МЕТОДЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИИ
реклама
ЮНЕСКО АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БОТАНИКИ им. Н. Г. ХОЛОДНОГО комиссия УКРАИНСКОЙ ССР ПО ДЕЛАМ ЮНЕСКО МЕТОДЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИИ Препринт 88.2 Киев 1988 ЮНЕСКО АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР Комиссия Украинской ССР по делам ЮНЕСКО Институт ботаники им. Н. Г. Холодного МЕТОДЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ \ Препринт 88 . 2 Киев 1988 уда 575 МЕТОДЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ - Киев, 1988. (Препринт / АН УССР, Институт ботаники; 8 8 .2 ) 23 с. Момот Василий Павлович, Кучук Николай Викторович, Пастернак Тарас Петрович В работе описаны методы клеточной и генетической инженерии растений. Они включают методы соматической гибридизации и генети­ ческой трансформации у высших растений. Методы описаны в модифи­ кациях, применяемых в отделе цитофизиологии и клеточной инженерии Института ботаники им. Н .Г . Холодного АН УССР. Для специалистов в области клеточной и генетической инжене­ рии растени й. (С) Институт ботаники АН УССР, 1988 ВВЕДЕНИЕ Клеточная и генетическая инженерия растений к настоящему времени накопила значительный материал и постепенно превращается из академической дисциплины в одну из наиболее разрабатываемых и многообещающих в практическом отношении областей биотехнологии. В первую очередь это связано с расширением к руга растений, имеющих сельскохозяйственное значение, доступных для манипуляций на к л е ­ точном уровне. Кроме того, интерес к генетической инженерии выс­ ших растений возрос в связи с появлением клонированных индивиду­ альных генов бактериального и растительного происхождения, имею­ щих практическое з н а ч е н и е . Очевидно, что развертывание исследований по клеточной и г е ­ нетической инженерии растений невозможно без подготовки специа­ листов в этой области. В то же время в СССР очень мало практичес­ ких пособий, в которых подробно были бы описаны основные методы, применяемые в клеточной и генетической инженерии растений. Хотя з а рубежом и издан ряд хороших пособий (ссылки на некоторые из них приведены в списке литературы), они, к сожалению, не в с е г д а доступны для исследователей в нашей с т р а н е . Данная работа пред­ назначена для того, чтобы хотя бы в какой -то степени восполнить этот пробел. Все методы, представленные в этом препринте, описаны в тех модификациях, в которых они применяются в отделе цитофизиологии и клеточной инженерии Института ботаники им. Н .Г . Холодного АН УССР сотрудниками отдела (Момот В .П ., Кучук Н .В ., Пастернак Т . П . ) . В конце работы приведен список литературы, в которой можно найти описание методов и их модификаций, более подходящих для тех или иных целей и объектов. В этой небольшой работе мы не ставили задачи описать вое ме­ тоды, применяемые в клеточной и генетической инженерии растений. Однако мы надеемся, что приведенные методы позволят начинающему последователю сориентироваться среди большого числа существующих методик. Если же будет обнаружено, что мы упустили к ак и е-то важ­ ные моменты, авторы о благодарностью примут любые замечания и пожелания. 3 СЛИЯНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРОТОПЛАСТОВ, МЕХАНИЧЕСКАЯ ИЗОЛЯЦИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЕДИНИЧНЫХ ГЕТЕРОКАРИОЦИТОВ Все работы по созданию новых, более совершенных растительных форм до последнего времени проводились лишь путем полового скре­ щивания растений и последующего отбора желаемых генотипов, что накладывало ряд ограничений как на возможности комбинирования г е ­ нов, так и на скорость селекционного процесса. разработанная з а последнее время технология соматической гибридизации высших р а с ­ тений путем слияния протопластов и регенерации продуктов слияния до целых растений позволяет обойти часть ограничений, свойствен­ ных половому процессу и открывает заманчивые перспективы перед генетиками, физиологами, биохимиками растений и селекционерами. Применение методов соматической гибридизации позволяет успешно преодолевать естественную нескрещиваемость филогенетически отда­ ленных видов растений и, кроме того, создавать дополнительные р е ­ зервы наследственной изменчивости. К настоящему времени опублико­ вано более 200 работ описывающих результа ты изучения различных соматических гибридов и позволяющих выделить три основные направ­ ления исследований по соматической гибридизации высших растений: 1 ) изучение и реконструкция плазмагенов; 2 ) исследования по гибридизации клеток филогенетически отда­ ленных видов растений; 3 ) получение гибридного материала, представляющего практи­ ческий интерес для селекционеров. В зависимости от поставленной задачи исследователем могут быть использованы самые разнообразные методы селекции соматичес­ ких гибридов / 1/ , но мы в предлагаемой ниже методике рассмотрим лишь метод механической изоляции индивидуальных продуктов слияния с последующим их культивированием - прием, не связанный с выра­ женным отбором тех или иных рекомбинантных форм из общего спектра возникающих при слиянии клеток протопластов. