Сперматогенез и процессы перекисного окисления липидов в

Проблемы репродукции, 2, 2015
doi: 10.17116/repro201521223-26
Сперматогенез и процессы перекисного окисления липидов в гонадах
крыс, подвергнутых действию шестивалентного хрома
К.б.н., с.н.с. В.П. МАМИНА
Институт экологии растений и животных УрО РАН, Екатеринбург, Россия, 620144
Цель исследования — изучить влияние шестивалентного хрома (VICr) в малых дозах на состояние сперматогенеза и процессы
перекисного окисления липидов в семенниках у крыс линии Wistar.
Материал и методы. Эксперименты проводили на половозрелых самцах разведения Wistar массой 230—250 г (n=40).
Животные были разделены на четыре группы: 1-я группа (контроль) — крысам ежедневно внутрибрюшинно (в/б) вводили
физиологический раствор в течение 48 дней; 2-я — крысы получали ежедневно в/б инъекцию бихромата калия (K2Cr2O7) в
дозе 0,028 мг/кг в течение 48 дней; 3-я — крысы получали ежедневно в/б инъекцию K2Cr2O7 в дозе 0,28 мг/кг в течение
48 дней; 4-я — животные получали ежедневно в/б инъекцию K2Cr2O7 в дозе 2,8 мг/кг в течение 48 дней. Для определения
активности сперматогенеза использовали количественный цитологический анализ. Уровень перекисного окисления липидов
в ткани семенника определяли по накоплению конъюгированных диенов и малонового диальдегида.
Результаты. Цитологический анализ мазков показал снижение индекса напряженности сперматогенеза (p<0,05), увеличение
числа клеток Сертоли и Лейдига (p<0,05), увеличение числа сперматид с микроядрами и процента аномальных митозов
(p<0,05). При дозах 0,28 и 2,8 мг/кг происходит увеличение концентрации диеновых конъюгатов, а содержание малонового
диальдегида возрастает только при дозе 2,8 мг/кг (p<0,05). Активация процессов липопероксидации в гонадах сопровождалась
тенденцией к подавлению антиоксидантной активности.
Выводы. VICr в малых дозах вызывает нарушения в процессе сперматогенеза, которые приводят к снижению герминативной
функции семенника. Механизм действия VICr на семенники связан с активацией процессов перекисного окисления липидов
в гонадах.
Ключевые слова: VICr, сперматогенез, сперматиды с микроядрами, патологические митозы и мейозы, перекисное окисление
липидов.
Spermatogenesis and lipids peroxidation in rats gonads after hexavalent chrome action
V.P. MAMINA
Institute of Plant and Animal Ecology, Ural Division of Russian Academy of Sciences, Ekaterinburg, Russia, 620144
Objective. To study the influence of low dosed hexavalent chrome on spermatogenesis and lipid peroxidation in testis of Wister rats.
Material and methods. The experiments were performed on adult male Wistar rats weighing 230—250 g (n=40). The rats were
divided into four groups: group I (control) — rats injected daily with physiologic saline intraperitoneally (i.p.) for 48 days; group II
— received potassium dichromate (K2Cr2O7) at a dose 0,028 mg/kg daily i.p.; group III — received potassium dichromate (K2Cr2O7)
at a dose 0,28 mg/kg daily i.p.; group IV — received potassium dichromate (K2Cr2O7) at a dose 2,8 mg/kg daily i.p. The level of lipid
peroxidation was measured at the accumulation of dienes conjugate and malondialdehyde.
Results. The decrease of spermatogenesis intensity index was observed (p<0.05), the increase of Sertoli and Leydig cells was found
(p<0.05) and the increase of spermatids with micronucleus and percent of abnormal mitosis (p<0.05) was demonstrated. The
activation of lipid peroxidation in gonads was accompanied by decreasing antioxidatic activity.
Conclusion. Hexavalent chrome causes abnormal spermatogenesis. The mechanism of hexavalent chrome action is associated with
lipid peroxidation activation.
Keywords: hexavalent chromium, spermatogenesis, spermatids with micronuclei, lipids peroxidation.
