выдержки и сокращённые версии научных публикаций
реклама
Ответ первичных фибробластов и остеобластов на поверхность ПЭЭК, обработанную плазмой. Д. Брайм, Ш. Штрамет, К. Шредер. Отделение травмы, кисти и реконструктивной хирургии Медицинской Школы Гамбургского университета Институт низких температур и плазмафизики , Грайсвальд Абстракт: ПЭЭК-это синтетический полимер с подходящими биомеханическими и стабильными химическими свойствами , что делает его привлекательным для использования в качестве материала для эндопротезирования и замены связок. Однако, химическая инертность поверхности не является причиной хорошей межфазной биосовместимости и для ПЭЭК требуется модификация поверхности перед его применением в организме. В ходе данного эксперементального исследования мы проанализировали влияние обработки плазмой поверхности ПЭЭК на пролиферацию и дифференциацию первичных фибробластов и остеобластов. Далее мы протестировали способность к индукции микроструктурированного клеточного роста на поверхности, обработанной плазмой. Мы продемонстрировали, что обработка ПЭЭК низкотемпературной плазмой оказывает значительное влияние на на пролиферацию фибробластов. В зависимости от обработки поверхности степень пролиферации может быть как простимулирована , так и подавлена. Поведение остеобластов было проверено за счет оценки параметров дифференциации. При обнаружении щелочной фосфатазы, коллагена 1 и минерализированного экстрацеллюлярного матрикса как параметров дифференциации остеобластов, протестированные материалы показали результаты , сопоставимые с коммерчески доступными материалами с культурами полимерных клеток такими как, например, полистерин (TCPS). Дальнейший клеточный рост успешно проводился на микроструктурированной клеточной фольге, что может быть инструментом будущего для биозаместительных систем, использующих методы тканевой инженерии. Эти результаты показывают, что химически инертные материалы, такие как ПЭЭК могут быть специфически модефицированы плазмой для улучшения биосовместимости. 1. Введение: С увелечением продолжительности жизни возрастает и необходимость в материалах, замещающих человеческие ткани. Базовыми свойствами данных материалов являются хорошие механические свойства и межтканевая совместимость. Вследствие этого материал должен обладать хорошей тканевой толерантностью (гистосовместимостью) без цитотоксического, карценогенного или мутогенного эффектов и что еще более важно способностью вызывть желаемый ответ в организме. Физиологическое взаимодействие между организмом и и биоматериалом зависит от характеристик поверхности последнего. Шероховатость и состав поверхности в частности контролирует абсорбцию протеинов экстраллюлярного матрикса (1) , что ответственно за успешную адгезию эндогенных клеток к биоматериалу и, в следствии этого, стабильного прикрепления импланта к окружающим тканям. (2) Поверхность материала может быть изменена многими методиками. (3) Одним из них является инновационнейший метод обработки плазмой.(4) Плазма- это ионизированные газы полученные в закрытой системе путем смешивания газа под низким давлением с ионизированными волнами. По сравнению с методами нанесения жидких реактивов и осаждения пленок, обработка пламой имеет преимущества , так как не влияет на коэффициент жесткости и исключает применение потенциально опасных веществ. Наносящиеся при этом реагенты помещаются вместе с материалом в плазменный реактор и модифицируют химические и физические свойства поверхности (5). Механические, оптические и электрические свойства при этом остаются неизменными(6). Известные до этого полимерные материалы показывали отличные результаты in vitro, но не обладали достаточными свойствами для использования в ортопедической хирургии. Метод плазменной модификации используетя в коммерчиских целях долгое время. (7,8) Типичными плазмомодифицируемыми полимерными материалами для культивирования клеток в экспериментах являются Primaria и TCPS. Оба типа полимеров генерируют хорошую клеточную адгезию in vitro , но не обладают достаточными свойствами для использования как ортопедический имплантируемый материал. В ортопедической хирургии до сих пор используются металлические сплавы, но из-за большей твердости, чем у кости они могут вызывать ее резорбцию при защитной реакции кости.