Молекулярно–генетическая характеристика факторов

На правах рукописи
Коваленко
Константин Алексеевич
Молекулярно–генетическая характеристика факторов
цитокиновой системы при ранних эмбриональных потерях
03.02.07 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону – 2014
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южный
федеральный университет» Министерства образования и науки
Российской Федерации
Научный руководитель:
кандидат биологических наук, доцент
Машкина Елена Владимировна
Официальные оппоненты:
Асланян Марлен Мкртичович,
доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова» Министерства образования и науки
Российской Федерации, профессор кафедры
генетики
Абилев Серикбай Каримович,
доктор биологических наук, профессор, Федеральное
государственное
бюджетное
учреждение науки Институт общей генетики
им. Н.И. Вавилова Российской академии
наук, заместитель директора института
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт биологии гена
Российской академии наук
Защита диссертации состоится 11 декабря 2014 г. в 14.00 часов на заседании
диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д
212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный
исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы,
85.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО
«Белгородский государственный национальный исследовательский университет» и на сайте: www.bsu.edu.ru.
Автореферат разослан «__»_____________________________ 2014 г.
Ученый секретарь совета
по защите диссертаций на соискание учѐной степени кандидата наук,
на соискание учѐной степени доктора наук Д 212.015.13,
доктор биологических наук
В.И. Кочкаров
2
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. В связи со сложившейся на сегодняшний день
В связи со сложившейся на сегодняшний день демографической ситуацией в
нашей стране проблема сохранения репродуктивного здоровья населения становится все более актуальной. Примерно 15-20% клинически подтвержденных
беременностей заканчиваются выкидышем (Luo L. et al., 2013). Кроме того, 25% женщин детородного возраста страдают от привычного невынашивания беременности (Сидельникова В., Сухих Г., 2010). Почти в 50% случаев причина
невынашивания беременности остается неизвестной (Regan L., Rai R., 2000,
2006; Bates S., 2010; Banerjee P. et al., 2013). Исследования механизмов, лежащих в основе ранних репродуктивных потерь, являются актуальными.
Несколько регулирующих механизмов (например, иммунологический, эндокринный и метаболический) участвуют в успешном развитии беременности человека и нарушение в любом из этих процессов приводит к нарушению ранних
этапов эмбрионального развития. Причины гибели зародышей в ранние сроки
беременности различны. Невынашивание беременности (НВБ) – это мультифакториальное заболевание, которое формируется на фоне неблагоприятных
внешних и внутренних факторов. Одной из ведущих причин ранних эмбриональных потерь принято считать генетический фактор. Если ранее считалось,
что основными наследственными причинами невынашивания беременности являются хромосомные аберрации, то в настоящее время появляется все больше
данных о влиянии генных мутаций и полиморфизма генов на нарушение течения беременности (Мартышин М. и др., 1980, Веропотвелян Н., 1989, Божедомов В. и др., 2000, Баранов В. и др., 2009). В настоящее время установлено, что
определенный вклад в развитие патологических состояний при беременности
может вносить наличие в генотипе полиморфных вариантов ряда генов. Данные
гены условно делятся на несколько функциональных групп, которые представляют собой самостоятельную генную сеть.
Адекватная имплантация, нормальная плацентация и, как следствие, полноценный кровоток способствуют установлению и успешному развитию беременности. Тромбофилии, обусловленные генетическими причинами, могут
приводить к нарушениям развития плода (Scifres C. et al., 2009). Наследственные тромбофилии могут стать причиной появления тромбозов в течение беременности и в постнатальном периоде, а так же к осложнения сосудистого характера плаценты. В результате возможны нарушения развития плода или процесса имплантации. (Grandone E. et al., 2003; Younis J. et al., 2003, Макацария А.
и др., 2007). Наследственные формы тромбофилии могут быть обусловлены мутациями в генах факторов свертывающей системы крови, ферментов фолатного
цикла, в генах фибриногена и его рецепторов, в генах ферментов, обеспечивающих процессы фибринолиза. Вклад полиморфизма генов фолатного цикла в
повышение риска невынашивания беременности может быть обусловлен также
участием фолатов во многих жизненно важных клеточных процессах, в том
3
числе биосинтезе пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, метилировании
ДНК и др. (Hassold T. et al., 2001; Kim S. et al., 2011).
Около половины случаев самопроизвольного прерывания беременности связаны с изменением функционирования факторов иммунной системы, реакцией
организма матери на плод как аллотрансплантат из-за отцовских антигенов.
Иммунологические нарушения могут быть обусловлены особенностями генотипа, в том числе и по генам цитокинов, которые являются эндогенными медиаторами межклеточных взаимодействий. Ранние этапы эмбриогенеза зависят от
соотношения функциональной активности про- и противовоспалительных цитокинов, опосредующих иммунный ответ материнского организма на развивающийся плод, контролирующих процессы формирования плаценты и ангиогенеза (Амчиславский T. и др., 2003; Bombell S., McGuire W., 2008; Kaur A.,
2011).
Ранние этапы эмбрионального развития базируются на механизмах, лежащих в основе функционирования нескольких функциональных групп белков и
генов, их кодирующих. Однако эти механизмы изучены недостаточно, что существенно затрудняет понимание закономерностей взаимодействия клеток различных типов, отдельных систем организма и формирования его реакций. Многие общие и частные проблемы генетики, физиологии, иммунологии и других
биологических дисциплин требуют исследования механизмов регуляции экспрессии генов цитокинов как молекул межклеточной сигнализации. Следует
добавить, что изучение контроля экспрессии как отдельных генов цитокинов,
так и генных кластеров, объединяющих гены цитокинов определенного типа,
способствует решению одной из важнейших проблем молекулярной биологии –
исследования механизмов регуляции экспрессии генов эукариот (Мордвинов
В., Фурман Д., 2009).