На сегодняшний день проблема воздействия химических факторов окружающей среды на репродуктивную функцию мужчин остается весьма актуальной в связи с ростом идиопатического мужского
бесплодия [16]. За последние десятилетия отмечалось ухудшение показателей состояния репродуктивного здоровья: коэффициент фертильности
мужчин снизился в 1,5 раза [1], причинами бес-
плодного брака в 30—40% случаях является инфертильность мужчин [8, 18]. Соединения шестивалентного хрома (VICr) относятся к опасным загрязнителям окружающей среды и входят в перечень
потенциально опасных химических веществ по действию на репродуктивную функцию человека [10,
e-mail: mamina@ipae.uran.ru
23
Сперматогенез и ПОЛ после воздействия шестивалентного хрома
11]. Кроме того, загрязнители окружающей среды, в
том числе и VICr, обладающие мутагенными и канцерогенными свойствами, являются основными
факторами риска в период полового созревания организма [9]. Данные о влиянии VICr в малых дозах на
мужскую репродуктивную функцию единичны и
зачастую противоречивы. Противоречивость мнений, по-видимому, обусловлена тем, что при воздействии малых доз не всегда выявляются биологические эффекты в силу различных причин (объект
исследования, короткий период наблюдений, выбор адекватной тест-системы и т.д.). Кроме того,
длительное (хроническое) воздействие, как правило, сопровождается одновременными процессами
репарации. Поэтому в токсикологических исследованиях для выявления нарушений герминативной
функции семенников необходимо использовать
наиболее информативный показатель, к которому
следует отнести количественный, гистологический
анализ семенников [6, 7]. Одной из возможных
причин мужского бесплодия является «оксидантный стресс», затрагивающий как количественную,
так и качественную характеристику спермограммы
[13]. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гонадах может служить индикатором
ранних изменений в герминативной функции семенников. Изучение механизмов повреждающего
действия VICr на сперматогенный эпителий позволяет прогнозировать риск развития специфической
патологии и отдаленных последствий, разработать
систему профилактических мероприятий.
Цель настоящей работы — изучить влияние VIСr в
малых дозах на состояние сперматогенеза и процессы ПОЛ в семенниках у крыс линии Wistar, выявить
возможную взаимосвязь нарушения процесса сперматогенеза и состояния ПОЛ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводились на половозрелых
самцах (n=35) разведения Wistar с массой тела 237—
257 г. Статистические группы составляли по 6—8
особей. Моделирование хромовой интоксикации
осуществлялось при субхроническом ежедневном
внутрибрюшинном введении животным бихромата
калия (K2Cr2O7 ) в дозах 1/1000, 1/100 и 1/10 от LD50
(LD50=28 мг на 1 кг массы тела), что составляет
0,028, 0,28 и 2,8 мг на 1 кг массы тела по веществу.
Наибольшая из доз соответствует уровню порога
острого действия по общетоксическим показателям
[12]. Две другие дозы в токсикологии считаются малыми, последнюю из них можно приблизительно
соотнести с предельно допустимой концентрацией
в воздухе рабочей зоны. В конце экспозиционного
периода животных умерщвляли путем цервикальной дислокации с соблюдением требований Международных принципов Хельсинкской декларации
24
о гуманном отношении к животным для экстирпации органов [20]. Проводили цитологический анализ окрашенных мазков гомогенатов ткани семенников: определяли процентное соотношение клеток разных генераций сперматогенного эпителия
(сперматогоний, сперматоцитов и сперматид), количество округлых сперматид с микроядрами, количество клеток Сертоли и Лейдига, индекс напряженности сперматогенеза, митотический и мейотический индексы [2]. Уровень ПОЛ в семенниках
определяли по накоплению диеновых конъюгатов
(ДК) [5] и малонового диальдегида (МДА) [14], активность антиоксидантной системы — по подавлению Fe2+-зависимого окисления фосфолипидов
желтка [3]. Статистическую обработку полученных
результатов проводили с помощью программного
пакета Statistica 6.0 с использованием непараметрического U-критерия Уилкоксона—Манна—Уитни
[4], значимые различия при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Цитологический анализ мазков из клеточного
гомогената семенников у крыс, подвергнутых воздействию VICr, показал достоверное снижение числа
сперматоцитов, сперматид, увеличение числа клеток
Сертоли и снижение индекса напряженности сперматогенеза (рис. 1). Следует отметить, что у животных, получивших дозы 2,8 и 0,28 мг/кг VICr, наблюдается увеличение в 1,5 раза числа клеток Лейдига
(p<0,05). Кроме того, эти клетки отличались более
крупными размерами и базофильной зернистостью
по сравнению с контролем. Количественные и морфологические изменения эндокриноцитов скорее
всего вызваны нарушением процесса сперматогенеза и носят компенсаторно-защитный характер.
