ÑÅËÜÑÊÎÕÎÇßÉÑÒÂÅÍÍÀß ÁÈÎËÎÃÈß, 2013, ¹ 4 Ìîëåêóëÿðíàÿ èäåíòèôèêàöèÿ ñòðóêòóðû ìèêðîáèîìîâ ÓÄÊ 579.6/.8:631.46:575.852'1 ÊÎÍÖÅÏÖÈß ÒÀÊÑÎÍÎÌÈ×ÅÑÊÎÃÎ ÏÐÎÑÒÐÀÍÑÒÂÀ È ÈÍÒÅÃÐÀËÜÍÀß ÎÖÅÍÊÀ ÑÄÂÈÃΠ ÑÒÐÓÊÒÓÐÅ ÌÈÊÐÎÁÍÛÕ ÑÎÎÁÙÅÑÒ ÏÎ ÄÀÍÍÛÌ ÀÍÀËÈÇÀ ÁÈÁËÈÎÒÅÊ ÃÅÍÀ 16S-ðÐÍÊ∗ Å.Â. ÏÅÐØÈÍÀ1, À.Ñ. ÄÎËÜÍÈÊ2, À.Ã. ÏÈÍÀÅÂ1, Ê.À. ËÎØÀÊÎÂÀ1, Å.Å. ÀÍÄÐÎÍÎÂ1 Ïðîáëåìà òàêñîíîìè÷åñêîé ñòðóêòóðû è äèíàìèêè ñëîæíûõ ìèêðîáèîìîâ æèâîòíûõ, ÷åëîâåêà, ðàñòåíèé, ïî÷âû — îäíà èç íàèáîëåå èíòðèãóþùèõ â ñîâðåìåííîé ìèêðîáèîëîãèè. Òåõíîëîãèè âûñîêîïðîèçâîäèòåëüíîãî ñåêâåíèðîâàíèÿ ïðè èçó÷åíèè ðàçíîîáðàçèÿ ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ ïî ïîëèìîðôèçìó ãåíîâ 16S-ðÐÍÊ ïîçâîëèëè ñóùåñòâåííî óâåëè÷èòü îáúåìû ïîëó÷àåìûõ ìåòàãåíîìíûõ äàííûõ, îäíàêî èõ êîððåêòíûé àíàëèç è áèîëîãè÷åñêàÿ èíòåðïðåòàöèÿ âûçûâàþò çàòðóäíåíèÿ, â ÷àñòíîñòè â ñâÿçè ñ ýôôåêòîì èçáèðàòåëüíîé àìïëèôèêàöèè ñ óíèâåðñàëüíûìè ïðàéìåðàìè è ñîáñòâåííî àòðèáóòèðîâàíèåì îáðàçöîâ. Äëÿ ðåøåíèÿ îïèñàííûõ ïðîáëåì ìû ñîçäàëè ñïåöèàëüíóþ îïåðàöèîííóþ ñðåäó — òàêñîíîìè÷åñêîå ïðîñòðàíñòâî (ÒÏ), â êîòîðîì ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãåíà 16S-ðÐÍÊ ïðåäñòàâëåíû òî÷êàìè, ãåîìåòðè÷åñêèå ðàññòîÿíèÿ ìåæäó êîòîðûìè ñîîòâåòñòâóþò ãåíåòè÷åñêèì äèñòàíöèÿì ìåæäó ñîîòâåòñòâóþùèìè ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè. Êàðòèðîâàíèå äàííûõ ïî áèîðàçíîîáðàçèþ ãåíà 16S-ðÐÍÊ â ïðåäëàãàåìîì ÒÏ è ïðåäñòàâëåíèå ìèêðîáíîãî ñîîáùåñòâà êàê íàäîðãàíèçìåííîé ñèñòåìû ñ ïðèñóùèìè åé èíòåãðàëüíûìè ïàðàìåòðàìè èìååò ðÿä ïðåèìóùåñòâ ïåðåä òðàäèöèîííûìè ïîäõîäàìè ê îöåíêå áèîðàçíîîáðàçèÿ. Òàê, â ðàìêàõ ÒÏ, ãäå êàæäàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ãåíà 16S-ðÐÍÊ ïîëó÷àåò ñîáñòâåííûé èäåíòèôèêàòîð èç 42 êîîðäèíàò, ìîæíî àíàëèçèðîâàòü íåàòðèáóòèðîâàííûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè â ëþáîé àìïëèêîííîé áèáëèîòåêå. Õîòÿ îïèñàííîå â ðàáîòå ÒÏ â ñòðîãîì ñìûñëå íå ÿâëÿåòñÿ ìíîãîìåðíûì ìàòåìàòè÷åñêèì ïðîñòðàíñòâîì (â ÷àñòíîñòè, îñè ÒÏ âçàèìîçàâèñèìû), ïîëó÷åííûå êðàéíå âûñîêèå êîýôôèöèåíòû êîððåëÿöèè ïîïàðíûõ ãåíåòè÷åñêèõ äèñòàíöèé ìåæäó ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè è èõ ãåîìåòðè÷åñêèìè àíàëîãàìè, áåçóñëîâíî, ñâèäåòåëüñòâóþò â ïîëüçó îáîñíîâàííîñòè ïðèìåíåíèÿ ÒÏ íà ïðàêòèêå. Ðàçâèòèå êîíöåïöèè ÒÏ èìååò áîëüøîå çíà÷åíèå íå òîëüêî ïðè àíàëèçå ñòðóêòóðû ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ, íî è äëÿ èçó÷åíèÿ ýâîëþöèîííîé èñòîðèè ãåíà 16S-ðÐÍÊ. Ïîñêîëüêó ìîäåëü ïîçâîëÿåò äàòü îïèñàíèå ëþáîìó åãî âàðèàíòó (ðåàëèçîâàííîìó è åùå íå ðåàëèçîâàííîìó â õîäå ýâîëþöèè), â åå ðàìêàõ ìîãóò ðåøàòüñÿ âîïðîñû, ñâÿçàííûå ñ ïðîèñõîæäåíèåì è äèâåðãåíòíîé ýâîëþöèåé ïðîêàðèîòíûõ òàêñîíîâ (íàïðèìåð, âîçìîæíî îïðåäåëåíèå ãèïîòåòè÷åñêîãî öåíòðà åãî ïðîèñõîæäåíèÿ, è òîãäà ÒÏ ðåîðãàíèçóåòñÿ â ýâîëþöèîííîå ïðîñòðàíñòâî).  êà÷åñòâå ýêñïåðèìåíòàëüíûõ îáúåêòîâ íàìè èñïîëüçîâàíû ðàçíûå ïî÷âåííûå ìèêðîáèîìû, â òîì ÷èñëå ñìîäåëèðîâàíû èõ èçìåíåíèÿ ïîä âîçäåéñòâèåì óñëîâèé ñðåäû (çàñîëåíèå). Îäíàêî ïðåäëîæåííûé â ðàáîòå ìàòåìàòè÷åñêèé ìåòîä óíèâåðñàëåí è ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí äëÿ èçó÷åíèÿ íå òîëüêî áèîðàçíîîáðàçèÿ ïðîêàðèîò, íî è ñîîáùåñòâ ýóêàðèîòè÷åñêèõ îðãàíèçìîâ (â òîì ÷èñëå æèâîòíûõ è ðàñòåíèé; ïåðñïåêòèâíûì òàêñîíîìè÷åñêèì ìàðêåðîì â ýòîì ñëó÷àå áóäåò ãåí 18S-рРНК). Êëþ÷åâûå ñëîâà: ìèêðîáèîì, ïî÷âà, çàñîëåíèå, 16S ðÐÍÊ, òàêñîíîìè÷åñêîå ïðîñòðàíñòâî. Keywords: microbiom, soil, salinization, 16S rRNA, taxonomic space. Ïðè èññëåäîâàíèè ðàçíîîáðàçèÿ ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ íàèáîëåå ïîïóëÿðåí àíàëèç ïîëèìîðôèçìà ãåíîâ 16S-ðÐÍÊ (1). Òåõíîëîãèè âûñîêîïðîèçâîäèòåëüíîãî ñåêâåíèðîâàíèÿ ïîçâîëèëè çíà÷èòåëüíî óâåëè÷èòü îáúåìû ýêñïåðèìåíòàëüíûõ äàííûõ ïî áèîðàçíîîáðàçèþ, â ðåçóëüòàòå ÷åãî ñòàëî âîçìîæíûì èçó÷åíèå íå òîëüêî ñòðóêòóðû, íî è äèíàìèêè ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ (2, 3). Îäíàêî ýòî ïîñòàâèëî ðÿä ïðîáëåì, ñâÿçàííûõ ñ ïîëó÷åíèåì, àíàëèçîì è áèîëîãè÷åñêîé èíòåðïðåòàöèåé ìåòàãåíîìíûõ äàííûõ (4). Ðàññìîòðèì äâå èç íèõ. Ïåðâàÿ ïðîáëåìà îáóñëîâëåíà ýôôåêòîì èçáèðàòåëüíîé àìïëèôèêàöèè ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé 16S-ðÐÍÊ ïðè ïðîâåäåíèè ìóëüòèìàòðè÷íîé ÏÖÐ ñ óíèâåðñàëüíûìè ïðàéìåðàìè (5, 6). Îñîáåííî ÿðêî îí ïðîÿâëÿåòñÿ ∗ Ðàáîòà ïîääåðæàíà Ìèíèñòåðñòâîì íàóêè è îáðàçîâàíèÿ ÐÔ (ÃÊ ¹ 16.552.11.7047), ãðàíòîì ÐÔÔÈ 1204-01371a è Ïðîãðàììîé ïîääåðæêè ôóíäàìåíòàëüíûõ èññëåäîâàíèé ïî ïðèîðèòåòíûì íàïðàâëåíèÿì Ñàíêò-Ïåòåðáóðãñêîãî ãîñóäàðñòâåííîãî óíèâåðñèòåòà. 