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ 1 . Оборудование: - ламинарный бокс; инвертированный микроскоп; центрифуга на 1000 об/мин; полуавтоматическая микропипетка на 1 мкл. 4 2 . Растительный материал: ■«асептически выращиваемые растения; -каллусные культуры» 3 , Химические реактивы: -ферментные смеси и среды для выделения протопластов по стандартным методикам / 2/ ; -0 ,4 5 М раствор маннитола; - 0,5 М раствор сахарозы; -раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) (с о с т а в указан в те к с т е )^ -буферный раствор (состав указан в т е к с т е ) ; -питательные среды МО-1 / 3 / (состав среды указан в т е к с т е ) , ^•Лабораторная посуда и инструменты; -чашки Петри; -чашки. Купрака; -наконечники для микропипеток; -лабораторная посуда и инструменты для выделения и культи­ вирования протопластов по стандартным методикам. Все перечисленные растворы,матерналы и инструменты исполь зуются стерильными, ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ В опытах по соматической гибридизации с дальнейшей механи ческой изоляцией гибридов необходимо научиться четко,однозначно идентифицировать гибридные клетки,находящиеся в смеси с роди тельскими партнерами,Для таких опытов обычно берутся партнеры, обладающие визуальными маркерами,т*е. партнеры,один из которых представлен каллусными протопластами (богатыми цитоплазмой о яр­ ко выраженными цитоплазматическими тяжами и хорошо видимым ядром)» а другой « мезофильными протопластами (зеленые пластиды,мало цито­ плазмы,большая вакуоль) /з/« Источником получения каллусных протопластов могут быть как овежеиндуцированные ( 1-2 п ас с а ж а ),та к и длительно выращиваемые каллусные ткани,предварительно прошедшие 2-3 паооажа на агаризо« ванных или жидких питательных средах в темноте при 25~28°С в ченив 10- 11* дней,Материалом для получения мезофильных протоплас­ тов могут олужить лиотья рас тений,растущих в поле или в теплице, но в этом случае необходима их стерилизация*Более удобны для р а ­ боты листья асептически выращиваемых в вегетативной комнате рас*» 5 тений. Состав питательных сред для культивирования растительного м атериала, а также условия освещенности асептически выращиваемых растений играют существенную роль в процессах ферментативного вы­ деления и способности к клеточному делению полученных протоплас­ тов и обычно подбираются исследователем экспериментальным путем. В к ач естве осмотика при приготовлении ферментных смесей мож­ но использовать 0,45 М раствор маннитола, 0,5 М раствор сахарозы или солевую среду де-5 . Состав среды уг-5: 1. СаС12 в2Н20 - 18,4 г 2 . КаС1 - 9 г, 3. КС1 0 ,4 г 4. глюкоза - I г 5 . Н2 0 - I л Обычно Для получения большого количества протопластов из каллусного материала используют ферментную смесь, приготовленную на основе среды и -5 , а мезофильных - на 0,45 М растворе маннитола или 0 ,5 М с а х а р о з е . Для синхронного выделения каллусных и мезо­ фильных протопластов применяют разные концентрации ферментов, а сам* процесс ферментации проводят при 20-25°С в течение 10-16 ча­ сов в темноте. Выделенные протопласты фильтруют через воронку с капроновой сеткой с диаметром пор 60 -1 0 0 мкм и фильтрат центрифугируют 3-4 шЕ&уты при 500-700 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, бротоИласТы ресуспендируют в 10 мл среды и-5 или 0,45 М растворе ман-* нитола и повторяют процедуру 1-2 р а з а . Иногда необходима очистка протопластов с применением 0,5 М сахарозы, позволяющая в процессе центрифугирования удалить из суспензии протопластов разрушенные клетки и остатки клеточных стенок, препятствующих проведению про­ ц е с с а слияния. Слияние протопластов Индуцированное слияние растительных протопластов проводят обычно по методике "ПЭГ-высокий рН-высокое содержание Са^*". Отмытые от ферментного раствора каллусные и мезофильные протопласты смешивают в соотношении 1:1 или 2:1 в конечном объеме суспензии 1-2 мл. "Густую” суспензию протопластов пипеткой нано­ с я т в чешки Петри диаметром 4 см и оставляют на 10-20 мин для осаждения. Диаметр наносимой капли равен примерно I см. Через 1 0 -2 0 мин к смеси осевших на дно чашки Петри добавляют осторожно сверху или с боков 1-3 капли раствора ПЭГа и выдерживают 5-25 мин. 6 Состав раствора ПЗГа: ~ 2000 мг; 150 мг; 10 мг; 50 г.