(9) При использовании ПЭЭК всех этих недостатков можно избежать, так как ПЭЭК обладает хорошими механическими (10) и химическими (11,12) свойствами. Его эластичность соответствует костной ткани и поэтому эффекта защиты кости от перегрузки можно не ожидать после имплантации. Так как ПЭЭК имеет хорошее соотношение жесткости, предела прочности, коэффициента деформации, абразивности и сопротивления усталости он выглядит применимыи для синдесмопластики.(13) Поверхность ПЭЭК гидрофобна и материал инертен, поэтому он не может вызывать ни абсорбцию протеинов ,ни адгезию клеток(14) . Поэтому необходимо обработать его поверность для улучшения клеточной адгезии и биосовместимости. Проводилось несколько исследований включая и обработку плазмой для предания поверхности ПЭЭК лучших свойств для пролиферации и прикрепления клеток(9, 14-16). Однако не было получено доступных данных , отражающих пролиферацию и адгезию первичных клеток костномышечной системы после плазменной модификации ПЭЭК., для этого и было проведено данное исследование in vitro. 2. Материалы и методы: 2.1 Дизайн исследования: В ходе данного исследования анлизировалось влияние плазменной обработки поверхности ПЭЭК на пролиферацию и дифференциацию первичных фибробластов и остеобластов. Исследование пролиферации клеток проводилось с помощью культивации клеток крайней плоти человека на плазма-активированный и пассивированный ПЭЭК ( ПЭЭК фольга толщиной 250 микрон). Через 24, 48, 72 часа проводился анализ пролиферации подсчетом клеток, морфология клеток за счет анализа количества ДНК в сравнении с клетками на материале TCPS. Определяя концентрацию LDH ( лактатдегидрогеназы) внутри клеток через 24,48, 72 часа судили о цитототоксичности. В порядке определения дифференциации клеток использовались первичные остеобласты со свода черепа новорожденных мышей CD-1 , которые культивировались на ПЭЭК , активированным плазмой более 30 дней. Специфическая дифференциация остеобластов оценивалась за счет гистологической окраски и вновь оценивалась с TCPS. Цель нескольких серий экспериментов –проверить может ли быть усилен рост клеток на биоматериалах с химическим микроструктурированием. В этих экспериментах проверялся рост клеток на обработанном плазмой микроструктурированном ПЭЭК. 2.2. Модификации плазмы Два процесса нанесения плазмы были использованы. Вначале вся поверхновсть подвергалась обработке генерирующей функциональные группы, способствующие прикреплению биомолекул и адгезии клеток. Для этого применялась микроволновая аммиак/аргоновая плазма 1/4 на мощности 500 Ватт и давлении 0.1 бар в течении 77 с. Затем использовалась специальная металическая маска, снижающая характеристики системы до 30 микрометров и частично удаляющая функциональные группы путем травления мягкой плазмой. Для этого применялась низкоструйная микроволновая плазма водород/аргон 1/3 1000 с. Изменение химического состава поверхности оценивалось за счет угла контакта (вода, метод лежачей капли) и рентген фотоэлектронной спектроскопии. 2.3. Культивирование первичных фибробластов и остеобластов. Первичные фибробласты были получены из крайней плоти человека. После обработки клеток коллагеназой они помещялись в раствор содержащий 10% фетальной телячьей сыворотки и 1% пенициллин- стрептомицин. Через 24 часа клетки были помещены на ПЭЭК , обработанный плазмой и TCPS с исходной плотностью 1,5 на 10 в 4 степени на см в -2 степени. Пролиферация клеток микроскопически устанавливалась за счет счетной камеры Нойбауэра. В дополнение, для определения пролиферациии высчитывалась концентрация ДНК. Для этого клетки были отделены от поверхности субстрата в каждый момент времени с помощью трипсинации , посчитаны и специалным образом окрашены. Содержание ДНК в клетках соответсвовало окрашиванию и было фотометриччески измерено на 625 нм. Для того, чтобы оценить цитотоксическое действие модифицированного субстрата измерялась активность ЛДГ , выделяющуюся из цитоплазмы поврежденных клеток в надосадочную жидкость и измеряюмую с помощью колориметрического анализа.