76 ïðè èññëåäîâàíèè ìåñòîîáèòàíèé ñ áîëüøîé äîëåé ìèíîðíûõ ãðóïï ìèêðîîðãàíèçìîâ (òàêèõ êàê ïî÷âåííîå ñîîáùåñòâî) è ìîæåò ïðèâåñòè íå òîëüêî ê ÏÖÐ-çàâèñèìûì èñêàæåíèÿì äàííûõ î ñòðóêòóðå ìèêðîáèîìà, íî è ê ïîëíîìó îòñóòñòâèþ ðÿäà íóêëåîòèäíûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé â ÏÖÐ-ïðîäóêòå. Òàê, G.T. Bergmann ñ ñîàâò. (7) ïîêàçàëè, ÷òî èç-çà ñðàâíèòåëüíî ñëàáîãî ñðîäñòâà âñåõ ñîâðåìåííûõ êîíñòðóêöèé óíèâåðñàëüíûõ ïðàéìåðîâ ñ ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè áàêòåðèé èç ôèëû Verrucomicrobia äàííûå ïî îáèëèþ ýòèõ ìèêðîîðãàíèçìîâ â ïî÷âå áûëè äîâîëüíî ñèëüíî çàíèæåíû (7). Íåñìîòðÿ íà òî, ÷òî ïðîáëåìà èçáèðàòåëüíîé ïðàéìåð-çàâèñèìîé àìïëèôèêàöèè ìîëåêóë 16S-ðÐÍÊ â òîé èëè èíîé ñòåïåíè çàòðàãèâàåò ëþáîå ñîâðåìåííîå èññëåäîâàíèå, äî ñèõ ïîð íå áûëî ïðåäëîæåíî ýôôåêòèâíûõ ñïîñîáîâ åå ðåøåíèÿ. Âòîðàÿ ïðîáëåìà ïîÿâëÿåòñÿ ïðè àíàëèçå òàêñîíîìè÷åñêîé ñòðóêòóðû ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ è åå áèîëîãè÷åñêîé èíòåðïðåòàöèè. Îñíîâíàÿ òðóäíîñòü â ñëó÷àå ìåòàãåíîìíûõ äàííûõ ñâÿçàíà ñ âûñîêîé ñòåïåíüþ áèîðàçíîîáðàçèÿ ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ, à òàêæå ñ íàëè÷èåì â èõ ñîñòàâå òàêñîíîìè÷åñêè íå èäåíòèôèöèðóåìûõ ìèêðîîðãàíèçìîâ. Äîëÿ ìèêðîîðãàíèçìîâ, íå èìåþùèõ òàêñîíîìè÷åñêîé õàðàêòåðèñòèêè, íà óðîâíå êàê ðîäà, òàê è áîëåå âûñîêèõ òàêñîíîâ (âïëîòü äî ôèëû) ñîñòàâëÿåò, ïî ðàçíûì îöåíêàì, áîëåå ïîëîâèíû îò îáùåãî ñîñòàâà ìèêðîîðãàíèçìîâ â ñîîáùåñòâå (8). Íàëè÷èå òàêèõ ôîðì íå ïîçâîëÿåò ñðàâíèâàòü ñîñòàâ ìèêðîáèîìîâ â íåçàâèñèìûõ ýêñïåðèìåíòàõ è, â ÷àñòíîñòè, îãðàíè÷èâàåò èñïîëüçîâàíèå ìîëåêóëÿðíûõ ìåòîäîâ â èññëåäîâàíèÿõ, ñâÿçàííûõ ñ àíàëèçîì áîëüøîãî ÷èñëà îáðàçöîâ (ìèêðîáèîëîãè÷åñêîå êàðòèðîâàíèå ïî÷â, ìîíèòîðèíãîâûå èññëåäîâàíèÿ, áèîãåîãðàôèÿ ìèêðîáèîìîâ è äð.). Äëÿ ðåøåíèÿ îïèñàííûõ ïðîáëåì ìû ñîçäàëè ñïåöèàëüíóþ îïåðàöèîííóþ ñðåäó äëÿ ðàáîòû ñ íóêëåîòèäíûìè ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè — òàêñîíîìè÷åñêîå ïðîñòðàíñòâî (ÒÏ) äëÿ ãåíà 16S-ðÐÍÊ. ÒÏ ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ìåòðè÷åñêîå ìíîãîìåðíîé ïðîñòðàíñòâî, â êîòîðîì ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãåíà 16S-ðÐÍÊ ïðåäñòàâëåíû òî÷êàìè, ãåîìåòðè÷åñêèå ðàññòîÿíèÿ ìåæäó êîòîðûìè ñîîòâåòñòâóþò ãåíåòè÷åñêèì äèñòàíöèÿì ìåæäó ñîîòâåòñòâóþùèìè ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè (ïðîöåíò ðàçëè÷àþùèõñÿ íóêëåîòèäíûõ ïîçèöèé). Ïåðâàÿ âåðñèÿ òàêîãî ïðîñòðàíñòâà îïèñàíà ðàíåå (9), íî èñïîëüçîâàííûå òîãäà ìåòîäû åãî ïîñòðîåíèÿ íå ïîçâîëèëè ïîëó÷àòü âûñîêèå êîýôôèöèåíòû êîððåëÿöèè ìåæäó ãåíåòè÷åñêèìè äèñòàíöèÿìè è èõ ãåîìåòðè÷åñêèìè àíàëîãàìè (r ≈ 0,3).  íàñòîÿùåì èññëåäîâàíèè ïðåäëàãàåòñÿ àëüòåðíàòèâíûé ïîäõîä ê ïîñòðîåíèþ òàêñîíîìè÷åñêîãî ïðîñòðàíñòâà (ÒÏ).  ïåðâîé ÷àñòè íàìè áóäåò ïðîäåìîíñòðèðîâàíî èñïîëüçîâàíèå ÒÏ äëÿ îöåíêè ýôôåêòà èçáèðàòåëüíîé ïðàéìåð-çàâèñèìîé àìïëèôèêàöèè â ÏÖÐ íà ïðèìåðå òðåõ ïàð óíèâåðñàëüíûõ ïðàéìåðîâ äëÿ ãåíà 16S-ðÐÍÊ, âî âòîðîé ÒÏ áóäåò èñïîëüçîâàíî äëÿ îöåíêè ñòðóêòóðû è äèíàìèêè ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ (â óñëîâèÿõ çàñîëåíèÿ). Ìåòîäèêà.  êà÷åñòâå ìîäåëè ïðè îöåíêå ýôôåêòà èçáèðàòåëüíîé ïðàéìåð-çàâèñèìîé àìïëèôèêàöèè èñïîëüçîâàëè îáðàçåö äåðíîâî-ïîäçîëèñòîé ïî÷âû, îòîáðàííûé â èþëå 2007 ãîäà âáëèçè ïîñ. Áåëîãîðêà (Ëåíèíãðàäñêàÿ îáë.) èç ãîðèçîíòà À1. Ïðè èññëåäîâàíèè ïðîöåññà ïðèðîäíîãî ïî÷âåííîãî çàñîëåíèÿ ëåòîì 2009 ãîäà ïðîâåëè ýêñïåäèöèþ â ðàéîí ñîëîí÷àêà Øèíãèðëàó (Êàçàõñòàí) è âäîëü ãðàäèåíòà çàñîëåííîñòè îòîáðàëè øåñòü îáðàçöîâ ïî÷âû (Ò1, Ò2, Ò2-3, Ò3, Ò4 è Ò5; ñîäåðæàíèå ñîëåé â Ò1 — 1,23 %, â Ò5 — 0,01 %).  200 êì îò ñîëîí÷àêà áûëè âçÿòû òðè îáðàçöà òèïè÷íîé äëÿ ðåãèîíà òåìíî-êàøòàíîâîé ïî÷âû (îäíà öåëèííàÿ — ÍÖ è 77 äâå çàëåæíûå — ÍÇ è ÍÊ) (10).  îïûòå ïî çàñîëåíèþ â ïî÷âó ñ ó÷àñòêà ÍÊ âíîñèëè ðàñòâîð ñîëåé òàêîãî æå ñîñòàâà, êàê â îáðàçöå Ò1 (íà 100 ã ïî÷âû Cl− — 8 ìM, SO42− — 12 ìM, Na+ — 7 ìM, K+ — 0,5 ìM, Mg2+ — 2,5 ìM, Ca2+ — 10 ìM) äî êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 3 % (w/w). Ñîëè êàëüöèÿ è ñóëüôàòîâ äîáàâëÿëè ðàçäåëüíî. Ýêñïåðèìåíò âûïîëíÿëè â äâóõ òåõíè÷åñêèõ ïîâòîðíîñòÿõ (äëÿ êîíòðîëÿ è îïûòà).  ñîñóäàõ ñ ïî÷âîé ïîääåðæèâàëè ïîñòîÿííóþ âëàæíîñòü (60 % îò ïîëíîé âëàãîåìêîñòè). Ïðîáû îòáèðàëè èç òðåõ ðàâíîóäàëåííûõ äðóã îò äðóãà è îò ñòåíîê ñîñóäà òî÷åê è îáúåäèíÿëè (â ðàâíûõ îáúåìàõ) íà ñòàäèè ÄÍÊ-ýêñòðàêòîâ. ÄÍÊ âûäåëÿëè èç ïî÷âåííîãî îáðàçöà (0,2 ã) ñîãëàñíî îïèñàíèþ (11). Ïðè îöåíêå ýôôåêòà èçáèðàòåëüíîé ïðàéìåð-çàâèñèìîé àìïëèôèêàöèè äëÿ ïîëó÷åíèÿ áèáëèîòåê ãåíà 16S-ðÐÍÊ áûëè âûáðàíû òðè ïàðû óíèâåðñàëüíûõ ïðàéìåðîâ: fD1/rD1 (27f: 5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´, 1525r: 5´-AAGGAGGTGATCCAGCC-3´) (12); fBD1/rBD1 (642f: 5´HAATHYGTGCCAGCAGC-3´, 1445r: 5´-GTCRTCCYDCCTCCTC-3´) (13) è Eu3 (63f* : 5´-AGGCCTAACACATGCAAGTC-3´, 1494r: 5´-TACGGYTACCTTGTTACGAC-3´) (14). Àìïëèôèêàöèþ âûïîëíÿëè ïî ñòàíäàðòíîé ìåòîäèêå (11), ïîëó÷åííûå ôðàãìåíòû êëîíèðîâàëè â âåêòîðå pAL-TA («Åâðîãåí», Ðîññèÿ) ïî ïðîòîêîëó ïðîèçâîäèòåëÿ è èñïîëüçîâàëè êîíñòðóêöèè äëÿ òðàíñôîðìàöèè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê Escherichia coli (DH10B) (15). Äëÿ êàæäîé ïàðû ïðàéìåðîâ áûëà ñîçäàíà áèáëèîòåêà ôðàãìåíòîâ ãåíà 16S-ðÐÍÊ (L1 — Eu3, L2 — fD1/rD1 è L3 — fBD1/rBD1). Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü íóêëåîòèäîâ îïðåäåëÿëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ïðàéìåðà FGPS (485-292) 5´-CAGCAGCCGCGGTAA-3´ (16) â àâòîìàòè÷åñêîì ñåêâåíàòîðå SEQ8000 ñ ïðèìåíåíèåì ðåàãåíòîâ ôèðìû-ïðîèçâîäèòåëÿ («Beckman Culter», ÑØÀ) â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèëàãàåìûì ïðîòîêîëîì. Âûðàâíèâàíèå ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé ïðîâîäèëè â ïðîãðàììå Clustal X, ïîñòðîåíèå ìàòðèö ãåíåòè÷åñêèõ äèñòàíöèé è ôèëîãåíåòè÷åñêîãî äðåâà — â ïðîãðàììå MEGA 5. Òàêñîíîìè÷åñêóþ èäåíòèôèêàöèþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé âûïîëíÿëè íà ñåðâåðå RDPII (17). Äëÿ ïîëó÷åíèÿ áèáëèîòåê ãåíà 16S-ðÐÍÊ ïðè îöåíêå ñòðóêòóðû è äèíàìèêè ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ â óñëîâèÿõ çàñîëåíèÿ àìïëèôèêàöèþ ïðîâîäèëè ñ óíèâåðñàëüíûìè ïðàéìåðàìè F515 è R806 ê âàðèàáåëüíîìó ó÷àñòêó V4 (18). Ïèðîñåêâåíèðîâàíèå àìïëèôèêàòîâ âûïîëíÿëè íà ïðèáîðå GS Junior («Roche», Ðèñ. 1. Ðàñïîëîæåíèå òðåõ ïàð óíèâåðñàëüíûõ ïðàéìåðîâ Øâåéöàðèÿ) ñîãëàñíî ðåîòíîñèòåëüíî íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãåíà 16S- êîìåíäàöèÿì ïðîèçâîäèòåðÐÍÊ Escherichia coli (øòàìì K12). ëÿ. Àíàëèç ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé îñóùåñòâëÿëè â ïðîãðàììå QIIME v. 1.5.0 (19). Èç íóêëåîòèäíûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé óäàëèëè ñëóæåáíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, ïðîâåëè ôèëüòðàöèþ, âûðàâíèâàíèå, ïîñòðîåíèå ìàòðèöû ãåíåòè÷åñêèõ äèñòàíöèé è òàêñîíîìè÷åñêóþ èäåíòèôèêàöèþ ñ èñïîëüçîâàíèåì ïàðàìåòðîâ, óñòàíîâëåííûõ ïî óìîë÷àíèþ. Êëàñòåðíûé àíàëèç îáðàçîâ âûïîëíÿëè ñ èñïîëüçîâàíèåì àëãîðèòìà «unweighted unifrac». Äîñòîâåðíîñòü ðàçëè÷èé îöåíèâàëè ïî t-êðèòåðèþ Ñòüþäåíòà è F78 êðèòåðèþ Ôèøåðà. Ðåçóëüòàòû. À í à ë è ç ò à ê ñ î í î ì è ÷ å ñ ê î ã î ñ î ñ ò à â à à ì ï ë è ê î í í û õ á è á ë è î ò å ê. Áèáëèîòåêè ãåíà 16S-ðÐÍÊ, ïîëó÷åííûå ñ èñïîëüçîâàíèåì ðàçëè÷íûõ êîíñòðóêöèé óíèâåðñàëüíûõ ïðàéìåðîâ. Ëîêàëèçàöèÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé òðåõ ïàð óíèâåðñàëüíûõ ïðàéìåðîâ â ãåíå 16S-ðÐÍÊ, èñïîëüçîâàííûõ äëÿ ïîëó÷åíèÿ áèáëèîòåê, ïðèâåäåíà íà ðèñóíêå 1. Äëÿ àíàëèçà â êàæäîé àìïëèêîííîé áèáëèîòåêå âûáðàëè ïðèìåðíî ðàâíîå ÷èñëî ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé: 33 — èç L1, 29 — èç L2 è 33 — èç L3. Íóêëåîòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè áûëè îòíåñåíû ê áàêòåðèàëüíûì ôèëàì Proteobacteria (32 %), Acidobacteria (26 %), Verrucomicrobia (7 %), Actinobacteria (4 %), Bacteroidetes (3 %), Planctomycetes (3 %), Chlamydiae (3 %) è Firmicutes (2 %) è äåïîíèðîâàíû â GenBank (the National Center for Biotechnology Information — NCBI) ñ ïðèñâîåíèåì èäåíòèôèêàòîðîâ HQ412669-HQ412763. Ðèñ. 2. Ðàñïðåäåëåíèå ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé èç àìïëèêîííûõ áèáëèîòåê L1 ( ), L2 (c) è L3 (c), ïîëó÷åííûõ äëÿ ãåíà 16S-ðÐÍÊ ñ èñïîëüçîâàíèåì ðàçíûõ ïàð óíèâåðñàëüíûõ ïðàéìåðîâ, íà ôèëîãåíåòè÷åñêîì äðåâå: À — ïîñëåäîâàòåëüíîñòè èç ôèëû Proteobacteria, Á — ïîñëåäîâàòåëüíîñòè èç ôèëû Actinobacteria. Ïðè ïîñòðîåíèè ôèëîãåíåòè÷åñêîãî äðåâà áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ïîñëåäîâàòåëüíîñòè èç òðåõ áèáëèîòåê íåðàâíîìåðíî ðàñïðåäåëÿþòñÿ â ïðåäåëàõ îñíîâíûõ ïðîêàðèîòíûõ òàêñîíîâ (ðèñ. 2). Òàê, â ôèëå Proteobacteria îñíîâíóþ ÷àñòü ñîñòàâëÿëè íóêëåîòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè èç áèáëèîòåêè L1. Áîëåå òîãî, ïîäàâëÿþùåå áîëüøèíñòâî èç íèõ ôîðìèðîâàëè êîìïàêòíóþ ãðóïïó, ðîäñòâåííóþ ïîðÿäêó Rhizobiales.  ôèëå Acidobacteria ñëîæèëîñü ïðîòèâîïîëîæíîå ðàñïðåäåëåíèå ñ ïåðåâåñîì â ñòîðîíó ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé èç áèáëèîòåê L2 è L3. Ïðè÷åì ïîñëåäîâàòåëüíîñòè èç L2 êëàñòåðèçîâàëèñü ïðåèìóùåñòâåííî ñ àöèäîáàêòåðèÿìè èç ãðóïï Gp3 è 79 Gp2, à ïîñëåäîâàòåëüíîñòè èç L3 — ñ ãðóïïîé Gp1. Íåðàâíîìåðíîñòü â ðàñïðåäåëåíèè íóêëåîòèäíûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé íàáëþäàëàñü òàêæå äëÿ ôèë Verrucomicrobia è Chlamydiae (òàáë. 1). Ïîëó÷åííûå äàííûå íàãëÿäíî 1. Òàêñîíîìè÷åñêàÿ èäåíòèôèêàöèÿ ïîñëå- äåìîíñòðèðóþò ýôôåêò ïðàéìåðäîâàòåëüíîñòåé ãåíà 16S-ðÐÍÊ ïðè àíà- çàâèñèìîé àìïëèôèêàöèè, êîòîëèçå àìïëèêîííûõ áèáëèîòåê L1, L2 è ðûé ïðîÿâèëñÿ íà óðîâíå ôèë. Îöåíêà ñòðóêòóðû è äèL3, ïîëó÷åííûõ ñ ðàçíûìè ïàðàìè óíèâåðñàëüíûõ ïðàéìåðîâ íàìèêè ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ â óñëîâèÿõ çàñîëåíèÿ. Çàñîëåíèå îòíîÔèëà L1 L2 L3 Proteobacteria 18 8 7 ñÿò ê ÷èñëó íàèáîëåå ìîùíûõ Acidobacteria 4 13 11 ýêîëîãè÷åñêèõ ôàêòîðîâ (20). ÏîäVerrucomicrobia – 1 6 Actinobacteria 4 – – ðîáíî äèíàìèêà ìèêðîáíîãî ñîBacteroidetes 2 – 1 îáùåñòâà ïðè åñòåñòâåííîì çàñîPlanctomycetes – 2 1 ëåíèè îïèñàíà íàìè ðàíåå (10). Chlamydiae – – 3 Firmicutes 2 – – Çäåñü æå ìû îñòàíîâèìñÿ íà êðàòÏ ð è ì å ÷ à í è å. Ïðî÷åðê îçíà÷àåò, ÷òî ïðåäñòàâèòåëü êîì ñðàâíèòåëüíîì àíàëèçå ñòðóêôèëû íå âûÿâëåí. òóðû ñîîáùåñòâ â óñëîâèÿõ åñòåñòâåííîãî è èñêóññòâåííîãî çàñîëåíèÿ. Âî âñåõ ïðîáàõ áûëè âûÿâëåíû ïðåäñòàâèòåëè 21 áàêòåðèàëüíîé ôèëû, ñðåäè êîòîðûõ äîìèíèðîâàëè áàêòåðèè èç ôèë Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria. Ñðàâíèòåëüíûé àíàëèç ïðîöåññîâ åñòåñòâåííîãî è èñêóññòâåííîãî çàñîëåíèÿ âûÿâèë ðÿä îáùèõ îñîáåííîñòåé â èçìåíåíèè ñòðóêòóðû ñîîáùåñòâ.  îáîèõ ñëó÷àÿõ ïðè çàñîëåíèè âîçðàñòàëà äîëÿ áàêòåðèé èç ôèë Firmicutes è Bacteroidetes. Èçìåíåíèÿ êàñàëèñü îäíèõ è òåõ æå ïîðÿäêîâ (Bacillales è Sphingobacteriales) è ñåìåéñòâ (Balneolaceae è Bacillaceae) (ðèñ. 3). Ðèñ. 3. Òàêñîíîìè÷åñêîå ðàçíîîáðàçèå ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ (íà óðîâíå ñåìåéñòâà) â óñëîâèÿõ åñòåñòâåííîãî (À, Ò1-ÍÖ) è èñêóññòâåííîãî (Á, ÍÊ-ÍÊ´) ïî÷âåííîãî çàñîëåíèÿ, îöåíåííîå ïî äàííûì ñåêâåíèðîâàíèÿ àìïëèêîííûõ áèáëèîòåê ãåíà 16S-ðÐÍÊ: Ò1-Ò5 — îáðàçöû ñîëîí÷àêîâîé ïî÷âû, ÍÇ, ÍÖ è ÍÊ — îáðàçöû òåìíî-êàøòàíîâîé ïî÷âû (ÍÖ — öåëèííàÿ, ÍÇ è ÍÊ — çàëåæíûå), ÍÊ´ — îáðàçåö ÍÊ ïîñëå äîáàâëåíèÿ ñîëåé òîãî æå ñîñòàâà, ÷òî â âàðèàíòå Ò1; ÍÀ — ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, íå àòðèáóòèðóåìûå íà óðîâíå ïîðÿäêà. Òàêæå â