Цель работы. Исследовать индивидуальный и сочетанный вклад полиморфных вариантов генов цитокинов и уровня их экспрессии при ранних эмбриональных потерях.
Задачи исследования.
1. Определить частоты регистрации полиморфных вариантов генов про- и
противовоспалительных цитокинов в тканях материнского происхождения при
физиологически протекающей беременности, при спонтанной гибели эмбриона,
а также при неразвивающейся беременности первого триместра.
2. Определить частоты регистрации аллельных вариантов генов про- и
противовоспалительных цитокинов в хорионической ткани при физиологически протекающей беременности, при спонтанной гибели эмбриона и неразвивающейся беременности первого триместра.
3. Оценить сочетанный вклад полиморфных вариантов генов цитокинов,
факторов свертывающей системы крови и фолатного цикла в нарушение ранних этапов эмбрионального развития человека.
4. Изучить уровень экспрессии генов IL-1β, IL-6, TNFα, IL-10 в тканях материнского и зародышевого происхождения при физиологически протекающей
беременности и при невынашивании беременности первого триместра.
Научная новизна работы.
4
Впервые получены данные о частоте полиморфных вариантов генов
цитокинов в клетках хорионической ткани при двух различных патологиях
первого триместра беременности – спонтанной гибели эмбриона и
неразвивающейся беременности. Установлено, что гетерозиготный генотип 31СТ гена IL-1β преобладает среди женщин с неразвивающейся
беременностью. Установлено, что риск неразвивающейся беременности
повышается в случае гомозиготного состояния по аллели -174G гена IL-6 в
клетках хорионической ткани.
Впервые показано, что случаи спонтанной гибели эмбриона
характеризуются снижением доли образцов децидуальной и хорионической
тканей, полученных от одной женщины, в которых выявлен полиморфный
вариант гена IL-1β. Частота регистрации полиморфного варианта гена TNFα в
клетках крови среди женщин со спонтанным абортом статистически значимо
ниже по сравнению с контрольной группой и группой женщин с неразвивающейся беременностью. Фактором повышенного риска развития спонтанного
прерывания беременности является гетерозиготное состояние полиморфизма в
592 положении промоторного участка гена IL-10.
Впервые показано, что риск невынашивания беременности повышается при
сочетанном наличии аллельных вариантов генов IL-1β, MTRR, MTR и одного из
факторов свертывающей системы крови (SERPINE1 или ITGA2).
Впервые выявлены корреляционные связи между уровнями экспрессии
генов цитокинов в децидуальной и хорионической тканях при физиологически
протекающей беременности. В хорионической ткани при неразвивающейся
беременности все корреляционные связи между активностью генов цитокинов
нарушаются. Выявлено увеличение уровня экспрессии гена IL-1β в хорионе при
неразвивающейся беременности. Установлено, что при неразвивающейся
беременности в децидуальной ткани повышается уровень экспрессии генов IL6, IL-10.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. С повышенным риском возникновения неразвивающейся беременности
ассоциированы генотипы -31CT гена IL-1β и -174GG гена IL-6. Повышенный
риск спонтанного прерывания беременности характерен для генотипов -308GG
гена TNFα и -592СА гена IL-10.
2. Риск невынашивания беременности первого триместра увеличивается у
женщин, имеющих в своем генотипе исследуемые аллельные варианты генов
трех функциональных групп: цитокинов, фолатного цикла и факторов свертывающей системы крови (IL-1β, MTRR, MTR, SERPINE1, ITGA2, ITGB3).
3. При неразвивающейся беременности в децидуальной ткани происходит
активация экспрессии генов цитокинов IL-6 и IL-10. Уровнь экспрессии гена IL1β возрастает в хорионе при неразвивающейся беременности. В хорионической
ткани нарушаются корреляционные связи между уровнем экспрессии генов цитокинов.
Теоретическое и практическое значение работы.
В результате исследования получены новые данные о роли сопряженного
функционирования генов цитокинов, факторов свертывающей системы крови и
5
фолатного цикла на ранних этапах эмбрионального развития человека, а также
о корреляционных связях между активностью генов цитокинов в децидуальной
и хорионической тканях.
Полученные данные о повышении риска возникновения невынашивании беременности в первом триместре у носителей полиморфных вариантов генов цитокинов, фолатного цикла и факторов свертывающей системы крови могут
быть использованы в медико-генетических консультациях для предварительной
оценки величины риска возникновения осложнений ранних сроков беременности.
Созданный банк образцов ДНК и РНК, выделенных из децидуальной и хорионической тканей, а также из клеток крови женщин с неразвивающейся беременностью и спонтанным абортом на ранних сроках беременности может
быть использован в дальнейших исследованиях причин эмбриональной гибели.
Полученные в результате исследования данные используются при чтении
лекций в курсах «Биология развития и размножения», «Генетика человека»,
«Генетика репродукции», «Медико-генетическое консультирование» на факультете биологических наук Южного федерального университета. Внедрены в
практическую деятельность клинико-диагностической лаборатории «Наука» и
«Центра репродукции человека и ЭКО» (г. Ростов-на-Дону).
Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России 2007-2013» по теме «Молекулярно-генетический анализ
генов цитокиновой системы при нарушении репродуктивной функции человека» (соглашение № 14.А18.21.0199).
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на научных
сессиях факультета биологических наук ЮФУ (2012-2013 гг.), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010» (Москва, 2010), V конгрессе Всемирной организации репродуктивной медицины (Москва, 2010), юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы перинатологии, акушерства и гинекологи» (Майкоп, 2010), VI съезде Российского общества медицинских генетиков
(Ростов-на-Дону, 2010), I Международной научно-практической конференции
«Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы
современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» (Екатеринбург,
2011), XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и
научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2011), IV Международной
научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011), Европейском конгрессе генетиков человека (Нидерланды, Амстердам, 2011; Германия, Нюрнберг, 2012;
Франция, Париж, 2013), Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт – основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Новосибирск, 2012), конференции
ВОГиС «Проблемы генетики и селекции» (Новосибирск, 2013), 21-ом Международном конгрессе генетиков (Сингапур, 2013), V международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий
и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013).
