Взаимосвязь структуры и биологической активности
реклама
На правах рукописи Соколова Екатерина Владимировна Взаимосвязь структуры и биологической активности каррагинанов красных водорослей Японского моря 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2012 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН Научные руководители: д.х.н., с.н.с. Ермак И.М. д.б.н. Богданович Л.Н. Официальные оппоненты: Звягинцева Т.Н., д.х.н., профессор, ТИБОХ ДВО РАН, зав. лабораторией. Попов С.В., д.б.н., доцент, Институт физиологии Коми НЦ, УРО РАН, зав. отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение наук Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН, Владивосток Защита состоится «29» марта 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН (690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159). С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст автореферата размещен на официальном сайте ВАК и на сайте совета www.piboc.dvo.ru Автореферат разослан « » февраля 2012 г. Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Черников Олег Викторович 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Каррагинаны – Сульфатированные полисахариды красных водорослей, в основе химической структуры которых находится дисахаридное повторяющееся звено, состоящее из остатков Dгалактозы, соединенных регулярно чередующимися β-1-4 и α-1-3 глликозидными связями. Структурное разнообразие каррагинанов обусловлено присутствием -(1-4) остатка в виде 3,6-ангидрогалактозы, а также количеством и местоположением сульфатных групп в моносахаридных остатках (Knutsen, 1994). Регулярные полисахариды, полимерная цепь которых построена из повторяющихся дисахаридных звеньев одного типа, получили собственное название. Природные каррагинаны редко соответствуют регулярным структурам, чаще они содержат повторяющиеся звенья нескольких типов и представлены нерегулярной или гибридной структурой, что объясняется многоступенчатым биосинтезом полисахаридов в клеточной стенке водорослей. Вариабельность первичной структуры каррагинанов обуславливает многообразие их макромолекулярной организации и определяет широкий спектр их биологической активности (Yermak, Khotimchenko, 2003). В то же время биологические свойства этих полисахаридов, как и их надмолекулярная структура, изучаются в основном на коммерческих образцах, представленных каппа- и лямбда-типами каррагинанов. Всестороннее изучение каррагинанов красных водорослей дальневосточных морей позволит оценить влияние различных уровней структурной организации полисахаридов на их физиологическую активность. Среди разнообразных биологических свойств сульфатированных полисахаридов наибольший интерес в настоящее время привлекают противовирусная, антикоагулирующая, иммуномодулирующая, противоопухолевая, противоязвенная активности. Сульфатированные полисахариды взаимодействуют со множеством протеинов клеток эукариот и оказывают на иммунный ответ организма разнонаправленное действие, как ингибирующее, так и стимулирующее (Stephanie et al., 2010), что позволяет рассматривать каррагинаны в качестве возможных иммуномодуляторов. В последнее время появились данные об антиоксидантной активности полисахаридов морских водорослей (Yuan, Walsh, 2006, Zhang et al., 2010, Costa et al., 2010). Среди сульфатированных полисахаридов продолжается поиск веществ, проявляющих выраженное антитромбическое действие, не вызывающее кровотечение (Melo et al., 2004, Mestechkina, Shcherbukhin, 2010, Jiao et al. 2011, Pomin 2010). Однако данные о влиянии структурных особенностей и молекулярной массы полисахаридов на активацию тромбоцитов, играющих основную роль в системе первичного гемостаза организма, немногочисленны. Каррагинаны, используемые как загустители и стабилизаторы различных пищевых продуктов, относятся к растворимым пищевым волокнам (ПВ) и внесены в список пищевых продуктов (Food and Drugs, 2008). ПВ – пищевые волокна; АСМ – атомно-силовая микроскопия; БАД – биологически активная добавка; ИЛ – интерлейкин; ФНОα – фактор некроза опухоли α; G – 3-β-D-галактоза; D – 4-α-Dгалактоза; DA – 4-3,6-ангидро-D-галактоза; S – сульфатная группа; ЛПС – липополисахарид; АФК – активные формы кислорода; ком. – коммерческий; FRAP – железо-восстанавливающая способность (от англ. ferric reducing antioxidant capacity); ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания; ИБС – ишемическая болезнь сердца; КА – коэффициент атерогенности; ХС – холестерин; ХС-ЛПНП – холестерин липопротеинов низкой плотности; ХС-ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотности; ТГ – триглицериды; СРБ – С-реактивный белок; СD3+ – Т-лимфоциты; CD4+ – Т-хелперы+ + + + + индукторы; CD8 – Т-цитотоксические лимфоциты; ИРИ – CD4 /CD8 ; CD22 – В-лимфоциты; CD16 – + NK-клетки (нормальные киллеры); CD25 – лимфоциты (рецептор к ИЛ2, активированные 4 Известно, что недостаток ПВ в рационе человека способствует возникновению многих желудочно-кишечных, метаболических и сердечнососудистых нарушений (Galisteo et al., 2008). В случае сердечно-сосудистых заболеваний ПВ способны понижать риск их развития посредством улучшения липидных показателей крови (Brown et al., 1999, Castro et al., 2005). Кроме того, ПВ находятся в тесном контакте с лимфоидной тканью, связанной с кишечником, которая составляет значительную часть общей иммунной системы организма. Хотя известно, что ПВ, в частности полисахариды, могут модулировать различные звенья иммунитета, способность ПВ влиять на иммунную систему организма остается недостаточно исследованной. В связи с этим весьма актуальным является изучение возможности использования каррагинана как источника ПВ в комплексной терапии пациентов с различными заболеваниями. Цель работы: изучить влияние структуры каррагинанов, выделенных из красных водорослей Японского моря семейств Tichocarpaceae и Gigartinaceae, на их биологическую активность и экспериментально обосновать возможности использования этих полисахаридов в медицинской практике. Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи: 1. определить физико-химические характеристики и изучить макромолекулярную организацию различных типов каррагинанов; 2. исследовать иммуномодулирующую активность каррагинанов в моделях ex vivo; 3. изучить антиоксидантные свойства каррагинанов в экспериментах in vitro; 4. определить антитромботическое действие каррагинанов; 5. оценить возможность использования БАД «Каррагинан-ДВ» в комплексной терапии пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Научная новизна работы. Впервые методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) изучена надмолекулярная структура каррагинанов, выделенных из красных водорослей семейств Tichocarpaceae и Gigartinaceae. Установлена избирательность иммуномодулирующего действия отдельных структурных типов каррагинанов и показана их потенциальная антиоксидантная активность. Исследованы антитромботические свойства каррагинанов, и впервые показано, что они ингибируют коллагениндуцированную агрегацию тромбоцитов, снижая активацию этих клеток с участием гликопротеина VI. Практическая значимость работы. Показано, что БАД «КаррагинанДВ», рекомендованный в качестве дополнительного источника пищевых волокон и использованный в комплексной терапии пациентов с сердечнососудистыми нарушениями, способствует нормализации параметров липидного обмена, снижению уровня маркеров хронического воспалительного процесса и положительной динамике ряда показателей иммунного статуса. Основные положения, выносимые на защиту. Каррагинаны – каппа, лямбда, каппа/бета, икс и каппа/йота – выделенные из красных водорослей семейств Tichocarpaceae и Gigartinaceae, являются высокомолекулярными сульфатированными полисахаридами (М.