Цитогенетическое исследование мультипотентных мезенхимных стромаль

МАТЕРИАЛЫ НАУЧНОЙ К О Н Ф Е Р Е Н Ц И И «ГЕНЕТИКА — МЕДИЦИНЕ»
Цитогенетическое исследование
мультипотентных мезенхимных
стромальных клеток человека
в процессе культивирования*
Б о ч к о в Н.П., В о р о н и н а Е.С., К а т о с о в а Л . Д . , Н и к и т и н а В.А.
Учреждение Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН
115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел./факс: 8(495)324-35-79, e-mail: esvoronina@med-gen.ru
Проведено комплексное цитогенетическое исследование мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (МСК) че­
ловека, выделенных из жировой ткани и костного мозга, на разных этапах культивирования, включающее кариотипирование и
оценку уровня анеуплоидии методом FISH. В некоторых культурах обнаружены как числовые, так и структурные нарушения, с
формированием клонов аномальных клеток. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости более глубокого изуче­
ния генетики стволовых клеток и создания системы контроля их качества при использовании их в клеточной терапии.
Ключевые слова: мезенхимальные мультипотентные стромальные клетки, кариотип, анеуплоидия
Введение
М С К человека являются наиболее универсальным
источником для клеточной терапии. Поскольку стволо­
вых клеток, взятых из организма (костный мозг, жиро­
вая ткань, пуповинная кровь и другие источники), недо­
статочно для использования в лечебных целях, они под­
вергаются культивированию. Культивирование прово­
дится не только с целью увеличения их количества, но и
для освобождения от нестволовых клеток, коммитирования в определенном направлении. Однако культиви­
рование может приводить к возникновению хромосом­
ных перестроек, которые, в свою очередь, могут
обусловливать предрасположенность к развитию онко­
логических заболеваний или являться прямой причиной
злокачественной трансформации [5, 8, 9]. Кроме того,
введение в организм больного клеточного транспланта­
та, содержащего аномальные клоны, может привести к
иммунным осложнениям, связанным с элиминацией ге­
нетически измененных клеток.
С учетом на закономерностей хромосомной неста­
бильности и ее значимости в онкогенезе становится
очевидной необходимость выявления клеточных линий,
несущих хромосомные перестройки, и исключения их
из дальнейшего использования в качестве транспланта­
та. Следует также отметить, что в каждом отдельном
случае необходимо оценивать соотношение терапевти­
ческих свойств и потенциального риска повреждающего
действия клеточного трансплантата [7].
Обеспечение безопасности клеточной терапии явля­
ется одним из главных условий. В настоящее время раз­
рабатываются единые производственные стандарты хра­
нения и применения клеточных препаратов [3], но
оценка генетической стабильности до сих пор не рас­
сматривалась как обязательное условие претрансплантационного тестирования. Вопросы отдаленных послед­
ствий клеточной терапии с генетической точки зрения
изучены недостаточно. В то же время нет сомнений в
том, что генетическая нестабильность клеточных куль­
тур-трансплантатов может вести к нежелательным по­
следствиям, обусловленным хромосомными аномалия­
ми или нарушением экспрессии генов [1].
Программа работы нашего коллектива — оценка уров­
ня, видов и последствий хромосомной изменчивости
МСК в зависимости от источника клеток и длительности
культивирования. Конечная цель этих исследований —
разработка методов претрансплантационного кариологического тестирования МСК с целью безопасности клеточ­
ной терапии, а также определение условий культивирова­
ния для получения генетически стабильных линий клеток.
В настоящей статье приводятся собственные данные на­
шего коллектива по цитогенетике МСК.
Материалы и методы
Культивирование стромальных фибробластов кост­
ного мозга проводили по методу, предложенному
А.Я. Фриденштейном с соавторами [4]. Мононуклеарные клетки, выделенные из костного мозга или жировой
ткани, высаживали в культуральные вентилируемые
флаконы, содержащие ростовую среду DM ЕМ с
10—20% эмбриональной телячьей сыворотки, возможно
добавление 1% инсулин-трансферрин-селенита. Через
24—48 ч неприлипшие клетки удаляли со сменой среды.