(можно использовать ПЭГ с м .в . от 2000 до 6000 ) ; 100 мл. 5.Н2 0 Под воздействием раствора ПЭГа происходит слипание и агрега** ция родительских протппластов^оцепленных с дном чашки Петри.Они меняют свою сферическую форму и с л е г к а плазмолизируютоя^о одно временным превращением двух-трёхслойного осадка протопластов в однослойную мс е то ч к у ” . Через 20-25 мин. к препарату, обработанному ПЭГом добавляют буферный раствор (высокий pH - высокое содержание Са^*) по 5 - 6 ка­ пель.Процедуру повторяют через 10 мин. еще дважды.В зависимости от конкретного растительного материала разбавление буферной смесью можно проводить одноразово,добавляя при этом 0 , 5-1 мл. буферной смеси на чашку. І.Глюкоза 2.СаСІ 2Н20 3.КЙ2Р0 ц 4.ПЭГ м .в . 6000- Состав буферной смеси: 1.Натрий-глициновый буфер 2 . Глюкоза Э«ДМС0 (диметилсульфоксид) 4,СаС1 2 в 2Н20 5.Н 20 - 10 мл;у -1200 мг; - 2 мл; -266 мг; - до 20 мл х со с та в: 380 мг. глицина растворить* в 5 0 мл* Н2 0 и довести до 100 мл. 0,1 М раствором ИаОН, pH - 1 0 , 5 . После 30 мин. обработки препарата буферной смесью,раствор ПЗГ-буфер осторожно отбирают пипеткой,не оголяя слоя протопластов и троекратно с интервалом в 5-ГО мин. отмывают питательной средой МО-1 общим объемом 8-10 мл.В дальнейшем смесь гибридных и роди * тельских протопластов культивируют в тонком слое питательной сре ды МО-1 ( I м л .) на рассеянном овету при температуре 25°С Э-10«оуток / 2 , 3, 4 / . Состав питательной среды МО-1: Х.Макро мТ - 250 мл; 2 .Микро МС I мл; 3 « Я®-* хелат - 10 г ; 7 4 «Сахароза ЗвМезоинозитол бвМаннитол 7 . Глюкоза 8 «ВГ - - 10 г ^ 100 мг; 62 г ; 10 г ; 2 мгв, 2 мг; 0,5 мг; 2 мг; 2 мг; 300 мг; 300 мг; 200 мг; 2 мг; I мг; 9 *в б КЗ.Биотин II«Никотиновая кислота 12«Пролин 1 3 . Гидролизат казеина I**.Дрожжевой эк стр а к т 1 5 .Альбумин яичный Гб.Нафтилуксусная кислота 17«Индолилуксусная кислота 1 8*2 ,4 дихлорфенокоиуксусная . кислота I мг; 19.6~бензиламинопурин 1,5 мг; 2 0.3еат и н 0,1 мг; 21 «Вода до I л. pH - 5 , 6 - 5 » 8 . Пропиои приготовления макро N1 и микро МС представлены в /2/«Питательную среду МО-1 стерилизуют фильтрованием через мем ~ бранные фильтры с диаметром пор 0 , 2- 0»4 мкм« Механическая изоляция и культивирование индивидуальных продуктов слияния Пооле проведённого слияния смесь гибридных и родительских протопластов культивируют на богатых органическими компонентами питательных средах до наступления первых делений в гибридных клетках«Обычно гибридные клетки активно делятся на питательных средах,индуцирующих деление каллусных протопластов одного из род и т е л е й ,х о т я подбор оптимальной среды культивирования почти в о е г д а решается эмпирическим путем.За 2-12 часов до начала работ по механическому отлову единичных продуктов слияния культуру прото^ пластов необходимо в 5-ГО раз разбавить свежей питательной орв дой и перенести в чашки Петри диаметром 6 см«Одновременно гото « вят к работе и чашки Купрака.Их внешняя камера заполняется 0,25 М раствором маннитола ( для создания необходимой влажности)«Номер­ ные ячейки внутренней камеры необходимо заполнить питательной средой объемом 0,5 мкл* 8 Непосредственный отбор гибридных делящихся клеток произво­ дят е помощью полуавтоматической микропипетки на I мкл. При помощи инвертированного микроскопа,находящегося непос­ редственно в стерильной камере ламинарного бокса,идентифицируют продукты слияния,претерпевшие 2-3 деления«Продукты слияния имеют морфологию каллусных клеток,но содержат вокруг ядра и частично в цитоплазме зеленые хлоропласти,происходящие от мезофильных прото*** пластов второго родителя.Отлов клеток производят при увеличении 100 *200 , что позволяет быстро вводить кончик наконечника микропи­ петки в поле зрения к гибридной делящейся клетке„После подводки наконечника к клетке начинают медленно вт яги в ать I мкл. среды с данной клеткой.Отобранную клетку помещают в номерную ячейку внут ренней камеры чашки Купрака,осторожно выдавливая плавающую клет­ ку с I мкл, среды,держа при ртом микропипетку вертикально и нб ка­ саясь концом наконечника дна ячейки.В чашке Купрака делящиеся г е терокариоциты культивируют 6-8 дней,после чего необходимо в каж­ дую ячейку добавить по I мкл. свежей среды.Через М -20 дней обра­ зовавшиеся гибридные колонии можно поместить в капли ( І 00-200 м к л .) свежей питательной среды и постепенно (через 5-6 дней) пересадить на среду с пониженной концентрацией осмотика (по схеме 0,45М~0,ЗМ- 0,2 М)> _ Колонии гибридных клеток после 7-дневного роста на жидко.