( комплект для определения цитотоксичности, Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Germany). Количество образовавшегося цвета в анализе соответсвовало количеству лизированных клеток. Первичные остеобласты были получены с теменной кости CD 1 мышат с помощью поэтапной обработки в растворе 0,1 % коллагеназой кластридий Ia. (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) и 0,2% диспазы. (Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Germany). Клетки были затем культивированы в α-MEM (минимально поддерживающая среда) содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% полисахаридов. Через 48 часов клетки извлекались и помещались на плазмоактивированную ПЭЭК и TCPS с исходной плотностью 1.5 × 104 cm−2. Среду меняли после 1 и 3 дня. После чего в среду добавлялись 5 mM β-глицерофосфата, и 100 µg ml−1 аскорбиновой кислоты (минерализация среды ) и меняли каждый следующий день. Цитотоксический анализ повторяли каждый раз по вышеописанному способу. Культуры сохраняли до 30 дней при 37 ◦C при 95% воздуха и 5% CO2 в атмосфере. После чего клетки фиксировались 3,7% формальдегидом в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) на 10 мин и ополаскивали данным раствором. Анализировали количество щелочной фосфатазы и коллагена ( окрашивание по Ван Гизу) и минерализованного матрикса (окрашивание по фон Коссу) по стандартному протоколу (20). В отдельном эксперименте первичные остеобласты высеевались на микроструктурированную ПЭЭК фольгу. Фольга подготавливалась с помощью двух различных методов обработки плазмой, описанных выше. Через два часа клетки фиксировали 3,7% формальдегидом в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре, промывали PBS и окрашивали красителем Гимза. 2.4. Статистический анализ. Распределение параметров было обобщено, определением значения ± стандартная ошибка среднего значения. Сравнения между несколькими материалами были оценены с помощью критерия Манна-Уитни. Статистический уровень а = 0,05 рассматривался как значительный. Все статистические анализы проводились в программе "Сигма Стат / Сигма Плот". 3. Результаты: 3.1 Характеристики поверхностей измененных материалов. Химиxеские изменения в составе поверхности полимера –это результат гетерогенных реакций между поверхностью и воздействующим газом. Атомы или боковые группы полимера могут быть заменены химически активированными веществами, полученными при обработке плазмой. Обработка поверхности ПЭЭК фольги включает два этапа . Первый- аминогруппы включаются в состав ПЭЭК за счет аммиак/аргон плазмы ( плазменная функционализация). Это создает поверхность с 5% азот-содержащих функциональных групп до 50 % с аминогруппами. ( Рис.1) К тому же , плазма не только выполняет прямое замещение, но также замещает полимерные цепи, полученные в ходе распада ароматических колец. Второй этап был связан с материалом, обладающим функциональными группами ( плазменная пасивация). Атомарный водород, получаемый в газовую фазу замещает кислород и азот содержащие функциональные группы. Это создает очень низко энергетическую поверхность ( пассивация), характеризуемую сниженным содержанием O/C и N/C связей. (Рис. 1) Рис. 1 Результаты физиохимического анализа поверхности с помощью определения угла смачивания и радиофотоэлектронной спектроскопии для необработанного и обработанного плазмой ПЭЭК. 3.2. Первичные фибробласты. Первичные фибробласты были расположены по активированной плазмой поверхности (аммиак-модификация) ПЭЭК и TCPS с плотностью 1.5 × 104 клеток на см–2. . Через 24 часа обьединенный слой костных клеток может быть микроскопически обследован на обоих материалах. Аналих токичности был негативным повторно на обоих материалах ( определение концентрации LDH). Во втором экспериментальном исследовании клетки были вновь помещены на плазма активированный ( аммиак –модифицированный) ПЭЭК и TCPS с той же плотностью. Каждые 