6
Личное участие автора. Все исследования выполнены в соответствии с целью и задачами диссертации, поставленными лично автором. На основании
широкого перечня самостоятельно проанализированной литературы им подобран комплекс методик, которые освоены и выполнены лично автором. Автор
осуществлял аналитическую обработку полученных результатов, статистическую обработку, подготовку основных публикаций по выполненной работе,
написание и оформление рукописи.
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 23 работы, в том числе 8 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования,
заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, приложения. Изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, иллюстрирована 59 рисунками. Список использованной литературы включает 33 отечественных и 198 зарубежных источника.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для молекулярно-генетического исследования использовали образцы ДНК,
выделенной из лейкоцитов периферической крови 122 женщин (средний возраст 29,2 лет) с невынашиванием беременности в первом триместре. Взятие
крови проводили из локтевой вены натощак в вакуумные пробирки с ЭДТА.
Среди женщин с невынашиванием беременности – 62 с неразвивающейся беременностью и 60 со спонтанным абортом на сроке 5-11 недель беременности. В
контрольную группу вошли 114 женщин (средний возраст 30,3 года) с физиологически протекающей беременностью, у которых в анамнезе отсутствовали
спонтанный аборт и/или неразвивающаяся беременность. Все индивидуумы не
имели родства между собой и были включены в соответствующие группы
только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью
клинических и лабораторно-инструментальных методов исследования. Все
женщины подписали информированное согласие об участии в исследовании.
Материалом для исследования также послужили образцы децидуальной (25
образцов) и хорионической тканей (23 образца), полученные при медицинском
аборте у женщин с физиологическим течением беременности на сроке 5-11
недель, а также при спонтанном аборте (14 образцов хорионической и 13 децидуальной тканей) или неразвивающейся беременности (19 парных образцов децидуальной и хорионической тканей) раннего срока. Полученные образцы тканей немедленно погружали в жидкий азот и хранили при температуре -80° С до
выделения нуклеиновых кислот.
Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови проводили
термо-коагуляционным методом с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь»
(Литех, Москва). Для выделения геномной ДНК из тканей использовали фенолхлороформный метод согласно стандартному протоколу (Grimberg J. et al.,
1989). Выделение тотальной РНК из образцов тканей материнского и зароды7
шевого происхождения проводили экстракцией смесью гуанидинтиоционатфенол-хлороформ (Chomczynski P. et. al., 1987).
Аллельные варианты -31С-Т гена IL-1β (MIM *147720), -174G-C гена IL-6
(MIM *147620), -592С-A, -819C-T гена IL-10 (MIM *124092), -308G-A гена TNFα
(MIM *191160), C677T (rs1801133) гена MTHFR, A66G (rs1801394) гена MTRR,
A2756G гена MTR, Т1565С (rs5918) гена ITGB3, C807T гена ITGA2, -455G-A
гена FGB, -675 5G/4G гена SERPINE1 исследовали с использованием наборов
реагентов SNP-экспресс (Литех, Москва). Разделение продуктов амплификации
проводили методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле.
Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор реагентов компании Синтол (Москва). Уровни экспрессии генов IL-1β, IL-6, IL-10,
TNFα определяли с помощью real-time PCR. Реакцию амплификации для каждого исследуемого гена проводили отдельно и в двух повторах для каждого образца.
Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга определяли с использованием критерия χ2 (www.gen-exp.ru). Оценку различий в распределении аллельных вариантов генов в обследованных группах
осуществляли с помощью критерия χ2, используя программу BIOSTAT (Biostatistica..., 1998). О риске развития невынашивания беременности судили по отношению шансов (odds ratio – OR). OR указан с 95%-ым доверительным интервалом (CI). При статистическом анализе результатов изучения уровня экспрессии генов ∆Ct рассчитывали согласно Livak K. и Schmittgen T. (Livak K.,
Schmittgen T., 2001). Для сравнения уровня экспрессии генов использовали все
значения экспрессии гена (∆Ct) и сравнивали их между собой как две выборки.
Для подтверждения достоверности отличий экспрессии гена в совокупности
одной из выборок образцов, по сравнению с другой выборкой, использовали
критерий Манна-Уитни. Для определения взаимосвязи изучаемых показателей
использовали линейную корреляцию Пирсона (r) при их нормальном распределении в совокупности.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование полиморфизма генов цитокинов в клетках крови женщин
с различным характером течения беременности
В ходе изучения частот генотипов исследованных аллельных вариантов
установлено, что в контрольной группе и в группах женщин с НБ и СА в
анамнезе для всех рассмотренных локусов эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (P > 0,05).
Распределение частот генотипов по полиморфизму -31C-Т гена IL-1β среди
женщин с неразвивающейся беременностью не отличается от контрольной
группы (табл. 1). Среди женщин со спонтанным абортом преобладают гомозиготы по аллели -31С гена IL-1β. Однако, данные отличия по сравнению с контрольной группой статистически не достоверны.
Однако, среди женщин с неразвивающейся беременностью гетерозигот по
полиморфизму -31C-Т гена IL-1β больше, чем среди женщин с самопроизволь8
ным абортом (табл. 1). При этом доля гомозигот по аллели -31С гена IL-1β почти в два раза ниже по сравнению с группой женщин с самопроизвольным
абортом. Таким образом, выявлены статистически значимые отличия в частотах
генотипов и аллелей по полиморфизму -31С-Т гена IL-1β между двумя группами женщин с патологией беременности в I триместре (НБ и СА).
