Хроматографическая очистка плазмидной ДНК для клинического

142
Оригинальные исследования
Хроматографическая очистка
плазмидной ДНК для клинического применения
(генной терапии)
Ю.Д. Романова 1, И.И. Салафутдинов 1, 2, Н.М. Замалютдинова 1, А.А. Ризванов 1
1
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань
2
Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения
республики Татарстан, Казань
Chromatographic purification of plasmid DNA for clinical applications (gene therapy)
J.J. Romanova 1, I.I. Salafutdinov 1, 2, N.M. Zamalyutdinova 1, A.A. Rizvanov 1
1
Kazan (Volga region) Federal University, Kazan
2
Republican Clinical Hospital, Ministry of Health of the Republic of Tatarstan, Kazan
Для успешного применения плазмидных векторов в
протоколах генной терапии необходима разработка методов получения гомогенных высокоочищенных препаратов
рекомбинантной ДНК, не содержащих загрязняющих компонентов, в первую очередь хромосомной ДНК, бактериальных белков, РНК и эндотоксинов. В ходе проведенного
исследования нами была проведена оптимизация способа
очистки плазмидной суперскрученной ДНК с помощью трех
хроматографических этапов из щелочного лизата бактериального штамма E. coli. Были подобраны оптимальные
условия для этапа щелочного лизиса в целях увеличения
выхода плазмиды и минимизации длительности очистки
с помощью гель-фильтрации.
For the successful application of plasmid vectors in gene
therapy protocols it is necessary to develop methods for
purification of highly homogeneous preparations of recombinant
DNA that do not contain contaminants, primarily chromosomal
DNA, bacterial proteins, RNA and endotoxins. In the course
of our study we performed optimization of the purification of
plasmid supercoiled DNA by three chromatographic steps from
an alkaline lysate of bacterial strain of E. coli. We determined
an optimal conditions for alkaline lysis step in order to increase
the yield and minimize the duration of the plasmid purification
by gel filtration.
Ключевые слова: рекомбинантная ДНК, плазмида,
гель-фильтрафия, анионообменная хроматография, высаливающая хроматография, генная терапия.
Key words: recombinant DNA plasmid, gel filtration, anion
exchange chromatography, salting-out chromatography, gene
therapy.
В настоящее время векторные системы созданные на основе плазмид и вирусов применяют в различных протоколах генной терапии ряда заболеваний человека. Методы генной терапии основаны на
введение в клетки векторов с генами, кодирующими
терапевтические гены [1]. В разрабатываемых схемах генной терапии, находящихся на разных стадиях
клинических испытаний, на долю плазмидных векторов приходится 18% [2]. Векторы на основе плазмид считаются наиболее безопасными по сравнению
с вирусными системами доставки, поскольку после
их введения в клетки не возникает выраженного иммунного ответа, а также отсутствует интеграция в
геномом хозяйской клетки, что нивелирует возможный инсерционный мутагенез. В тоже время вопрос
эффективной доставки и экспрессии генетического
материала в составе плазмидных конструкций остается открытым. Вследствие этого для успешного лечения заболеваний необходимо введение большого
количества препарата плазмидной ДНК или использование специфических систем их доставки [3-4].
Стандартный метод получения плазмид из бактериальных клеток включает несколько ключевых
этапов: наработка биомассы рекомбинантного бактериального штамма, лизис клеток, очистку плазмиды от геномной ДНК, РНК, белков и эндотоксинов
клеток продуцента [5]. В большинстве современных
методов очистки плазмидной ДНК для разрушения
клеточной стенки применяется щелочной лизис,
который требует тщательного контроля, поскольку
превышение времени контакта щелочи со суперскрученной плазмидной ДНК приводит к ее денатурации.
Для дальнейшей очистки ДНК из щелочного лизата в
основном применяют хроматографические методы –
гель-фильтрацию, адсорбционную, ионно-обменную,
аффинную, обращенно-фазную и хроматографию
гидрофобных взаимодействий. Ряд хроматографических методов имеет существенные недостатки.
Например, применение в качестве сорбента гидроксилапатита ограничено тем, что он легко накапливает необратимо адсорбирующие вещества и может
применяться лишь после удаления большей части
балластного материала [6]. Некоторые из методов,
например, аффинная хроматография [7], не дают
возможность увеличить масштабы производства изза высокой стоимости сорбентов, а некоторые методы
предполагают применение токсичных реагентов, как,
например, при применении обращенно-фазной хроматографии [8], что недопустимо для медицинских
препаратов. В связи с чем, возникает потребность в
методах получения высокоочищенных рекомбинантных ДНК, которые можно было бы масштабировать
для производства медицинских препаратов нуклеиновых кислот в промышленных объемах.
e-mail: rizvanov@gmail.com
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 3, 2012
143
Оригинальные исследования
Материал и методы
Рекомбинантная плазмида. В работе использовался рекомбинантная плазмида pBud-VEGF-FGF2,
представлющая собой кольцевую замкнутую молекулу ДНК молекулярной массой 3,7 кДа (5583 п.н.),
созданную на основе плазмидного вектора pBudCE4.1
(Invitrogen, США) [9]. За основу метода получения
препаративного количества плазмиды с характеристиками, рекомендованными ВОЗ для клинического применения (WHO Technical Report Series No 941, 2007),
был принят протокол фирмы «GEHealthcare», разработанный для трехстадийной очистки плазмиды весом
6,2 кДа с помощью фирменных хроматографических
колонок (табл. 1) (GE Healthcare Life Sciences, США).
