Стволовые клетки в медицине - Биологический факультет МГУ
реклама
Кошелева Настасья Владимировна старший научный сотрудник кафедры эмбриологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Ernst Heinrich Philipp August Haeckel (1834 –1919) 1868, 1871, 1877 – издания книги по эволюции многоклеточных Stemmbäume – эволюционные деревья Stammzelle – одноклеточный предок многоклеточных организмов Александр Александрович Максимов (22 января (3 февраля) 1874, Санкт-Петербург – 4 декабря 1928, Чикаго) Активное внедрял метод тканевых культур в России, экспериментальнонаучно обосновал унитарную теорию кроветворения, ввел в науку понятие о стволовых клетках. 1908: термин «стволовая клетка» был предложен к широкому использованию Первые экспериментальные доказательства существования стволовых клеток A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Till, J. E., & McCulloch, E. A. Radiation Res. 14, 213-222 (1961) Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. Becker, A. J., McCulloch, E. A. & Till, J. E. Nature 197, 452-454 (1963) В начале 60-х Э.МакКуллоч и Ж.Тилл обнаружили в костном мозге мыши самообновляющиеся клетки Вильгельм Ру (9.06.1850, Йена – 15.09.1924, Галле) Установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней Росс Гаррисон (13.01.1870, Джермантаун, - 30.09.1959, НьюХейвен, штат Коннектикут) Одним из первых предложил метод культивирования изолированных тканей и впервые наблюдал рост нервного волокна вне организма. Развитие методов культивирования in vitro ( конец 19 столетия – середина 20 столетия) Поддержание жизнеспособности тканей и клеток вне организма Арнольд – 1887 г. - наблюдение за поведением лейкоцитов лягушки 4-5 дней в лимфе. Гаррисон –1906 -1907 гг.- живые нервные клетки в лимфе лягушки Каррель –1912 - 1917 гг. - ткани птиц и млекопитающих в плазме крови и с добавлением эмбриональных экстрактов Фишер – 1941 г. - диализованная плазма крови с добавлением разнообразных стимулирующих рост молекул Игл – 1955 г. - Первая синтетическая питательная среда Клеточная терапия и тканевая инженерия (конец 20 столетия по настоящее время) Культивирование стволовых и прогениторных клеток Регенеративная медицина (заместительная клеточная терапия, тканевая инженерия) Расходные материалы для культивирования клеток Сыворотки Среды Культуральный пластик Лабораторный пластик 1. Выделение 2. Сортировка 3. Культивирование • микробиологический и токсикологический контроль • размножение • стимуляция дифференцировки 4. Характеристика полученных культур 5. Криоконсервация 6. Трансплантация в поврежденную ткань Основные свойства стволовых клеток А В Б А- стволовые клетки делятся асимметрично, образуется дочерняя клетка и клеткапредшественник Б- клетки-предшественники делятся и через ряд размножающихся предшественников дифференцируются в зрелые клетки зрелые клетки Verfaillie C.M. (2002) Trends Cell Biol 12:502-508 В- стволовые клетки могут дифференцироваться в зрелые клетки в тканях организма in vivo Две области нейрогенеза в мозге взрослых млекопитающих (van Praag et al., Nature, 2002) Модель изменения локализации и потенций стволовых клеток Fortier L.A. (2005) Vet Surg 34:415-423 История открытия эмбриональных стволовых клеток 1878 – первые попытки оплодотворения яйцеклеток млекопитающих вне организма 1959 – в США впервые методом ЭКО получено животное (кролик) 1968 - Edwards и Bavister провели первое оплодотворение яйцеклетки человека in vitro 1978 – родился первый ребенок ЭКО 1981 – Evans и Kaufman и Martin получили ЭСК мыши 1998 - Thomson и другие получили ЭСК человека оплодотворенная яйцеклетка (1сут.) бластоциста (5-6 сут.) гаструла (14-16сут.) внутренняя клеточная масса Получение эмбриональных стволовых клеток Клеточные культуры ES Бластоциста Параметры, характеризующие линии ЭСК •Фенотип (морфология, экспрессия маркеров) •Плюрипотентность in vitro образование тератом получение химерных животных •Высокие темпы пролиферации •Кариотип и его стабильность Получение химерных животных при введении ЭСК в бластоцисту или морулу СПОСОБНОСТЬ ДАВАТЬ ТЕРАТОМЫ ПРИ ИНЪЕКЦИИ ИММУНОДЕФИЦИТНЫМ МЫШАМ тератома, через три недели после инъекции мЭСК Ткани тератом, сформированных из ЭСК Цилиндрический эпителий Хрящ Слизистые эпителиальные клетки Стратифицированный эпителий Мышечные волокна Миелинизированный нерв Легко размножить Дифференцируются во все типы клеток ЭСК Отторгаются Могут давать опухоли Лауреаты нобелевской премии 2012 года Джон Гёрдон Синья