Таблица 1 – Частота генотипов и аллелей по полиморфизму -31C-Т гена IL1β в клетках крови женщин с различным характером течения ранних сроков беременности
Генотип
Контроль Патология беременности
(МА), абс. СА,
абс. χ21 (Р)
НБ,
абс. χ21 (Р)
(%)
(%)
(%)
-31CC
42 (36,8)
32 (53,3)
18 (29,0)
4,38
1,8
-31CT
56 (49,1)
22 (36,7)
36 (59,7)
(0,11)
(0,41)
-31TT
16 (14,0)
6 (10,0)
8 (11,3)
Частота аллели -31Т 0,386
0,283
0,411
2
χ 2(Р)
3,64 (0,06)
0,22 (0,64)
2
χ 3(Р)
Генотипы: 7,78 (0,02) Аллели:
4,4 (0,04)
Примечание: МА – медицинский аборт; СА – спонтанный аборт; НБ – неразвивающаяся
беременность; χ21 – сравнение частот генотипов с контролем; χ22 – сравнение частот аллелей
с контролем; χ23.- сравнение между группами СА и НБ.
Не выявлено статистически значимых различий в частотах генотипов и аллелей по полиморфизму -174G-C гена IL-6 между сравниваемыми группами
женщин.
В группе женщин со спонтанным абортом число гомозигот по аллели -592С
гена IL-10 снижено, а доля гетерозигот по полиморфизму -592С-Т гена IL-10
повышена по сравнению с контролем (табл. 2). Данные различия являются статистически значимыми. Фактором повышенного риска развития спонтанного
аборта является гетерозиготное состояние полиморфизма -592С-Т гена IL-10
(OR = 2,72 95% CI 1,43-5,18).
Подобная ситуация характерна и для второго полиморфизма гена IL-10 819С-Т (табл. 2). Среди женщин со спонтанным абортом число гомозигот 819СС и гетерозигот -819СТ по гену IL-10 – практически одинаково. Частота
аллели -819Т гена IL-10 среди женщин со спонтанным абортом в первом триместре достоверно выше по сравнению с группой контроля.
Гетерозиготы по полиморфизму -308G-A гена TNFα реже всего встречаются
среди женщин со спонтанным абортом в первом триместре (табл. 2). Распределение частот генотипов по исследуемому полиморфизму среди женщин с НБ не
отличалось от контрольной группы. Выявлены статистически значимые отличия в частотах генотипов и аллелей по полиморфизму -308G-A гена TNFα
между группой женщин с СА в I триместре и контрольной группой. Также выявлены статистически значимые отличия между двумя группами женщин с патологией беременности в I триместре (НБ и СА) (табл. 2).
9
Таблица 2 – Частота генотипов и аллелей генов IL-10 и TNFα в клетках
крови женщин с различным характером течения ранних сроков беременности
Ген, полиморфизм
Контроль Патология беременности
(МА), абс. СА,
абс. χ21 (Р)
НБ,
абс. χ21 (Р)
(%)
(%)
(%)
IL-10 -592 C-A
СС
65 (57,0)
24 (40,0)
37 (59,7)
0,12
10,4
CА
37 (32,5)
34 (56,7)
19 (30,6)
(0,94)
(0,006) 6 (9,7)
АА
12 (10,5)
2 (3,3)
Аллель -592А
0,268
0,317
0,25
2
χ 2(Р)
0,93 (0,33)
0,13 (0,72)
2
χ 3(Р)
Генотипы: 8,99 (0,01) Аллели: 1,34 (0,25)
IL-10 -819 C-T
CC
69 (60,5)
26 (43,3)
40 (64,5)
4,69
1,89
CT
37 (32,5)
28 (46,7)
15 (24,2)
(0,1)
(0,39)
TT
8 (7,0)
6 (10,0)
7 (11,3)
Аллель -819T
0,232
0,333
0,234
2
χ 2(Р)
0 (0,98)
4,09 (0,04)
2
χ 3(Р)
Генотипы: 6,95 (0,03) Аллели: 2,97 (0,08)
TNFα -308G-A
GG
72 (63,2)
49 (81,7)
36 (58,1)
0,45
6,96
GA
39 (34,2)
11 (18,3)
24 (38,7)
(0,8)
(0,03)
AA
3 (2,6)
0
2 (3,2)
Аллель -308А
0,197
0,09
0,226
2
χ 2(Р)
0,4 (0,53)
6,51 (0,01)
2
χ 3(Р)
Генотипы: 8,79 (0,01) Аллели: 8,17 (0,004)
Примечание: МА – медицинский аборт; СА – спонтанный аборт; НБ – неразвивающаяся
беременность; χ21 – сравнение частот генотипов с контролем; χ22 – сравнение частот аллелей
с контролем; χ23.—сравнение частот генотипов и аллелей между группами СА и НБ.
Исследование частоты регистрации полиморфизма генов цитокинов в
клетках хорионической ткани при различном характере течения ранних
сроков беременности
Для оценки вклада генотипа самого зародыша была установлена частота регистрации исследуемых полиморфизмов в клетках хорионической ткани (табл.
3). В клетках хорионической ткани распределение частот генотипов и аллелей
по полиморфизму -174G-C гена IL-6 в контрольной группе и среди женщин со
спонтанным абортом практически одинаково (табл. 3). Среди образцов хорионической ткани, полученных из абортивного материала при неразвивающейся
беременности, статистически значимо чаще регистрируются гомозиготы по аллели -174G гена IL-6. При этом (OR = 18,0; 95% CI 3,2-100,9), что указывает на
высокий риск развития данной мультифакторной патологии у гомозигот по
нормальной аллели гена IL-6. Полиморфный вариант гена в данном случае не
является фактором риска (OR = 0,16; 95% CI 0,04-0,63).