24 часа производились таблетки из клеток после трипсинизации и центрифугирования и временно сохранялись при температуре – 80. После завершения эксперимента анализировалась концентрация ДНК клеточных таблеток. Клетки, прикрепленные к ПЭЭК , обработанному плазмой , показывали значительно большее количество ДНК , чем контрольные. (Рис.2) В дальнейшей экспериментальной схеме первичные фибробласты были распределены по плазма – пассивированной (Н2-модифицированной) поверхности ПЭЭК и концентрация ДНК измерялась через 24, 48 и 72 часа. В этом случае концетрация ДНК была ниже , чем в контрольной группе. (Рис 3) Рис.2 Общее количество ДНК (ng/dl) первичных остеобластов связанных с NH3 плазма модифицированным ПЭЭК ()vs.TCPS(◦);∗∗= p <0.001 (Mann-Whitney критерий ранговый тест). Рис.3 Количество ДНК (ng/dl) первичных фибробластов связанных с количеством клеток (t =72 h) на H2 плазма пасивированном ПЭЭК (2000 s) к. TCPS; ∗∗= p <0.001 (Mann-Whitney критерий). 3.3. Первичные остеобласты. Для анализа биосовместимости ПЭЭК, в сравнении с TCPS мы инкубировали образцы с первичными остеобластами из теменной кости мышей в α-MEM (минимально поддерживающая среда) культуре средней относительно стандартных условий. В присутствии различных материалов было изучено поведение остеобластов в помощью морфологических и биохимических способов. В течении 3-4 дней образовавшийся клеточный слой был исследован для каждого материала. Микроскопически никаких морфологических отличий не было обнаружено в сравнении с контрольными материалами(Рис. 4) . Остеобласты продолжали пролиферацию формируя мултислой клеток и в конце образуя экстрацеллюлярный матрикс. Проводимый анализ токсичности с помощью определения концентрации LDH было повторно негативным. Эти результаты были подтверждены в 3 независимых сериях экспериментов. В ходе наблюдений сильное выделение щелочной фосфатазы было продемонстрировано через 21 день.( Рис. 5) Также была обнаружена сильноая продукция коллагена. ( рис. 6) Далее , окрашивание по фон Коссу выявило продукцию костно специфического экстрацеллюлярного матрикса через 30 дней посредством окрашиванния черным цветом депо кальция.( Рис. 7) В общем и целом не было обнаружено сильной разницы в сравнении с контрольной группой. Эти находки подтвердили, что клетки поддерживают свою дифференцировку в остеобласты в присутствии контрольных материалов, а особенно то что ПЭЭК, обработанный плазмой совместим с прикреплением на поверхности фольги. Чтобы показать эффект химического микростуктурирования поверхности биоматериала на томограмме клеточного слоя первичные остеобласты были нанесены на микроструктурированный ПЭЭК. Через 2 часа с помощью окрашивания Гимзой было показано распределение клеток в соответствии с микроструктурой ПЭЭК , обработанным плазмой. ( Рис. 8) 4. Дисскусия. Металлические сплавы все еще наиболее часто используемый материал для замены соединений в ортопедической хирургии. Однако, резорбция примыкающей кости часто имеет место в связи с защитой от перегрузки в следствии относительно высокой жесткости протеза. Для того , чтобы обойти это были разработаны такие альтернативные материалы как ПЭЭК для замещения кости и ее соединений.( 9,14,21) Например, элластичность ПЭЭК сходна с костной тканью и феномен защиты от перегрузки не настолько ожидаем, как при использовании других материалов. (9) В дополнение , ПЭЭК возможно использовать как материал для пластики суставных связок благодаря его пределу прочности на разрыв и сопротивлению вбразивному изнашиванию. (13) Благодаря этим хорошим механическим качествам, ПЭЭК был выбран в качестве полимерного субстрата для этого экспериментального исследования. Рис. 4 Световая микроскопия показывает количество первичных остеобластов на NH3 плазма активированном ПЭЭК (A) к TCPS (B) ( 104 объем первичных зародышевых клеток в cm−2, magnificaœon: 300×). Рис. 5 Экспрессия щелочной фосфатазы первичных остеобластов на NH3 модифицированном ПЭЭК (A) к TCPS (B) через 21 день культивирования (увеличение : 400×). Рис. 6 Выявление коллагена на NH3 плазма активированном