ñîîáùåñòâàõ ïðîèñõîäèëà çàêîíîìåðíàÿ ñìåíà òèïè÷íûõ ïî÷âåííûõ àêòèíîáàêòåðèé (Rubrobacteriaceae è Solirubrobacteriaceae) íà ãðóïïû àêòèíîáàêòåðèé, áîëåå ïðèñïîñîáëåííûõ ê óñëîâèÿì çàñîëåíèÿ (íå èäåí80 òèôèöèðóåìûõ íà óðîâíå ñåìåéñòâà áàêòåðèé èç êëàññà Actinobacteria â ñëó÷àå åñòåñòâåííîãî çàñîëåíèÿ è áàêòåðèé èç ñåì. Nocardioidaceae è Streptomycetaceae â ñëó÷àå èñêóññòâåííîãî çàñîëåíèÿ (ñì. ðèñ. 3). Íàðÿäó ñ îáùèìè çàêîíîìåðíîñòÿìè â ðàçâèòèè ïðîöåññîâ åñòåñòâåííîãî è èñêóññòâåííîãî çàñîëåíèÿ íàìè áûëè îáíàðóæåíû è ñóùåñòâåííûå ðàçëè÷èÿ. Âíåñåíèå â ïî÷âó ñîëåé âûçâàëî çíà÷èòåëüíîå ñíèæåíèå ðàçíîîáðàçèÿ â ñîîáùåñòâå. Ñîñòàâ ôèë Firmicutes è Bacteroidetes ïî ñóòè îãðàíè÷èâàëñÿ ëèøü äâóìÿ ñåìåéñòâàìè — Bacillaceae è Balneolaceae. Çàñîëåíèå òàêæå ïðèâåëî ê âûðàæåííîìó ñîêðàùåíèþ ÷èñëà ñåìåéñòâ àêòèíîáàêòåðèé (ñì. ðèñ. 3, Á). Íàèáîëåå çàñîëåííûé ó÷àñòîê ñîëîí÷àêà, íàïðîòèâ, õàðàêòåðèçîâàëñÿ áîëüøèì ðàçíîîáðàçèåì ñðåäè ïðåäñòàâèòåëåé íàçâàííûõ ôèë (ñì. ðèñ. 3, À). Íàëè÷èå ñóùåñòâåííûõ ðàçëè÷èé â ñòðóêòóðå ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ äëÿ ñðàâíèâàåìûõ ïðîöåññîâ ïîäòâåðæäàåò òàêæå äåíäðîãðàììà, ãäå îáðàçöû Ò1 è ÍÊ´ íàõîäÿòñÿ â ðàçíûõ êëàñòåðàõ (ðèñ. 4). Ðèñ. 4. Ðåçóëüòàòû êëàñòåðíîãî àíàëèçà ñòðóêòóðû ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ â óñëîâèÿõ åñòåñòâåííîãî è èñêóññòâåííîãî ïî÷âåííîãî çàñîëåíèÿ (ïî äàííûì ñåêâåíèðîâàíèÿ àìïëèêîííûõ áèáëèîòåê ãåíà 16S-ðÐÍÊ): Ò1-Ò5 — îáðàçöû ñîëîí÷àêîâîé ïî÷âû, ÍÇ, ÍÖ è ÍÊ — îáðàçöû òåìíî-êàøòàíîâîé ïî÷âû (ÍÖ — öåëèííàÿ, ÍÇ è ÍÊ — çàëåæíûå), ÍÊ´ — îáðàçåö ÍÊ ïîñëå äîáàâëåíèÿ ñîëåé òîãî æå ñîñòàâà, ÷òî â âàðèàíòå Ò1. Àëãîðèòì êëàñòåðèçàöèè — «unweighted unifrac»; çâåçäî÷êîé îòìå÷åíû êëàñòåðû ñî çíà÷åíèåì äîñòîâåðíîñòè áîëåå 80 %. Ïî ñòðî å íèå òàêñîíîìè÷åñ ê î ã î ï ð î ñ ò ð à í ñ ò â à è â û á î ð îïò è ì à ë ü í î é ñ è ñ ò å ì û ê î î ð ä è í à ò. Äëÿ îöåíêè ýôôåêòà èçáèðàòåëüíîé àìïëèôèêàöèè ìû ïîñòðîèëè ìíîãîìåðíîå ìàòåìàòè÷åñêîå ïðîñòðàíñòâî — òàêñîíîìè÷åñêîå ïðîñòðàíñòâî äëÿ ãåíà 16S-ðÐÍÊ (ÒÏ). Ðàíåå (9) ïîëîæåíèå íóêëåîòèäíûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé â ÒÏ îïðåäåëÿëè â ñèñòåìå êîîðäèíàò ïðàâèëüíîãî ñèìïëåêñà.  íàñòîÿùåé ðàáîòå â êà÷åñòâå êîîðäèíàò ÒÏ èñïîëüçîâàëè ñèñòåìó ðåïåðíûõ òî÷åê — ïîñëå- Ðèñ. 5. Ñõåìà òðàíñôîðìàöèè ãåíåòè÷åñêèõ äèñòàíöèé â òàêñîíîìè÷åñêèå: i, j — íóêëåîòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè 16S-ðÐÍÊ, âõîäÿùèå â ñîñòàâ àíàëèçèðóåìîé àìïëèêîííîé áèáëèîòåêè; À, B, Ñ — íóêëåîòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, âûáðàííûå èç áàçû äàííûõ Ribosomal Database Project (RDP) II äëÿ ïîñòðîåíèÿ òàêñîíîìè÷åñêîãî ïðîñòðàíñòâà (ðåïåðíûå òî÷êè), d — ãåíåòè÷åñêèå äèñòàíöèè ìåæäó íóêëåîòèäíûìè ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè (p-distance — äîëÿ ðàçëè÷àþùèõñÿ íóêëåîòèäíûõ ïîçèöèé â ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿõ, %), di´ — ãåîìåòðè÷åñêèå àíàëîãè ãåíåòè÷åñêèõ äèñòàíöèé). äîâàòåëüíîñòåé ãåíà 16S-ðÐÍÊ ó îòäåëüíûõ ïðåäñòàâèòåëåé êðóïíûõ áàê81 òåðèàëüíûõ è àðõåîòíûõ òàêñîíîâ. Ïîëîæåíèå òî÷êè â ÒÏ çàäàâàëè ïðÿìîé òðàíñôîðìàöèåé ãåíåòè÷åñêèõ äèñòàíöèé (äîëÿ ðàçëè÷àþùèõñÿ íóêëåîòèäíûõ ïîçèöèé, âûðàæåííàÿ â p-distance) îò ðåïåðíûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé â ãåîìåòðè÷åñêèå êîîðäèíàòû. Òàêàÿ ñèñòåìà êîîðäèíàò ïîçâîëèëà ðàññ÷èòàòü ãåîìåòðè÷åñêèå àíàëîãè (dij´) äëÿ ãåíåòè÷åñêèõ äèñòàíöèé (dij) (ðèñ. 5). Ðèñ. 6. Çàâèñèìîñòü ñðåäíèõ çíà÷åíèé êîýôôèöèåíòà êîððåëÿöèè îò ÷èñëà âûáðàííûõ «êîîðäèíàòíûõ îñåé» — ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé ãåíà 16S-ðÐÍÊ (âñåãî 107) ñ ðàçíîé ïðåäñòàâëåííîñòüþ ñðåäè îñíîâíûõ áàêòåðèàëüíûõ è àðõåîòíûõ ôèë. Äëÿ ôîðìèðîâàíèÿ îïòèìàëüíîãî íàáîðà êîîðäèíàò ÒÏ èç íàèáîëåå êðóïíîé íà ñåãîäíÿøíèé äåíü áàçû äàííûõ ïî ãåíó 16S-ðÐÍÊ — Ribosomal Database Project II îòîáðàëè 107 ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé ïî êðèòåðèþ ïðåäñòàâëåííîñòè ñðåäè îñíîâíûõ áàêòåðèàëüíûõ è àðõåîòíûõ ôèë. Çàòåì âû÷èñëèëè êîýôôèöèåíòû êîððåëÿöèè (ãåîìåòðè÷åñêèå ðàññòîÿíèÿ) ìåæäó ìàòðèöàìè ãåíåòè÷åñêèõ äèñòàíöèé (dij) è èõ ðàññ÷èòàííûõ â ÒÏ àíàëîãîâ (dij´) äëÿ âñåõ âîçìîæíûõ íàáîðîâ êîîðäèíàò (Ñn107, ãäå n = 2, …, 107). Î÷åíü âûñîêîå ñîîòâåòñòâèå dij è dij´ íàáëþäàëîñü ïðè ñðàâíèòåëüíî íåáîëüøîì ÷èñëå êîîðäèíàò — îò 20 äî 45 (ðèñ. 6). Äëÿ äàëüíåéøèõ ïîñòðîåíèé èñïîëüçîâàëè 42 ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ñ íàèëó÷øèìè çíà÷åíèÿìè r. Âûáðàííûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè áûëè ðàâíîìåðíî ðàñïðåäåëåíû ìåæäó 23 áàêòåðèàëüíûìè è 2 àðõåîòíûìè ôèëàìè, ïðè ýòîì èõ çíà÷èòåëüíàÿ äîëÿ ïðèíàäëåæàëà ê íàèáîëåå êðóïíûì áàêòåðèàëüíûì ôèëàì: Proteobacteria (7 ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé), Firmicutes (4 ïîñëåäîâàòåëüíîñòè), Actinobacteria (3 ïîñëåäîâàòåëüíîñòè) è Acidobacteria (3 ïîñëåäîâàòåëüíîñòè).  ñïèñîê òàêæå âîøëè ïðåäñòàâèòåëè ôèë Bacteroidetes, Chlamydiae, Deinococcus-Thermus, Nitrospirae, Spirochaetes, Thermotogae, Chlorobi, Chloroflexi, Cyanobacteria, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Planctomycetes, Verrucomicrobia, OP10, TM7, WS3, SR1, Euryarchaeota, Korarchaeota. È ñ ñ ë å ä î â à í è å à ì ï ë è ê î í í û õ á è á ë è î ò å ê â ÒÏ. Îöåíêà ýôôåêòà èçáèðàòåëüíîé ïðàéìåð-çàâèñèìîé àìïëèôèêàöèè.  