10
Таблица 3 – Частота генотипов (%) и аллелей генов цитокинов в тканях хориона при различном характере течения беременности
Ген, полиморфизм
Контроль Патология беременности
(МА), абс. СА,
абс. χ21 (Р)
НБ,
абс. χ21 (Р)
(%)
(%)
(%)
IL-1β -31C-T
CC
6 (26,1)
7 (50,0)
4,23
4 (21,1)
(0,12)
0,67
CT
16 (69,6)
5 (35,7)
13 (68,4)
(0,72)
TT
1 (4,3)
2 (14,3)
2 (10,5)
Аллель -31Т
0,391
0,321
0,447
2
χ 2(Р)
0,37 (0,54)
0,27 (0,6)
Il-6 -174 G-C
GG
2 (8,7)
4 (28,6)
12 (63,2)
2,63
14,7
GC
18 (78,3)
9 (64,3)
7 (36,8)
(0,27)
(0,0006)
CC
3 (13,0)
1 (7,1)
0
Аллель -174С
0,522
0,393
0,184
2
χ 2(Р)
1,16 (0,61)
10,2 (0,001)
IL-10 -592 C-A
СС
8 (34,8)
4 (28,6)
12 (63,2)
0,25
3,79
CА
14 (60,9)
9 (64,3)
7 (36,8)
(0,88)
(0,15)
АА
1 (4,3)
1 (7,1)
0
Аллель -592А
0,348
0,393
0,184
2
χ 2(Р)
0,15 (0,7)
2,08 (0,09)
TNFα -308G-A
GG
15 (65,2)
8 (57,1)
9 (47,4)
1,08
2,67
GA
7 (30,4)
6 (42,9)
10 (52,6)
(0,58)
(0,26)
AA
1 (4,3)
0
0
Аллель -308А
0,196
0,214
0,263
2
χ 2(Р)
0,04 (0,85)
0,54 (0,46)
Примечание: МА – медицинский аборт; СА – спонтанный аборт; НБ – неразвивающаяся
беременность; χ21 – сравнение частот генотипов с контролем; χ22 – сравнение частот аллелей
с контролем.
Таким образом, в проведенном исследовании установлено, что вклад исследуемых аллельных вариантов генов цитокинов в увеличение риска спонтанного
прерывания беременности и остановку развития зародыша не одинаков.
Сочетанный анализ исследуемых аллельных вариантов генов цитокинов в
клетках децидуальной и хорионической тканей показал, что случаи спонтанного аборта характеризуются снижением доли образцов децидуальной и хорионической тканей, полученных от одной женщины, в обеих из которых выявлен
полиморфный вариант гена IL-1β. Если в контрольной группе 58% парных образцов тканей являются гетерозиготами по полиморфизму -31С-Т гена IL-1β, то
в группе со спонтанным абортом данный показатель составил 7,1% (OR =
11
0,056; 95% CI 0,006-0,52; P = 0,0036). Только при патологии беременности первого триместра выявлено сочетание нормального генотипа клеток материнского
происхождения с наличием полиморфного варианта гена IL-1β в клетках хориона. При такой ситуации возможно возникновение дисбаланса в синтезе данного провоспалительного цитокина клетками зародышевого и материнского
происхождения. Наличие полиморфного варианта гена IL-1β в клетках хориона
обуславливает более высокую продукцию данного цитокина в клетках зародышевого происхождения.
Ранние этапы эмбриогенеза связаны с активными клеточными делениями и
процессами ремоделирования тканей при участии цитокинов и факторов роста.
Функционирование ферментов фолатного цикла обеспечивает растущий и формирующийся организм необходимым для синтеза ДНК количеством в том
числе и метильных групп. Поэтому в дальнейшем мы провели анализ частоты
регистрации полиморфных вариантов генов фолатного цикла и интегринов, активно участвующих в перечисленных процессах.
Исследование частоты регистрации полиморфизма генов фолатного
цикла и интегринов в клетках крови женщин и их ассоциация с
невынашиванием беременности
Поскольку различий в распределении частот генотипов и аллелей по исследуемым аллельным вариантам генов фолатного цикла и интегринов между
группами женщин со спонтанным абортом и неразвивающейся беременностью
не было выявлено, мы сочли целесообразным объединить две данные группы в
одну, и обозначили ее как «невынашивание беременности» (НВБ). Характер
распределения генотипов по полиморфизму С677Т гена MTHFR одинаков в
двух группах женщин. Не было выявлено различий и по частоте генотипов по
полиморфизму А66G гена MTRR. Частота аллели 2756G гена MTR в группе
женщин с невынашиванием беременности составила 0,26, что статистически
значимо превышает данный показатель для контрольной группы (0,17) (P =
0,02).
Сочетанный анализ аллельных вариантов трех генов фолатного цикла показал, что в генотипе каждой пятой женщины из контрольной группы присутствуют аллельные варианты одновременно двух генов фолатного цикла – MTRR
и MTR (табл. 4). Среди женщин с невынашиванием беременности в 1,5 раза
выше доля лиц, в генотипе которых сочетаются аллели 66G гена MTRR и 2756G
гена MTR.
Таблица 4 – Анализ сочетанного носительства аллельных вариантов генов
фолатного цикла среди женщин двух групп
Группа
Генотип
MTRR 66AG, MTRR 66GG, MTRR 66AG или
абс. (%)
абс. (%)
66GG, абс. (%)
MTR 2756AG 12 (10,5)
9 (7,9)
21 (18,4)
Контроль MTR 2756GG 0
3 (2,6)
3 (2,6)
(n=114)
MTR 2756AG или 2756GG
24 (21,05)
MTR 2756AG 20 (16,1)
14 (11,3)
34 (27,4)
НВБ
MTR 2756GG 2 (1,6)
4 (3,2)
6 (4,8)
12
(n=124)
MTR 2756AG или 2756GG
40 (32,2)*
Примечание: * - статистически значимые отличия по сравнению с контрольной группой
при P<0,05.