ПЭЭК (A) к TCPS (B) через 21 день культивирования (увеличение : 200×). Рис. 7 Выявление минерализации через появление типичных “костных узелков ” on NH3 plasma acœvated PEEK (A) к TCPS (B) через 30 дней культивирования (увеличение: 200×). Отсутствие токсичности ПЭЭК было уже продемонстрировано в 1990. (22) В данном исследовании были использованы линии мышинных фибробластов и анализ токсичности проводился за счет определения концентрации лактатдегидрогеназы. Рост линий клеток скелетомоторной системы на необработанном ПЭЭК сравнивался с некоторыми потенциально имплантируемыми материалами такими как полиэтосульфон (ПЭС) , полиэтилен с ультравысокой молекулярной массой, титановой и кобальт-хром-молибденовой эмалью. (23) В этом случае токсических эффектов для необработанного ПЭЭК выявленно не было , но также не было и стимулирующего эффекта пролиферации клеток как и у других материалов. ПЭЭК не показал in vitro ни цитотоксичности , ни мутогенности. (24) Сложностью является биосовместимость необработанного ПЭЭК, так как ПЭЭК химически инертен из-за низкого числа гидрофильных групп , и достигается она благодаря адгезии клеток в незначительной степени. Попытки улучшить биосовместимость ПЭЭК ранее также проводились. Рис 8 Выявление образования первичных остеобластов через 2 часа культивирования на плазма модифицированном микроструктурированном ПЭЭК (окраска по Гимзе, увеличение: 25×). В этих случаях ПЭЭК покрывался N2/O2 плазмой и слоем карбона , содержащего фосфат кальция или фибронектином , присоединяемым к химически модифицированной поверхности ПЭЭК. (14,15) Эти исследования говорили о различных линиях клеток с наиболее важным преимуществом в легком и неограниченном делении. Однако, большим ограничением клеточных линий является их неспособность к дифференцировке и поэтому они отражают поведение первичных клеток. Исследования , предшествовавшие данному, не заходили столь далеко . Поэтому , мы выполнили первые серии исследований с клеточными культурами относительно поведения первичных фибробластов и остеобластов после модификации поверхности ПЭЭК. Цель данного исследования была проанализировать , улучшится ли биосовместимость ПЭЭК после модификации поверхности обработкой ПЭЭК. Эти исследования сравнивались с TCPS, полимером, обеспечивающим отличные условия для пролиферации и прикрепления клеток in vitro. Дополнительно анализировались преимущества широкого использования нанесения плазмы в производстве биоматериалов с структурированными поверхностями. Так как фибробласты легко выращиваются in vitro они использовались для изучения пролиферации первичных клеток на материале., обработанном плазмой. И тем не менее, только остеобласты предоставляют информацию о специфичной к костной ткани биосовместимости. В порядке доказательства этого первичные остеобласты из теменной кости мыши были нанесены на поверхность материала. Первичные фибробласты и остеобласты уже были изучены в ряде экспериментов , анализирующих биосовмнстимость различных субстратов. (9,23,25-29) Типы костных клеток могут передавать ценную информацию относительно адгезии, пролиферации, дифференциации и апоптоза. Дифференциация и функционирование остеобластов могут быть протестированы за счет анализа щелочной фосфатазы и коллагена, двух основных продуктов типично выделяемых остеобластами. Маркировка ферментов AP и van Gieson окрасками для коллагена являются легкими и достоверными методами , а также дополнительно позволяющими анализировать экспрессию в непосредственно близких пробах. (30) Однако, анализ протеинов и клеточной адгезии к ПЭЭК поверхности возможно только в ограниченном проценте так как ПЭЭК значительно присуща ауто-флюорисценция и поэтому иммуно-флюорисцентные методы характеристики поверхностных протеинов не применимы.