Жилкова Влияние фрагментации ДНК и нарушения процесса

УДК 573.6:577.21-076
Влияние фрагментации ДНК и нарушения процесса созревания сперматозоидов
на степень бластуляции в программе ЭКО
А.М. Феськов1, И.А. Феськова1, Е.С. Жилкова1, Е.В. Сомова1, А .Н. Зозулина1
1
Клиника профессора Феськова A.M., «Центр Репродукции Человека», Украина,
61098, г. Харьков, ул. Елизарова 15
email: zhilkova@feskov.com.ua; zhilkova@mail.ru
Введение
В настоящее время нарушениям отцовского генома уделяется все большее
внимание в репродуктивной медицине. Использование классического анализа спермы
не всегда позволяет выявить отцовский эффект, обусловливающий нарушения
эмбрионального развития [1, 2]. Отцовский эффект может быть связан с такими
генетическими
факторами,
как
генные мутации,
микроделеции,
анеуплоидии,
повреждения ДНК и нарушения компактизации хроматина [3-5]. Сперматогенез - это
сложный многостадийный процесс развития и созревания сперматозоидов из незрелых
половых клеток. В среднем, продолжительность созревания сперматозоида занимает
около двух с половиной месяцев. Нормальное протекание сперматогенеза требует
скоординированного влияния многочисленных факторов (генетических, клеточных,
гормональных и других). Следствием нарушения процесса созревания может быть
наличие анеуплоидий в ядрах сперматозоидов, а также фрагментация ДНК
сперматозоидов [6-7]. Фрагментация ДНК сперматозоидов - относительно недавно
открытая предположительная причина мужского бесплодия, которая интенсивно
исследуется в последнее десятилетие [8, 9]. В то же время известны противоречивые
данные о возможном влиянии фрагментации ДНК сперматозоидов на ранние этапы
эмбрионального развития, процесс бластуляции, на повышенный риск замирания
беременности на раннем сроке и частоту спонтанных абортов [10, 11]. Фрагментация
ДНК представляет собой двухцепочечные и одноцепочечные разрывы молекулы ДНК.
Причинами разрывов ДНК считают процессы изменения структуры хроматина в ходе
сперматогенеза и апоптоз [12-14].
Разрывы ДНК, выявляемые в эякуляторных сперматозоидах, могут являться
следствием дефекта созревания в ходе сперматогенеза (репарации и ремоделинга). С
другой стороны, не исключено, что такие дефекты могут служить факторами запуска
апоптоза [15]. В среднем около 20% эякуляторных сперматозоидов мужчин с
различными
параметрами
спермограммы
выявляются
как
апоптотические.
Установлено, что фрагментация ДНК, как следствие апоптоза, значительно ниже в
группе мужчин с нормозооспермией в сравнении с группами мужчин с нарушениями
параметров классической спермограммы [16]. Предполагается, что апоптоз служит
конечным результатом различных патологических состояний и системой деградации,
контролирующей сперматогенез [17]. Аномалии хроматина сперматозоидов часто
ассоциированы с низкими показателями спермограммы, однако многие исследователи
констатируют, что параметры фрагментации не имеют четкой корреляции с
параметрами спермы, рекомендованными к исследованию ВОЗ (концентрацией,
подвижностью, морфологией) [18-21]. В то же время в ряде исследований найдена
отрицательная корреляция фрагментации ДНК с характеристиками спермограммы:
концентрацией,
подвижностью
и
процентом
морфологически
аномальных
сперматозоидов [22, 23]. Спорным также остается вопрос о зависимости степени
фрагментации ДНК от возраста пациента [24].
Цель. Целью данной работы было исследовать содержание сперматозоидов,
несущих фрагментированную ДНК, у мужчин с высоким уровнем незрелых
сперматозоидов в эякуляте, а также оценить степень бластуляции и частоту
наступления беременности после переноса эмбрионов, полученных от таких пациентов,
в ходе программы ЭКО.
Материалы и методы
В ходе данной работы
были сформированы 2 экспериментальные группы.