В дальнейшем культуры инкубировали до достижения
75—90% конфлюэнтности. После этого клетки снимали
* Работа выполнена при частичной ф и н а н с о в о й поддержке гранта Р Ф Ф И 09-04-00948а и ГК Н Ш - 5 9 8 4 . 2 0 0 8 . 7
ISSN 2 0 7 3 - 7 9 9 8
3
/
/
/
МАТЕРИАЛЫ НАУЧНОЙ К О Н Ф Е Р Е Н Ц И И «ГЕНЕТИКА — М Е Д И Ц И Н Е »
раствором трипсина и рассевали в новую посуду. Куль­
тивирование проводили при температуре 37°С в услови­
ях абсолютной влажности и 5% С О 2 в воздухе. Начиная
с 3-го пассажа культуры МСК имели мономорфный вид
и состояли из клеток веретенообразной формы.
Колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл вводи­
ли в культуральные флаконы за 2 часа до начала фиксации.
Снятие клеток со дна флакона проводили в 2 этапа.
На 1-м этапе получали митотические клетки, кото­
рые использовали для кариотипического анализа.
На 2-м этапе после трипсиновой обработки снимали
со дна флакона все остальные клетки, которые в последу­
ющем использовались для оценки частоты анеуплоидии
в интерфазных ядрах с применением FISH-метода.
В пробирки, полученные на первом и втором этапах,
добавляли 0,55%-ный раствор КС1 и инкубировали в тер­
мостате при 37°С в течение 8—9 мин. Для остановки гипотонизации перед центрифугированием в пробирки до­
бавляли 3—5 капель фиксатора. Фиксацию проводили
смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты
(в соотношении 3:1) стандартным способом, трижды ме­
няя фиксатор.
Дифференциальную окраску препаратов для кариотипирования проводили с применением GTG-метода
(G-bands by trypsin using Giemsa). Для каждой культуры
МСК анализировали не менее 15 метафаз. Анализ пре­
паратов проводили согласно международной номенкла­
туре ISCN (2005) [6].
Для проведения интерфазного FISH-анализа ис­
пользовали зонды фирмы Vysis, Inc. (СЕР6 (D6Z1),
СЕР8 (D8Z1), СЕРХ, CEPY альфа-сателлитной ДНК.
Денатурацию, гибридизацию и отмыв проводили по
стандартному протоколу. Для контрастной окраски ядер
использовали DAPI. FISH-препараты анализировали
под микроскопом AxioImager с комплектом интерфе­
ренционных фильтров (Zeiss, Германия) с помощью
программного обеспечения FISH-анализа (Fish View
System, Applied Spectral Imaging). Использование метода
двухцветного интерфазного FISH-анализа позволило
исключить ядра с нерезультативной гибридизацией.
Результаты и обсуждение
Кариотипирование, оценку анеуплоидии и хромо­
сомных аберраций проводили на ранних пассажах
(1—5-й пассажи), а некоторые культуры кариотипировали также на 10—15-м пассажах. Всего проанализиро­
вано 26 культур МСК: 19 культур из жировой ткани и
7 культур из костного мозга.
Кариотип культур МСК из жировой ткани
В табл. 1 представлены результаты кариотипирования культур МСК из жировой ткани (12 женщин и
один мужчина). На ранних этапах культивирования
(2—5-й пассажи) хромосомный набор 12 культур МСК
соответствовал нормальному. В одном случае наблюда­
ли мозаицизм mos48,XX,+C?,+C?[5]/46,XX[39].
На поздних пассажах (10—15-м) кариотипирование
было проведено для шести культур МСК, три из которых
сохранили нормальный хромосомный набор (46,ХХ).
8 остальных культурах выявлены различные мозаичные
формы: №2 — моносомия по хромосоме 6 и робертсоновская транслокация между хромосомами 21 и 22 в
89,7% клеток, №5 — моносомия по хромосоме 6 (78,9%)
(рис. 3), №6 — трисомия по хромосоме 18 (78%).
Таблица 1
Результаты кариотипирования М С К из жировой ткани
№ культуры
Пассаж
1
4
4
14
2
!