Ни по одному из исследуемых аллельных вариантов генов, кодирующих
интегриновые рецепторы для фибриногена, гена фибриногена и ингибитора активатора плазминогена не выявлено отличий как по частотам генотипов, так и
по частотам аллелей между женщинами контрольной группы и женщинами с
невынашиванием беременности первого триместра.
Однако, повышенный риск невынашивания беременности в первом триместре выявлен для женщин, имеющих в своем генотипе аллельные варианты
генов MTRR, MTR и SERPINE1 (OR = 2,3; P = 0,013) (табл. 5). При таком генотипе склонность к гипергомоцистеинемии и повышенному тромбообразованию
сочетается с повышением уровня SERPINE1 и снижением фибринолитической
активности. Среди женщин с невынашиванием беременности статистически
значимо выше доля лиц, характеризующихся наличием в генотипе аллельных
вариантов одновременно трех генов – MTRR, MTR и ITGA2. Еще более значимым является одновременное носительство аллельных вариантов генов MTRR,
MTR и ITGB3 (OR = 5,9; P = 0,003) (табл. 5).
Таблица 5 – Сочетанный анализ генотипов по исследуемым аллельным вариантам генов у женщин двух групп
Ген, генотип
MTRR 66АG / 66GG + OR
Р
MTR 2756АG / 2756GG (95% CI)
Контроль НВБ
ITGB3 1565ТC или 1565СС
3 (2,6%)
16 (12,9%) 5,9 (1,6-20,1) 0,003
ITGA2 807СT или 807ТТ
15 (13,1%) 30 (24,2%) 2,2 (1,1-4,35) 0,03
FGB -455GA или -455AA
12 (10,5%) 22 (17,7%) 1,9 (0,9-4,1)
0,09
SERPINE1 -675 5G4G или -675 18 (15,8%) 36 (29,0%) 2,3 (1,2-4,3)
0,013
4G4G
Примечание: НВБ – женщины с невынашиванием беременности первого триместра.
С другой стороны известно, что при повышении уровня гомоцистеина, в том
числе обусловленного генетическими факторами возможна активация реакций
воспалительного ответа (Lazzerini P. et al., 2007). Поэтому мы провели сочетанный анализ носительства аллельных вариантов генов фолатного цикла, факторов свертывающей системы крови и цитокинов. Установлено, что риск невынашивания беременности в первом триместре возрастает в 2 раза у женщин,
имеющих в своем генотипе аллельные варианты генов MTRR, MTR, ITGA2, IL1β (табл. 6). Еще более высокий риск характерен для лиц, у которых полиморфизм по генам MTRR, MTR сочетается с полиморфизмом по гену SERPINE1 и
IL-1β.
Таблица 6 – Ассоциация сочетанного носительства аллельных вариантов генов фолатного цикла, факторов свертывающей системы крови и цитокинов с
риском невынашивания беременности
Гены, генотипы
Контроль НВБ,
OR
Р
13
, абс. (%)
MTRR (66АG / 66GG) + MTR (2756АG / 9 (7,9)
2756GG) + ITGА2 (807СТ / 807TT) +
IL-1β (-31TC / -31CC)
MTRR (66АG / 66GG) + MTR (2756АG / 9 (7,9)
2756GG) + SERPINE1 (-675 5G4G /
-675 4G4G) + IL-1β (-31TC / -31CC)
абс. (%) (95% CI)
20 (16,4) 2,29
0,05
(0,9-5,3)
28 (22,9) 3,47
(1,6-7,7)
0,002
Примечание: НВБ – женщины с невынашиванием беременности первого триместра.
На мышах Mus musculus линии BALB/c INFγ-/- было показано, что при генетически обусловленном дефиците фермента MTHFR во время беременности
изменяется уровень целого ряда медиаторов воспаления (Mikael L. et al., 2012).
По данным литературы известно, что повышенный уровень гомоцистеина способствует высвобождению таких молекул как NF-kB, IL-1β, IL-6, IL-8 (Ji C.,
Kaplowitz N., 2004; Su S. et al., 2005; Sharma P. et al., 2006; Mansoori N. et al.,
2012). С другой стороны показано, что повышение уровня провоспалительных
цитокинов способно нарушать процессы формирования трофобласта в том
числе и путем изменения концентрации факторов коагуляции, в частности
SERPINE1 (Bauer S. et al., 2004).
Анализ уровня экспрессии генов цитокинов при невынашивании
беременности
Уровень экспрессии гена IL-1β при неразвивающейся беременности достоверно увеличивается в хорионической ткани (практически в 2 раза по сравнению с физиологически протекающей беременностью) (рис. 1).
При неразвивающейся беременности уровень экспрессии гена TNFα как в
децидуальной, так и в хорионической тканях не отличается от контрольных
значений (рис. 1).
А
Б
Рис. 1. Уровень экспрессии гена IL-1β (А) и TNFα (Б) в клетках хорионической ткани относительно экспрессии гена GAPDH в норме и при неразвивающейся беременности (МА – медицинский аборт, НБ – неразвивающаяся беременность).
14
Уровень экспрессии гена IL-6 в децидуальной ткани несколько выше по
сравнению с хорионической как в норме, так и при неразвивающейся беременности (Р = 0,035 и Р > 0,06 соответственно). В децидуальной ткани выявлено
повышение экспрессии гена IL-6 при неразвивающейся беременности по сравнению с нормально протекающей беременностью (рис. 2). Повышение уровня
IL-6 может приводить к нарушению процессов имплантации, ангиогенеза децидуальной ткани и трофобласта, а также к нарушению инвазии трофобласта, увеличению синтеза провоспалительных цитокинов. И как следствие – нарушение
ранних этапов развития плода.