Таблица 1. Характеристика препарата плазмидной ДНК после трехстадийной очистки
с помощью хроматографических колонок (GE Healthcare Life Sciences).
Допустимое содержание плазмиды и загрязняющих веществ
Показатель
Эндотоксины
Хромосомная ДНК
РНК
Протеины E. coli
Суперскрученная кольцевая
замкнутая ДНК
Допустимое количество
плазмиды и загрязняющих
веществ, согласно
рекомендациям ВОЗ
Содержание плазмиды
и загрязняющих веществ в препарате
плазмидной ДНК
< 10 E. U./ мг ДНК
< 1,7 E.U./ мг ДНК
< 2 мкг/ мг ДНК
< 0,02 мкг/ мг ДНК
< 0,2 мкг/ мг ДНК
< 0,01 мкг/ мг ДНК
< 3 мкг/ мг ДНК
< 1 мкг/ мг ДНК
> 97%
98%
Культивирование штамма продуцента. Культивирование штамма Escherichia coli XL1 Blue, содержащего плазмиду pBud-VEGF-FGF2, проводили на среде
Лурия-Бертани c добавлением антибиотика зеоцин
в конечной концентрации 25 мкг/мл. Ночную культуру объемом 2000 мл выращивали при соотношении
объема воздуха к объему среды 3:1, на качалке при
200 об/мин до значений оптической плотности 2,5.
Клетки концентрировали центрифугированием в течение 10 мин при 6000 об./мин.
Щелочной лизис и осаждение плазмидной ДНК.
Щелочной лизис проводили согласно стандартной
методике [5]. Осажденную бактериальную культуру
ресуспендировали в 100 мл буфера (25 мМ трис-HCl,
10 мМ ЭДТА, 50 мМ глюкозы, рН 7,5, 100 мкг/мл
РНКаза А). К суспензии добавляли 100 мл лизирующего буфера (200 мМ NaOH, 1% SDS (додецилсульфат натрия)). Спустя 5 мин проводили нейтрализацию с помощью добавления охлажденного
ацетатного буфера (3 М CH3CO2K). Полученную
взвесь фильтровали через бумажный фильтр (марка
«синяя лента»). К отфильтрованному раствору приливали изопропанол в соотношении 1:0,7, выдерживали при комнатной температуре 10 мин. Осадок
центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение
30 мин при 4°С. Супернатант сливали, осадок промывали 70% этанолом, центрифугировали 15 мин
при тех же условиях. Спирт сливали, осадок подсушивали при комнатной температуре и растворяли
в 50 мл трис-НСl буфера (50 мМ трис-HCl, 10 мМ
ЭДТА, рН 7,5).
Хроматографическая очистка рекомбинантной
плазмидной ДНК. Все этапы хроматографической
очистки проводили с помощью системы жидкостной хроматографии BioLogicLP («Bio-Rad», США),
снабженной градиентным насосом с производительностью до 40 мл/мин, проточным УФ-детектором с
двумя длинами волн (254 и 280 нм) и кондуктометром. Очистка проводилась на фирменных колонках
«PlasmidSelect Xtra Starter Kit» (GE Healthcare Life
Sciences, США). Концентрацию нуклеиновых кислот
определяли на спектрофотометре NanoPhotometer
Pearl («Implen», Германия). Чистоту препарата анализировали с помощью электрофореза в 0,8 %
агарозном геле с добавлением бромистого этидия.
В качестве маркера молекулярной массы использовали «GenRuler 10kb DNALadder» (Fermentas, США).
Результаты и обсуждение
Согласно протоколу «GE Healthcare» полученный
щелочной лизат можно было непосредственно использовать для очистки на колонках. Однако такой
лизат содержал избыточное количество РНК, что
приводило к увеличению продолжительности очистки на первом этапе с помощью Sepharose 6 Fast Flow
(рис. 1А). В целях минимизации длительности первого этапа очистки щелочного лизата, перед внесением на хроматографическую колонку, образец подвергали дополнительной обработке РНКазой А для
разрушения РНК, плазмиду из раствора осаждали
изопропанолом. На колонку, предварительно уравновешенную буфером А, вносили 10 мл образца,
с концентрацией нуклеиновых кислот около 1 мг/мл
(табл. 2). Плазмиду элюировали тем же буфером со
скоростью 4 мл/мин. Сорбент после каждого выхода
пика плазмиды промывали дистилированной водой
(рис. 1Б).