I
46.ХХ
mos44 ) XX,-6,der(21;22)(q10;q10)[26]/46,XX[3]
46.ХХ
46.ХХ
3
5
11
4
4
46,ХХ
5
10
46,ХХ
mos45,XX,-6[30]/46,XX[8]
6
3
11
46,ХХ
mos47,XX,+18[ 11 ]/46,ХХ[13]
7
3
10
4
46.ХХ
46.ХХ
5
8
5
mos48,XX,+C?,+C?[5]/46,XX[39]
46.ХХ
3
2
5
15
46.ХХ
11
12
13
3
46.XY
10
4
Кариотип
46.ХХ
46,ХХ
46.ХХ
46, XX
М Е Д И Ц И Н С К А Я ГЕНЕТИКА. 2 0 0 9 . №12
Кариотип культур МСК из костного мозга
При кариотипировании МСК из костного мозга в од­
ном случае обнаружен интересный феномен. На 1-м пас­
саже в одной из культур был выявлен мозаицизм: 4,7%
клеток имели нормальный мужской кариотип (46,XY), а
в 95,3% клеток Y-хромосома отсутствовала (45,X). При
анализе лимфоцитов периферической крови донора этих
клеток была получена противоположная картина: 5%
лимфоцитов с аномальным кариотипом (45,X) и 95% с
нормальным мужским (46,XY). Следовательно, этот муж­
чина имел мозаичный кариотип, но при культивирова­
нии костного мозга анеуплоидные клетки имели селек­
тивное преимущество в размножении.
При кариотипировании было выявлено две культуры
МСК с разными анеуплоидиями: 45,X и трисомией 8.
Эти результаты были подтверждены FISH-методом и
описаны ниже, в разделе «Молекулярно-цитогенетическии анализ МСК». В результате оценки кариотипа
остальных культур МСК из костного мозга на ранних и
поздних пассажах их хромосомный набор соответство­
вал нормальному — 46,XY или 46,XX — и не менялся в
процессе культивирования.
Таким образом, даже при коротком культивирова­
нии вероятность злокачественной трансформации мо­
жет резко повыситься в результате как возникновения
геномных мутаций de novo, так и позитивной селекции
существующих в организме клонов аномальных клеток,
обладающих более высокой скоростью размножения по
сравнению с нормальными.
Молекулярно-цитогенетический анализ МСК
Всего проанализировано около 100 тыс. интерфаз­
ных ядер МСК из разных источников.
В трех культурах МСК из жировой ткани на поздних
(9—15-й) пассажах обнаружено наличие двух клеточных
популяций, одна из которых представлена диплоидным
хромосомным набором, другая — анеуплоидным: моносомией по хромосоме 6. Не вызывает сомнения, что эти
генетические нарушения появились в процессе культи­
вирования и аномальные клетки имели селективное
преимущество в размножении.
При FISH-анализе культур МСК, выделенных из ко­
стного мозга, также были обнаружены клоны аномальных
клеток. В одной из культур выявлен клон с трисомией по
хромосоме 8. Частота анеуплоидии по этой хромосоме бы­
ла оценена на 4-, 6- и 12-м пассажах. Клон выявляется уже
на 4-м пассаже и составляет примерно 24% от общего чис­
ла проанализированных клеток, на 6-м пассаже выявлено
уже 34% ядер с трисомией по хромосоме 8. Однако к 12-му
пассажу наблюдали только 16% трисомных клеток в этой
культуре. Условия культивирования и пересевов клеточ­
ных культур были сходными, поэтому появление анома­
льных клонов клеток можно объяснить их селективным
преимуществом в размножении. Изменение размера кло­
на может свидетельствовать о разной скорости его деле­
ния в процессе культивирования. Можно предположить,
ISSN 2 0 7 3 - 7 9 9 8
что процессы пролиферации и старения в анеуплоидных
клетках протекают быстрее, чем в нормальных.
Кроме того, при цитогенетическом анализе была вы­
явлена культура МСК из костного мозга здоровой жен­
щины, несущие клоны, в которой на 4-м пассаже выя­
вили 12% клеток, несущих клон с одной Х-хромосомой,
а на 10-м пассаже обнаружили уже 91% таких клеток,
т.е. они обладали селективным преимуществом.
В отличие от клонов МСК из жировой ткани, клоны
в МСК из костного мозга выявлялись уже на 2—4-м пас­
сажах, т.е. источником аномального клона в этих куль­
турах могли быть аберрантные клетки донора, которые
при культивировании имели селективное преимущество
в размножении.