При всех исследуемых дозах наблюдалось снижение митотического и мейотического индексов,
достоверно значимое увеличение числа сперматид с
микроядрами и патологических митозов и мейозов
(табл. 1). Аберрации были представлены в основном фрагментами и мостами (рис. 2). Увеличение
числа сперматид с микроядрами и процента аномальных митозов происходит за счет мутагенного
эффекта VICr.
Известно, что соединения VICr обладают мутагенными и канцерогенными свойствами [17].
Снижение мейотического индекса вызывает задержку дифференцировки и созревания половых
клеток на последующих стадиях. Результаты по влиянию VICr на ПОЛ в гонадах представлены в табл. 2.
Из приведенных данных следует, что при дозах 0,28 и
2,8 мг/кг наблюдается увеличение концентрации
ДК, а содержание МДА возрастает только при дозе
2,8 мг/кг. Активация процессов липопероксидации в
гонадах сопровождалась тенденцией к подавлению
антиоксидантной активности.
Проблемы репродукции, 2, 2015
Таблица 1. Показатели пролиферативной активности сперматогенных клеток и мутагенного эффекта при воздействии VICr
Показатель
Контроль
Митотический индекс, ‰
Мейотический индекс, ‰
Сперматиды с микроядрами
Патологические митозы и мейозы
Доза, VICr
0,28 мг/кг
0,18±0,04
0,51±0,08
0,50±0,06*
12,5±0,88*
0,028 мг/кг
0,18±0,03
0,53±0,09
0,76±0,08*
15,2±2,46*
0,32±0,05
0,63±0,06
0,35±0,04
9,5±1,4
2,8 мг/кг
0,22±0,05
0,55±0,05
2,20±0,4*
14,7±1,7*
Примечание. Здесь и в табл. 2: * — значимые различия между контрольной и опытными группами (p<0,05).
Таблица 2. Показатели ПОЛ в семенниках крыс при воздействии K2Cr2O7 в разных дозах
Показатель
Контроль
ДК, нмоль/г ткани
МДА ткани, нмоль/г
АОА, усл. ед.
6,95±0,17
3,62±0,14
0,40±0,06
Доза (K2Cr2O7)
0,28 мг/кг
7,62±0,32*
3,84±0,21
0,25±0,04
0,028 мг/кг
7,75±0,87
3,94±0,57
0,28±0,06
2,8 мг/кг
7,76±0,28*
3,96±0,22*
0,30±0,03
Примечание. АОА — антиоксидантная активность.
%
18
16
14
12
1 – Сперматогонии
2 –Сперматоциты
3 – Сперматиды
4 – Сертоли
5 – ИН
10
8
6
4
2
0
1
2
3
4
Интактные
5
1
2
3
4
5
1
2
0,028
3
4
5
1
0,28
2
3
4
5
2,8
Доза VICr, мг/кг
Рис. 1. Количество сперматогенных клеток и клеток Сертоли на мазках из гомогената семенников, индекс напряженности сперматогенеза (ИН) у крыс после воздействия VICr в разных дозах.
С процессами ПОЛ в клетках связаны не только
структурная и функциональная организация клеточных мембран, но и скорость деления и гормональная
рецепция. Поэтому образование свободных радикалов и накопление промежуточных продуктов ПОЛ
оказывают влияние на процессы клеточной пролиферации, воздействуя на ДНК клетки, вызывают в
них мутационные изменения, которые впоследствии
приводят к формированию патологических форм
сперматозоидов [15]. Кроме того, активация ПОЛ
стимулирует процессы апоптоза в ткани семенника
[19]. Поэтому снижение числа сперматогенных клеток, которое мы наблюдаем в эксперименте, может
быть обусловлено не только задержкой дифференциации клеток, но и их гибелью.
