в полноразмерный зонд. Преимущество разделения зонда на две составные части заключается в том, что амплифицируется только лигированный полноразмерный зонд, а отдельные олигонуклеотиды при этом не будут амплифицироваться. Каждый полноразмерный зонд имеет уникальную длину, так что полученные ампликоны можно разделить и идентифицировать путем капиллярного электрофореза. Поскольку прямой праймер, используемый в амплификации зонда, мечен флуоресцентной меткой, каждый ампликон генерирует флуоресцентный сигнал, который может быть детектирован на генетическом анализаторе (секвенаторе). Сравнивая значения сигналов, полученных для исследуемого образца, с данными, полученными для референсных образцов, можно определить относительное количество каждого ампликона. При этом сила флуоресцентного сигнала будет тем выше, чем больше количество копий целевых участков ДНК. Особенностью метода является то, что в результате постановки ПЦР амплифицируется не участок анализируемой ДНК, а олигонуклеотидный зонд. Так как данный метод представляет собой мультиплексную реакцию, то в одной реакции одновременно может участвовать до 50 различных зондов. При этом все зонды амплифицируются с одной праймерной пары, что значительно увеличивает воспроизводимость реакции. Преимущества метода Данный метод анализа является высокоточным и позволяет детектировать различия в целевом участке ДНК всего в один нуклеотид. Для постановки анализа необходимо примерно 30 нг геномной ДНК (около 3000 клеток или 0,5 мл амниотической жидкости). Возможно использование материала с частично деградированной ДНК. Метод MLPA-анализа используется для определения: • изменения числа копий гена • статуса метилирования импринтированных и промоторных участков ДНК • относительного количества мРНК • известных точечных мутаций и SNP Области применения • пренатальная и постнатальная диагностика • диагностика наследственных нейрогенетических и умственных заболеваний • диагностика наследственных форм рака • характеристика опухолей • фармакогенетика • определение статуса метилирования Схема протокола 5 1. Денатурация и гибридизация 5 Последовательность, комплементарная ПЦР-праймеру X Комплементарная последовательность 5’ Последовательность, комплементарная ПЦР-праймеру Y Вставка 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 2. Лигирование 3. ПЦР X 5’ Y 3’ Лигаза X 5’ ДНК А Y X Y X 5’ 3’ 5’ 3’ Лигаза Y 5’ Каждый ампликон имеет уникальную длину 130-480 nо 3’ ДНК Б 5’ 4. Разделение ампликонов капиллярным электрофорезом Тел.: (495) 647-2740, 932-9214, 939-2421, e-mail:info@biochemmack.ru, www.biochemmack.ru 5 Наборы SALSA® MLPA® Компания «БиоХимМак» предлагает наборы для проведения MLPA-анализа SALSA® MLPA® (MRC-Holland). Доступны наборы для постановки 25, 50 и 100 тестов. Каждый набор включает в себя: • Salsa MLPA буфер • Salsa лигаза • Лигазный буфер А • Лигазный буфер B • Salsa ПЦР primer Mix • Salsa полимераза • Смесь зондов Необходимое оборудование Для осуществления MLPA-анализа потребуется 96-луночный амплификатор с прогреваемой крышкой (например, VeritiTM Thermal Cycler, Applied Biosystems) и генетический анализатор (секвенатор) (например, 3100, 3730 или 3500 Series Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Этапы выполнения методики MLPA-анализ включает следующие этапы: • выделение геномной ДНК • денатурация ДНК • гибридизация зондов на целевых участках ДНК • лигирование зондов 6 • амплификация (ПЦР) • капиллярный электрофорез • анализ результатов НЕСООТВЕТСВИЕ ПОЛНОЕ СООТВЕТСВИЕ Несоответствие в области лигирования зонда –> нет лигирования, нет продукта амплификации Лигирование двух олигонуклеотидов зонда –> амплификация, продукт амплификации Процедура выполнения MLPA-анализа занимает около 24 часов, включая все ручные процедуры и капиллярный электрофорез образцов. Группа компаний «БиоХимМак». 