Группа 1 состояла из 132 пациентов, для которых была исследована зависимость между
содержанием сперматозоидов с фрагментированной ДНК и частотой бластуляции
эмбрионов в программе ЭКО. Средний возраст пациентов был 36,5±4,3 лет. В группу 2
были включены 120 мужчин, для которых была исследована корреляция между
содержанием незрелых сперматозоидов и сперматозоидов, несущих поврежденную
ДНК. Средний возраст пациентов был 39,5±6,2 лет. Отдельным этапом работы стало
проведение исследования частоты наступления клинической беременности после
переноса эмбрионов, полученных
в программах ЭКО от 150 пациентов с разной
степенью фрагментации ДНК сперматозоидов (группа 3).
С целью исследования корреляции между уровнем фрагментации ДНК с
показателями спермограммы в ходе подготовки к программе ЭКО/ИКСИ было
обследовано 80 мужчин. Из них: 35 пациентов с астенозооспермией, 24 пациента с
олигозооспермией и 21 пациент с тератозооспермией. Средний возраст пациентов был
39,5±4,3 лет. Группу контроля составили 20 пациентов с заключением спермограммы
«нормозооспермия».
С целью проведения анализа фрагментации ДНК сперматозоидов был
использован метод SCD (sperm chromatin dispersion) (HaloSperm, Halotech, Испания).
Метод основан на дисперсии хроматина вокруг ядра, за счет чего можно различить
сперматозоиды с различной степенью фрагментации ДНК. Анализ был проведен с
помощью
флуоресцентного
микроскопа
Nikon
Eclipse
80i.
Результат
был
задокументирован с помощью цитогенетической программы Lucia FISH (LIM, Чехия).
Содержание сперматозоидов в эякуляте, содержащих фрагментированную ДНК, в
норме не должно было превышать 20,0 % [16].
Исследование
степени
зрелости
сперматозоида
основано
на
селекции
сперматозоидов по степени связывания с гиалуроновой кислотой (hyaluron binding
assay, HBA-тест). Только полностью зрелый сперматозоид с интактной ДНК имеет на
головке специальные рецепторы и способен эффективно связываться с гиалуронатом.
Для определения содержания зрелых спермиев в эякуляте были использованы наборы
компании Biocoat Incorporation (США). В норме содержание незрелых сперматозоидов
в эякуляте не должно было превышать 20,0 % [17].
В ходе программы ЭКО для КСО использовали протокол
с а-ГнРГ. КСО
занимала по времени не менее десяти дней. На момент трансвагинальной пункции
размер фолликулов в среднем достигал 18 мм. Для поддержки лютеиновой фазы у
пациенток
применяли
препараты
прогестеронового
ряда.
Полученные
после
трансвагинальной пункции ооциты и зиготы в течение двух дней культивировались в
средах Universal IVF Medium (Medicult). Эмбрионы, начиная с третьего дня развития и
до
стадии
бластоцисты,
культивировались
в
среде
BlastAssist
(Medicult).
Культивирование эмбрионов проходило при температуре 36,8ºС – 37,1ºС; при
содержании СО2 5,5 – 6,0 %. Перенос эмбрионов был проведен на пятые сутки
развития эмбрионов в среде UTM (Medicult).
Полученные
данные
статистически
обработаны
с
помощью
t-критерия
Стьюдента, а также путем определения коэффициента корреляции Пирсона [25].
Результаты
При исследовании зависимости частоты формирования бластоцист (ЧФБ) от
содержания сперматозоидов с поврежденной ДНК значительное снижение степени
бластуляции выявлено при фрагментации ДНК более 40,0% (р<0,05). Результаты
данного анализа приведены в таблице 1.
Корреляция между результатами HBA-теста и анализа фрагментации ДНК
сперматозоидов была установлена в 82,5 % случаев (р<0,05). Результаты по
исследованию степени зрелости сперматозоидов, содержанию сперматозоидов с
анеуплоидиями и фрагментированной ДНК для 120 пациентов приведены в таблице 2.
