Утверждаю» Председатель Ученого совета Биолого

«Утверждаю»
_________________________
Председатель Ученого совета
Биолого-почвенного факультета СПбГУ
И.А.Горлинский
ОТЧЕТ
Докторанта Романовской Екатерины Вячеславовны
о работе над докторской диссертацией
«Молекулярная структура и динамика комплексов транскрипционных факторов с ДНК
при активации транскрипции эукариотических генов»
за второй год докторантуры
Общепризнано, что процессы регуляции транскрипции реализуются на хроматиновой
матрице. Компонентами хроматина регуляторных областей многих индуцибельных генов
являются транскрипционные факторы семейства NF1. Впервые эти белки были описаны в 1982
г. как факторы, специфически связывающиеся с четырьмя участками ДНК в 5'-области гена
лизоцима цыпленка (первоначально – TGGCA-связывающий белок), затем были найдены как
обязательные компоненты регуляторных систем более 100 генов, как экспрессирующихся на
ранних стадиях эмбрионального развития, так и тканеспецифичных, что позволяет отнести их к
конститутивным факторам транскрипции. NF1 связывается как гомодимер с симметричной
консенсусной последовательностью 5'-TTGGCNNNNN(N)GCCAA-3' на дуплексе ДНК. Однако
позднее выяснилось, что он взаимодействует с любой половиной палиндромной
последовательности – только с меньшим сродством, и при этом сохраняется его способность
активировать транскрипцию.
Тонкие механизмы участия транскрипционных факторов NF1 в процессах регуляции
транскрипции до конца не выяснены. С одной стороны, факторы NF1 являются классическими
компонентами энхансеосомы и участвуют в передаче регуляторного сигнала. Причем влияние
NF1 на транскрипцию может быть как активирующим, так и репрессирующим. С другой
стороны, факторы транскрипции семейства NF1 обладают рядом особенностей, не свойственных
другим представителям сайт-специфических белков. Так, необходимо отметить их способность
функционировать в качестве как факторов транскрипции, так и факторов репликации геномов
некоторых вирусов.
Самым интересным свойством, с нашей точки зрения, является cлабое связывание
факторов NF1 с ДНК в составе нуклеосомных частиц. Белки NF1 обладают в 100-300 раз более
низким сродством к нуклеосомной ДНК по сравнению со свободной – независимо от
ротационного и трансляционного позиционирования ДНК в частице. Данные, полученные в
последнее время, позволяют предположить, что транскрипционные факторы этого семейства
участвуют в ремоделировании нуклеосомы и поддержании специфической предустановленной
(“preset”) структуры хроматина в регуляторных областях, которая определяет состояние
компетенции гена к транскрипции. Фундаментальная роль транскрипционных факторов NF1 в
формировании структуры хроматина проявляется и в вовлечении NF1 во многие опухолевые
процессы. Отдельные изоформы факторов контролируют экспрессию гена опухолевого
супрессора р53 в молочной железе мыши, генов онкобелков Е6 и Е7 вируса папилломы
человека, вызывающего рак шейки матки.
В качестве модельной системы для изучения роли факторов NF1 в организации
хроматина исследуется структура хроматина регуляторной области гормон-зависимого гена
триптофандиоксигеназы (ген tdo) крысы при переходе гена к транскрипционно активному
состоянию. Ген tdo крысы экспрессируется преимущественно в печени. В хроматине
регуляторной
области
гена
tdo
обнаружены
три
конститутивных
участка
гиперчувствительности к ДНКазе1, что свидетельствует о компетентном к транскрипции
состоянии хроматина. Известно, что в регуляторной области гена tdo локализованы сайты
связывания рецепторов глюкокортикоидных гормонов, САССС-связывающего фактора и
транскрипционных факторов семейства NF1. Данные о том, что сайты связывания NF1
совпадают с конститутивными участками гиперчувствительности к ДНКазе1, с одной стороны,
и появившиеся в последние годы данные о решающей роли факторов семейства NF1 в
формировании открытой («preset») структуры хроматина гена лизоцима цыпленка и промотора
вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV)позволили поставить основной задачей
нашего исследования детальное изучение взаимодействия NF1 со своими специфическими
сайтами в регуляторной области гена tdо в состоянии компетенции к транскрипции.
Было изучено связывание частично очищенных белковых экстрактов с фрагментами
регуляторной области гена tdo методом торможения электрофоретической подвижности в геле в
присутствии конкурентной ДНК. В качестве неспецифического конкурента мы использовали
ДНК фага λ, в качестве специфического конкурента – РvuII-фрагмент ДНК, содержащий
синтезированную
согласованную
нуклеотидную
последовательность
5’GATCCTTGGCAGCTTGCCAAG-3’, специфически взаимодействующую с фактором NF1.
Нами было показано, что при связывании EcoRI – HindIII-фрагмента регуляторной области гена
tdo от -499-го до -292-го нуклеотида с ядерными белками наблюдается образование трех
специфических комплексов C-1, C-3 и С-3. При увеличении концентрации специфического
конкурента происходит резкое уменьшение содержания комплексов, что свидетельствует о
принадлежности изучаемых белков к семейству ядерных факторов NF1. Аналогичные
результаты были получены и при связывании с ядерными белками HindIII – TaqI-фрагмента от
-292-го до -178-го нуклеотида. C помощью компьютерного анализа было показано, что данные
фрагменты ДНК содержат последовательности, гомологичные либо классической
палиндромной последовательности для NF1 с варьирующей длиной вставки между мотивами
узнавания, либо ее половине.
Материалы исследования доложены на IV съезде Российского общества биохимиков и
молекулярных биологов, Новосибирск, май 2008, и на международной конференции
EUROMAR Magnetic Resonance Conference, Санкт-Петербург, июль 2008. Сдана в печать статья
«Идентификация транскрипционных факторов семейства (NF1) в клетках печени крыс и
клетках гепатомы линии HTC».
Отчет заслушан и принят на заседании кафедры биохимии биолого-почвенного
факультета СПбГУ 10 ноября 2008 г., протокол №6.
Е.В.Романовская рекомендована для продолжения работы над докторской диссертацией
в докторантуре в 2009 году (третий год докторантуры).
И.о. зав. кафедрой биохимии
биолого-почвенного факультета СПбГУ
д.б.н., профессор
Н.Д. Ещенко