м. от 147 до 527 kDa) с различной надмолекулярной структурой. Методом АСМ выявлены особенности лимфоциты); CD95+ – лимфоциты (активированные лимфоциты, маркер аппоптоза); ФЧ – фагоцитарное число; ФИ – фагоцитарный индекс; ФАН – фагоцитарная активность нейтрофилов; ИЗФ – индекс завершенности фагоцитоза; Ig – иммуноглобулин, НМ - низкомолекулярный. 5 макромолекулярной организации каррагинанов, обусловленные как нерегулярностью структуры, так и степенью сульфатирования полисахаридов. Все каррагинаны обладают иммуномодулирующей активностью, индуцируя в концентрационной зависимости синтез цитокинов, активацию лимфоцитов, активность макрофагов. Степень проявления этой активности зависит от структуры полисахаридов. Каппа/бета-каррагинан обладает избирательным действием в отношении индукции синтеза про- (ИЛ-6 и ФНОα) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10). Антиоксидантные свойства каррагинанов проявляются в способности перехватывать оксид азота, гидроксил радикал, супероксид анион и определяются структурными особенностями полисахаридов. Каррагинаны обладают антитромботическим действием, понижая скорость коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов и ингибируя адгезию этих клеток, опосредованную коллагеновым рецептором тромбоцитов – гликопротеином VI. Эффект антикоагулирующего действия каррагинанов зависит от молекулярной массы и степени сульфатирования полисахарида. БАД «Каррагинан-ДВ» может быть рекомендован в комплексной терапии пациентов с ИБС. Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены автором в виде устных докладов на следующих конференциях: «9th International Marine Biotechnology Conference» (Qingdao, China, 2010); «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine» (Санкт-Петербург, Россия, 2011); «Russian-Indian Symposium on Glycosciences» (Москва, Россия, 2011). Публикации. Всего 14 работ, из них по теме диссертации 12 публикаций, в том числе статей, опубликованных в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК – 5, тезисов в материалах научных конференций – 7. Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела молекулярной иммунологии ТИБОХ ДВО РАН 26 декабря 2011 года. Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН в соответствии с плановой темой НИР «Изучение структуры и иммунобиологических свойств макромолекул и их комплексов, включенных в патогенез наиболее распространенных и социально значимых бактериальных инфекций» (№ гос. рег. 01.2.00 951069, научный руководитель – д.х.н. Т.Ф. Соловьева). Работа поддержана грантами: Президиума РАН - «Фундаментальные науки – медицине» (руководитель д.х.н. И.М. Ермак) и «Молекулярная и клеточная биология» (руководитель к.б.н. В.А. Рассказов); интеграционным грантом ДВО - УРО РАН (руководитель д.х.н. И.М. Ермак) и грантами ДВО РАН (руководитель аспирантка Е.В. Соколова). Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в совместной работе с сотрудниками лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН и сотрудниками МО ДВО РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 256 источников. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста. Автор выражает искреннюю благодарность своим руководителям д.х.н. Ермак И.М. и д.б.н. Богданович Л.Н. за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы и безграничное терпение; к.х.н. Барабановой А.О. за 6 любезное предоставление образцов каррагинанов, используемых в работе, к.х.н. Давыдовой В.Н. и к.б.н. Аминину Д.Л. за практические помощь в определении иммуномодулирующей активности; к.х.н. Горбач В.И. и к.х.н. Назаренко Е.Л. за практическую помощь при проведении исследований; Калитник А.А. за любезное предоставление НМ производного каппакаррагинана, д.х.н. Соловьевой, к.х.н. Хоменко В.А. и всем сотрудникам ЛМОАБИ. Особую благодарность автор выражает член-корреспондент РАН Васьковскому В.Е. и д.х.н. Лукьянову за тщательный критический анализ текста диссертации и автореферата. Автор также выражает благодарность сотрудникам МО ДВО РАН: главному врачу к.м.н. Крыжановскому С.П. и заведующей диспансерным отделением терапевту Ивановой Т.Б., оказавшим неоценимую помощью в проведении клинических исследований, и особую признательность врачу-лаборанту Сергеевой Н.В. за помощь в проведении работы с биологическим материалом; а также сотрудникам ИАПУ ДВО РАН к.ф.-м.н. Чусовитину Е.А. и Балагану С.А. за эксперименты с использованием АСМ. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Образцы каррагинанов, используемых в работе. В работе использованы пять структурных типов каррагинанов, как с регулярной, так и нерегулярной гибридной структурой. Каррагинаны были выделены из красных водорослей семейства Gigartinaceae и Tichocarpaceae, собранных в Японском море (залив Петра Великого, м. Фальшивый). Выделение каррагинанов и установление их химической структуры было проведено ранее в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН (Yermak et al., 1999, 2006, Barabanova et al., 2008, Барабанова и др., 2005). Структуры повторяющихся дисахаридных звеньев исследуемых каррагинанов представлены в Таблице 1. Таблица 1. Структуры повторяющихся дисахаридных звеньев каррагинанов красных водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae. Вид водоросли Тип каррагинана C. armatus T. crinitus C. armatus C. pinnulatus T. crinitus HO CH2OH лямбда икс каппа каппа/йота каппа/бета HO O O CH2OH OH G Структура повторяющегося звена 3-β-D-галактопиранозное звено 4-α-D-галактозное звено G2S D2S, 6S G2S, 4S DA G4S DA G4S/G4S DA/DA2S G4S/G DA/DA O OH HO CH2OH O O O O O O OH D G DA OH Примечание: G – 1,3-β-D-галактоза; D – 1,4-α-D-галактоза; DA – 1,4-3,6-ангидро-Dгалактоза; S – сульфатная группа. Порфиран был выделен из красной водоросли Porphyra tenera и любезно предоставлен профессором Йонг Хван Кимом (Кионги Университет, Республика Корея). Этот полисахарид относится к ряду агаранов и представляет галактан, который может быть отнесен к «молекулярным гибридам», содержащим остатки D- и L-галактозы (содержание сульфатных групп составляет 4 %). 7 Низкомолекулярное (НМ) производное каппа-каррагинана получено кислотным гидролизом в 0,1 N HCl (24 ч, 37ºС). В работе были использованы коммерческие лямбда- (Fluka), каппа(Sigma) и йота- (Sigma) каррагинаны, агароза (Sigma) и нефракционированный гепарин в виде натриевой соли (Sigma, США). Молекулярно-массовое распределение полисахаридов оценивали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Agilent 1100 с колонкой Shodex GS-620, предварительно откалиброванной декстрансульфатами. Средневязкостные молекулярные массы образцов каррагинанов определяли методом вискозиметрии при 25°С в 0,1 N NaCl, используя зависимость характеристической вязкости от молекулярной массы полимеров, согласно уравнению Марка-Хаувинка-Куна: [η] = k × Mα, где η – характеристическая вязкость, M – молекулярная масса, К = 3 × 10-3 и α= 0,95 эмпирические константы (Таблица 2). АСМ-изображения каррагинанов, нанесенных на слюду, получены на сканирующем зондовом микроскопе Solver P47. В качестве метода сканирования использовали полуконтактный режим с одновременной регистрацией сдвига фаз. Поверхностный потенциал определен на ZetaSizer Nano ZS (Malvern, UK) при 633 нм. Иммуномодулирующая активность. Способность каррагинанов вызывать индукцию синтеза ФНОα и ИЛ-6 и ИЛ-10 в опытах ex vivo была определена по методике (Bienvenu et al., 1995). Определение активных форм кислорода в мышиных макрофагах и концентрации ионов Ca2+ в лимфоцитах мышей согласно методике (Aminin et al., 2008). Антиоксидантная активность. In vitro антиоксидантные свойства полисахаридов определяли по железо-восстанавливающей способности (FRAP) (Rupérez et al., 2002), относительной антиоксидантной способности по фосфомолибденовому методу (Prieto et al., 1999), по способности перехватывать гидроксил радикал (Halliwell