Яманака В области физиологии и медицины - «за открытие возможности перепрограммирования зрелых клеток в плюрипотентные стволовые клетки». Плюрипотентные клетки могут дифференцироваться во все типы клеток, кроме внезародышевых оболочек Национальный центр биотехнологической информации США National Center for Biotechnological Information, NCBI Количество публикаций со словами «induced pluripotent stem cells» http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ Образование тератомы у иммунно-дефицитных мышей Гистологическая окраска гематоксилином и эозином тромбоциты Черные стрелки – незрелые эритроциты Белые стрелки – зрелые эритроциты Вырастили работающую сердечную ткань из iPS трансмиссионная электронная микроскопия Гемопоэтические и стромальные (МСК) клетки красного костного мозга Гематопоэтические СК А.Я. Фриденштейн (1924-1998) Источники МСК • Строма костного мозга (0,001% - 0,01% ядросодержащих клеток) • Стромально-сосудистая фракция жировой ткани • Кожа • Фетальная печень • Плодные оболочки и плацента • Пупочный канатик • Амниотическая жидкость • Периферическая и пуповинная кровь • Пульпа молочных зубов Современнные критерии определения МСК (требования комитета по мезенхимным и тканевым СК Международного общества клеточной терапии, 2006г) 1. Адгезия к пластику при стандартных условиях культивирования 2. Фенотип Положительная Отрицательная экспрессия (>95% экспрессия (<2% +) +) CD105 CD73 CD90 CD45 CD34 CD14 или CD11b CD79a или CD19 HLA-DR 3. Дифференцировка in vitro: остеобласты, хондроциты, адипоциты Dominici et al., 2006 Стратегия трансплантации аутологичных стволовых клеток Источники экстраэмбриональных стволовых клеток Выделение стволовых клеток из плаценты и плодных оболочек Дифференцировка клеток из decicua basalis плаценты человека остеогенная дифференцировка адипогенная дифференцировка хондрогенная дифференцировка Huang Y-C. et al. (2009) Stem Cell Rev and Repr 5:247-255 Применение клеток пупочного канатика в медицине Сбор замораживание и хранение пуповинной крови Банки пуповинной крови 1988 Элиан Глюкман в клинике святого Людовика в Париже впервые провела трансплантацию пуповинной крови ребенку с анемией Фанкони Морфология МСК-подобных клеток, из вартонова студня пупочного канатика The cells were stained using May-Grunwald-Giemsa solution. Magnification,50 Bruyn et al., Stem Cells and Dev, 2011, V20, №3 Дифференцировка МСК-подобных клеток, из вартонова студня пупочного канатика 7 дней остеогенной индукции 7 дней адипогенной индукции 21 день остеогенной индукции 28 дней адипогенной индукции Bruyn et al., Stem Cells and Dev, 2011, V20, №3 хондроциты на 21 день индукции Трансплантология — раздел медико-биологических знаний, изучающий проблемы пересадки органов и тканей, и перспективы создания искусственных органов и тканей Юрий Юрьевич Вороной (1895-1961) «Невозможно наносить заведомую инвалидность здоровому человеку, вырезая у него нужный для пересадки орган для проблематичного спасения больного» Основоположником экспериментальной трансплантации жизненно важных органов является Алексис КАРРЕЛЬ (1873-1944) В 1912 году был удостоен Нобелевской премии Проводил операции по трансплантации органов в эксперименте, их консервации и технике наложения сосудистых анастомозов. Он разработал основные принципы консервации донорских органов путем перфузии. НАПРАВЛЕНИЯ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ: Аутотрансплантация донором трансплантата является реципиент для самого себя; Изотрансплантация донором трансплантата является однояйцовый брат-близнец реципиента; Аллотрансплантация донором трансплантата является генетически и иммунологически другой организм одного вида; Ксенотрансплантация донором трансплантата является организм другого биологического вида; Рост средней продолжительности жизни Life Expectancy Trend Регенеративная медицина — – это создание живых полнофункциональных тканей для восстановления или замещения повреждённых тканей и/или органов (NIH Fact Sheet, 2006) 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Количество научных публикаций со словами «regenerative medicine» Начало клинического становления регенеративной медицины В июне 2008 года в клинике Барселоны провел первую пересадку человеческого органа, выращенного из стволовых клеток Паоло МАККИАРИНИ Центр регенеративной медицины в С 2006 г выпускается специализированный журнал Regenerative medicine UK, Europe, Rest of World Future Medicine Ltd Unitec House 2 