При неразвивающейся беременности уровень экспрессии гена IL-10 в децидуальной ткани наибольший – выше по сравнению с хорионической тканью (Р
< 0,06), статистически значимо выше по сравнению с децидуальной тканью в
контроле (Р = 0,047) (рис. 2).
При нормально развивающейся беременности в децидуальной ткани установлено наличие сильной положительной корреляционной связи между активностью генов IL-6 и TNF (r = 0,71; Р = 0,032), а также IL-10 и TNF (r = 0,94; Р =
0,0006).
В хорионической ткани при физиологически развивающейся беременности
выявлено, что уровень экспрессии IL-1β прямо коррелирует с активностью синтеза мРНК гена IL-6 (r = 0,91; Р = 0,0007), а также с уровнем экспрессии гена IL10 (r = 0,8; Р = 0,0094). В то же время для уровня экспрессии гена IL-6 выявлена
положительная корреляция с уровнем активности генов IL-10 (r = 0,73; Р =
0,0174) и TNF (r = 0,75; Р = 0,0299).
Таким образом, на ранних сроках нормально развивающейся беременности
в хорионической ткани активность экспрессии генов цитокинов согласована и
взаимозависима.
При неразвивающейся беременности все корреляционные связи, характерные для синтеза цитокинов в хорионе, исчезают (рис. 3). Уровни экспрессии генов IL-1β и IL-6, а также IL-6 и IL-10 практически не зависят друг от друга (r =
0,29).
А
Б
Рис. 2. Уровень экспрессии гена IL-6 (А) и IL-10 (Б) в клетках хорионической и децидуальной тканей относительно экспрессии гена GAPDH в норме и
при неразвивающейся беременности (МА – медицинский аборт, НБ –
неразвивающаяся беременность).
15
А
Б
В
Г
Рис. 3. Соотношение индивидуальных уровней экспрессии генов цитокинов
(∆Ct) в клетках хорионической ткани относительно экспрессии гена GAPDH
(А,Б – физиологическое течение беременности; В,Г – неразвивающаяся беременность)
Таким образом, при неразвивающейся беременности изменяется характер
функционирования клеток как материнского, так и зародышевого происхождения. Однако масштаб изменений в паттерне экспрессии генов цитокинов в хорионической ткани больше, по сравнению с децидуальной тканью. Направленность данных изменений связана с увеличением суммарного уровня провоспалительных цитокинов. Увеличение провоспалительного звена с одновременной
супрессией регуляторного иммунного звена может быть важным механизмом,
вовлеченным в нарушение ранних этапов эмбриогенеза человека.
ВЫВОДЫ
1. Риск возникновения неразвивающейся беременности повышается при
наличии генотипов -31CT гена IL-1β и -174GG гена IL-6. С повышенным
риском спонтанного прерывания беременности ассоциированы генотипы 308GG гена TNFα и -592СА гена IL-10. При спонтанной гибели эмбриона полиморфный вариант -31СТ гена IL-1β, одновременно выявленный в образцах децидуальной и хорионической тканей, полученных от одной женщины, по сравнению с контролем, выявляется достоверно реже. Если в контрольной группе
58% парных образцов тканей, являются гетерозиготами по полиморфизму 16
31СТ гена IL-1β, то в группе со спонтанным абортом данный показатель составил 7,1% (P = 0,0036).
2. Риск ранних эмбриональных потерь повышается при сочетании
полиморфных вариантов генов IL-1β, MTRR, MTR, SERPINE1 (OR = 3,47 95%;
CI 1,6-7,7; P = 0,002).
3. При неразвивающейся беременности в децидуальной ткани повышается
уровень экспрессии генов IL-6, IL-10. Уровень экспрессии гена IL-1β в хорионической ткани практически в 2 раза выше по сравнению с физиологически
протекающей беременностью (P = 0,013).
4. При нормально развивающейся беременности в децидуальной ткани установлено наличие положительной корреляционной связи между активностью
генов IL-6 и TNFα (r = 0,71; Р = 0,032), а также IL-10 и TNFα (r = 0,94; Р =
0,0006). В хорионической ткани при физиологически развивающейся беременности уровень экспрессии IL-1β коррелирует с активностью синтеза мРНК гена
IL-6 (r = 0,91; Р = 0,0007), а также с уровнем экспрессии гена IL-10 (r = 0,8; Р =
0,0094). При неразвивающейся беременности все корреляционные связи, характерные для хориона при нормально развивающейся беременности, исчезают.
Уровни экспрессии генов IL-1β и IL-6, а также IL-6 и IL-10 практически не зависят друг от друга (r = 0,29).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Женщинам с угрозой прерывания беременности, имеющим НБ в анамнезе
или при спорадических случаях потери беременности в первом триместре, рекомендуется проводить ДНК-диагностику для выявления полиморфных вариантов -31CT гена IL-1β, -174GG гена IL-6, 308GG гена TNFα и -592СА гена IL10.
2. Полученные в результате исследования данные о частоте аллельных вариантов генов цитокинов, фолатного обмена и интегринов, а также их сочетания, приводящие к нарушениям ранних этапов эмбрионального развития человека, рекомендуется использовать для оценки риска возможных эмбриональных
потерь в медико-генетических консультациях.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Исследование частот полиморфных аллелей генов ангиотензиногена и
интегринов β-3 в трех возрастных группах жителей Ростова-на-Дону / К.А.
Коваленко, С.О. Сеина, Чанг Нгуен Тхи и др. // Валеология. — 2010. — №3. —
С. 49-54.
2. Coagulation genes and pregnancy / K.A. Kovalenko, L.V. Gutnikova, E.V.
Mashkina et al. // Abstracts of the 5th Congress of the World Association of
Reproductive Medicine. — Moscow, 2010. — P. 11-12.