et al., 1987, 1991), супероксид анион радикал (Nishimiki et al., 1972) и оксид азота (Green et al., 1982), перекись водорода (Ruch et al., 1989). Влияние рН на антиоксидантную активность определяли согласно модифицированному методу (Decker, Schanus, 1986). Антитромботическое действие. Влияние полисахаридов на компоненты гемостаза in vitro проводили посредством определения тромбинового времени (Caceres et al., 2000), гемолиза эритроцитов (Belokoneva et al., 2003), агрегации тромбоцитов (Cazenave et al., 2004) и адгезии тромбоцитов, опосредованной различными рецепторами тромбоцитов к фибриногену (интегрин IIbβ3) и коллагену (интегрин 2β1 и гликопротеин VI) (Bellavite et al., 1996). Все эксперименты проведены с использованием образцов крови волонтеров, от которых получено письменное согласие на участие в исследовании. Протоколы исследования были одобрены этическим комитетом Медицинского Объединения ДВО РАН. Результаты экспериментов выражены в виде среднего ± стандартное отклонение. Достоверность различий между показателями оценивали по однопараметрическому тесту ANOVA. Медико-биологические исследования БАД «Каррагинан-ДВ». На основе двух типов каррагинанов в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН был разработан БАД «Каррагинан-ДВ», рекомендованный в качестве дополнительного источника пищевых волокон На базе МО ДВО РАН автором данной работы был проведен анализ и сбор информации амбулаторных карт пациентов: с диагнозом ишемическая болезнь сердца (ИБС) и стенокардия напряжения II – III функционального 8 класса (изолированная или в сочетании с артериальной гипертонией), находящихся на диспансерном учете в поликлинике, а также здоровых пациентов, проходящих ежегодный медицинский осмотр. Формирование опытных и контрольной групп проводилось рандомизированным способом (методом случайного выбора) с учетом возраста и общего состояния каждого пациента. Были сформированы 3 группы: контрольная (n=20) - практически здоровые люди в возрасте от 46 до 60 лет; 1-ая (n=20) – группа сравнения, больные с ИБС, получающие поддерживающую терапию, 2-ая (n=20) группа, больные с ИБС, получающие поддерживающую терапию и БАД «КаррагинанДВ» в виде капсул по 250 мг в течение 20 суток. Схема обследования на клинико-лабораторные показатели пациентов: в 1-ой группе до (1а) и через 30-40 дней (1б) после предыдущего обследования; 2-ая до (2а) и через 2 – 3 недели (2б) после получения БАД «Каррагинан-ДВ». Клинические и лабораторные данные проанализированы из амбулаторных карт по следующим показателям: иммунофенотипирование лимфоцитов (СD3, CD4, CD8, CD22, CD16, CD25, CD95); содержание сывороточных иммуноглобулинов (IgG, M, A); активность нейтрофилов периферической крови: фагоцитарная активность нейтрофилов (ФАН) – процент нейтрофилов участвующих в фагоцитозе, фагоцитарный индекс (ФИ) – отношение числа поглощенных микробных клеток к 100 нейтрофилам; фагоцитарное число (ФЧ) – среднее число микробных клеток, поглощенных одним фагоцитирующим нейтрофилом, индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) – переваривающая способность нейтрофилов; концентрации общего холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ), альфа холестерина - липопротеидов высокой плотности (ХС-ЛПВП); липопротеидов низкой плотности (ХС-ЛПНП) и коэффициент атерогенности (КА). Уровень С-реактивного белка определен методом ИФА; количество фибриногена по методу Р.А. Рутберга. Индекс массы тела рассчитан по формуле: m/h2, где m – масса тела, кг; h – рост, м. Статистический анализ клинико-лабораторных данных выполняли с использованием прикладного пакета Statistica 6. Использовались следующие методы: проверка нормальности распределения количественных признаков при малом числе наблюдений (W-критерий Шапиро-Уилка), парный и непарный t-критерии. Уровень доверительной вероятности был задан равным 95%. Результаты исследования и их обсуждение. Предметом исследования являются пять различных типов каррагинанов, химическая структура которых была установлена ранее. Как видно из Таблицы 1, исследуемые типы каррагинанов отличаются между собой количеством и местоположением сульфатных групп в дисахаридном повторяющемся звене полимера и присутствием остатков 3,6ангидрогалактозы. Известно, что биологическая активность природных полимеров определяется не только первичной структурой, но и их макромолекулярной организацией. Согласно результатам, полученным методов высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Shodex GS-620 (Рис. 1), все исследуемые полисахариды полидисперсны по молекулярной массе, значения которой находятся в пределах 200 – 600 кДа. Эти величины согласуются со значениями средневязкостных молекулярных масс каррагинанов, рассчитанных на основе результатов вискозиметрии (Таблица 2). На основании данных электрокинетических измерений был рассчитан электрокинетический потенциал макромолекул каррагинанов в разбавленных растворах. Как видно из Таблицы 2, наибольший отрицательный поверхностный потенциал имеет лямбда- 9 каррагинан, а наименьший – каппа/бета-каррагинан, соответствует их первичной структуре (Таблица 1). что Рис. 1. Высокоэффективная жидкостная хроматография полисахаридов на колонке Shodex GS-620 с рефрактометрической детекцией (nRID). Таблица 2. Физико-химические характеристики исследуемых полисахаридов. образец М*, kDa [η],** мл/мг электрокинетический потенциал, мВ (0,1 М NaCl), С=0,5 мг/мл λ-каррагинан 247 0,41 × 10-3 -40 ± 2 κ/β-каррагинан 380 0,61 × 10-3 -28 ± 1 κ/ι-каррагинан 160 0,28 × 10-3 -30 ± 2 Х-каррагинан 527 0,82 × 10-3 -36,4 ± 2 κ-каррагинан 376 0,62 × 10-3 -33 ± 2 НМ κ-каррагинан 1,6 – – порфиран 300 0,495 × 10-3 – *М – средневязкостная молекулярная масса; **η – характеристическая вязкость; Для изучения макромолекулярной структуры каррагинанов в широком диапазоне концентраций был использован метод АСМ, который позволяет избегать артефактов, наблюдаемых для других методов микроскопии, связанных с фиксацией и окрашиванием образцов полимеров (Funami, 2010 б). Кроме того, высота и ширина объектов на АСМ-изображениях дает информацию о степени макромолекулярной ассоциации полимеров и ее характере (Funami, 2010 а). На Рис. 2 представлены АСМ-изображения каппа-каррагинана в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,1 мг/мл. Каппа-каррагинан при низкой концентрации (0,01 мг/мл) (Рис. 2 а) образует гибкие спирали. Изображение фазового контраста (Рис. 2 б) позволяет увидеть, что отдельные волокна состоят из двух близко расположенных нитей, ориентированных параллельно. Их высота при 0,01 мг/мл (Рис. 2 а) составляет 0,73 ± 0,15 нм, что свидетельствует об образовании каппа-каррагинаном двуспиральных структур, согласно литературным данным (Funami et al., 2007). При высоких концентрациях (0,05 мг/мл) (Рис. 2 в) каппа-каррагинан формирует сеточно-волокнистую структуру, состоящую их макромолекулярных ассоциатов, высота которых достигает 3,87 ± 0,79 нм, что указывает на характер межмолекулярной ассоциации полисахарида по типу «бок-к-боку». 10 Рис. 2. АСМ-изображения каппа-каррагинана на свежесколотой поверхности слюды при концентрациях: а – 0,01 мг/мл, б – фазовый контраст при 0,01 мг/мл, в – 0,05 мг/мл. Стрелками указаны ответвления без изменения высоты, кружками – параллельно ориентированные волокна. Каппа/бета-каррагинан при низкой концентрации (0,01 мг/мл) образует равномерный слой коротких изолированных нитей (Рис. 3 а). Высота структуры каппа/бета-каррагинана (0,60 ± 0,39 нм) может свидетельствовать об отсутствии двуспиральных структур. Рис. 3. АСМ-изображения каппа/бета-каррагинана на свежесколотой поверхности слюды при концентрациях: а – 0,01 мг/мл; б – 0,05 мг/мл; в – трехмерное изображение каппа/бета-каррагинана при 0,1 мг/мл При высоких концентрациях (Рис. 3 б) полисахарида наблюдается образование переплетенных крупных волокон, которые формируют многослойную надмолекулярную структуру, отличную от таковой в случае каппа-каррагинана. Трехмерное изображение позволяет увидеть образование межмолекулярных ассоциаций по типу бок-к-боку (средняя высота объектов 4,65 ± 1,26 нм) (Рис. 3 в). Рис. 4. АСМ-изображения лямбда-каррагинана на свежесколотой поверхности слюды при концентрациях: а – 0,01 мг/мл; б – 0,025 мг/мл (вставка части изображения фазового контраста, которое позволяет увидеть сотоподобные структуры небольшого размера); в – 0,05 мг/мл 11 Лямбда-каррагинан характеризуется высоким поверхностным отрицательным зарядом и отсутствием 3,6-ангидрогалактозы (конформация обоих остатков галактозы в дисахаридном звене в этом случае соответствует конформации кресла – 1С4). На АСМ-изображениях лямбда-каррагинана наблюдается образование им сотоподобных структур, концентрация которых на единицу площади увеличивается в концентрированных растворах (0,05 – 0,1 мг/мл), в то время как высота структуры полисахарида достигает 1,03 ± 0,26 нм и не изменяется с увеличением концентрации (1,01 ± 0,11 нм при 0,1 мг/мл, изображение приведено в тексте диссертации) (Рис. 4 а, б, в). Такое поведение полисахарида свидетельствует об отсутствии образования им волокон, наблюдаемых для каррагинанов, содержащих 3,6-ангидрогалактозу. Среди изучаемых каррагинанов первичная структура икс-каррагинана сочетает в себе как элементы каппа- и каппа/бета- (3,6-ангидрогалактоза), так и лямбда-карагинанов (высокое содержание сульфатных групп). Согласно АСМ-изображению икс-каррагинан в разбавленных растворах образует двуспиральные структуры, формирующие с увеличением концентрации полисахарида волокна за счет ассоциации по типу бок-к-боку. В этом случае ассоциация приводит к образованию упорядоченных сотоподобных структур. Известно, что каррагинаны обладают свойствами влагоудерживающих агентов. В связи с этим было рассмотрено изменение нормированного объема каррагинана, видимого на поверхности слюды (Рис. 5). С помощью программного обеспечения, разработанного в ИАПУ ДВО РАН, были оценены так называемые «видимые объемы» каррагинанов и рассчитанные на их основе нормированные объемы. Как видно из рис. 5 нормированный объем каппа-, каппа/бетакаррагинанов при концентрации 0,05 мг/мл значительно увеличивается, что, вероятно объясняется образованием в надмолекулярной структуре полисахаридов полостей, которые в случае каппа/бета-каррагинана более крупные. Нормированный лямбда-каррагинана Рис. 5. Нормированный объем объем надмолекулярных структур каппа-, практически не изменяется при всех каппа/бета-, икс- и лямбда-каррагинанов. значениях концентрационного ряда. Кривая зависимости нормированного объема икс-каррагинана от концентрации, как и его макромолекулярная структура, имеет промежуточный характер (Рис. 5). Таким образом, полученные данные свидетельствуют об особенностях макромолекулярной организации исследуемых каррагинанов, обусловленых как нерегулярностью их структуры, так моносахаридным составом полисахаридов и степенью сульфатирования. Иммуномодулирующие свойства каррагинанов. Полисахариды полиионной природы такие, как каррагинаны, способны к многоточечному взаимодействию с поверхностью иммунокомпетентных клеток, что может обеспечивать модуляцию различных компонентов иммунной системы. Каррагинаны взаимодействуют со множеством белков, связывающих сульфатированные полисахариды, и оказывают на иммунный 12 ответ разнонаправленное действие (Stephanie et al., 2010). Имеющиеся литературные данные по иммуностимулирующей активности каррагинанов получены для коммерческих образцов полисахаридов и не учитывают структурные особенности этих веществ. В данной работе проведен анализ иммуномодулирующего действия исследованных типов каррагинанов в различных тест-системах ex vivo. Одним из важных показателей иммуностимулирующей активности веществ является их способность влиять на продукцию синтеза активных медиаторов иммунной системы организма - цитокинов. Особым условием при использовании веществ в иммунокоррегирующей терапии, учитывающей существующий в организме баланс про- и противовоспалительных реакций, являются показатели избирательности данного вещества в отношении продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Изучено влияние каррагинанов на продукцию цитокинов, синтезируемых клетками крови, как провоспалительных (ФНОα, ИЛ-6), так и противовоспалительных (ИЛ-10). Способность каррагинанов активировать клетки и вызывать в них синтез цитокинов была соотнесена с активностью липополисахарида (ЛПС), цитокин-индуцирующая активность которого была принята за 100 % (Рис. 6). Рис. 6. Влияние каррагинанов на индукцию синтеза ФНОα, ИЛ-6 и ИЛ-10: 1, ЛПС; 2, каппа/бета-каррагинан; 3, каппа/йота-каррагинан; 4, каппакаррагинан; 5, лямбда-каррагинан; 6, икс-каррагинан: –C = 1 нг/мл; –C = 10 нг/мл; –C = 100 нг/мл; –C = 1 мкг/мл. содержание цитокинов выражено в виде среднего ± стандартное отклонение (n = 5). Цельную кровь инкубировали с образцами (колонки 1–6) при различных концентрациях или с физиологическим раствором (контроль). * p < 0.05. Рис. 7. Влияние каррагинанов (100 мкг/мл) на (а) формирование АФК в макрофагах мышей и (б) концентрацию Ca2+ в цитоплазме лимфоцитов мышей: 1, контроль; 2, каппа/йота-каррагинан; 3, лямбдакаррагинан; 4, каппа/каррагинан; 5, каппа/бета-каррагинан. Суспензию перитонеальных макрофагов инкубировали с раствором каррагинанов (С = 100 мкг/мл) (колонки 2–5) или физиологическим раствором в качестве контроля (колонка 1). Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение (n = 3); *p < 0.05. 13 Как показали результаты, все исследуемые образцы каррагинанов проявляют цитокин-индуцирующую активность, стимулируя синтез ФНОα и интерлейкинов (ИЛ-6, ИЛ-10) мононуклеарными клетками крови человека. Способность каррагинанов активировать синтез цитокинов сильно зависит от концентрации полисахаридов и их структуры. При высокой концентрации (1-10 мкг/мл) все типы каррагинанов вызывают увеличение уровня цитокинов (ИЛ-6 и ФНОα), по сравнению со спонтанным синтезом, в то время как при низкой концентрации (менее 100 нг/мл) они малоактивны (Рис. 6). Лямбда- и каппакаррагинаны оказывают более сильное индуцирующее действие на индукцию синтеза ИЛ-6 и ФНОα при концентрации 100 нг/мл. Высокая цитокининдуцирущая активность лямбда-каррагинана в отношении ИЛ-6 при концентрации 100 нг/мл согласуется с литературными данными (Bhattacharyya et al., 2010). Согласно полученным нами результатам, из всех исследованных полисахаридов каппа/бета-каррагинан обладает низкой способностью к индукции синтеза ИЛ-6 и ФНОα при концентрации 100 нг/мл, в то время как его способность индуцировать продукцию противовоспалительного ИЛ-10 при низких концентрациях (10 – 100 нг/мл) выше, чем у ЛПС. Избирательность цитокин-индуцирующей активности каппа/бета-каррагинана может быть обусловлена как низкой степенью сульфатирования полисахарида, так и особенностями его макромолекулярной структуры, описанной выше (при концентрации полимера С = 10 мкг/мл). Каррагинаны всех структурных типов активируют индукцию синтеза противовоспалительного ИЛ-10, и их активность возрастает с увеличением концентрации. Каппа/бета-каррагинан наиболее активен в этом тесте и при наименьшей концентрации 10 нг/мл его активность сравнима с активностью ЛПС. Известно, что ионы внутриклеточного Са2+ являются маркерами процесса активации иммунокомпетентных клеток. В связи с этим полисахариды тестировали на их способность влиять на внутриклеточную концентрацию Са2+ в цитоплазме иммунокомпетентных клеток – лимфоцитов селезенки мышей в одной максимальной концентрации 100 мкг/мл. Среди исследованных полисахаридов лямбда-каррагинан является наиболее эффективным. Этот тип каррагинана вызывает увеличение концентрации кальция в лимфоцитах почти в два раза (Рис. 7). Лямбда-каррагинан также оказывает выраженное воздействие на макрофаги, активируя процесс формирования активных форм кислорода (АФК) в них на 30% (Рис. 7). Эффективная концентрация лямбда-каррагинана, вызывающая полумаксимальный эффект, составляет 37 мкг/мл. Так как формирование АФК в макрофагах происходит под действием лямбда-каррагинана при той же концентрации, что и увеличение [Ca2+], то вполне возможно, что стимулирующий эффект является Ca2+-зависимым, и стимулирование синтеза АФК осуществляется через регулирование проницаемости мембран клеток к ионам кальция. Таким образом, лямбдакаррагинан может эффективно стимулировать активацию лимфоцитов и формирование АФК в иммунокомпетентных клетках, в то время как каппа/бета-каррагинан является активным индуктором синтеза провоспалительных цитокинов. Полученные данные свидетельствуют об избирательности иммуномодулирующего действия каррагинанов и предполагают, что использование полисахаридов с определенной структурой позволит регулировать активность иммунокомпетентных клеток организма. 