Albert Place London, N3 1QB,UK Tel: +44 (0)20 8371 6080 Fax: +44 (0)20 8371 6089 Краснодаре Открыт 8 ноября 2012 на базе КГМУ Станет клинической платформой для разработки и внедрения новых регенеративных технологий. Правительственный грант в размере 150 млн. рублей. Работы по выполнению гранта начались с 1 октября, сроки реализации проекта – до 2013 года включительно. Основные направления регенеративной медицины • Клеточная терапия заболеваний • Индукция восстановления тканей и органов с использованием биосовместимых материалов (скаффолдов) и клеточного материала • Активация эндогенных полипотентных клеток и активизация таким образом восстановительных процессов Основа для роста рынка регенеративной медицины • Увеличение внимания к пожилым • Разработаны новые методы доставки • Разработаны/найдены новые биоматериалы • Изменение понимания использования клеточных препаратов в медицинском сообществе Клеточные продукты • Аутологичные – Без культивирования – С культивированием • Аллогенные – Без культивирования – С культивированием • Ксеногенные “MSC’s are the cells that are doing all the business of healing” Dr.Arnold Caplan Реконструкция костей свода черепа с помощью аутологичных МСК Структура таневого эквивалента: аутологичные МСКСКЖТ, фиксированые фибриновым клеем на биодеградируемой матрица Palacos (Macropore USA), Трехмерная компьютерная томограмма 7-летней девочки до операции (определяются костные дефекты в области теменных костей) Через 3 мес. после операции (костные дефекты не определяются) Stefan Lendeckel et all Ученые вырастили «гибридный зуб» с помощью мышей Эпителиальные клетки десны человека «Гибридные зубы» под капсулой почки мышей Angelova Volponi A et al. J DENT RES 2013;92:329-334 Исследователи под руководством профессора Пола Шарпе (Paul Sharpe), из Королевского колледжа Лондона вырастили биоинженерный зуб из клеток человеческой десны и стволовых клеток мыши "A salamander can grow back its leg, why can't a human do the same?" Dr. Anthony Atala В Америке напечатали уши Dr. Jay Vacanti Результаты использования клеточных технологий Полученные Ожидаемые Восстановление костного мозгаНейродегенеративные заболевания Кожа (ожоги, раны) Инфаркт Роговица Инсульт Хрящ Патологии печени Кость Аутоиммунные заболевания Сосуды Реконструкция иммунной Спинальная травма системы Диабет Примерно 1 из 5000 продуктов пройдет коммерческую разработку 1 млн долларов США и 15 лет для выхода продукта на рынок На рынок в первую очередь выходят клеточные продукты, применение которых сопряжено с минимальным риском для пациентов и разработка которых проста, доказуема и масштабируема Автоматизация процессинга для медицинских центров AXP™ AutoXpress™ BioArchive® System Thermogenesis Cytori celution ™ Cytori Автоматизированные приборы выделения и хранения клеток позволяют: •Стандартизировать этапы процессинга •Минимизировать человеческий фактор •Получать стандартный продукт на выходе Автоматизация процессинга для производственных процессов Автоматизированные станции культивирования клеток позволяют: •Стандартизировать этапы процессинга •Вести постоянный контроль согласно GMP •Получать стандартный продукт на выходе Персонализация клеточных препаратов •iPS – клетки – создание персональных плюрипотентных клеток •Isolagen® - выделение персональных фибробластов кожи •SPRS- терапия® - персонализированная программа коррекции возрастных изменений кожи с применением аутологичных фибробластов •Технологии Cytori – выделение персональных клеток жировой ткани •BIOSEED®-C – аутологичные трансплантаты для восстановления хряща Таким образом, можно получать клетки из различных источников и создавать на их базе клеточные и тканеинженерные восстановления конструкции формы поврежденных органов и для функции Стволовые клетки в медицине, •количество экспериментов с СК на человеке мало •не знаем о долговременных эффектах СК •не знаем о реакции микроокружения в зоне инъекции •СК способны индуцировать опухоли или рост эктопической ткани Факультет _____________________________ Курс__________________________________ Группа________________________________ Фамилия Имя Отчество__________________ Дата: 27 марта2013 г. Вопрос 1. Откуда получают экстраэмбриональные стволовые клетки? Ответ1:_________________________________ Вопрос 2. Как называется трансплантация, при которой донором трансплантата является генетически и иммунологически другой организм одного вида ? Ответ2:_________________________________