ВЫВОДЫ
1. Воздействие VICr в малых дозах на семенники
крыс вызывает нарушения в процессе сперматогенеза, которые приводят к снижению его герминативной функции.
25
Сперматогенез и ПОЛ после воздействия шестивалентного хрома
Рис. 2. Патологические митозы у крыс при воздействии VICr (обозначены стрелками).
а — ×960; б — ×1350.
2. Повышение функциональной активности эндокриноцитов при воздействии VICr в дозах 2,8 и 0,28
мг/кг носит компенсаторно-защитный характер.
3. При всех исследуемых дозах выявлен мутагенный эффект VICr на половые клетки семенника.
4. Механизм действия VICr на семенники связан с
активацией процессов ПОЛ в гонадах. Повышение
уровня липопероксидации сопровождается подавлением антиоксидантной активности.
Конфликт интересов — отсутствует.
Источники финансирования: государственная организация.
ЛИТЕРАТУРА
1.
Быков В.Л. Сперматогенез у мужчин в конце ХХ века. Проблемы репродукции. 2000;1:6-13.
11. Хром. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Женева. ВОЗ;1990.
2.
Иванов Ю.В. Морфологические методы исследований в гигиене и токсикологии. Гигиена и санитария. 1983;4:17-20.
3.
Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О. Оценка антиоксидантной активности плазмы крови с применением
желточных липопротеидов. Лабораторное дело. 1988;5:59-62.
12. Шейко Л.Д. Функциональное состояние яичников и семенников крыс при воздействии малых доз солей шестивалентного хрома. Дальневосточный медицинский журнал (приложение). 1997;2:40-42.
4.
Кобзарь А.И. Прикладная математическая статистика. М. 2006.
5.
Костюк В.А., Потапович А.И., Лунец Е.Ф. Спектрофотометрическое определение диеновых конъюгатов. Вопросы медицинской химии.1984;30:4:125-127.
6.
Королев Ю.Н., Курило Л.Ф., Гениатулина М.С., Никулина
Л.А. Структурно-функциональные нарушения в семенниках
крыс в условиях острого иммобилизационного стресса. Андрология и генитальная хирургия. 2012;4:25-28.
7.
Курило Л.Ф. Система тестирования факторов, повреждающих женские и мужские гаметы и гонады. Гигиена и санитария. 2011;5:72-78.
8.
Никитин А.И. Гормоноподобные ксенобиотики и репродуктивная система. Проблемы репродукции. 2002;2:5-15.
9.
Никитин А.И. Вредные факторы среды и репродуктивная система человека (ответственность перед будущими поколениями). 2-е издание, дополненное. СПб:. Элби-СПб. 2008;240.
10. Перечень веществ, продуктов, производственных процессов,
бытовых и природных факторов, канцерогенных для человека. Федеральные санитарные правила, нормы и гигиенические нормативы. ГН 1.1.029-95. М. 1995;3-7.
26
13. Agarwal A, Saleh RA. Role of oxidants in male infertility: rationale,
significance, and treatment. Urologic Clinics of North America.
2002;29:1-12.
14. Asakawa G, Matsushita S. Coloring conditios of thiobarbituric acid test for detecting lipid peroxides. Lipids. 1980;15:3:137-140.
15. Aitken RJ, Krausz C. Oxidative stress, DNA damage and the Y
chromosome. Reproduction. 2001;122:497-506.
16. Dohle GR, Diemer T, Giwercman A. Europ Assoc Urology. 2010.
17.
Saxena DK, Murthy RC, Lal B. et al. Effect of hexavalent chromium on testicular mutaration on the rat. Reprod Toxicol.
1990;4:223-228.
18. Sharlip ID, Jarow JP, Belker AM, Lipshultz LI, Sigman M, Thomas AJ. et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril.
2002;77:873-882.
19. Sinha HAP, Swerdloff RS. Hormonal and genetic control of germ
cell apoptosis in the testis. Rev Reprod. 1999;4:38-47.
20. World Medical Association Declaration of Helsinki: Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects. UMS.
2002;42-46.