При
исследовании
зависимости
параметров
спермограммы
от
уровня
фрагментации ДНК спермы среди пациентов, для которых было выявлено высокое
содержание сперматозоидов с фрагментированной ДНК, 27 пациентов имели
заключение спермограммы «астенозооспермия» (77,1 % случаев астенозооспермии), 16
пациентов – с олигозооспермией (66,7 % случаев олигозооспермии), 10 пациентов – с
тератозооспермией (47,6 % мужчин с тератозооспермией). В контрольной группе
высокое содержание спермиев с фрагментированной ДНК было выявлено у 2
пациентов (10,0 % пациентов с нормозооспермией). Не выявлено значительных
отличий по содержанию сперматозоидов, несущих фрагментированную ДНК, для
пациентов с астено-, олиго- и тератозооспермией. Однако, содержание сперматозоидов
с поврежденной ДНК значительно (р<0,05) выше у пациентов с низкими показателями
спермограммы, в сравнении
исследованию
корреляции
с пациентами с нормозооспермией. Результаты по
между
параметрами
спермограммы
и
степенью
фрагментации ДНК сперматозоидов приведены в таблице 3.
Таблица 1. Частота формирования бластоцист (ЧФБ) для мужчин с разной
tφ
tst
26,1
52,0 %
± 16,4 %
487,5
-0,21
0,21
0,98
2,08
21-40 %
18 чел.
30,0 %
± 6,3 %
45,5
28,4 %
± 17,6 %
414,8
-0,19
0,49
0,39
2,78
Более
45 чел.
52,6 %
± 8,2 %
69,3
29,3 %
± 12,1 %
155,6
-0,99
0,07
13,31
4,30
40 %
ЧФБ
± 4,4 %
ЧФБ
9,7 %
индексу
69 чел.
среднее
0-20 %
человек
Ошибка
коррел. r
Коэфф-т
Дисперсия
Ошибка к
средний, %
Индекс ЧФБ
фр. ДНК
Дисперсия
фрагм. ДНК
Ошибка к
Фр. ДНК
Количество
фрагм. ДНК
Группы по
степенью фрагментации ДНК сперматозоидов (р<0,05).
Таблица 2. Содержание анеуплоидных спермиев и сперматозоидов, несущих
фрагментированную ДНК при нормальном и высоком содержании незрелых
сперматозоидов в эякуляте.
Результат исследования
Количество
пациентов, N
Количество
пациентов, %
51
42,5 %
21
17,5 %
HBA-тест: менее 20,0 %;
SCD-тест: менее 20,0 %;
HBA-тест: более 20,0 %;
SCD-тест: менее 20,0 %;
HBA-тест: более 20,0 %;
48
40,0 %
SCD-тест: более 20,0 %
Таблица 3. Корреляция между параметрами спермограммы и степенью
фрагментации ДНК сперматозоидов
Заключение
спермограммы
SCD-тест: содержание сперматозоидов с
фрагментированной ДНК более 20 %
Количество пациентов,
N
Количество пациентов,
%
Олигозооспермия
16
66,7 %
Астенозооспермия
27
77,1 %
Тератозооспермия
10
47.6 %
Нормозооспермия
2
10,0 %
Отдельным этапом работы стало проведение исследования частоты наступления
клинической беременности после переноса эмбрионов, полученных в программах ЭКО
от 150 пациентов с разной степенью фрагментации ДНК сперматозоидов: 92 пациента
со степенью фрагментации ДНК менее 20,0 %; 58 пациентов со степенью фрагментации
ДНК более 20,0 %. Для данной группы пациентов частота наступления клинической
беременности была практически в 1,6 раз больше для пациентов, у которых
фрагментация ДНК сперматозоидов не превышала 20,0 % (р<0,05). Разница между
частотой замирания беременности у пациентов с высокой степенью фрагментации ДНК
сперматозоидов и уровнем фрагментации ДНК в пределах нормы статистически не
значима. Данные представлены в таблице 4.
Таблица 4. Частота наступления беременности для пациентов с разной
степенью фрагментации ДНК спермы.