ïîñòðîåííîì òàêèì îáðàçîì ÒÏ àìïëèêîííûå áèáëèîòåêè L1, L2 è L3 áóäóò ïðåäñòàâëåíû â âèäå «îáëàêîâ òî÷åê», à ýôôåêò èçáèðàòåëüíîé àìïëèôèêàöèè âûðàçèòñÿ â ðàçëè÷èÿõ ýòèõ îáëàêîâ ïî ôîðìå è ïîëîæåíèþ â çàâèñèìîñòè îò âàðèàíòà óíèâåðñàëüíûõ ïðàéìåðîâ. Ïðè ÷èñëåííîé îöåíêå ýôôåêòà èçáèðàòåëüíîé àìïëèôèêàöèè âûáðàëè íàèáîëåå ïðîñòûå ïàðàìåòðû, îïèñûâàþùèå âçàèìíîå ðàñïîëîæåíèå è ãåîìåòðèþ àìïëèêîííûõ áèáëèîòåê â ÒÏ, — öåíòðàëüíóþ òî÷êó (èìååò ñðåäíèå êîîðäèíàòû ïî êàæäîé èç êîîðäèíàòíûõ îñåé) è äèñïåðñèþ (ìåðà ðàçáðîñà òî÷åê îòíîñèòåëüíî öåíòðà). Äëÿ õàðàêòåðèñòèêè ðàçëè÷èé â ïîëîæåíèè àìïëèêîííûõ áèáëèîòåê â ÒÏ îïðåäåëèëè ðàññòîÿíèå ìåæäó âñåìè ïàðàìè öåíòðàëüíûõ òî÷åê. Âñå îáíàðóæåííûå íàìè ðàçëè÷èÿ â ãåîìåòðèè àìïëèêîííûõ áèáëèîòåê áûëè ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíû ñîãëàñíî êðèòåðèÿì Ñòüþäåíòà è Ôèøåðà. Äëÿ ïàðû L1-L2 d = 0,09, t = 30, f = 33, äëÿ ïàðû L1-L3 d = 0,10, t = 34, f = 36, äëÿ ïàðû L2-L3 d = 0,07, t = 24, f = 29, ãäå d — ðàññòîÿíèå ìåæäó öåíòðàëüíûìè òî÷êàìè àìïëèêîííûõ áèáëèîòåê, t — ÷èñëî îñåé ñ äîñòîâåðíûìè ðàçëè÷èÿìè â êîîðäèíàòàõ öåíòðàëüíîé òî÷êè (ïî t-êðèòåðèþ Ñòüþäåíòà), f — ÷èñëî îñåé ñ äîñòîâåðíûìè ðàçëè÷èÿìè â äèñïåðñèè (ïî F-êðèòåðèþ Ôèøåðà). Òî åñòü ðàññòîÿíèÿ ìåæäó öåíòðàëüíûìè 82 òî÷êàìè áèáëèîòåê ñâèäåòåëüñòâîâàëè â ïîëüçó ñõîäñòâà äëÿ L2 è L3 è èõ 2. Ìàêñèìàëüíûå ñìåùåíèÿ êî- ïðèíöèïèàëüíîãî îòëè÷èÿ îò L1. Èíûîðäèíàò öåíòðàëüíîé òî÷êè ïî ìè ñëîâàìè, óíèâåðñàëüíûå ïðàéìåðû îñÿì â ïàðàõ àìïëèêîííûõ áèá- D1 è BD1 ïî ñðàâíåíèþ ñ Eu3 â öåëîì ëèîòåê ãåíà 16S-ðÐÍÊ äëÿ ñõîäíûì îáðàçîì îïèñûâàëè ñòðóêòóðó ðàçíûõ ðîäîâ áàêòåðèé àíàëèçèðóåìîãî ìèêðîáíîãî ñîîáùåñòâà. Ðîä (L1-L2) (L1-L3) (L2-L3) Òàêîé âûâîä äîïîëíèòåëüíî ïîäêðåïëÿEubacterium 0,011 0,019 0,007 åòñÿ èñòîðèåé èõ ñîçäàíèÿ. Èçâåñòíî, Acidimicrobium 0,000 0,016 0,016 ÷òî ïðàéìåðû fD1/rD1 íà÷àëè èñïîëüParachlamydia 0,007 0,018 0,011 Simkania 0,006 0,015 0,009 çîâàòü äëÿ àíàëèçà ìèêðîáíîãî ðàçíîîáHolophaga 0,039 0,041 0,002 ðàçèÿ îäíèìè èç ïåðâûõ (12). Èõ àíàëîAcidobacteria 0,033 0,004 0,029 Xiphinematobacter 0,014 0,033 0,020 ãàìè (ñ ó÷åòîì çíà÷èòåëüíûõ èçìåíåíèé, Korarchaeota NA 0,011 0,007 0,018 ïðîèçîøåäøèõ â áàçàõ äàííûõ çà áîëåå Thermotoga 0,015 0,009 0,007 Roseomonas 0,006 0,021 0,015 ÷åì äåñÿòèëåòíèé ïåðèîä) ñòàëè ïðàéCaulobacter 0,040 0,044 0,004 ìåðû fBD1/rBD1 (13). Ïðàéìåðû Eu3 Sinorhizobium 0,045 0,048 0,003 Azotobacter 0,004 0,019 0,015 ïîâñåìåñòíî ïðèìåíÿþòñÿ ïðè T-RFLP Campylobacter 0,008 0,020 0,011 Ï ð è ì å ÷ à í è å. Èñïîëüçîâàííûå ïðè ïî- (terminal restriction fragment length polyëó÷åíèè áèáëèîòåê L1, L2 è L3 ïàðû óíèâåð- morphism) àíàëèçå ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ ñàëüíûõ ïðàéìåðîâ ñì. â ðàçäåëå «Ìåòîäèêà». (14), íî èõ îñîáåííîñòü ñîñòîèò â ñóùåñòâåííîì ïåðåâåñå â èñïîëüçîâàííûõ ïðè êîíñòðóèðîâàíèè ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé â ñòîðîíó ïðîòåîáàêòåðèé (21). Âîçìîæíî, èìåííî ïîýòîìó ïðè àíàëèçå ñåêâåíèðîâàííûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé èç áèáëèîòåêè Eu3 áûëî îáíàðóæåíî áîëüøîå ÷èñëî ãåíîâ 16S-ðÐÍÊ ðèçîáèé — òèïè÷íûõ ïðåäñòàâèòåëåé ýòîé ôèëû. Ñ öåëüþ áîëåå äåòàëüíîãî àíàëèçà 3. Ðàññòîÿíèÿ (d) ìåæäó öåíòðàëüíûìè òî÷êàìè àìïëèêîí- ðàçëè÷èé â ñòðóêòóðå áèáëèîòåê áûëà ïîíûõ áèáëèîòåê ãåíà 16S-ðÐÍÊ, ñòðîåíà òàáëèöà ñìåùåíèé êîîðäèíàò ïîëó÷åííûìè äëÿ ðàçíûõ ïî÷- öåíòðàëüíîé òî÷êè ïî îñÿì (ñìåùåíèå âåííûõ îáðàçöîâ â óñëîâèÿõ ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ðàçíîñòü äâóõ êîîðåñòåñòâåííîãî çàñîëåíèÿ äèíàò öåíòðàëüíûõ òî÷åê). Íàèáîëüøèå ñìåùåíèÿ íàáëþäàëèñü äëÿ áèáëèîòåêè Îáðàçåö d Îáðàçåö d Ò1—Ò2 0,07 Ò2-3—Ò4 0,11 L1 â ôèëå Proteobacteria (êîîðäèíàòû SiÒ1—Ò2-3 0,15 Ò2-3—Ò5 0,01 norhizobium è Caulobacter), íàèìåíüøèå — â Ò1—Ò3 0,08 Ò2-3—ÍÖ 0,09 Ò1—Ò4 0,08 Ò2-3—ÍÇ 0,12 ïàðå L2-L3 (çäåñü ìàêñèìóì îòìå÷àëè Ò1—Ò5 0,07 Ò3—Ò4 0,05 äëÿ äâóõ ðîäîâ àöèäîáàêòåðèé — XiphiÒ1—ÍÖà 0,19 Ò3—Ò5 0,09 Ò1—ÍÇ 0,07 Ò3—ÍÖ 0,13 nematobacter è Acidobacteria NA) (òàáë. 2). Ò2—Ò2-3 0,10 Ò3—ÍÇ 0,07 Âñå îáíàðóæåííûå òî÷êè ñìåùåíèÿ õîÒ2—Ò3 0,05 Ò4—Ò5 0,05 Ò2—Ò4 0,04 Ò4—ÍÖ 0,15 ðîøî ñîîòâåòñòâóþò äàííûì, ïîëó÷åííûì Ò2—Ò5 0,06 Ò4—ÍÇ 0,02 ñ èñïîëüçîâàíèåì òðàäèöèîííîãî ïîäõîÒ2—ÍÖ 0,16 Ò5—ÍÖ 0,17 Ò2—ÍÇ 0,04 Ò5—ÍÇ 0,03 äà (ïîñòðîåíèå ôèëîãåíåòè÷åñêîãî äðåâà), Ò2-3—Ò3 0,10 ÍÖ—ÍÇ 0,17 ãäå òàêæå áûëî ïîêàçàíî, ÷òî îñíîâíûå Ï ð è ì å ÷ à í è å. Ò1-Ò5 — îáðàçöû ñîëîíðàçëè÷èÿ â ñòðóêòóðå àìïëèêîííûõ áèá÷àêîâîé ïî÷âû, ÍÇ è ÍÖ — îáðàçöû òåìíîêàøòàíîâîé ïî÷âû (ÍÖ — öåëèííàÿ, ÍÇ — ëèîòåê ñâÿçàíû ñ ôèëàìè Proteobacteria çàëåæíàÿ); èíäåêñîì (à) îòìå÷åíî íàèáîëüøåå è Acidobacteria (ñì. ðèñ. 2, òàáë. 1). çíà÷åíèå ïîêàçàòåëÿ. Îïèñàíèå èñïîëüçîâàííûõ óíèâåðñàëüíûõ ïðàéìåðîâ ñì. â ðàçäåëå Îöåíêà ñòðóêòóðû è äèíàìèêè «Ìåòîäèêà». ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ â óñëîâèÿõ çàñîëåíèÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì èíòåãðàëüíûõ ïàðàìåòðîâ ÒÏ. Êàê è â ñëó÷àå àìïëèêîííûõ áèáëèîòåê L1, L2 è L3, àìïëèêîííûå áèáëèîòåêè, õàðàêòåðèçóþùèå ïðîöåññ åñòåñòâåííîãî è èñêóññòâåííîãî çàñîëåíèÿ â ÒÏ áóäóò ïðåäñòàâëåíû â âèäå «îáëàêîâ òî÷åê».  