14 Антиоксидантные свойства каррагинанов in vitro В последние годы появились данные о том, что полисахариды, в том числе и полисахариды морских водорослей могут перехватывать свободные радикалы in vitro и выполнять функцию антиоксидантов, смягчающих окислительное повреждение в живых организмах (Zhang et al., 2010, Costa et al., 2010). Механизмы действия антиоксидантов могут быть различными: от непосредственного участия связывания свободнорадикальных групп до повышения устойчивости клеточных структур к их повреждающему действию. Изучена потенциальная антиоксидантная способность каррагинанов in vitro. Для изучения этой активности использованы различные тест-системы: железо-восстанавливающая активность (FRAP), относительная антиоксидантная активность (фосфомолибденовый метод) и способность перехватывать гидроксил радикал, супероксид анион, оксид азота и перекись водорода. Влияние рН на потенциальную антиоксидантную активность рассмотрено с помощью модели, основанной на окислении линолевой кислоты. Железо-восстанавливающая способность (FRAP) и фосфомолибденовый метод (относительная антиоксидантная способность). FRAP тест позволяет оценить в условиях in vitro восстанавливающую активность исследуемых полисахаридов по восстановлению ионов железа. Наряду с каррагинанами, в данном тесте для сравнения использованы образцы агарозы и образцы коммерческих типов каппа-, лямбда- и йота-каррагинанов. Как показали результаты (Таблица 3), каррагинаны всех типов проявляют низкую активность относительно аскорбиновой кислоты. Слабая восстанавливающая активность полисахаридов подтверждена фосфомолибденовым методом (Таблица 3). Таким образом, все образцы каррагинанов обладают слабой восстанавливающей способностью. Таблица 3. Восстанавливающая способность исследуемых полисахаридов определенная, посредством FRAP и фосфомолибденового методов. Результаты выражены в виде ммоль эквивалентов аскорбиновой кислоты / г сухого веса образца. источник каррагинана тип каррагинана C. armatus T. crinitus C. armatus T. crinitus C. pinnulatus Fluka Sigma Sigma Sigma лямбда икс каппа каппа/бета каппа/йота лямбда(ком.) каппа(ком.) йота(ком.) агароза FRAP метод Фосфомолибденовый метод 2 ммоль эквивалентов аскорбиновой кислоты / г сухого веса образца 278.52 ± 44.66 84.39 ± 30.48 296.94 ± 120.33 66.61 ± 24.07 291.24 ± 83.74 58.50 ± 25.27 360.10 ± 93.04 89.47 ± 34.73 292.12 ± 77.53 98.22 ± 44.88 неэффективен неэффективен неэффективен неэффективен неэффективен неэффективен неэффективен неэффективен Способность перехватывать гидроксил радикал. Как видно из диаграммы (Рис. 8), каррагинаны всех типов проявляют умеренную способность перехватывать гидроксил радикал. Действие каррагинанов в значительной степени определяется концентрацией полисахарида, в то время как структура веществ не оказывает существенного влияния на проявляемую активность. Активность исследуемых лямбда- и каппа-каррагинанов сопоставима с таковой для коммерческих образцов. Коммерческий образец йота-каррагинана проявляет наибольшее действие из всех типов каррагинанов при концентрации 0,5 мг/мл в этом тесте. Это согласуется с результатами Роха де Соуза и др. (Rocha de Souza et al., 2007), которые 15 показали, что йота-каррагинан перехватывает более эффективно, чем лямбда- и каппа-каррагинаны. гидроксил радикал Рис. 8. Способность каррагинанов перехватывать гидроксил радикал. Маннит – стандарт. 1 - лямбда; 2 - икс; 3 каппа; 4 - каппа/бета; 5 - каппа/йота; 6 лямбда (ком.); 7 йота (ком.); 8 - каппа (ком.); 9 - агароза. * p < 0.05. Способность перехватывать оксид азота. Все каррагинаны проявляют способность перехватывать оксид азота, и их активность сравнима с действием стандарта – аскорбиновой кислотой (Рис. 9). При низких концентрациях (0,5 – 0,25 мг/мл) большую, по сравнению с аскорбиновой кислотой, активность проявляют каррагинаны с высокой степенью сульфатирования (лямбда-, икс-, йота- и каппа/йота-каррагинан), в то время как каппа/бета-каррагинан менее активен, а несульфатированная агароза не проявляет активности. Следует заметить, что при самой низкой концентрации в ряду полисахаридов наибольшую активность проявляют образцы икс- и йота-каррагинанов, содержащие в дисахаридных звеньях не только большее количество сульфатных групп, но и 3,6-ангидро-производное. Вероятно, способность каррагинанов перехватывать оксид азота определяется как степенью сульфатирования полисахарида, так и его моносахаридным составом. Рис. 9. Способность перехватывать оксид азота каррагинанами. Аскорбиновая кислота – стандарт. 1 - лямбда; 2 - икс; 3 - каппа; 4 каппа/бета; 5 каппа/йота; 6 - лямбда (ком.); 7 - каппа (ком.); 8 - йота (ком.); 9 агароза. * p < 0.05. Способность перехватывать супероксид анион Как видно из рисунка (Рис. 10), все полисахариды обладают сравнимой с аскорбиновой кислотой или более высокой способностью перехватывать супероксид анион. Их активность увеличивается в следующем ряду: каппа/йота- (45,95 %) < каппа/бета- (47,67 %) < каппа- (53,92 %) < икскаррагинан (54,82 %) при 1,00 мг/мл. Икс-каррагинан, также как и в отношении оксида азота, обладает наибольшей способностью перехватывать супероксид анион независимо от концентрации полисахарида. Можно предположить, что наибольшая эффективность икс-каррагинана в отношении супероксид аниона и оксида азота (при С = 0,25 мг/мл) определяется как его первичной структурой, так и особенностями его макромолекулярной организации, наблюдаемой в АСМ-изображениях. 16 Рис. 10. Способность перехватывать супероксид анион каррагинанами. Аскорбиновая кислота использовалась в качестве стандарта. 1 - лямбда; 2 - икс; 3 каппа; 4 - каппа/бета; 5 - каппа/йота. * p < 0.05. Рис. 11. Влияние рН на антиоксидантную активность каррагинанов. 1 - лямбда; 2 - икс; 3 - каппа; 4 - каппа/бета; 5 - каппа/йота. * p < 0.05. Определение влияния рН на актиоксидантную способность. Зависимость антиоксидантной активности полисахаридов от рН измеряли по их способности уменьшать автоокисление линолевой кислоты при различных значениях рН. Как показали результаты, все каррагинаны обладают антиоксидантной активностью в диапазоне рН 3 – 9, с повышением рН до 11 их активность существенно уменьшается (Рис. 11). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что каррагинаны обладают антиоксидантной активностью in vitro, которая зависит от концентрации полисахарида, рН среды и их структурных особенностей. Хотя некоторые работы, посвященные in vitro антиоксидантному действию полисахаридов, свидетельствуют о том, что оно определяется их восстанавливающей активностью (Costa et al., 2010, Chen et al., 2009, Zhang et al., 2010), настоящее исследование не обнаруживает подобной закономерности. Исследованные полисахариды проявили гораздо более выраженный эффект в отношении супероксид аниона и оксида азота. Влияние полисахаридов красных водорослей на гемостаз ex vivo. Одним из показателей антитромботического эффекта веществ является их способность замедлять образование фибринового сгустка. Как показали результаты, все каррагинаны замедляют время образования фибринового сгустка, при этом их активность существенно ниже активности гепарина (Рис. 12). Из всех каррагинанов наиболее сильным антикоагулирующим действием обладают лямбда- и икс-каррагинаны, увеличивающие тромбиновое время на 50 и 43 %, соответственно, по сравнению с контролем. Каппа/бета- и каппакаррагинаны замедляют процесс коагуляции на 30 и 37 %, соответственно. Порфиран не обладает ингибирующим эффектом в этом тесте. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о зависимости тромбинового времени от степени сульфатирования полисахаридов – чем больше последняя, тем выше антикоагулирующий эффект полисахарида. Подобная зависимость антикоагулирующей активности, измеренной по регистрации протромбинового времени, наблюдалась при трехкратном увеличении сульфатных групп в каппа-каррагинане (Opoku et al., 2006). Следует отметить, что НМ производное каппа-каррагинана (1,6 кДа) не показывает значительного антикоагулирующего эффекта (Рис.12), тогда как исходный полисахарид (376 кДа) ингибирует образование фибринового сгустка на 50 % по сравнению с контролем. Согласно литературным данным, такая зависимость антикоагулирующего эффекта от молекулярной массы может быть обусловлена тем, что высокомолекулярные сульфатированные 17 полисахариды формируют нерастворимые комплексы с фибриногеном, в то время как их низкомолекулярные производные образуют растворимые комплексы (Shanmugam, Mody, 2000). Исследовано влияние полисахаридов на процесс активации тромбоцитов посредством их агрегации, вызванной различными индукторами (тромбин, коллаген и ристоцетин), и адгезии этих клеток с участием рецепторов тромбоцитов, специфичных к фибриногену и коллагену. В случае агрегации, индуцированной тромбином или коллагеном, полисахариды замедляют скорость агрегации, но с различной степенью (Рис. 13). Как показали результаты, тромбин-индуцированную агрегацию тромбоцитов ингибируют порфиран, каппа/бета-каррагинан и гепарин с приблизительно одинаковым действием, понижая скорость агрегации на 24, 22 и 19,5 %, соответственно (Рис. 13). Рис. 12. Изменение тромбинового времени в присутствии полисахаридов (С = 100 мкг/мл). Результаты выражены в % изменения времени образования фибринового сгустка под действием тромбина относительно отрицательного контроля. 1 - гепарин; 2 - лямбда; 3 - икс; 4 - каппа; 5 - каппа (НМ); 6 - каппа/бета; 7 порфиран. * p < 0.05. Рис. 13. Изменение скорости агрегации тромбоцитов, индуцированной различными индукторами, в присутствии полисахаридов (С = 100 мкг/мл). Результаты выражены в % изменения скорости агрегации относительно отрицательного контроля. 1 - гепарин; 2 лямбда; 3 - икс; 4 - каппа; 5 - каппа/бета; 6 порфиран. * p < 0.05. При использовании коллагена в качестве индуктора агрегации тромбоцитов, все полисахариды более интенсивно ингибируют этот процесс, по сравнению тромбином. Каппа/бета- и икс-каррагинаны снижают коллагениндуцированную агрегацию тромбоцитов в среднем на 53,5 %. Стоит отметить, что лямбда-каррагинан, неактивный в случае агрегации с тромбином, показывает достаточно высокую ингибирующую активность при коллаген-индуцированной агрегации (на 47,5 %). В то же время среди исследуемых полисахаридов только лямбда-каррагинан не воздействует на процесс ристоцетин-индуцированной агрегации тромбоцитов (Рис. 13). Агрегация под действием ристоцетина увеличивается в присутствии, как гепарина, так и исследуемых каррагинанов. Известно, что конечный шаг в активации тромбоцитов – агрегация этих клеток, вызванная перекрестным связыванием фибриногена с тромбоцитарным рецептором интегрином IIbβ3 (Jarvis, 2004, Jackson, 2007). Кроме того, интегрин IIbβ3 вовлечен в процесс адгезии этих клеток через взаимодействие с фактором фон Виллебранда, фибрином и фибриногеном (Kiefer, Becker, 2009). В связи с этим исследовано действие полисахаридов на адгезию тромбоцитов, опосредованную интегрином IIbβ3, к иммобилизированному фибриногену. Как показали результаты, все каррагинаны активируют адгезию тромбоцитов к фибриногену, но с меньшим эффектом, чем гепарин. Наиболее активными являются лямбда- и икскаррагинаны (повышение на 53 %), наименее активным – каппа/бетакаррагинан (повышение на 24 %), а порфиран не влияет на этот процесс. В то же время НМ производное каппа-каррагинана проявляет способность 18 увеличивать адгезию тромбоцитов, но в меньшей степени, чем исходный полисахарид (Рис. 14). Таким образом, наименее сульфатированный каппа/бета-каррагинан, являющийся одним из сильных ингибиторов агрегации тромбоцитов под действием тромбина и коллагена, является самым слабым индуктором адгезии тромбоцитов, опосредованной интегрином IIbβ3, к фибриногену. Следовательно, степень сульфатирования и молекулярная масса имеют определяющее значение для адгезии тромбоцитов к фибриногену с участием интегрина IIbβ3. Следует отметить, что влияние каррагинанов на адгезию тромбоцитов к фибриногену, меньше, чем для гепарина, что позволяет рассматривать эти полисахариды, особенно каппа/бета-каррагинан, в качестве перспективных антитромботических агентов. Рис. 14. Влияние каррагинанов (С = 50 нг/мл) на адгезию тромбоцитов к фибриногену, опосредованную интегрином IIbβ3. Результаты выражены в % изменения адгезии относительно отрицательного контроля. 1 - гепарин; 2 - Рис. 15. Влияние каррагинанов (С = 50 нг/мл) на адгезию тромбоцитов к коллагену, опосредованную интегрином 2β1 и гликопротеином VI. Результаты выражены в % изменения адгезии относительно отрицательного контроля. 1 - гепарин; 2 - лямбда; лямбда; 3 - каппа; 4 - каппа (НМ); 5 каппа/бета; 6 - порфиран.* p < 0.05. 3 - каппа; 4 - каппа (НМ); 5 - каппа/бета; 6 порфиран.* p < 0.05. Как известно, тромбоциты имеют два определяющих рецептора, специфичных к коллагену: интегрин 2β1 и гликопротеин VI, которые оказывают синергетический эффект на активацию тромбоцитов (Broos et al., 2011). В присутствии исследуемых полисахаридов изучена адгезия тромбоцитов к иммобилизированному коллагену, опосредованная интегрином 2β1 и гликопротеином VI. Полученные результаты показывают, что гепарин – наиболее сильный ингибитор коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов (Рис. 13) ингибирует их адгезию к коллагену, с участием двух рецепторов (Рис 15). В то время как, исследуемые полисахариды не затрагивают адгезию тромбоцитов, опосредованную интегрином 2β1, к иммобилизированному коллагену. Каррагинаны, как видно из Рис. 15, воздействуют преимущественно на один рецептор к коллагену – гликопротеин VI. Адгезия тромбоцитов к коллагену через гликопротеин VI ингибируется всеми каррагинанами и порфираном в среднем на 20 % (Рис. 15). Действие НМ каппа-каррагинана в этом тесте сравнимо с эффектом исходного полисахарида. Как и в случае агрегации тромбоцитов под действием коллагена, влияние структурных особенностей каррагинанов на адгезию тромбоцитов несуществено. Таким образом, каррагинаны и порфиран обладают антитромботической активностью, что проявляется в ингибировании тромбин- и коллагениндуцированной агрегации тромбоцитов и замедлении времени образования фибринового сгустка. Эффект исследуемых веществ проявляется за счет снижения активации (адгезии) тромбоцитов, опосредованной гликопротеином VI. Степень сульфатирования и молекулярная масса полисахаридов играют существенную роль в проявлении этой активности. Медико-биологические исследования приема БАД «Каррагинан-ДВ» 19 Полученные в экспериментах in vitro и ex vivo данные по иммуномодулирующей, антиоксидантной и антикоагулирующей активностям каррагинанов открывают перспективы их использования в медицинской практике и позволяют предположить положительный полифункциональный эффект каррагинана при включении его в качестве вспомогательного вещества в комплексную терапию. В ТИБОХ ДВО РАН был разработан БАД «Каррагинан-ДВ», который успешно прошел необходимые испытания во ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» г. Москва и допущен к реализации и использованию на территории Российской Федерации (№ 77.99.11.3.