й пи­ тательной среде с 0,2 М осмотиком можно,разделив на 2 части каждый клон,одну часть перенести' на агаризованные питательные среды с цитокининами для индукции о р г а н о г е н е з а ,а клетки другой части ис­ пользовать для цитогенетического анализа с целью изучения числа и морфологии хромосом и д о к а за т е л ь с т в а гибридное ти по клеточному яд РУ; В ряде сл у ч а е в ,в зависимости от использования конкретного растительного м атериала,удается довольно четко идентифицировать гибридные клоны на стадии 10 и более к леток .Т огда операцию по ме­ ханическому -изолированию можно упростить,высаживая отловленные клоны в капли полужидкой среды для культивирования объёмом 30 ~ 50 мкл.Подобные среды готовятся путем добавления к жидкой пита­ тельной среде 0 , 2# агарозы или агара.Миникапли наносят микропп ~ петкой в чашку Петри диаметром і» см. в количестве Ї 0 —15 е д . , п р е д ­ варительно заполнив полужидкой средой боковое пространство по п е ­ риметру для поддержания необходимой влажности.Через 15-20 дней проводят пересадку микроколоний на среды с пониженной концентра­ цией осмотика по схеме,описанной ранее, 9 МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИЙ РАСТЕНИЙ. "«ОКУЛЬТИВИ­ РОВАНИ Е \ ИЛИСТОВЫЕ ДИСКИ"*“ПРЯМОЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ\ • Возникшая сравнительно недавно генетическая инженерия р ас те­ ний приобретает все большее как фундаментальное,так и прикладное значение,В эти исследования вовлекаются все больший круг ученых, В настоящее время у довольно значительного числа растительных видов получены трансгенные растения.Среди них такие хозяйственно цен ные виды как хлопчатник,картоф ель,том аты,рапс, подсолнечник,лю церн а,кл евер /5/*Получены первые сообщения о трансформации видов из семейств злаковых и бобовых,имеющих первостепенное значение для сельскохозяйственной практики. Успехи генной инженерии позволили проклонировать гены как про*- так и эукариот,имеющих важное практическое значение,Это р а з ­ личные гены устойчивости к гербицидам,насекомым,вирусам,Получен­ ные гены были введены в различные виды растений,получена их фено­ типическая экспрессия,Трансгенные растения,имеющие эти гены,в нас­ тоящее время начинают использоваться в селекционной практике, Большое значение имеет генетическая инженерия растений в по­ лучении фундаментальных знаний,Так было показано,что многие физио­ логические реакции рас тений,такие как светорегуляция или ткане специфический синтез белков,опосредуются на уровне промоторов г е ­ н о в,Причем уже расшифрованы нуклеотидные последовательности,несу­ щие эти функции / б/« Достижения генетической инженерии растений были бы невозмож­ ны б ез развития методов введения чужеродной генетической информа­ ции в растительную клетку,Эти методы позволили встраивать гены как прокариотического,так и эукариотического происхождения,но под контролем эукариотических регуляторных элементов,в геном растений и получать стабильную фенотипическую экспрессию.Введённая чужерод­ ная генетическая информация встраивается в геном растений и ста­ бильно наследуется в поколениях как доминантный признак. Методы генетической трансформации растений условно можно раз­ делить на две группы,Первая группа методов ("кокультивирование" и "листовые диски") основана на природной способности почвенных бак­ терий АкгоЪа^ег1ит 1;итеГасЬепз вводить свой генетический мате­ риал в растения / 7 , 8, 10 /.Э т и методы достаточно просты в при менеиии,и у большинства вышеперечисленных культур генетическая 10 трансформация была получена с помощью агробактерий. В то же время они имеют и некоторые о г р а н и ч е н а Так» у-злаковых культур не удалось до сих пор четко доказать'генетическую трансформацию, опосредованную агробактериямн. Кроме того, в с е г д а имеются некото­ рые сложности с элиминацией самих агробактерий, причем некоторые культуры довольно тяжело переносят совместное культивирование с бактериями и часто гибнут* Другая группа методов, к которой относится '’прямой перенос генов” , предполагает физическое преодоление мембранного барьера у Протопластов растений / 9/ , Эти методы обеспечивают абсолютную стерильность, что позволяет надежно тестировать события трансфор­ мации. Они применимы во всех случаях, к о гд а отработана система культивирования растительных протопластов, что» конечно,, наклады­ вает определенные ограничения на эти методы. Таким образом, овладение всем арсеналом приемов и методов генетической трансформации растений позволит исследователю успеш­ но решать поставленные задачи. Предлагаемые вашему вниманию методики разработаны в основном для видов из семейства пасленовых, в частности для т а б а к а , МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ 1. Оборудование:. . - ламинарный бокс'; - инвертированный микроскоп; • - настольная центрифуга, с максимумом ускорения до 1000 g; - источник напряжения до 1000-2000 В с системой ограничения по току, (ЛКБ, Швеция) или специальный прибор для электропорации (ВТХ, США). 