ýòîì ñëó÷àå èõ âçàèìíîå ðàñïîëîæåíèå â ÒÏ (ðàññòîÿíèå ìåæäó öåíòðàëüíûìè òî÷êàìè) ñëóæèò ìåðîé ñõîäñòâà èëè ðàçëè÷èÿ â ñòðóêòóðå ñîîáùåñòâ. Ïðè ðàñ÷åòå òàêèõ ðàññòîÿíèé ìåæäó 83 âñåìè ïàðàìè â óñëîâèÿõ åñòåñòâåííîãî çàñîëåíèÿ áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ìàêñèìàëüíûõ çíà÷åíèé íàçâàííûé ïàðàìåòð äîñòèãàåò ïðè ñðàâíåíèè îáðàçöà èç íàèáîëåå çàñîëåííîãî ó÷àñòêà ñîëîí÷àêà (Ò1) ñ íåçàñîëåííîé ïî÷âîé (ÍÖ) (òàáë. 3). Ïðîèçâåäåííûå âû÷èñëåíèÿ äèñïåðñèè òî÷åê îòíîñèòåëüíî öåíòðàëüíîé òî÷êè è ñðàâíåíèå ïàðàìåòðîâ ñðåäíåãî è äèñïåðñèè ñ èñïîëüçîâàíèåì êðèòåðèåâ Ñòüþäåíòà è Ôèøåðà ïîêàçàëè, ÷òî íàáëþäàåìûå â ÒÏ ðàçëè÷èÿ äîñòîâåðíû. Ïîýòîìó ìû ìîæåì èñïîëüçîâàòü ÒÏ ïðè èçó÷åíèè äèíàìèêè ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ. Äëÿ åå îïèñàíèÿ áûëè ââåäåíû ïàðàìåòðû âåêòîðà ñìåùåíèÿ (ïîêàçûâàþùåãî íàïðàâëåíèå ñóêöåññèè) è óãëà ìåæäó âåêòîðàìè ñìåùåíèÿ (ìåðû ñõîäñòâà ïðîöåññîâ ñóêöåññèè, ïðîèñõîäÿùåé â ðàçëè÷íûõ ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâàõ). Íàïðàâëåíèå âåêòîðà ñìåùåíèÿ äëÿ ñîîáùåñòâà îïðåäåëÿåòñÿ ðàçíèöåé êîîðäèíàò åãî íà÷àëüíîé è êîíå÷íîé òî÷åê (öåíòðàëüíûõ òî÷åê ñîîáùåñòâ), ìîäóëü âåêòîðà ðàâåí ðàññòîÿíèþ ìåæäó öåíòðàëüíûìè òî÷êàìè, óãîë ìåæäó âåêòîðàìè ðàññ÷èòûâàåòñÿ ïî ôîðìóëå ñêàëÿðíîãî ïðîèçâåäåíèÿ âåêòîðîâ. Ïðè àíàëèçå ïðîöåññîâ ïî÷âåííîãî çàñîëåíèÿ â ÒÏ ïîñòðîèëè òðè âåêòîðà: ÍÖ→Ò1, ÍÇ→Ò1 (ðàçâèòèå åñòåñòâåííîãî çàñîëåíèÿ) è ÍÊ→ÍÊ´ (ðàçâèòèå èñêóññòâåííîãî çàñîëåíèÿ) (ðèñ. 7). À Á Ðèñ. 7. Îïðåäåëåíèå èíòåãðàëüíûõ õàðàêòåðèñòèê ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ â òàêñîíîìè÷åñêîì ïðîñòðàíñòâå (öåíòðàëüíûå òî÷êè è óãëû ìåæäó âåêòîðàìè ñìåùåíèÿ äëÿ ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ), ïîñòðîåííîì íà îñíîâàíèè àìïëèêîííûõ áèáëèîòåê ãåíà 16S-pÐÍÊ, äëÿ óñëîâèé åñòåñòâåííîãî (À) è èñêóññòâåííîãî (Á) çàñîëåíèÿ: Ò1, ÍÇ, ÍÖ, ÍÊ, ÍÊ´ — ñîîòâåòñòâåííî îáðàçöû ïî÷âû ñîëîí÷àêîâîé, òåìíî-êàøòàíîâîé (ÍÖ — öåëèííàÿ, ÍÇ è ÍÊ — çàëåæíûå), ÍÊ´ — îáðàçåö ÍÊ ïîñëå äîáàâëåíèÿ ñîëåé òîãî æå ñîñòàâà, ÷òî â âàðèàíòå Ò1. PC1, PC2 — êîîðäèíàòû ïðîåêöèè ñ ìàêñèìàëüíûìè ðàçëè÷èÿìè â ðàñïîëîæåíèè ñðàâíèâàåìûõ ñîâîêóïíîñòåé òî÷åê. Ïðè àíàëèçå óãëîâ ìåæäó âåêòîðàìè â óñëîâèÿõ åñòåñòâåííîãî è èñêóññòâåííîãî ïî÷âåííîãî çàñîëåíèÿ îêàçàëîñü, ÷òî èñêîìûå çíà÷åíèÿ ëåæàò â ïðåäåëàõ ñåêòîðà 90° (42° äëÿ ïàðû ÍÊ→ÍÊ´/ÍÖ→Ò1 è 73° — äëÿ ÍÊ→ÍÊ´/ÍÇ→Ò1). Ñ ó÷åòîì ïðåäïîëîæåíèÿ, ÷òî óãîë â ýòîé ñèñòåìå âàðüèðóåò îò 0° (ïîëíîñòüþ ñõîäíîå ðàçâèòèå ñîîáùåñòâ) äî 180° (äèàìåòðàëüíî ïðîòèâîïîëîæíûå èçìåíåíèÿ â ñòðóêòóðå ñîîáùåñòâ), ïîëó÷åííûå íàìè äàííûå ñâèäåòåëüñòâóþò â ïîëüçó íàëè÷èÿ ñõîäíûõ ïàòòåðíîâ â ðàçâèòèè èññëåäóåìûõ ñîîáùåñòâ. Òàêîé ðåçóëüòàò õîðîøî ñîãëàñóåòñÿ ñ ïîëó÷åííûì íàìè ðàíåå ïðè ñðàâíèòåëüíîì àíàëèçå òàêñîíîìè÷åñêîé ñòðóêòóðû ìåòàãåíîìà, ãäå, íàðÿäó ñ âûÿâëåííûìè ñóùåñòâåííûìè ðàçëè÷èÿìè, 84 â çàñîëåííûõ îáðàçöàõ îòìå÷àëîñü ïîÿâëåíèå áàêòåðèé, ïðèíàäëåæàùèõ ê îäíèì è òåì æå ïîðÿäêàì è ñåìåéñòâàì. Âàæíî ïîä÷åðêíóòü, ÷òî òåíäåíöèè, íàáëþäàåìûå ïðè ñóêöåññèè â ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâàõ, ñòàíîâÿòñÿ î÷åâèäíûìè òîëüêî ïðè ïîäðîáíîì àíàëèçå èõ òàêñîíîìè÷åñêîé ñòðóêòóðû è íå ìîãóò áûòü âûâåäåíû íà îñíîâàíèè ðåçóëüòàòîâ òðàäèöèîííî èñïîëüçóåìîãî äëÿ ðåøåíèÿ ïîäîáíûõ çàäà÷ êëàñòåðíîãî àíàëèçà. Èñïîëüçîâàíèå âåêòîðîâ ñìåùåíèÿ èìååò è ðÿä äðóãèõ ïðåèìóùåñòâ ïåðåä òðàäèöèîííûìè ìåòîäàìè, ñðåäè êîòîðûõ óïðîùåíèå ïðîöåäóðû àíàëèçà äèíàìèêè ñîîáùåñòâ, âîçìîæíîñòü åå ñîïîñòàâëåíèÿ ó ðàçëè÷íûõ ïî ïðèðîäå ñîîáùåñòâ è ðàíæèðîâàíèÿ ýêîëîãè÷åñêèõ ôàêòîðîâ ïî ñèëå èõ âîçäåéñòâèÿ íà ñîîáùåñòâî. Ïîíÿòíî, ÷òî ïî ðåçóëüòàòàì îäíîãî èññëåäîâàíèÿ íåâîçìîæíî îäíîçíà÷íî òðàêòîâàòü çíà÷åíèÿ óãëîâ ìåæäó âåêòîðàìè ðàçâèòèÿ ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ. Äëÿ áîëåå òî÷íîé îöåíêè íóæíî âûïîëíèòü ðÿä èññëåäîâàíèé, â êîòîðûõ íåîáõîäèìî ïðîàíàëèçèðîâàòü ôàêòîðû ïî âîçäåéñòâèþ íà ìèêðîáíîå ñîîáùåñòâî: âûäåëèòü ôàêòîðû, îêàçûâàþùèå ïðîòèâîïîëîæíîå è îäíîíàïðàâëåííîå äåéñòâèå, ðàçäåëèòü ôàêòîðû ïî ñèëå âîçäåéñòâèÿ íà ìèêðîáíîå ñîîáùåñòâî, ïðîâåñòè ñîïîñòàâëåíèå âåëè÷èíû óãëà ñ òîé èëè èíîé ñèëîé âîçäåéñòâèÿ ýêîëîãè÷åñêîãî ôàêòîðà è ò.ä. Î÷åâèäíî, ÷òî óñïåõ ïðåäñòàâëåííîé â íàñòîÿùåé ðàáîòå âåðñèè ÒÏ ñâÿçàí ñ ïåðåáîðîì âñåâîçìîæíûõ êîìáèíàöèé èç ìíîæåñòâà «êîîðäèíàòíûõ îñåé». Òàê, áûëî ïîêàçàíî, ÷òî âûñîêèõ êîýôôèöèåíòîâ êîððåëÿöèè ìîæíî äîñòè÷ü ëèøü ïðè èñïîëüçîâàíèè íåñêîëüêèõ äåñÿòêîâ êîîðäèíàò, â òî âðåìÿ êàê ïðåäûäóùàÿ âåðñèÿ ÒÏ (9) îïåðèðîâàëà ëèøü 13 òî÷êàìè îòñ÷åòà. Òàêèì îáðàçîì, ïðåäëîæåííàÿ àëüòåðíàòèâíàÿ ìîäåëü ïîçâîëèëà âûÿâèòü îñíîâíóþ ïðîáëåìó, âîçíèêàþùóþ ïðè êîíñòðóèðîâàíèè ÒÏ — ïðîáëåìó ðàçìåðíîñòè. Ïî âñåé âèäèìîñòè, â äàëüíåéøèõ ðàáîòàõ íåîáõîäèì ïîèñê îïðåäåëåííîãî êîìïðîìèññà ìåæäó îïèñàííûìè ìîäåëÿìè. Èòàê, ìû ïîêàçàëè âîçìîæíîñòü èñïîëüçîâàíèÿ êîíöåïöèè òàêñîíîìè÷åñêîãî ïðîñòðàíñòâà (ÒÏ) ïðè ðåøåíèè ïðîáëåì, ñâÿçàííûõ ñ èçáèðàòåëüíîé ïðàéìåð-çàâèñèìîé àìïëèôèêàöèåé ãåíà 16S-ðÐÍÊ è èçó÷åíèåì òàêñîíîìè÷åñêîé ñòðóêòóðû ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ. Êàðòèðîâàíèå äàííûõ ïî áèîðàçíîîáðàçèþ ãåíà 16S-ðÐÍÊ â ÒÏ è ïðåäñòàâëåíèå ìèêðîáíîãî ñîîáùåñòâà êàê íàäîðãàíèçìåííîé ñèñòåìû ñ ïðèñóùèìè åé èíòåãðàëüíûìè ïàðàìåòðàìè íå òîëüêî äîïîëíÿåò òðàäèöèîííûå ïîäõîäû ê îöåíêå áèîðàçíîîáðàçèÿ, íî è èìååò ïåðåä íèìè ðÿä ïðåèìóùåñòâ. Íàïðèìåð, â ðàìêàõ êîíöåïöèè ÒÏ ðàçðåøàåòñÿ íàèáîëåå àêòóàëüíûé íà ñåãîäíÿøíèé äåíü âîïðîñ î íåàòðèáóòèðîâàííûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿõ, ïîñêîëüêó