(23) Относительно этих характеризующих ПЭЭК свойств мы решили выполнить гистологичесое окрашивание таким образом, чтобы клеточная дифференцировка остеобластов на ПЭЭК визуализировалась микроскопически. Так как общеизвестно, что стимулирующий эффект на пролиферацию клеток может быть оценен не только подсчетом клеток, но также за счет анализа протеинов и ДНК, (9) мы измерили содержание ДНК в клетках колориметрическим анализом. После культивации первичных человеческих фибробластов на активированной плазмой ( NH 3 – модифицированной ) ПЭЭК фольге мы были способны увидеть , что коэффициент пролиферации определяется анализом концентрации ДНК существенно более высоким по сравнению с TCPS. Сливной слой клеток был выявлен на обоих материалах. Различий между клетками в морфологии и поведении в распространении выявленны не были. Тест на токсичность анализирующий концентрацию LDH был повиорно отрицательным во всех случаях. Мы также наблюдали, что пассивация ПЭЭК H2 плазмой является причиной супрессии клеточного роста по сравнению с контрольным материалом посредством определения содержания ДНК клеток. Еще раз, не было никаких доказательств токсического компонента, обусловленного обработкой плазмой. Так как стабильность внутренней поверхности импланта преимущественно обеспечивается белками экстрацеллюлярного матрикса и выработкой минерализованного костного матрикса остеобластами , прикрепленными к поверхности импланта, мы сосредоточились на анализе параметров дифференциации первичных остеобластов. Дифференциация остеобластов in vitro используется для отражения условий культивирования и позволяет ознакомиться с характером роста и временем удвоения. Вариации характеристик поверхности не только отражают различия относительно аффинитета клеток к материалу, но также и различия в дифференциации. (31) После культивации остеобластов на ПЭЭК и TCPS обработанных NH3 плазмой не было найдено никаких токсических компонентов. Концентрация лактатдегидрогеназы всегда была ниже уровня обнаружения. Дифференциация остеобластов была продемонстрирована с помощью специфичных техник окрашивания щелочной фосфатазой, коллагеном типа I и костными узлами. После культивации остеобластов в течении 30 дней на активированной плазмой ПЭЭК фольге были зафиксированы все специфические параметры дифференциации представленные в синтезе минерализованного костного матрикса in vivo. Эти данные показали, что обработанная плазмой поверхность ПЭЭК представляет отличные условия для клеточной специфической дифференциации первичных остеобластов. Мы и далее не могли отметить какие-либо различия с другими материалами для культивации клеток как , например, TCPS. Эти результаты показали, что ПЭЭК может быть преобразован в материал с высокой биосовместимостью с помощью использования техники плазменной обработки. В связи с хорошим взаимодействием с клетками плазма –ПЭЭК in vitro равно как и хорошими эластическими качествами , продемонстрированными в различных экспериментах (13,14) , ПЭЭК может быть отмечен как материал, который соответствует всем критериям ортопедического материала. Далее мы описали микроструктурированный рост остеобластов в клеточных масштабах на плазма –активированной микростуктурированной TCPS фольге. Локальные отличия в клеточной адгезии предположительно происходят из-за различных концентраций белков экстрацеллюлярного матрикса абсорбированных на поверхности полимера.(32) Травление плазмой выявляет участки высокого протеинового аффинитета ( гидрофильные) и низкого ( гидрофобные). Химическое микроструктурирование полимерных материалов через плазмоиндуцированное изменение поверхности является весьма применимым методом для получения участков высокой и низкой концентрации функциональных групп в микроскопических величинах (33) и регулилирует клеточную адгезию и рост. В итоге, нужно отметить , что не было найдено токсических эффектов у ПЭЭК и что его биосовместимость может быть улучшена модифицированием поверхности используя плазменное травление. В соответствии с наблюдениями других авторов можно допустить, что улучшение биосовместимости происходит , вероятно , благодаря увеличению абсорбции протеинов экстрацеллюлярного матрикса и клеточной адгезии ( 14) . По итогу этой экспериментальной работы мы смогли продемонстрировать , что модификация поверхности ПЭЭК NH3 плазмой оказывает эффект стимуляции репродукции на первичные фибробласты