На следующем этапе с помощью высаливающей
хроматографии отделяли суперскрученную замкнутую кольцевую форму плазмиды от открытой линейной формы на колонке PlasmidSelect Xtra, содержащей меркаптопиридиновые лиганды. На колонку,
уравновешенную буфером В, наносили образец в
количестве 5 мг. Плазмиду, удержанную на колонке, промывали от открытой линейной формы тем же
буфером при скорости потока 4 мл/мин, затем плазмиду элюировали буфером С при скорости потока
3 мл/мин.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 3, 2012
144
Оригинальные исследования
0
50
Время, мин
100
0
50
Время, мин
Рис. 1. Гель-фильтрация плазмиды pBud-VEGF-FGF2 на колонке Sepharose 6 Fast Flow после щелочного
лизиса (А) и после щелочного лизиса и очистки изопропанолом (Б). Пик 1 – плазмида; пик 2 – РНК
1
2
3
Таблица 2. Количество нуклеиновых кислот
в образцах на разных этапах очистки
Этап очистки
6 т.п.н. →
3 т.п.н. →
1 т.п.н. →
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов очистки
плазмиды pBud-VEGF-FGF2 с применением
жидкостной хроматографии:
1 – маркер GenRuler;
2 – ДНК после щелочного лизиса;
3 – ДНК после очистки
Количество, мг
Щелочной лизис
58,5
Колонка Sepharose 6 Fast Flow
12,8
Колонка PlasmidSelect Xtra
9,4
Колонка Source 30Q
9,0
Полученные после гель-фильтрации фракции
плазмиды содержали значительное количество
плазмиды линейной формы. Поскольку нахождение плазмиды в растворе при больших значениях
рН вызывает необратимую денатурацию плазмиды
за короткий промежуток времени, увеличили объем
ацетатного буфера (рН 5,0) для более быстрого и
однородного смещения рН раствора в кислую сторону. Увеличение объема ацетатного буфера на 35%
приводило к заметному уменьшению количества линейной формы плазмиды.
На финальном этапе очистки использовали анионообменную хроматографию на колонке с сорбентом
Source 30Q. На колонку, уравновешенную буфером
Д, наносили образец в количестве 5 мг, плазмиду,
удержанную на колонке, промывали от эндотоксинов тем же буфером при скорости потока 4 мл/мин,
затем плазмиду элюировали буфером Е в те же
условиях. Чистоту плазмиды определяли с помощью
электрофореза в агарозном геле (рис. 2).
Таким образом, были оптимизированы условия
очистки препарата плазмидной ДНК pBud-VEGF-FGF2
с помощью трех хроматографических колонок, входящих в состав набора «PlasmidSelect Xtra Starter
Kit» (GE Healthcare Life Sciences, США). В качестве
дополнительного этапа очистки щелочного лизата
была выбрана преципитация плазмиды изопропанолом. Общий выход плазмиды после всех этапов
очистки составил 15,4%.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 3, 2012
Оригинальные исследования
145
Благодарности
Выполнение данного научного исследования
финансируется за счёт темы Государственного автономного учреждения здравоохранения «Республиканская клиническая больница Министерства
здравоохранения Республики Татарстан» «Разработка новых методов прямой генной терапии у
пациентов с хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей и диабетической сто-
пой» и государственного контракта ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации
№ 16.552.11.7083. Работа частично выполнена на
оборудовании Федерального центра коллективного пользования физико-химических исследований
веществ и материалов (ФЦКП ФХИ) и Научнообразовательного центра фармацевтики Казанского
(Приволжского) федерального университета.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Sheridan C. Gene therapy finds its niche. Nat. Biotechnol.
2011; 29(2): 121–8.
2. Mac Gabhann F., Annex B.H., Popel A.S. Gene therapy from the
perspective of systems biology. Curr. Opin. Mol. Ther. 2010; 12(5):
570–7.
3. Suda T., Liu D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and
applications. Mol Ther. 2007; 15(12): 2063–9.
4. van der Aa M.A., Mastrobattista E., Oosting R.S. et al., The
nuclear pore complex: the gateway to successful nonviral gene delivery.
Pharm Res. 2006; 23(3): 447–59.
5. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory
manual. 3 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.
6. Hilbrig F., Freitag R. Isolation and purification of recombinant
proteins, antibodies and plasmid DNA with hydroxyapatite
chromatography. Biotechnol J. 2012; 7(1): 90–102.
7. Wils P., Escriou V., Warnery A. et al. Efficient purification of
plasmid DNA for gene transfer using triple-helix affinity chromatography.
Gene Ther. 1997; 4(4): 323–30.
8. Prazeres D.M., Schluep T., Cooney C. Preparative purification
of supercoiled plasmid DNA using anion-exchange chromatography. J.
Chromatogr. A. 1998; 806(1): 31–45.
9. Салафутдинов И.И., Шафигуллина А.К., Ялвач M.Э. и др.
Эффект одновременной экспрессии различных изоформ фактора
роста эндотелия сосудов VEGF и основного фактора роста фибробластов FGF2 на пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной
вены человека HUVEC. Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия 2010; 5(2): 62–7.
Поступила 13.08.2012
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 3, 2012