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова Информация для заказа Кат. номер Наименование набора Заболевания Пренатальная и постнатальная диагностика P095 SALSA MLPA P095 Aneuploidy Анеуплоидии (синдром Дауна, синдром Эдвардса, синдром Патау) P055 SALSA MLPA P055 PAH Фенилкетонурия ME029 SALSA MLPA ME029 FMR1/AFF2 Синдром ломкой Х-хромосомы P021 SALSA MLPA P021 SMA Спинальная мышечная атрофия P036 SALSA MLPA P036 Human Telomere Широкий субтеломерный скрининг P250 SALSA MLPA P250 DiGeorge Синдром Ди Джорджи Наследственные формы рака P190 SALSA MLPA P190 CHEK2 Предрасположенность к раку молочной железы P002 SALSA MLPA P002 BRCA1 Рак молочной железы (наследственная форма) P378 SALSA MLPA P378 MUTYH Рак толстой кишки, рак желудка (наследственные формы) P251 SALSA MLPA P251 NB mix 1 Нейробластома P315 SALSA MLPA P315 EGFR Солидные опухоли P003 SALSA MLPA P003 MLH1/MSH2 Наследственный неполипозный рак толстой кишки E024 SALSA MLPA ME024 9p21 CDKN2A/2B region Меланомы кожи Онкогематология P327 SALSA MLPA P327 iAMP21 Острый лимфоидный (лимфопластический) лейкоз, iAMP21 P037 SALSA MLPA P037 CLL-1 Хронический лимфолейкоз Генетические заболевания P091 SALSA MLPA P091 CFTR Муковисцидоз P050 SALSA MLPA P050 CAH Адреногенитальный синдром P034 SALSA MLPA P034 DMD Мышечная дистрофия Дюшена P170 SALSA MLPA P170 APP Болезнь Альцгеймера P051 SALSA MLPA P051 Parkinson Болезнь Паркинсона P041 SALSA MLPA P041 ATM-1 Атаксия-телеангиэктазия (синдром Луи-Бара) P343 SALSA MLPA P343 Autism-1 Аутизм Для получения полного перечня наборов обращайтесь в офис компании «БиоХимМак» по электронной почте pcr@biochemmack.ru, либо на сайт производителя наборов MRC-Holland (www.mrc-holland.com) Тел.: (495) 647-2740, 932-9214, 939-2421, e-mail:info@biochemmack.ru, www.biochemmack.ru 7 Термоциклер Veriti® (Applied Biosystems) Генетические анализаторы 3500 и 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems) • Выпускается в четырех форматах: 96-луночный (0,2 или 0,1 мл), 384-луночный и 60-луночный (0,5 мл) • Шесть независимых температурных блоков, содержащих по 16 ячеек каждый, позволяют выполнять одновременно до 6 различных протоколов • Возможность работы в скоростном или стандартном режимах. Скоростной режим предоставляет возможность сократить время амплификации • Термоциклер Veriti имеет цветной сенсорный экран с диагональю 6,5 дюймов, который очень удобен в эксплуатации • В приборе имеется USB-порт для переноса данных и загрузки обновлений. Это позволяет хранить на флеш-памяти неограниченное число протоколов • 8-капиллярная система 3500 и 24-капиллярная система 3500xL • Усовершенствованная система терморегуляции для улучшенного контроля температуры при анализе фрагментов ДНК, требующем высокой точности • Твердотельный лазер с одной длиной волны 505 нм и длительным сроком службы, работает от стандартной сети и не требует охлаждения • Встроенная мощная система сбора данных и ПО для первичного анализа, позволяющие оценивать качество данных в реальном времени • Усовершенствованная технология для мультиплексного анализа фрагментов ДНК с использованием до 6 красителей Официальный дистрибьютор в России ЗАО «БиоХимМак» 119991 Москва, Ленинские горы, МГУ им. Ломоносова Тел.: (495) 647-2740, 939-2421, факс (495) 939-0997 E-mail: prc@biochemmack.ru www.biochemmack.ru биохиммак.рф