У.675.2.10 от 08.02.2010г) и был предложен в качестве дополнительного источника ПВ. В данной работе исследована возможность применения БАД «Каррагинан-ДВ» в комплексной терапии пациентов с ишемической болезнью сердца. Для оценки эффективности БАД «Каррагинан-ДВ» автором работы были проанализированы амбулаторные карты 60 пациентов и выделены три группы, каждая из которых включала 20 пациентов (Таблица 4). Для оценки эффективности «Каррагинан-ДВ» были проанализированы показатели липидного профиля и иммунного статуса трех сформированных групп пациентов. Таблица 4. Динамика показателей липидного профиля и маркеров воспаления пациентов с ИБС до и после приема БАД «Каррагинан-ДВ». Показатель норма контроль Группа 1 Группа 2 до (1а) после(1б) до(2а) после(2б) 4,71 ± 6,79 ± 6,37 ± 6,06 ± 5,06 ± 0,24**, ХС, ммоль/л 0,92 0,16* 0,21 0,27* *** 1,54 ± 1,54 ± 1,85 ± 0,91 ± 1,13 ± 0,12*, триглицериды, ммоль/л 0,05 0,22 0,18* 0,12* **, *** 2,65 ± 4,48 ± 4,00 ± 4,31 ± 2,87 ± 0,28**, ХС-ЛПНП, ммоль/л 0,10 0,19* 0,32* 0,25* *** 1,38 ± 1,48 ± 1,44 ± 1,28 ± ХС-ЛПВП, ммоль/л 0,02 0,11 0,08 0,06 1,45 ± 0,06 Коэффициент 2,51 ± 3,98 ± 3,67 ± 3,82 ± 2,42 ± 0,24**, атерогенности, ед. 0,07 0,43* 0,38* 0,26* *** 3,20 ± 4,36 ± 3,72 ± 3,95 ± фибриноген, г/л 0,09 0,25* 0,11* 0,19* 3,49 ± 0,15** 1,54 ± 3,71 ± 3,30 ± 2,96 ± С-реактивный белок, мг/л 0,24 0,74* 0,70* 0,72* 2,56 ± 0,59 5,74 ± 6,69 ± 6,52 ± 6,68 ± 5,62 ± 0,31**, Лейкоциты, 109/л 4,0-9,0 0,31 0,49* 0,36* 0,44* *** 23,53 ± 29,1 ± 29,1 ± 27,43 ± 2 Индекс массы тела, кг/м 1,88 0,86 0,86 1,44 27,21 ± 1,41 1 группа – поддерживающая терапия (1а – до, 1б – через 30 – 40 дней); 2 группа – поддерживающая терапия и БАД «Каррагинан-ДВ» (2а – до, 2б – через 30 – 40 дней); Данные представлены в виде средних значений ± ошибка средней (М ± m); *-Р-уровень менее 0,05 в сравнении с группой контроля; **- Р-уровень менее 0,05 между группами 1 а и 1 б или 2 а и 2 б; ***- Р-уровень менее 0,05 между группами 1 б и 2 б. 3,0 5,2 0,15 2,0 2,0 3,0 0,9 1,42 2,3 3,4 2,0 4,0 0,068 8,2 Так как известно, что одной из причин прогрессирования ИБС является нарушение иммунного статуса организма, то были проанализированы показатели иммунного статуса пациентов. У больных ИБС на фоне поддерживающей терапии как в группе 1а, так и 2а выраженных нарушений фенотипической и функциональной активности лимфоцитов периферической крови не выявлено, хотя отмечены достоверные различия некоторых средних показателей иммунного статуса по сравнению с контрольной группой, которые не выходили за рамки норм методов. Изменение показателей иммунного статуса считается клинически значимым, если показатель отличается от 20 нормального или отличается в динамике не менее, чем на 20 %. Таким образом, согласно полученным данным (таблица приведена в диссертации), показатели групп 1а и 2а значимо не отличаются друг от друга и на фоне поддерживающей терапии сохраняют прежние значения (колебания в пределах нормы метода). Следует отметить, что в этих же группах отмечены пониженные значения средних показателей ФАН и незначительное подавление поглотительной способности нейтрофилов. В контрольной группе показатели фагоцитоза (ФЧ и ФИ) также были ниже нормы. У пациентов группы 1 в динамике не наблюдалось значительных изменений в показателях иммунного статуса, за исключением достоверного повышения концентрации IgM, находящихся в пределах норм методов. При сравнении данных группы 2 а и 2 б выявлено: снижение количества лейкоцитов (15,9 %), увеличение абсолютного и относительного количества CD4+ (37,9 и 31,6 %) и изменение ИРИ в сторону увеличения, но в пределах нормы. При этом отмечено снижение содержания IgG (6,3 %) и IgM (19,1%), что согласуется с динамикой CD22+-клеток (18,7%) и усиление поглотительной активности фагоцитов крови в виде повышения ФЧ (20,1 %) и ИЗФ (27,9 %). В целом повысился хелперный потенциал Т-клеток и произошла активация поглотительной и переваривающей способности нейтрофилов. Сравнение показателей иммунного статуса 1 и 2 групп пациентов через 40 дней от начала исследования показывает достоверное снижение в группе 2 количества лейкоцитов, снижение CD22+-клеток, IgG, IgM, увеличение IgА и ИЗФ, находящихся в пределах нормы методов. Таким образом, на фоне приема БАД «Каррагинан-ДВ» по сравнению с группой 1, не получавшей БАД, отмечается положительная динамика в показателях иммунного статуса. БАД «Каррагинан-ДВ» не вызывает гиперактивации иммунной системы, обладает умеренной модуляцией клеточного и гуморального звена иммунитета и усиливает местный иммунитет. Сердечно-сосудистые нарушения относятся к хроническим заболеваниям и связаны с воспалительными процессами, обусловленными эффектами холестерина и ЛПНП, индуцирующих воспаления эндотелия артерий, приводя к атеросклеротическим осложнениям (Wellen, Hotamisligil, 2005). Высокое содержание в плазме общего ХС, триглицеридов и атерогенных липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛПНП), и низкое содержание в плазме антиатерогенных липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП), считаются важными факторами риска в развитии сердечнососудистых заболеваний (ССЗ) (Lottenberg et al., 2010). В связи с этим показатели липидограмм широко используются в медицинской практике в качестве биомаркеров ССЗ (Castro et al., 2005). Изучено влияние БАД «Каррагинан-ДВ» на липидный спектр пациентов с ИБС. Как видно из Таблицы 4, показатели общего ХС и ХС-ЛПНП у пациентов с ИБС (1 а, 2 а), находящихся только на поддерживающей терапии, достоверно выше, чем у условно здоровых лиц. После приема БАД «Каррагинан-ДВ» (в группе 2 б) у пациентов наблюдается достоверное снижение содержания ХС на 16,5 % и ХС-ЛПНП на 33,5 % по сравнению с показателями до приема препарата. В группе, где пациенты продолжали традиционное лечение, уровень общего холестерина снизился незначительно – на 6,2 %; ХС-ЛПНП на 10,7 %. Уровень триглицеридов в динамике увеличился в обеих группах, но во 2 группе он оставался достоверно ниже, чем в контрольной группе. Для оценки соотношения атерогенных и антиатерогенных липопротеидов использовали холестериновый коэффициент атерогенности (КА). В группах 1а, 1б и 2а КА достаточно высок, а после приема БАД «Каррагинан-ДВ» в группе 2б он достоверно снижается на 36,6 %. Выявленные различия показателей липидного профиля в группах 1б и 2б достоверны, за исключением уровня ХС- 21 ЛПВП, который изменяется незначительно в обеих группах. Таким образом, приведенные данные показывают, что применение БАД «Каррагинан-ДВ» способствует снижению уровня общего холестерина, ХСЛПНП и КА. Наряду с основными параметрами липидограммы, проводили анализ маркеров хронического воспаления у пациентов (общее количество лейкоцитов, фибриногена, С-реактивного белка и др.) (Lottenberg et al., 2010), поскольку атеросклероз рассматривается как состояние повышенного окислительного стресса, характеризуемого воспалением и изменением уровня липидов и протеинов (Wellen, Hotamisligil, 2005). Согласно представленным в Таблице 4 данным, у пациентов до приема БАД эти показатели выше, чем у здоровых лиц, хотя и находятся в пределах норм. Применение БАД «Каррагинан-ДВ» приводит к статистически