2 . Биологический материал: - культура протопластов растений; - стерильные растения; - культура АйгоЬасЪегз-ит 1;итеГас1епз; - плазмидная ДНК, содержащая селективный ген под эу к ар и оти ­ ческим промотором, « 3. Химические реактивы: - ферментные растворы и среды для выделения и к удьтнви рова' иия протопластов по стандартным методикам; - раствор 0,4 М маннитола, содержащий 6 мМ ИёС12 ; - раствор 0,3 М Ме01 2 ; и - pax.; тв op ПЭРа млз» 6000 в 0,4 М мам ни толе; - регенерационная питательная среда R для листьев табака; - питательная среда у та для роста бактерий; - растворы клафорана 20 мг/мл, карбенициллина 20 мг/мл, канамицинсульфата 20 мг/мл. Подробный состав растворов и питательных сред указан ниже. 4. Лабораторная посуда и инструменты, необходимые для работы с протопластами и клетками по стандартным методикам. Все вышепе­ речисленные раствори, материалы, инструменты, з а исключением обо­ рудования, используются стерильными* Метод "листовых д и с к ов** . Для работы используют стерильные растения табакЪ. Листья на­ резаются полосками или дисками диаметром 2-3 мм и помещают на по­ верхность жидкой питательной среды для регенерации r . К этим листьям в тот асе день добавляют свежую ночную культуру агробак терий - примерно I мл на чашку диаметром 100 мм, содержащую 8-10 мл среды. Зараженные листья помещают в термостат и культивируют при 28°С от 2$ до 48 часов* После инкубации листь^ обмывают стериль­ ной водой и высушивают фильтровальной бумагой„ Затем листья пере­ носят на агаризованную питательную регенерационную среду r , с о ­ держащую 500 м г/л клафорана, 500 мг/л карбенициллина и 50 мг/л канамицинсульфата. Примерно через один месяц образуются темнозе­ леные точки, а затем побеги. Образовавшиеся побеги переносят на безгормональную питательную среду с клафораном 200 м г /л , карбенициллином 200 м г/л и канамицинсульфатом 100 м г / л . Укоренившиеся растени я анализируют. В предлагаемом методе мы не используем под­ ложек из клеточных культур других растений, как это описано в ли­ т е ратуре , так как это усложняет процедуру и не д а ет значительного увеличения частоты трансформации. Метод "листовых дисков" прост в работе и позволяет стабильно получать значительные количества генетически трансформированных растений независимого происхождения. В то же время при применении э того метода к другим видам растений необходимо вводить некоторые модификации, связанные о особенностями культивирования i n v i t r o этих видов* Метод кокультивирования протопластов р а с т е ний с A g r obacterium tumefaciene Очищенные протопласты табака переносят в среду для культиви­ рования о 0 , 4 М сахарозой в качестве осмотика. Протопласты инку­ 12 бируют при обычных условиях в течение трех суток до появления первых делений. Затем к ним добавляют свежую ночную культуру аг робсктерий из расчета 100-200 бактерий на протопласт. Совместное кокультивирование продолжается в течение 36-48 часов в термостате при 28°С. В первые часы кокультивирования можно под микроскопом наблюдать прикрепление агробактерий к клеточной стенке п р о то п л а с­ тов. После окончания кокультивирования к культуре протопластов добавляют ферментный раствор, используемый для выделения прото­ пластов, с целью разделения образовавшихся сгустков. Через 2-3 ч аса протопласты отмывают дважды раствором ^5 и переносят в с в е ­ жую питательную среду для дальнейшего культивирования с добавле­ нием 500 м г/л клафорана и 500 мг/л карбенициллина. Протопласты культивируют по стандартным методикам в течение трех-четырех не­ дель. Затем микроколонии переносят на агаризованную питательную среду с клафораном 200 м г/л, карбенициллином 200 мг/л и капам ицинсульфатом 50 м г/л . Продолжающие рост в этих условиях колонии переносят на свежие регенерационные питательные среды с 100 мг/л. канамицинсульфата. Полученные таким образом растения анализируют,. Метод кокультивирования растительных протопластов с агробактериямй в основном имеет ограниченное применение, так как у боль­ шинства растительных видов протопласты с трудом переносят сов­ местное культивирование с бактериями и часто эти эксперименты оканчиваются гибелью культуры. В то же время этот метод позволяет отбирать значительное число трансформантов и в отдельных э к с п е р т ментах частота трансформации достигает 1СГ^~1СГ^. '’Прямой перенос генов" с, помощью электропорации протопл а с т у Очищенные протопласты суспендируют в 0 ,4 М маннитоле, содо$р* жащем 6 мМ Мв012 и 0,1% МЭС буфера pH 5 ,6 , до конечной п л о т н о о т 1 , 2 - 1 ,6 х Ю 6 п р ./м л . К суспензии добавляют 40 мкг ДНК тимуса $Вт* ленка, используемой в качестве носителя. Затем добавляют 0,3) № раствор МбС12 ( 3- 5$ ) так, чтобы сопротивление суспензии было, ^ пределах 1 - 1 ,2 кОм. Вносят 10-15 мкг ДНК плазмиды с геном, опрОг деляющим селектируемый признак. Вся смесь осторожно перемешиваете с я . Пробирку с протопластами помещают на водяную баню 45 С в т е ­ чение 5 мин. Затем быстро охлаждают на ледяной бане до температур ры 20°С. Суспензию осторожно перемешивают в течение 10 мин, а здг тем добавляют 24$ раствор ПЭГа м .