Таблица 2
Средняя частота анеуплоидии
в культурах М С К из жировой ткани
Хромосома
Пассаж
Моносомия,
М±т, %
Трисомия,
М±гл, %
6
Ранний
Поздний
Ранний
Поздний
Ранний
1,52±0,32
0,42±0,11
0,42±0,17
8
X
Поздний
1,18±0,43
2,07±0,37
1,51±0,61
0,76±0,16
0,41±0,13
0,90±0,32
0,19±0,07
0,64±0,24
0,16±0,08
Таблица 3
Средняя частота анеуплоидии по аутосомам
в культурах М С К из костного мозга
Хромосома
Пассаж
6
Ранний
Поздний
Ранний
Поздний
8
Моносомия,
М±т, %
0,83±0,17
0,81±0,24
0,96±0,16
0,78±0,12 ,
Трисомия,
М±т, %
0,32±0,09
0,32±0,12
0,20±0,07
0,16±0,05
Таблица 4
Средняя частота
анеуплоидии по половым хромосомам
в культурах МСК из костного мозга
Хромосома
Пассаж
Гипосомия,
М±т, %
а
Гиперсомия, 6 ||
М±т, %
!
X (жен.)
Ранний
1,30±0.31
0,21±0,10 f
Поздний
0,39±0,04
0,19±0,04 |;
X (муж.)
Ранний
0,11±0,04
1,02±0,18 [:
Поздний
2,5з±о,б4 :;
0,01±0,01
Y
Ранний
0,39±0,11
0,75±0,14 f
Поздний
0,75±0,45
1,73±0,35 f
Примечание. а — моносомия для культур с женским кари- |
отипом и нуллисомия для культур с мужским кариотипом; |!
6
— трисомия для культур с женским кариотипом и дисо- |
мия для культур с мужским кариотипом
|
5
МАТЕРИАЛЫ НАУЧНОЙ К О Н Ф Е Р Е Н Ц И И «ГЕНЕТИКА — М Е Д И Ц И Н Е »
Данные по частоте анеуплоидии в культурах МСК, не
несущих клоны, представлены в табл. 2—4. Частота моносомии по всем хромосомам была выше частоты трисомии.
Более высокая частота моносомии, чем частота трисомии,
является теоретически ожидаемой, так как кроме меха­
низма нерасхождения хромосом, являющегося общим для
обоих типов анеуплоидии и приводящего к их равному со­
отношению, моносомия может быть обусловлена и меха­
низмом отставания хромосом в анафазе митоза.
Было обнаружено, что в МСК, выделенных из жиро­
вой ткани, на ранних пассажах частота моносомии по
Х-хромосоме достоверно ниже частот моносомии по аутосомам 6 и 8 (р<0,05 и р<0,01 соответственно), а в культу­
рах, прошедших 10 и более пассажей, частота трисомии X
была ниже частоты трисомии по хромосоме 8 (р<0,05).
Частоты анеуплоидии по половым хромосомам и аутосомам не менялись в процессе культивирования.
При анализе МСК, выделенных из костного мозга
мужчин, выявлено, что частота потери X хромосомы ни­
же, чем Y хромосомы. Спонтанная частота потери хромо­
сомы Y в культурах МСК составила от 0,39 до 0,75% на
разных пассажах, тогда как нулисомия по хромосоме X за­
фиксирована как крайне редкое явление (табл. 4). Это мо­
жет быть связано с выявлением разовых событий потери
единственной Х-хромосомы вследствие нерасхождения
или отставания в процессе клеточного деления или может
рассматриваться как гибридизационный артефакт. По
остальным хромосомам не выявлено достоверных разли­
чий. Частота анеуплоидии по аутосомам 6 и 8 не менялась
в процессе культивирования. При культивировании МСК
увеличилась частота появления дополнительных X и Y
хромосом (р<0,01, р<0,01 соответственно).
При сравнении анеуплоидии в МСК, полученных из
разных источников, можно предположить, что частота ане­
уплоидии по аутосомам 6 и 8 выше в клетках, выделенных
из жировой ткани, чем в клетках, выделенных из костного
мозга (табл. 2, 3). Статистически достоверные различия вы­
явлены лишь при сравнении частоты потери одной хромо­
сомы 6 (р<0,05) в МСК из разных источников, а также мо­
носомии (р<0,01) и трисомии по хромосоме 8 (р<0,01).