достоверному снижению маркеров воспаления: количества лейкоцитов на 15,9 %, уровня фибриногена на 8,62%, содержания С-реактивного белка на 13,03 %. Индекс массы тела у пациентов до и после приема БАД «КаррагинанДВ» не изменялся, что может указывать на то, что понижение в уровнях общего ХС и ХС-ЛПНП происходит за счет действия пищевой добавки, а не состава рациона пациентов. Ухудшения общего самочувствия пациентов за период наблюдения не отмечалось. Неблагоприятных явлений, связанных с приемом препарата, не выявлено. Механизмы, посредством которых потребляемые ПВ могут понижать концентрации С-реактивного белка, до сих пор не выяснены, тем не менее, рассматриваются возможности того, что действие волокон замедляет абсорбцию глюкозы и модуляцию цитокинов, благоприятствуя ответной реакции кишечной флоры и усиливая синтез противовоспалительных цитокинов (Lottenberg et al., 2010). Как было показано выше в данной работе в экспериментах ex vivo, каррагинаны усиливают синтез противовоспалительного ИЛ-10 (Рис. 6). Вполне возможно, что улучшение показателей липидограммы и маркеров хронического воспаления пациентов связано с иммуномодулирующим эффектом полисахаридов. Таким образом, полученные результаты исследования демонстрируют, что профилактический прием БАД «Каррагинан-ДВ» в качестве дополнительного источника пищевых волокон в комплексной терапии пациентов с сердечно-сосудистыми нарушениями способствует нормализации параметров липидного обмена, снижению уровня маркеров хронического воспалительного процесса и положительной динамике ряда показателей иммунного статуса. Выводы 1. Показано, что каппа-, лямбда-, каппа/йота-, каппа/бета- и икскаррагинаны, выделенные из красных водорослей Японского моря семейств Tichocarpaceae и Gigartinaceae, представляют собой полидисперсные высокомолекулярные полисахариды, с молекулярными массами от 246 до 527 кДа и поверхностным зарядом от -24 до -40 mB. 2. Установлено, что при низких концентрациях (10 мкг/мл) каппа- и каппа/йота-каррагинаны формируют двуспиральные структуры, в то время как каппа/бета-каррагинан образует изолированные короткие волокна. При высоких концентрациях каппа-, каппа/йота- и каппа/бета-каррагинаны формируют волокнисто-сеточные структуры в результате межмолекулярной ассоциации по типу «бок-к-боку». Лямбда-каррагинан, имеющий в разбавленных растворах конформацию неупорядоченного клубка, при высоких концентрациях образует сотоподобные структуры. 3. Показано, что все исследуемые каррагинаны обладают иммуномодулирующей активностью. Лямбда-каррагинан эффективно 22 стимулирует активацию лимфоцитов и усиливает синтез АФК в макрофагах. Каппа/бета-каррагинан обладает избирательным цитокининдуцирующим действием, при низкой концентрации (С=10 нг/мл), усиливая синтез противовоспалительного ИЛ-10 и не проявляя активности в отношении индукции синтеза провоспалительных ИЛ-6 и ФНОα. 4. Определена потенциальная антиоксидантная активность каррагинанов, которая проявляется в способности перехватывать оксид азота, гидроксил радикал, супероксид анион. Антиоксидантная активность каррагинанов уменьшается с ростом pH, зависит от моносахаридного состава количества и местоположения сульфатных групп в полисахаридах и не связана с их восстанавливающей способностью. 5. Установлено, что каррагинаны обладают антитромботической активностью, замедляя скорость образования фибринового сгустка и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов, ингибируя их адгезию к коллагену, опосредованную гликопротеином VI. Наибольшей атикоагулирующей активностью обладают каррагинаны с высокой степенью сульфатирования и большей молекулярной массой. Каппа/бета-каррагинан является наиболее сильным ингибитором агрегации тромбоцитов, и слабым индуктором их адгезии к фибриногену, что позволяет рассматривать этот полисахарид в качестве перспективного антитромботического агента. 6. Показано, что использование БАД «Каррагинан-ДВ» в комплексной терапии пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями способствует нормализации показателей иммунного статуса и биохимических показателей (липидного профиля и параметров хронического воспаления), что открывает перспективу применения БАД в терапевтической практике. Список публикаций 1. Ермак И. М., Давыдова В. Н., Аминин Д. Л., Барабанова А. О., Соколова Е. В., Богданович Р. Н., Полякова А. М., Соловьева Т. Ф. Иммуномодулирующая активность каррагинанов из красных водорослей дальневосточных морей // Тихоокеанский медицинский журнал. – 2009. – № 3. – С. 40–45. 2. Соколова Е. В., Барабанова А. О., Хоменко В. А., Соловьева Т. Ф., Богданович Р. Н., Ермак И. М. Изучение in vitro и ex vivo антиоксидантной активности каррагинанов – сульфатированных полисахаридов красных водорослей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т. 150, № 10. – С. 398–401. 3. Sokolova E. V., Barabanova A. O., Bogdanovich R. N., Khomenko V. A., Solov’eva T. F., Yermak I. M. In vitro antioxidant properties of red algal polysaccharides // Biomedicine and Preventive Nutrition. – 2011. – Vol. 1, N 3. – P. 161–167. 4. Соколова Е. В., Иванова Т. Б., Крыжановский С. П., Богданович Л. Н., Барабанова А. О., Ермак И. М. Влияние биологически-активной добавки на основе полисахаридов красной водоросли на липидный обмен пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями // Тихоокеанский медицинский журнал. – 2012. – № 1. – С. 93–96. 5. I.M. Yermak, A.O. Barabanova, D.L. Aminin, V.N. Davydova, E.V. Sokolova, Y.H. Kim, K.S. Shin, T.F. Solov’eva. Effects of structural peculiarities of carrageenans on their immunomodulatory and anticoagulant activities // Carbohydrate Polymers. – 2012. – Vol. 87, N 1. P. 713–720. 6. Соколова Е. В., Давыдова В. Н., Барабанова А. О., Хоменко В. А., Ермак И. М. Иммуномодулирующая и антиоксидантная активность каррагинанов из красных водорослей дальневосточных морей // Науч.практ. конф., посвящ. 10-летию создания Учебно-науч. центра «Физико- 23 химическая биология» в Республике Коми, 7-9 окт. 2009 г., Сыктывкар. – Сыктывкар: Ин-т физиологии Коми науч. центра УрО РАН, 2009. – С. 75–76. 7. Sokolova E., Bogdanovich R., Kryzhanovskiy S., Yermak I. The carrageenan influence on the immune system induces of patients with diabetes mellitus 2 type : 14th Intern. congr. of Immunology, Kobe, Japan, Aug. 23–27, 2010 : abstrs. book. – Kobe, 2010 // International Immunology. – 2010. – Vol. 22. – Suppl. 1. – P. i161. 8. Sokolova E. V., Barabanova A. O., Davidova V. N., Solov’eva T. F., Yermak I. M. The Immunomodulatory and antioxidant activity in vitro of red alga polysaccharides // 9th Intern. marine biotechnology conf., Qingdao, China, Oct. 8–12, 2010. – P. 404. 9. Yermak I. M., Barabanova A. O., Davidova V. N., Sokolova E. V., Kim Y. H., Shin K. S. Biological activity of sulfated polysaccharides from red seaweed of Pacific coast // 2nd Annual Russian-Korean conf. “Current issues of natural products chemistry and biotechnology”, Novosibirsk, Russia, March 15-18, 2010 – P. 40. 10. Sokolova E. V., Barabanova A. O., Bogdanovich L. N., Yermak I. M. Biological properties of carrageenans–red algal polysaccharides // Intern. conf. “Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine”, Saint-Petersburg, June 21–24, 2011. – P. 211. 11. Yermak I. M., Sokolova E., Kim Y.-H. Effects of structural peculiarities of sulphated polysaccharides from red seaweed on biological properties // The 3rd Korea-Russian Bio Joint Forum on the Natural Products Industrialization and Application, Gangneung, Republic Korea, Oct. 5–7, 2011. – P. 155–167. 12. Sokolova E. V., Barabanova A. O., Bogdanovich L. N., Yermak I. M. Biological properties of carrageenans – red algae polysaccharides // RussianIndian symp. on glycosciences, Moscow, June 13-16, 2011. – P. [29].