Фрагментация Количество
ДНК, %
человек
Клинические
Клинические
Замершие
беременности, N
беременности,
беременности
%
/ спонтанные
аборты, %
Менее 20,0 %
92
44
47,8
18,2 %
Более 20,0 %
58
17
29,3
23,5 %
С целью анализа зависимости частоты наступления беременности от содержания
незрелых форм сперматозоидов в эякуляте (от результатов НВА-теста) была
сформирована группа из 91 пациента: 44 пациента с содержанием незрелых
сперматозоидов менее 20,0 %, 47 пациентов с содержанием незрелых сперматозоидов
более 20,0 %. В результате проведения программы ЭКО для указанной группы
пациентов не было выявлено достоверной разницы между частотой наступления
беременности для пациентов с содержанием незрелых форм сперматозоидов в пределах
или выше нормы.
Выводы
Корреляция между результатами HBA-теста и анализа фрагментации ДНК
сперматозоидов была установлена в 82,5 % случаев, что подтверждает возможность
селективного метода, основанного на связывании гиалуроновой кислоты для выявления
сперматозоидов, несущих неповрежденную ДНК (р<0,05). Зависимость степени
бластуляции эмбрионов в программах ЭКО от степени фрагментации ДНК
сперматозоидов выявлена в случае значения фрагментации ДНК 40,0 % и выше
(р<0,05). Частота наступления клинической беременности значительно выше для
пациентов, у которых фрагментация ДНК сперматозоидов не превышает 20,0 %
(р<0,05). Разница между частотой замирания беременности у пациентов с высокой
степенью фрагментации ДНК сперматозоидов и уровнем фрагментации ДНК в
пределах нормы статистически не значима. Не выявлено значительных отличий по
содержанию сперматозоидов, несущих фрагментированную ДНК, для пациентов с
астено-, олиго- и тератозооспермией. Однако, содержание спермиев с поврежденной
ДНК значительно (р<0,05) выше у пациентов с показателями спермограммы,
отличными от нормы, в сравнении с пациентами с нормозооспермией. Не выявлено
достоверной разницы между частотой наступления беременности для пациентов с
содержанием незрелых форм сперматозоидов в пределах или выше нормы.
Определение фрагментации ДНК и степени зрелости сперматозоидов могут быть
рассмотрены как необходимые этапы диагностики в рамках подготовки пациентов к
программе ЭКО. Значения фрагментации ДНК, а также оценка степени зрелости
сперматозоидов имею прогностическую значимость качества эмбрионов, получаемы
при применении методов лечения ВРТ.
Список литературы
1. Воробьева О.А., Воскресенская А.В., Одинцов А.А., Филатов М.В. / Мужское
бесплодие и нарушение структурной организации хроматина сперматозоидов.
Существует ли связь? // Проблемы репродукции. – 2005. -№ 6. – с. 56-62.
2. Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Сорокина Т.М., Гришина Е.М. / Структура
наследственных нарушений репродуктивной системы. // Вест РАМН.- 2000.- №
5. – c. 32-36
3. Agarwal A., Said T.M. / Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in
male infertility. // Hum Reprod. – 2003.- Vol. 19. - № 4. – P. 331-345.
4. Benchaib M., Braun V., Lornage J. et al. / Sperm DNA fragmentation decreases the
pregnancy rate in an assisted reproductive technique // Hum. Reprod. - 2003. - Vol.
18, № 5. - Р. 1023-1028.
5. Brugnon F., Van Assche E., Verheyen G. et al. / Study of two markers of apoptosis
and meiotic segregation in ejaculated sperm of chromosomal translocation carrier
patients. // Hum Reprod. – 2006. –Vol. 21, № 3. – P. 683-685.
6. Calle J.F., Muller A., Walschaerts M. el al. / Sperm deoxyribonucleic acid
fragmentation as assessed by the sperm chromatin dispersion test in assisted
reproductive technology programs: results of a large prospective multicenter study //
Fertility and Sterility. - 2008. – Vol. 19, № 6. – P. 671-682.
7. Cayli S., Sakkas D., Vigue L., Demir R., Huszar G. Cellular maturity and apoptosis in
human sperm: creatin kinase, caspase-3 and Bcl_XL levels in mature and diminished
maturiry sperm // Mol. Hum. Reprod. – 2004. -Vol. 10. - № 5.- P. 365-372.
8. Dohle G.R., Diemer T., Giwercm A., Jungwirth A., Kopa Z., Krausz C. Мужское
бесплодие (научное редактирование: Акопян А.С.). – Европейская ассоциация
урологов. – 2010. – 67 с.