Таким образом, клонообразование в культурах МСК
является довольно частым явлением. Источником анома­
льного клона в культуре могут быть аберрантные клетки
донора, которые при культивировании имели селектив­
ное преимущество в размножении или аберрантные
клетки, возникшие de novo в процессе культивирования.
Клон может характеризоваться одной или несколькими
стабильными хромосомными или геномными аберрация­
ми и высокой генетической нестабильностью, что, в
свою очередь, может приводить к специфической и/или
неспецифической потере одной или нескольких хромо­
сом в каждом цикле деления [2].
При цитогенетическом исследовании культур МСК,
предназначенных для проведения клеточной терапии, не­
обходимо учитывать опасность генетической и онкогенной
трансформации МСК. Клоны, несущие различные хромо­
сомные аномалии, могут различаться по своей потенциаль­
ной опасности. Так, клон с трисомией по хромосоме 8 —
одна из наиболее частых аберраций при миелоидных зло­
качественных заболеваниях, а робертсоновская транслока­
ция не влияет* на качество жизни ее носителей.
Данные по разным типам хромосомной изменчивости
в культивируемых МСК свидетельствуют о необходимо­
сти более глубокого изучения генетики стволовых клеток
и создания системы контроля их качества, чтобы предот­
вратить нежелательные последствия в случаях примене­
ния этих клеток в терапевтических целях.
Список литературы
1. Бочков Н.П., Никитина В.А. Цитогенетика стволовых
клеток человека // Мол. Мед. — 2008. — № 3 . — С. 4 0 — 4 7 .
2. Бочков Н.П., Никитина В.А., Буяновская О.А. и др. Анеуплоидия в стволовых клетках, выделенных из ж и р о в о й ткани
человека // Б Э Б и М . - 2008. - № 9 . - С. 3 2 0 - 3 2 3 .
3. Бурунова В.В., Суздальцева Ю.Г., Воронов А.В. и др. Раз­
работка и внедрение производственных стандартов для клеточ­
ных продуктов мезенхимального происхождения // Клет. техн.
в биол. и мед. - 2008. - № 2 . - С. 9 7 - 1 0 1 .
4. Ф р и д е н ш т е й н А.Я., Чайлахян Р.К. Стромальные клетки
костного мозга и кроветворное м и к р о о к р у ж е н и е // Архив патол. - 1982. - № 1 0 . - С. 3 - 1 1 .
5. Duesberg P., Li R. Multistep carcinogenesis: a chain reaction of
aneuploidizations // Cell Cycle. - 2003. - Vol. 2(3). - P. 2 0 2 - 2 1 0 .
6. I S C N (2005): An International System for H u m a n Cytogene­
tic Nomenclature / Shaffer L.G., Tommerup N. (eds). — S. Karger,
Basel, 2005. - 130 p.
7. Lazennec G., Jorgensen C. Concise review: adult multipotent
stromal cells and cancer: risk or benefit? // Stem Cells. — 2008. —
Vol. 26. - P. 1 3 8 7 - 1 3 9 4 .
8. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M . C . et al. Spontaneous
human adult stem cell transformation // Cancer Res. — 2005. —
Vol. 65. - № 8 . - P. 3 0 3 5 - 3 0 3 9 .
9. Tolar J., Nauta A.J., Osborn M.J. et al. Sarcoma derived from
cultured mesenchymal stem cells // Stem Cells. — 2007. — Vol. 25.
- № 2 . - P. 3 7 1 - 3 7 9 .
Cytogenetic analysis of human multipotent mesenchymal stromal cells during cultivation
Bochkov N.P., Voronina E.S., Katosova L.D., Nikitina V.A.
Research Centre for Medical Genetics, Russian Academy of Medical Sciences.
Russia, 115478, Moscow, Moskvorechie str., 1. Tel./fax: +7(495)324-35-79, e-mail: esvoronina@med-gen.ru
Complex cytogenetic analysis of human multipotent mesenchymal stromal cells from adipose tissue and bone marrow was per­
formed at different stages of cultivation. The analysis included the assessment of karyotype and aneuploidy level using FISH. Some
cultures appeared to have numerical or structural abnormalities with abnormal cell clone formation. The results substantiate the need
for more profound study of stem cell genetics and development of quality control system for the cell therapy.
6