УДК 576.32/.36 ОСОБЕННОСТИ МЕХАНИЧЕСКИХ И ГЕОМЕТРИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЖИВЫХ ЭРИТРОЦИТОВ, ЗАКРЕПЛЕННЫХ НА ПОЛИЛИЗИНОВОЙ ПОДЛОЖКЕ М.М. Халисов (Университет ИТМО, Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург) Научный руководитель – к.ф.-м.н., доцент А.В. Анкудинов (Университет ИТМО, Физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе, Санкт-Петербург) Введение. Экстремально высокая деформируемость живых эритроцитов затрудняет исследования этих клеток с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) без предварительной отверждающей обработки. В связи с этим, перед АСМ исследованием эритроциты обычно высушивают или фиксируют специальными химическими агентами. Лишь небольшая часть АСМ исследований эритроцитов концентрируется на изучении необработанных, живых клеток [1-4]. Традиционно для иммобилизации живых клеток применяют полилизин. Это вещество создает положительный заряд на подложке, и эритроциты, заряженные отрицательно, притягиваются и прикрепляются к ней, благодаря чему и становится возможным АСМ исследование. Прикрепленное к подложке состояние не естественно для эритроцитов, поэтому можно, например, ожидать, что взаимодействие с подложкой деформирует клетки. Картина воздействия полилизина на эритроциты, однако, все еще далека от ясности, несмотря на ее принципиальную важность для развития АСМ диагностики этих клеток. Цель работы состояла в изучении с помощью оптической микроскопии и АСМ влияния полилизина на морфологию и модуль упругости живых эритроцитов в условиях, максимально приближенных к физиологическим. Базовые положения исследования. Изучались эритроциты крыс линии Wistar, для чего использовался атомно-силовой микроскоп Bruker Bioscope Catalyst, совмещенный с инвертированным оптическим микроскопом. Эритроциты наносили на дно чашки Петри, предварительно обработанное раствором полилизина разной концентрации. Модификация подложки для АСМ исследований осуществлялась раствором полилизина в объемной концентрации 10-3. Клетки исследовались в физиологическом растворе при температуре 37°С в режиме поточечного зондирования АСМ PeakForce QNM, позволяющем одновременно визуализировать топографию поверхности эритроцитов и получать количественную информацию об их локальном модуле Юнга. Использовались стандартные острые АСМ зонды пониженной жесткости Bruker SNL-10 (D). Промежуточные результаты. Прикрепленные к подложке эритроциты выглядели в оптическом микроскопе круглыми и окрашенными на фоне прозрачной подложки. АСМ эксперименты показали, что форма таких клеток отличалась от традиционной дисковидной двояковогнутой, характерной для свободных эритроцитов в жидкости. Эритроциты были сильно распластаны по подложке, имели небольшую высоту и преимущественно плоскую форму. Средний модуль Юнга таких клеток составил 13±9 кПа (n=17). С течением времени некоторые эритроциты теряли оптический контраст и обнаруживались на подложке лишь благодаря слабо заметному в оптический микроскоп контуру. АСМ измерение таких трансформировавшихся эритроцитов показало, что обесцвечивание сопровождается изменением формы с плоской на близкую к полусферической, небольшим уменьшением площади контакта с подложкой, существенным увеличением высоты, а также упрочнением. В среднем, такие клетки демонстрировали модуль Юнга 48±10 кПа (n=6). Обесцвечивание эритроцитов, подобное нашему, наблюдалось также в работе [5]. Авторы связывали результат с лизисом клеток вследствие продолжительного сильного натяжения плазматической мембраны эритроцита, вызванного адгезионным взаимодействием с полилизиновой подложкой. Однако полученные нами АСМ данные свидетельствуют о том, что при описанной трансформации плазматическая мембрана эритроцитов сохраняет свою целостность, а меняются лишь свойства клеток. Основной результат. С помощью оптической микроскопии и АСМ было проведено исследование свойств эритроцитов, прикрепленных к полилизиновой подложке, в условиях, приближенных к физиологическим. Зарегистрированная форма локализованных на полилизине эритроцитов отличалась от стандартной формы здоровых неприкрепленных клеток. Часть эритроцитов со временем резко изменяла свои свойства: клетки становились прозрачными, полусферическими и наблюдался рост их модуля упругости. Таким образом, можно сделать вывод, что продолжительное взаимодействие с полилизином может трансформировать свойства живых эритроцитов. Поэтому необходимо по возможности минимизировать концентрацию полилизина при обработке подложки и сокращать промежуток времени до старта АСМ исследования. 1. 2. 3. 4. 5. Литература Mozhanova, A.A., Nurgazizov, N.I., Bukharaev, A.A. // Proceedings Nizhni Novgorod March 2–5. 2003. P. 266–267 Lekka M., Fornal M., Pyka-Fościak G., Lebed K., Wizner B., Grodzicki T., Styczeń J. // Biorheology. 2005. Vol. 42(4). P. 307-317 Maciaszek J.L., Andemariam B., Lykotrafitis G. // J. Strain Analysis. 2011. Vol. 46 (5). P. 368379. Rebelo L. M., Sousa J. S., Santiago T. M., Mendes Filho J. // Microscopy: advances in scientific research and education. 2014. Vol. 1. P. 141-152. Hategan A., Law R., Kahn S., Discher D.E. // Biophys J. 2003. Vol. 85(4). P. 2746-2759.