9. Findikli N., Kahraman S., Kumtepe Y. /Assessment of DNA fragmentation and
aneuploidy on poor quality human embryos // Reprod Biomed Online. - 2004. – Vol.
8.- № 2.- P. 196-206.
10. Henkel R., Kierspel E., Hajimohammad M. et al. / DNA fragmentation of spermatozoa
and assisted reproduction technology // Reprod Biomed Online. – 2003.- № 7. – Р.
477-484.
11. Hong Ye, Guo-ning Huang , Yang Gao, De Yi Liu. / Relationship between human
sperm-hyaluronan binding assay and fertilization rate in conventional in vitro
fertilization // Hum. Reprod. – 2006. – Vol. 21. - №6. – P. 1545-1550.
12. Oehninger S., Chaturvedi S., Toner J. et al. / Semen quality is there a paternal effect
on pregnancy outcome in in-vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection? //
Hum Reprod. – 1998. – № 13. – P. 2161-2164.
13. Pandiyan N., Jequier A. / Meiotic structural chromosomal abnormalities of 1210
infertile males // Hum Reprod. – 1996. – Vol. 11. - № 12. – P. 1321-1326.
14. Sarah E. D., Sean P.F., Colin D. M. / Detection of chromosomes and estimation of
aneuploidy in human spermatozoa using in-situ hybridization // Molecular Human
Reproduction.-1997.-Vol. 3.-№ 7.-P. 585-598.
15. Schlegel P.N., Paduch D.A. / Yet another test of sperm chromatin structure // Fertil
Steril.- 2005. – Vol. 84.- № 4. – P. 854-859.
16. Seli E., Sakkas D. / Spermatozoal nuclear determinants of reproductive outcome:
implications for ART // Hum Reprod Update. - 2005. – V. 11, № 4. – P. 337-349.
17. Tesarik J., Mendoza C., Greco E. / Paternal effects acting during the first cell cycle of
human preimplantation development after ICSI // Hum Reprod. – 2002. - № 17. – P.
184-189.
18. Mehdi Benchaib, ValeÂrie Braun, Jacqueline Lornage, Samia Hadj et al. / Sperm
DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique
// Hum Reprod. - 2003. - V.18. - №.5. - Р. 1023-1028.
19. M. Muratori, S. Marchiani, L. Tamburrino, V. Tocci, P. Failli, G. Forti and E. Baldi. /
Nuclear staining identifies two populations of human spermwith different DNA
fragmentation extent and relationshipwith semen parameters // Hum Reprod. – 2008. V. 23. - №.5. - Р. 1035–1043.
20. Luke Simon, Gunnar Brunborg, Michael Stevenson,Deborah Lutton et al. / Clinical
significance of sperm DNA damage in assisted reproduction outcome // Hum Reprod.
- 2010. - V.25. - №.7. - Р. 1594–1608.
21. B.E. Speyer, A.R. Pizzey, M. Ranieri, R. Joshi, J.D.A. Delhanty and P. Serhal. / Fall in
implantation rates following ICSI with sperm with high DNA fragmentation // Hum
Reprod. – 2012. - V.25. - №.7. - Р. 1609–1618.
22. F. Bronet, E. Martıґnez, M. Gaytaґn, A. Lin˜aґn, D. Cernuda, M. Ariza, M. Nogales et
al. / Sperm DNA fragmentation index does not correlate with the sperm or embryo
aneuploidy rate in recurrent miscarriage or implantation failure patients // Hum
Reprod. – 2012. - V.27. - №.7. - Р. 1922–1929.
23. A.Borini, N.Tarozzi, D.Bizzaro, M.A.Bonu, L.Fava, C.Flamigni and G.Coticchio. /
Sperm DNA fragmentation: paternal effect on early post-implantation embryo
development in ART // Hum Reprod. – 2006. - V. 21. - №.11. - Р. 2876–2881.
24. K. Oleszczuk, A. Giwercman, M. Bungum. / Intra-individual variation of the sperm
chromatin structure assay DNA fragmentation index in men from infertile couples //
Hum Reprod. – 2011. - V.26. - №.12. - Р. 3244–3248.
25. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. – 460 с.