в. 6000 в 0 ,4 М маннитоле до* ко*нечной концентрации 8$. Все содержимое тщательно перемешивают*. После 10 мин инкубации смесь переносят в Ячейку для электропора** 13 і\т и прикладывают три импульса электрического тока с напряжен­ ностью 1 - 1 ,2 кВ/ом продолжительностью от І д о 30 мсек, Интервал между импульсами 10 сек , Обычно условия подбираются эмпирически таким образом, чтобы выживаемость протопластов составляла после электропорации 50$. Из камеры для электропорации суспензия прото­ пластов переносят на чашку, инкубируют еще 10 мин, а затем добав­ ляют питательную среду в 10-кратном объеме. Протопласты культиви­ руют по стандартный методикам. Схема отбора трансформантов такая же как и в случае кокультивирования протопластов с аг р о б ак терня­ ми. Отобранные трансформанты подвергают дальнейшему анализу. Генетическая трансформация растений с помощью электропорации протопластов позволяет получать высокую частоту трансформации, в некоторых экспериментах до 10“ ^ от числа выживших протопластов. Метод гарантирует абсолютную стерильность, он незначительно влия­ ет на частоту деления выживших протопластов. Этим методом можно тестировать различные генноинженёрные конструкции с помощью транэиентной экспрессии. В то же время основное ограничение, не по­ зволяющее широко использовать этот метод, касается разработки опособов выделения и культивирования протопластов различных видов растений. Решение этих проблем по всей видимости расширит область применения этого метода. Состав питательш х сред и растворов Ь Питательная среда УТв для выращивания бактерий: і на I л 10 г I г 10 г ,I г 0,25 г 0,25 г гидролизат казеина дрожжевой экстракт глюкоза N ad . MgS04 e7H26 •СаС1 2 #2Н20 •2» Раствор для суспендирования протопластов при электропорации: на 100 мл 7,2 г 0,05 г 0,1 г маннитод MgOlp • МЭС (морфолииоэтансульфоновая кислота) pH -5,6 И Раствор ПЭГа для электропорации. на 100 мл» ПЗГ (полиэтиленгликоль) - 24 г . м ,в . 6000 Манн итол 7 ,2 г* Регенерационная среда (Е ) для "листовых дисков’** на I л* - 100 мл» Макр.о МС I мл * Микро МС 5 мл. 3?е~хелат - 100 мг. Миоинозитол - 10 мг. Витамин Витамин I мг* - 10 г» Сахароза I мг. 6-6 е нз илам инопу рин Нафтилуксусная кислота ОЛ мг pH 5 , 6 - 5 ,8 Прописи приготовления м а к р о и микро МС* ?е~хелата представ лены в / 2 / . ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МИКРОИНЪЕКЦИИ К настоящему времени разработан целый ряд методов генетичес­ кой трансформации высших растений. Наиболее широко применяемые из них ~ использование естественного механизма трансформации Agrob ac te riu m t u m e f a c i e n s ' / 5/ и прямой перенос молекул ДНК в прото­ пласты под действием различных физических и химических агентов / 9 , I I , 12, 13. 1 4 /. Метод генетической трансформации высших растений с помощью микроинъекции разработан впервые в 1985 году одновременно в не­ скольких лабораториях, в том7 числе и в отделе цитофизиблогии и клеточной инженерии Института ботаники им. Н.Г,Холодного АН УССР* К настоящему времени этот способ трансформации пока что не вышел з а рамки чисто методических разработок, хотя потенциальные в о з ­ можности метода, несомненно, очень велики. , Предлагаемый нами метод трансформации с помощью микроинъек­ ции в клетки высших растений /1 Г , 12/ характеризуется рядом прей-' муществ: универсальностью и стандартностью операций, необходимых для трансформации широкого круга объектов-реципиентов (изолиро­ ванные протопласты, единичные каллусные клетки, клетки в составе целого растения, многоклеточные структуры) различным молекулярно­ генетическим материалом (молекулы ДНК, ядра, хлоропласты или ми­ тохондрии), используемым для инъекции, а также высокой эффектив­ ностью трансформации (до 5 0 # ). Важным преимуществом метода, по нашему мнению, является возможность работы с изолированными мик­ роспорами и клетками пыльцы. Относительно низкая производитель­ ность метода микроинъекции (до 50 инъекций в чао) в достаточной степени компенсируется высокой эффективностью трансформации. К недостаткам метода можно отнести необходимость наличия достаточно сложного приборного оборудования. МАТЕРИАЛ.