3. Анализ полиморфизмов генов системы гемостаза при невынашивании
беременности / Л.В. Гутникова, А.А. Александрова, К.А. Коваленко др. // Материалы юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы
17
перинатологии, акушерства и гинекологи»: тезисы докл. — Майкоп, 2010. — С.
33-34.
4. Полиморфизм генов фолатного цикла у женщин с невынашиванием беременности / Е.Г. Деревянчук, К.А. Коваленко, Е.В. Машкина и др. // Материалы
VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010»: тезисы докл. — Москва, 2010. — С.
49-50.
5. Полиморфизм генов интегринов и невынашивание беременности / Л.В.
Гутникова, К.А. Коваленко, И.О. Покудина и др. // Материалы VI съезда
Российского общества медицинских генетиков: тезисы докл. — Ростов-наДону, 2010. — С. 50.
6. Polymorphism of genes and pregnancy loss / E.V. Mashkina, K.A. Kovalenko,
N.V. Fomina et al. // Abstracts of the European Human Genetics Conference. —
Amsterdam, 2011. — P. 173.
7. Коваленко К.А. Гены свертывающей системы крови и беременность /
К.А. Коваленко, Н.В. Фомина // Материалы XLVIII Международной научной
студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: тезисы
докл. — Новосибирск, 2011. — С. 236.
8. Коваленко К.А. Цитокины и беременность / Н.В. Фомина, К.А. Коваленко, Е.В. Машкина // Материалы IV Международной научно-практической
конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины»:
тезисы докл. — Ростов-на-Дону, 2011. — С. 75.
9. Биохимические и генетические критерии фолатного метаболизма и
нарушения эмбриогенеза человека / Е.Г. Деревянчук, Е.В. Машкина, К.А. Коваленко и др. // Современные проблемы науки и образования. — 2011. — №4;
URL: www.science-education.ru/98-4738.
10. Исследование полиморфизма генов фолатного цикла и коагуляционных
факторов крови у супружеских пар с бесплодием / Е.А. Мирина, К.А.
Коваленко, Е.В. Машкина и др. // Валеология. — Ростов-на-Дону, 2011. — №2.
— С. 91-95.
11. Коваленко К.А. Исследование частоты полиморфных вариантов генов
цитокинов в бесплодных супружеских парах / Е.В. Машкина, Т.А. Лаптина,
К.А. Коваленко // Современные проблемы науки и образования. — 2012. —
№6; URL: www.science-education.ru/106-7587.
12. Урогенитальные инфекции и патология беременности / К.А. Коваленко,
Е.В. Машкина, А.Н. Рымашевский и др. // Журнал фундаментальной медицины
и биологии. — 2012. — №1. — С. 66-70.
13. Коваленко К.А. Роль цитокинов в невынашивании беременности / Н.В.
Фомина, К.А. Коваленко, Е.В. Машкина // V Всероссийская конференция с
международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт
- основа профилактической медицины в век нанотехнологий»: тезисы докл. —
Новосибирск, 2012. — С. 114.
14. Polymorphism of folate cycle and integrins genes and pregnancy loss / E.V.
Mashkina, K.A. Kovalenko, N.V. Fomina et al. // Abstracts of the European Human
Genetics Conference. — Nurnberg, 2012. — P. 138-139.
18
15. Cytokine gene expression in women with embryo loss / K.A. Kovalenko, E.V.
Mashkina, I.O. Pokudina et al. // Abstracts of the European Human Genetics
Conference. — Nurnberg, 2012. — P. 140.
16. Полиморфизм генов цитокинов в тканях плаценты при невынашивании
беременности / Е.В. Машкина, К.А. Коваленко, Н.В. Фомина и др. // Фундаментальные исследования. — 2013. — № 1; URL: http://rae.ru/fs/? section=content&op=show_article&article id=10000204.
17. Ассоциация полиморфных вариантов генов фолатного цикла и интегринов с невынашиванием беременности / Е.В. Машкина, К.А. Коваленко, Л.В.
Гутникова и др. // Медицинская генетика. — 2013. — Т. 12, №1. — С. 40-45.
18. Kovalenko K.A. Polymorphism of cytokine genes and pregnancy loss / E.V.
Mashkina, N.V. Fomina, K.A. Kovalenko // Abstracts of the Joint Conference of
HGM 2013 and 21st International Congress of Genetics ―Genetics & Genomics of
global health and sustainability‖. — Singapore, 2013. — P. 161-162.
19. Kovalenko K.A. The interactive map of NF-kappaB-depended inflammatory
molecular interactions in human / P.A. Zolotukhin, E.V. Mashkina, K.A. Kovalenko
// Abstracts of the European Human Genetics Conference. — Paris, 2013. — P. 551.
20. Коваленко К.А. Молекулярно-генетический анализ генов цитокиновой
системы при невынашивании беременности / Е.В. Машкина, К.А. Коваленко,
Н.В. Фомина // Конференция ВОГиС «Проблемы генетики и селекции»: тезисы
докл. — Новосибирск, 2013. — С. 30.
21. Анализ экспресии гена IL-10 в децидуальной и хорионической тканях при
невынашивании беременности / Е.В. Машкина, К.А. Коваленко, А.В.
Миктадова и др. // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 5;
URL: http://www.science-education.ru/111-10208.
22. Коваленко К.А. Ассоциация полиморфизмов фолатного метаболизма,
цитокинов и интегринов с нарушениями раннего эмбрионального развития человека / К.А. Коваленко // Материалы V Международной научно-практической
конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины»:
тезисы докл. — Ростов-на-Дону, 2013. — С. 233-234.
23. Исследование ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с
ранними эмбриональными потерями / Е.В. Машкина, К.А. Коваленко, Н.В.
Фомина и др. // Экологическая генетика. – 2014. – Т. XII, №1. – С. 19-27.
19