и остеобласты. Заключение: Биосовместимость обработанного плазмой полимера ПЭЭК была продемонстрирована за счет теста на остеобласт- специфическую биосовместимость заключающуюся в долгосрочном культивировании клеточных культур с первичными мышинными остеобластами. Доказательство хорошей биосовместимости были получены за счет световой микроскопии ( морфологии клеток ) , так же как и гистологии ( минерализации, экспрессии щелочной фосфатазы и коллагена). Далее, репродуктированная стимуляция и супрессия клеточной пролиферации может быть достигнута методами модификации плазмой. Данные результаты показывают, что химически инертные материалы, такие как ПЭЭК могут быть использованы как применимый костно и суставо заменительный материал с хорошими показателями для клеточного прикрепления , пролиферации и дифференциации. Список литературы 1. T. A. HORBETT, in “Proteins at Interfaces,” edited by T. A. Horbe£ and T. A. Brash (American Chemical Society, Washington DC, 1987). 2. B. D. RATNER, in “Comprehensive Polymer Science,” edited byG.AllenandJ.C.Bevington(PergamonPress,NewYork,1989) p. 201. 3. R. THULL, Orthopade 32 (2003) 51. 4. B. D. RATNER, in “Surface Modificaœon of Polymeric Biomaterials,” edited by B. D. Ratner and D. G. Castner (Plenum Press, New York, 1997) p. 35. 5. A. BRUNHOLD, F. KLEINERT, R. SCHNABEL and S. MARINOW, Lackiertechnik 51 (1997) 37. 6. D. KLEE and H. H O C¨ KER, Spektrum der Wissenscha« 6 (1995) 90. 7. R. D’AGOSTINO, Academic Press, 1990. 8. D. M. MANOS and D. L. FLAMM, Academic Press, 1986. 9. C. MORRISON, R. MACNAIR, C. MAcDONALD, A. WYKMAN, I. GOLDIE and M. H. GRANT, Biomaterials 16 (1995) 987. 10. D. F. WILLIAMS and A. McNAMARA, J. Mater. Sci. Le£. 6 (1987) 188. 11. J. A. BRYDSON (ed.) “Aromaœc Polyetherketones” Bu£erworths London, 1989). 12. C. P. SMITH, Swiss Plasœcs 3 (1981) 37. 13. 25. M. DAUNER, H. PLANCK and H. J. BR U¨ NING, He«e zur Zeitschri« der Unfallchirurg 234 (1994) 14. O. NOISET, Y. J. SCHNEIDER and J. MARCHAND- BRYNAERT, J. Biomater. Sci. Polym. Ed 10 (1999) 657. 15. Idem, ibid. 11 (2000) 767. 16. S. D. COOK andA. M. RUST-DAWICKI,J.Oral.Implantol. 21 (1995) 176. 17. K. SCHR O¨ DER, A. MEYER-PLATH, D. KELLER, W. BESCH, G. BABUCKE and A. OHL, Contrib. Plasma. Phys. 41 (2001) 562. 18. K. SCHR O¨ DER, D. KELLER, A. MEYER-PLATH, U. M U¨ LLER and A. OHL, in “Materials for Medical Engineering”, editedbyH.StallforthandP.Revell(Weinheim,Wiley-VCH,2000) p. 161. 19. K. SCHR O¨ DER, A. MEYER-PLATH, D. KELLER and A. OHL, Plasm. Polym. 7 (2002) 103. 20. P. DUCY, M. STARBUCK, M. PRIEMEL, J. SHEN, G. PINERO, V. GEOFFROY, M. AMLING and G. KARSENTY, Genes Dev. 13 (1999) 1025. 21. G. ZHANG, R. A. LATOUR, JR., J. M. KENNEDY, S. H. DEL, JR. and R. J. FRIEDMAN, Biomaterials 17 (1996) 781. 22. L. M. WENZ, K. MERRITT, S. A. BROWN, A. MOET and A. D. STEFFEE, J Biomed. Mater. Res. 24 (1990) 207. 23. A. HUNTER, C. W. ARCHER, P. S. WALKER and G. W. BLUNN, Biomaterials 16 (1995) 287. 24. A. KATZER, H. MARQUARDT, J. WESTENDORF, J. V. WENING and G. VON FOERSTER, ibid. 23 (2002) 1749. 25. K. C. OLBRICH, T. T. ANDERSEN, F. A. BLUMENSTOCK and R. BIZIOS, ibid. 17 (1996) 759. 26. 711. D. A. PULEO, L. A. HOLLERAN, R. H. DOREMUS and R. BIZIOS, J. Biomed. Mater. Res. 25 (1991) 27. A. REZANIA, C. H. THOMAS and K. E. HEALY, Ann. Biomed. Eng. 25 (1997) 190. 28. D. J. SIMMONS, G. N. KENT, R. L. JILKA, D. M. SCOTT, M. FALLON and D. V. COHN, Calcif. Tissue Int. 34 (1982) 291. 29. C. HENDRICH, U. NOTH, U. STAHL, F. MERKLEIN, C. P. RADER, N. SCHUTZE, R. THULL, R. S. TUAN and J. EULERT, Clin. Orthop. (2002) 278. 30. W. LINHART, F. PETERS, W. LEHMANN, K. SCHWARZ, A. F. SCHILLING, M. AMLING, J. M. RUEGER and M. EPPLE, J. Biomed. Mater. Res. 54 (2001) 162. 31. J. O. HOLLINGER and J. P. SCHMITZ, Ann. N. Y. Acad. Sci 831 (1997) 427. 32. J. MEYER, B. WIES, M. KANTLEHNER and H. KESSLER, in “Zellul¨are Interakœon mit Biomaterialien,” edited by N. M. Meenen, A. Katzer and J. M. Rueger Berlin (Heidelberg, Springer Verlag, 2000) p. 33. 33. 820 A. OHL andK. SCHR O¨ DER,Surf.Coat.Tech.116–119(1999)