* И ОБОРУДОВАНИЕ I . Основное оборудование: - комплект микроманипуляторов КМ-2 , - микроскоп с неподвижным столиком (типа МБИ-З'или МБИ-9); - бокс для стерильных работ (КПГ- I или УОБГ); - прибор для вытягивания капилляров ГГОК-1 ; - микрокузница MK-I*'. ^ П р о и з в о д с т в о .ЭЗНП АН СССР, г.Черноголовка 16 Материалы: стеклянные трубки диаметром 2-3 см, необходимые для вытяжки капилляров или же готовые капилляры, 2, Материалы, оборудование и химические реактивы, необходи ­ мые для ведения культуры клеток растений i n v i t r o . ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 1. Подготовительные операции: - установка к о м п л е к т манипуляторов КМ-2 и микроскопа в ла минарном боксе, для стерильных работ; - изготовление капилляров диаметром 1-2 мм из стеклянных за готовок диаметром 1-2 см (на приборе ПВК-1); - изготовление микроинструментов - микроиголок с диаметром кончика 1-3 микрометра, микроприсоски диаметром 20-100 микромет­ ров, микропипетки для отбора инъицированных клеток (на приборе MK-I); - подготовка объекта-реципиента (клетки, полученные из про топластов, клетки суспензионной культуры, изолированные микроспо ры) и трансформирующего фактора (ДНК) (по стандартным методикам); - подготовка вспомогательного оборудования, необходимого для проведения опыта (микрокамера для проведения микроинъекции, со­ стоящая из предметного стекла, стеклянных столбиков и наклеенного на них покровного стекла; пипетки для заполнения камеры; вазели­ новое масло); - - силиконизация камеры; - стерилизация микроинструмента и вспомогательных приспособ лений* 2 . Протокол проведения опыта - установка камеры в держатель на предметном столике микро­ скопа; - фиксация микроинструментов в держателях; i . заполнение микроиглы вазелиновым маслом (с помощью гидрай лической системы, состоящей из шприца и тефлоновых трубок); - нанесение в камеру суспензии клеток объемом 1-2 микролит^а (чтобы в камере находилось 15-20 клеток и быстрое заполнение ка­ меры вазелиновым маслом во избежание подсыхания суспензии; - нанесение в другой отсек камеры трансформирующего фактора; в случае введения чужеродной ДНКм- капля раствора ДНК объемом ОД-1 микролитр, в случае использования клеточных органелл - кап­ 17 ля суспензии клеток-доноров, органеллы которых предполагается ис­ пользовать. Все дальнейшие операции производят под визуальным контролем, осуществляемым с помощью микроскопа. - заполнение микроиглы трансформирующим фактором (в случае раствора ДНК - введение кончика микроиглы в каплю с раствором ДНК и набор раствора в кончик микроиглы, в случае клеточных органеллфиксация клетки-донора с помощью микроприсоски, введение в соот­ ветствующий компартмент клетки (ядро или цитоплазма) копчика мик­ роиглы и введение соответствующих органелл в кончик микроиглы; -г фиксация объекта-реципиента с помощью микроприсоски и вв е­ дение в его соответствующий компартмент (ядро или цитоплазма) кончика микроиглы; - введение в объект-реципиент раствора, содержащего транс­ формирующий фактор (заполнение кончика микроиглы раствором транс­ формирующего фактора, равно как и введение раствора в объект-ре­ ципиент,* производят с помощью гидравлической.системы); ’ - после инъецирования всех клеток в данной камере - отлов клеток с помощью микропипетки и перенос их в чашку Петри в микро­ каплю объемом О, 5-Г мкл под слой вазелинового масла. Описанные выше операции выполняются в стерильных условиях. 3. Доказательство события трансформации Инъецированные клетки культивируют в микрокаплях, р а з ­ бавляя их по мере необходимости свежей питательной средой. Полу­ ченные клеточные, линии и растения тестируют на наличие признаков, кодируемых введенными трансформирующими факторами, а также прово­ дят молекулярно-биологические и биохимические анализы. В описанном выше протоколе проведения опыта не указываются конкретные объекты, с которыми производятся манипуляции, посколь­ ку метод микроинъекции достаточно универсален. В зависимости от иопользуемых объектов и целей эксперимента изменяются только п а­ раметры микроинртрументов (диаметр микроприсоски'составляет при­ близительно половину диаметра клетки-реципиента; диаметр кончика микроиглы в случае введения ДНК составляет 0 ,5 -1 микрометр, а в Случае введения клеточных органелл - 2-4 микрометра; диаметр микр^пипетки для отлова инъецированных клеток составляет 1 , 5-2 диа­ метра объектов-реципиентов). Сравнивая технологию генетической трансформации высших рас­ тений с' помощью микроинъекции с другими методами трансформации, 18 можно отметить следующие существенные моменты: 1. Метод трансформации с помощью микроинъекции уступает в технологичности методам прямой трансформации и трансформации» опосредованной A groЪaeteriuml в тех случаях, когда последние при ыенимы. 