â ÒÏ êàæäàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ãåíà 16S-ðÐÍÊ ïîëó÷àåò ñîáñòâåííûé èäåíòèôèêàòîð, ïðåäñòàâëåííûé íàáîðîì èç 42 êîîðäèíàò, ÷òî ïîçâîëÿåò îáíàðóæèòü åå â ëþáîé àìïëèêîííîé áèáëèîòåêå. Ìû ïîëíîñòüþ îòäàåì ñåáå îò÷åò â òîì, ÷òî îïèñàííîå â ðàáîòå ÒÏ íå ÿâëÿåòñÿ â ñòðîãîì ñìûñëå ìíîãîìåðíûì ìàòåìàòè÷åñêèì ïðîñòðàíñòâîì (â ÷àñòíîñòè, îñè ÒÏ âçàèìîçàâèñèìû). Òåì íå ìåíåå, â èññëåäîâàíèè áûëè ïîëó÷åíû êðàéíå âûñîêèå êîýôôèöèåíòû êîððåëÿöèè ïîïàðíûõ ãåíåòè÷åñêèõ äèñòàíöèé ìåæäó ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè ñ èõ ãåîìåòðè÷åñêèìè àíàëîãàìè, ÷òî, áåçóñëîâíî, ñâèäåòåëüñòâóåò â ïîëüçó êîíöåïöèè ÒÏ. Î÷åâèäíî, ÷òî óñïåõ ïðåäñòàâëåííîé çäåñü âåðñèè ÒÏ ñâÿçàí ñ ïåðåáîðîì âñåâîçìîæíûõ êîìáèíàöèé èç ìíîæåñòâà «êîîðäèíàòíûõ îñåé». Ïðîäåìîíñòðèðîâàíî, ÷òî âûñîêèõ êîýôôèöèåíòîâ êîððåëÿöèè óäàåòñÿ äîñòè÷ü ëèøü ïðè èñïîëüçîâàíèè íåñêîëüêèõ äåñÿòêîâ êîîðäèíàò, ÷òî óêàçûâàåò íà ïðîáëåìó ðàçìåðíîñòè êàê îñíîâíóþ ïðè êîíñòðóèðîâàíèè ÒÏ. Äàëüíåéøåå ðàçâèòèå êîíöåïöèè ÒÏ 85 èìååò áîëüøîå çíà÷åíèå íå òîëüêî äëÿ àíàëèçà ñòðóêòóðû ìèêðîáíûõ ñîîáùåñòâ, íî è äëÿ èçó÷åíèÿ ýâîëþöèîííîé èñòîðèè ãåíà 16S-ðÐÍÊ. Ïîñêîëüêó ìîäåëü ïîçâîëÿåò äàòü îïèñàíèå ëþáîìó âàðèàíòó åãî ñòðóêòóðû (âêëþ÷àÿ êàê ýâîëþöèîííî ðåàëèçîâàííûå, òàê è åùå íå ðåàëèçîâàííûå), â åå ðàìêàõ ìîãóò îáñóæäàòüñÿ âîïðîñû, ñâÿçàííûå ñ ïðîèñõîæäåíèåì è äèâåðãåíòíîé ýâîëþöèåé íå òîëüêî ïðîêàðèîò, íî òàêæå îäíîêëåòî÷íûõ è ìíîãîêëåòî÷íûõ ýóêàðèîò (ïðè èñïîëüçîâàíèè ãåíà 18S-ðÐÍÊ äëÿ ïîñòðîåíèÿ ÒÏ) (íàïðèìåð, âîçìîæíî îïðåäåëåíèå ãèïîòåòè÷åñêîãî öåíòðà ïðîèñõîæäåíèÿ òàêñîíà).  ïîñëåäíåì ñëó÷àå ÒÏ ìîæåò áûòü ðåîðãàíèçîâàíî â ýâîëþöèîííîå ïðîñòðàíñòâî. ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 86 T r i n g e S.G., H u g e n h o l t z P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr. Opin. Microbiol., 2008, 5(11): 442-446. L a u b e r C.L., H a m a d y M., K n i g h t R., F i e r e r N. Pyrosequencing-based assessment of soil pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale. Appl. Environ. Microbiol., 2009, 15(75): 5111-5120. L o m b a r d N., P r e s t a t E., E l s a s J.D.V., S i m o n e t P. Soil-specific limitations for access and analysis of soil microbial communities by metagenomics. FEMS Microbiol. Ecol., 2011, 78: 31-49. H u n t e r C.I., M i t c h e l l A., J o n e s P., M c A n u l l a C., P e s s e a t S., S c h e r e m e t j e w M., H u n t e r S. Metagenomic analysis: the challenge of the data bonanza. Briefings in Bioinformatics, 2012, 6(13): 743-746. A c i n a s S.G., S a r m a - R u p a v t a r m R., K l e p a c - C e r a j V., P o l z M. PCR-induced sequence artifacts and bias: insights from comparison of two 16S rRNA clone libraries constructed from the same sample. Appl. Environ. Microbiol., 2005, 71(12): 8966-8969. S i p o s R., S z é k e l y A.J., P a l a t i n s z k y M., R é v é s z S., M á r i a l i g e t i K., N i k o l a u s z M. Effect of primer mismatch, annealing temperature and PCR cycle number on 16S rRNA gene-targeting bacterial community analysis. FEMS Microbiol. Ecol., 2007, 2(60): 341-350. B e r g m a n n G.T., B a t e s S.T., E i l e r s K.G., L a u b e r C.L., C a p o r a s o J.G., W a l t e r s W.A., K n i g h t R., F i e r e r N. The under-recognized dominance of Verrucomicrobia in soil bacterial communities. Soil Biol. Biochem., 2011, 43: 1450-1455. S u l W.J., C o l e J.R., J e s u s E.C., W a n g Q., F a r r i s R., F i s h J.A., T i e d j e J.M. Bacterial community comparisons by taxonomy-supervised analysis independent of sequence alignment and clustering. PNAS USA, 2011, 108(35): 14637-14642. Ä î ë ü í è ê À.Ñ., Ò à ì à ç ÿ í Ã.Ñ., Ï å ð ø è í à Å.Â.,  ÿ ò ê è í à Ê.Â., Ï î ð î ç î â Þ.Á., Ï è í à å â À.Ã., À í ä ð î í î â Å.Å. Êîíöåïöèÿ óíèâåðñàëüíîé òàêñîíîìè÷åñêîé ñèñòåìû áàêòåðèé: ýâîëþöèîííîå ïðîñòðàíñòâî ãåíà 16S ðÐÍÊ v. 1.0. Ñåëüñêîõîçÿéñòâåííàÿ áèîëîãèÿ, 2012, 5: 112-120. Ï å ð ø è í à Å.Â., Ò à ì à ç ÿ í Ã.Ñ., Ä î ë ü í è ê À.Ñ., Ï è í à å â À.Ã., Ñ å ð ã à ë è å â Í.Õ., À í ä ð î í î â Å.Å. Èçó÷åíèå ñòðóêòóðû ìèêðîáíîãî ñîîáùåñòâà çàñîëåííûõ ïî÷â ñ èñïîëüçîâàíèåì âûñîêîïðîèçâîäèòåëüíîãî ñåêâåíèðîâàíèÿ. Ýêîëîãè÷åñêàÿ ãåíåòèêà, 2012, 2: 31-38. À í ä ð î í î â Å.Å., Ï å ò ð î â à Ñ.Í., × è æ å â ñ ê à ÿ Å.Ï., Ê î ð î ñ ò è ê Å.Â., À õ ò å ì î â à Ã.À., Ï è í à å â À.Ã. Âëèÿíèå âíåñåíèÿ ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííîãî øòàììà Sinorhizobium meliloti ACH-5 íà ñòðóêòóðó ïî÷âåííîãî ñîîáùåñòâà ìèêðîîðãàíèçìîâ. Ìèêðîáèîëîãèÿ, 2009, 4(78): 525-534. W e i s b u r g W.G., B a r n s S.M., P e l l e t i e r D.A., L a n e D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bbacteriology, 1991, 2(173): 697-703. Ê î ð î ñ ò è ê Å.Â., Ï è í à å â À.Ã., À í ä ð î í î â Å.Å. Óíèâåðñàëüíûå 16SðÐÍÊ ïðàéìåðû BD1 äëÿ îïèñàíèÿ ãåíåòè÷åñêîãî ðàçíîîáðàçèÿ ñîîáùåñòâà ïî÷âåííûõ ïðîêàðèîò. Ýêîëîãè÷åñêàÿ ãåíåòèêà, 2006, 4: 32-37. S i n g h B., N a z a r i e s L., M u n r o S., A n d e r s o n I., C a m p b e l l C. Use of multiplex terminal restriction fragment length polymorphism for rapid and simultaneous analysis of different components of the soil microbial community. Appl. Environ. Microbiol., 2006, 72: 7278-7285. Ì à í è à ò è ñ Ò., Ô ð è ÷ Ý., Ñ ý ì á ð ó ê Äæ. Ìåòîäû ãåíåòè÷åñêîé èíæåíåðèè. Ìîëåêóëÿðíîå êëîíèðîâàíèå. Ì., 1984. N o r m a n d P., O r s o S., C o u r n o y e r B. Molecular phylogeny of the genus Frankia and related genera and emendation of the family Frankiaceae. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46: 1-9. W a n g Q., G a r r i t y G.M., T i e d j e J.M., C o l e J.R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Appl. Environ. Micro- biol., 2007, 73(16): 5261-5267. 18. B a t e s S.T., B e r g - L y o n s D., C a p o r a s o J.G., W a l t e r s W.A., K n i g h t R., F i e r e r N. Examining the global distribution of dominant archaeal populations in soil. ISME J., 2010, 5: 908-917. 19. C a p o r a s o J.G., K u c z y n s k i J., S t o m b a u g h J., B i t t i n g e r K., B u s h m a n F.D., C o s t e l l o E.K., F i e r e r N., P e ñ a A.G., G o o d r i c h J.K., G o r d o n J.I., H u t t l e y G.A., K e l l e y S.T., K n i g h t s D., K o e n i g J.E., L e y R.E., L o z u p o n e C.A., M c D o n a l d D., M u e g g e B.D., P i r r u n g M., R e e d e r J., S e v i n s k y J.R., T u r n b a u g h P.J., W a l t e r s W.A., W i d m a n n J., Y a t s u n e n k o T., Z a n e v e l d J., K n i g h t R. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods, 2010, 7(5): 335-336. 20. L o z u p o n e C.A., K n i g h t R. Global patterns in bacterial diversity. PNAS USA, 2007, 27(104): 11436-11440. 21. M a r c h e s i J.R., S a t o T., W e i g h t m a n A.J. M a r t i n T.A., F r y J.C., H i o m S.J., W a d e W.G. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64: 795-799. 1ÃÍÓ Âñåðîññèéñêèé ÍÈÈ ñåëüñêîõîçÿéñòâåííîé ìèêðîáèîëîãèè Ðîññåëüõîçàêàäåìèè, Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 25 ñåíòÿáðÿ 2012 ãîäà 196608 ã. Ñàíêò-Ïåòåðáóðã, Ïóøêèí-8, ø. Ïîäáåëüñêîãî, 3, e-mail: eeandr@gmail.com; 2Ñàíêò-Ïåòåðáóðãñêèé ãîñóäàðñòâåííûé óíèâåðñèòåò, 199034 ã. Ñàíêò-Ïåòåðáóðã, Ñòàðûé Ïåòåðãîô, Óíèâåðñèòåòñêèé ïðîñï., 28, e-mail: alexander.dolnik@gmail.com THE CONCEPT OF TAXONOMIC SPACE AND INTEGRAL ESTIMATES OF SHIFT IN THE STRUCTURE OF MICROBIAL COMMUNITY BASED ON ANALYSIS OF 16S rRNA GENE LIBRARIES E.V. Pershina1, A.S. Dol’nik2, A.G. Pinaev1, K.A. Loshakova1, E.E. Andronov1 Summary The problem of taxonomic structure and dynamics of soil, plant animal and human microbiomes is one of the most intriguing in modern microbiology. High Performance Technologies sequencing of the 16S rRNA gene allows to get much more metagenomic data, but their correct analysis and biological interpretation are still complicated, in particular with regard to the effect of selective amplification with universal primers and proper attribution of the samples. To resolve the problems, we created a special operating environment, the taxonomic space (TS), in which the sequences of 16S rRNA gene are represented by dots, geometric distance between which corresponds to the genetic distance between the sequences. Mapping the 16S-rRNA gene biodiversity data in this TS and evaluation of the microbial community as overorganism, with its integral parameters, have a number of advantages if compared to the traditional approaches. Thus, in the TS where each sequence of the 16S rRNA gene gets its own identifier of the 42 coordinates, the unattributed amplicons in any PCR-library can be analyzed. Although the described TS is not strictly a multi-dimensional mathematical space, in particular, its axes are interdependent, an extremely high correlation coefficients, obtained for genetic distances between sequences and their geometric counterparts, unconditionally, testify in favor of the validity of the use of TS in practice. The development of TS concept is of great importance not only in the analysis of the structure of microbial communities, but also in imvestigation of 16S rRNA genes evolution. Since the model allows to give a description for any variant, both realized and not yet realized in evolution, the issues related to the origin and divergent evolution of prokaryotes may be investigated, for example, the hypothetical center of origin can be determine, and then the TS will become an evolutionary space. As a model, we used different soil microbiomes in which the changes were induced by environmental conditions (salinity), both natural and simulated. However, the application of this approach can be extended to other complex microbiomes, particularly the microbiota in animals. Moreover, the proposed mathematical method is universal and can be used to study not only biodiversity in prokaryotes, but also the communities of eukaryotic organisms, including animals and plants, with the 18S rRNA gene as a taxonomic marker. Íîâûå êíèãè Á ð î ä ñ ê è é À.Ê. Áèîðàçíîîáðàçèå. Ì.: èçäâî «Àêàäåìèÿ», 2012, 208 ñ. Èçëîæåíû òåîðåòè÷åñêèå îñíîâû è ìåòîäû ðåøåíèÿ íàó÷íûõ è ïðàêòè÷åñêèõ çàäà÷ èçó÷åíèÿ è ñîõðàíåíèÿ áèîðàçíîîáðàçèÿ. Áîëüøîå âíèìàíèå óäåëÿåòñÿ âèäîâîìó, ãåíå- òè÷åñêîìó è ýêîñèñòåìíîìó óðîâíÿì ðàçíîîáðàçèÿ. Ðàññìîòðåíû îñíîâíûå ìåòîäû îöåíêè ñîñòîÿíèÿ è äèíàìèêè áèîðàçíîîáðàçèÿ, â òîì ÷èñëå ïðè ëîêàëüíûõ è ãëîáàëüíûõ èçìåíåíèÿõ ñðåäû; ìåæäóíàðîäíûå ïðîãðàììû è íàöèîíàëüíàÿ ñòðàòåãèÿ èçó÷åíèÿ è ñîõðàíåíèÿ áèîðàçíîîáðàçèÿ. 87