2 . Метод трансформации с помощью микроинъекции позволяет ре шать ряд задач по трансформации растений, которые невозможно ре­ шить другими методами, например: - трансформация растений, для которых не разработаны методи­ ки выделения, культивирования протопластов и регенерации из них растений и невосприимчивых к инокуляции АБГОЬасЪегЗлШ; - перенос в клетки изолированных клеточных органелл; - использование для трансформации неселектируемых молекул ДНК; - использование в качестве объектов-реципиентов гаплоидных клеток - микроспор, из которых в дальнейшем возможна регенерация гаплоидных растений. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ U Глеба 10.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. - Киев: Наукова думка, 1984. - 160 с , 2» Сидоров В .А ., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Соматичес­ кая гибридизация пасленовых. - Киев: Наукова думка, 1905. 3, Момот В .П ., Околот А.Н ., Череп Н.Н., Скаржинская М.В., Гле­ ба Ю.Ю. Межтрибные гибридные клеточные линии N i c o t i a n a chin e n sis, A t r o p a b e l l a d o n n a , полученные слиянием протопластов / / ДАН СССР. - 1982. - 267, № 4. - С. 959-962. Ч* M e n c z e l Ь . , Nagy F . , K is s Z . , M a lig a P. S tr e p to m y c in r e s i s t a n t end s e n s i t i v e s o m a tic h y b r id s o f N ic o t ia n a tabacum + N ic o t ia n a k n ig h t i a n a : c o r r e l a t i o n and r e s i s t a n c e t o N i c o t ia n a tabacum p la s tid s / / TAG. - 1 9 8 1 . - 5 9 , N 1 . - P . 1 9 1 - 1 9 8 . 5 . S c h e l l J . S t . T r a n s g e n ic p l a n t s a s t o o l t o s tu d y t h e m o le c u la r o r g a n iz a tio n o f p la n t g e n e s / / S c i e n c e . - 1987* - 2 5 7 , N'4819^ - P. 11?6-1182. 6 . W i ll m i t z e r L . The u s e o f t r a n s g e n i c p l a n t s t o s tu d y p l a n t g e n e e x p r e s s io n //T r e n d s in G e n e t ic s .- 1 9 8 8 .- 4 , N 1 . - P. 1 3 -1 8 . 7 . M arton L . , W ullem s G ., M o le n d ijk K . , S c h i l p e r o o r t R. In v i t r o t r a n s f o r m a t io n o f c u l t u r e d c e l l s from N i c o t ia n a tabacum by Ag­ r o b a c te r iu m t u m e f a c i e n s / / N a tu r e . - 1 9 7 9 . - 2 7 7 . - P . 1 2 9 - 1 3 1 . 8 . H o rsch R . , F ry J . , H offm an N ., E i c h o l t z D . , Rogers S . , Fra­ l e y R. A s im p le and g e n e r a l m ethod f o t t r a n s f e r i n g g e n e s i n t o p l a n t s / / S c i e n c e . - 1 9 8 5 . - 272* - P . 1 2 9 9 - 1 2 3 1 . 9» P o t r y c u s I . , S h i l l i t o R . , S a u l М ., P a s z k o w s k i J . D i r e c t g e n e t r a n s f e r . S t a t e o f t h e a r t and f u t u r e p o t e n t i a l / / P la n t M ole­ c u l a r B io lo g y R e p o r t e r . « 1 9 8 5 . - 3 , N 3 . - P . 1 1 7 - 1 2 8 . 10. An G. H ig h -e ffic ie n c y tran sform ation of cu ltu red tobacco c e l l s / / P lan t P h y s io l. - 1985. - 22» N 6 - 568-570. Г1. Мельников П .В ., Пастернак Т .П ., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Мик-’ роинЪекции ДНК в клетки высших растений / / Докл. АН УССР. 1985. - * 10, - С. 69-71. [2. Пастернак Т .П ., Мельников П .В ., Глеба Ю.Ю, и др. Генетическая трансформация клеток высших растений о помощью микроинъекций ДНК / / Изв. АН СССР. - 1986. - * 2. - С. 3IA -3I6. 20 13» C r o ssw a y s A .* O akes J . V . , I r v i n e J.M* a t a l . I n te g r a tio n e i f o r e i g n DM f o l l o w i n g m i c r o i n j e c t i o n o f t o b a c c o m e a o p h y ll p r o t o p l a s t s / / M ol. Gen. G e n e t. - 1 9 8 6 . - 2 0 2 , N 2 . ~ P. 1?9-185. 1 4 . H e u c h a u s G . , S p a n d e n b § r g G.* M i t t e l s t e i n 0 ., Scfaweigex4 T r a n s g e n i c r a p s e d p l a n t s o b t a i n e d by the m i c r o i n d e e t e d of D N A i n t o m i c r o s p o r e - d e v i d e d fctobryoids / / TAG. ' it 1 . - P . 3 0 - 3 6 . - 1987» - ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ......................... . . Слияние растительных рротопластов? неханическая изоляция И культивирование единичных гетерокариоцито^ Нетоды генетической трансформации растений. мКокультивиро««««6". "Листовце диски”* "Пряной переноо генов” Генетическая трансформация о помощью цикроинъекции Спноок литературц . 3 ^ 10 . . • . . 16 ( .................................................................................... 20 Василий Павлович Момот Николай Викторович Кучук Тарас Петрович Пастернак МЕТОДЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ Препринт Утверждено к печати Ученым советом Института ботаники им. Н.Г. Холодного АН УССР .Ф о р м а т Бу ма г а Оф с. еч П одп. к п \печ л - ^ Уч.-изд. л. / печ. офс. Т и раж $£>£>■ З а к ./ - Л М Ц а н а 2 -д /С(Р/1 К иевская кн иж ная типограф ия научной книги. Киев, Р елина, 4
