МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

М Е Т О Д Ы
В
Б И О Л О Г И И
МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ
И БИОХИМИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ
В СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ
РАСТЕНИЙ
М Е Т О Д Ы
В
Б И О Л О Г И И
МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ
И БИОХИМИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ
В СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ
РАСТЕНИЙ
Под редакцией
д-ра биол. наук, профессора, члена-корр. РАН Вл. В. Кузнецова,
д-ра биол. наук, профессора, В. В. Кузнецова,
д-ра биол. наук, профессора, Г. А. Романова.
Москва
БИНОМ. Лаборатория знаний
2012
УДК 57.08
ББК 28.04
М75
С е р и я о с н о в а н а в 2010 г.
Р е ц е н з е н т ы:
чл.-корр. РАН Р. К. Саляев
проф. Я. И. Бурьянов
Молекулярно-генетические и биохимические методы в совреМ75 менной биологии растений / под ред. Вл. В. Кузнецова, В. В. Кузнецова, Г. А. Романова. — М. : БИНОМ. Лаборатория знаний,
2012. — 487 с. : ил. — (Методы в биологии).
ISBN 978-5-9963-0738-8
Книга содержит изложение более 30 методов современной экспериментальной биологии, активно используемых при исследовании растений.
Подробно рассмотрены методы генной инженерии и биоинформатики,
функциональной геномики, белковой химии и гистохимии, методы изучения
биологически активных соединений и трансдукции сигналов, а также
биологии клетки и анализа субклеточных структур. Ряд методов был
разработан или модифицирован самими авторами статей, специалистами
Института физиологии растений и других институтов РАН. Структура
и способ изложения материала максимально облегчают задачу освоения
того или иного метода, помогают избежать ошибок в ходе эксперимента
и корректно интерпретировать полученные результаты. Многие описанные
методы широко применяются как при изучении растительных объектов,
так и объектов других царств живых организмов. Данный сборник будет
способствовать грамотному использованию наиболее современных методов
исследования в практике отечественной биологической науки.
Для студентов, аспирантов, научных сотрудников, проводящих фундаментальные или прикладные исследования в области биологии растений
и сельского хозяйства
УДК 57.08
ББК 28.04
Первый тираж издания осуществлен при финансовой поддержке
Российского фонда фундаментальных исследований по проекту № 11-04-07082
Научное издание
Серия: «Методы в биологии»
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
В СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ
Ведущий редактор канд. биол. наук В. В. Гейдебрехт
Редактор канд. биол. наук Т. В. Липина
Художник Н. А. Новак
Технический редактор Е. В. Денюкова. Корректор Д. И. Мурадян
Компьютерная верстка: Н. Ю. Федоровская
Подписано в печать 08.11.11. Формат 70×100/16.
Усл. печ. л. 39,65. Тираж 700 экз. Заказ
Издательство «БИНОМ. Лаборатория знаний»
125167, Москва, проезд Аэропорта, д. 3
Телефон: (499) 157-5272, e-mail: binom@Lbz.ru, http://www.Lbz.ru
ISBN 978-5-9963-0738-8
c БИНОМ. Лаборатория знаний,
2011
Оглавление
Предисловие . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ
И БИОИНФОРМАТИКИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1. Получение трансгенных растений
методом агробактериальной трансформации
Г. Н. Ралдугина, С. А. Данилова, Н. О. Юрьева . . . . . . . . . . 5
1.2. Получение транспластомных растений табака
методом баллистической трансформации
С. А. Данилова . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.3. Генетически трансформированные корни
как модельная система для изучения физиологических
и биохимических процессов корневой системы
целого растения
И. Н. Кузовкина, М. Ю. Вдовитченко . . . . . . . . . . . . . . . 37
1.4. Применение конструкций ДНК
с репортерными генами
в физиологии растений
Г. А. Романов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
1.5. Инсерционные мутанты Arabidopsis thaliana
и их использование
для изучения функции гена
А. В. Демиденко . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
1.6. Полимеразная цепная реакция.
Стратегия подбора праймеров
для анализа экспрессии генов
Е. А. Лысенко . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
1.7. Сравнение последовательностей ДНК и белков
Е. А. Лысенко . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА
И ЕГО ЭКСПРЕССИИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
2.1. Саузерн-блот-гибридизация
Д. В. Беляев . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
2.2. Применение гидрогелевых биочипов для идентификации
генно-модифицированных источников
Д. А. Грядунов, И. А. Гетман, Г. А. Романов . . . . . . . . . . 120
ОГЛАВЛЕНИЕ
485
2.3. Определение относительного количества
транскриптов растительных генов
методом нозерн-блот-гибридизации
Я. О. Зубо, М. В. Ямбуренко . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
2.4. Изучение регуляции экспрессии растительных генов
с использованием метода run-on транскрипции
Я. О. Зубо, М. В. Ямбуренко, В. В. Кузнецов . . . . . . . . . . 147
2.5. Определение относительного содержания транскриптов
генов растений с помощью ОТ-ПЦР
А. К. Кравцов, В. В. Кузнецов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
2.6. Исследование транскрипции генов
с помощью ДНК микрочипов
Д. А. Лось . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
2.7. ПЦР в режиме реального времени
на аппаратах отечественного производства
Г. А. Романов, Л. И. Патрушев . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
2.8. QTL-анализ и его применение
в физиологических исследованиях
Л. И. Сергеева . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ
И ГИСТОХИМИИ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
3.1. Количественное определение содержания белка
И. Е. Мошков, Н. С. Степанченко, Г. В. Новикова . . . . . 201
3.2. Разделение белков при помощи электрофореза
в присутствии додецилсульфата натрия
и двумерный электрофорез
Г. В. Новикова, Н. С. Степанченко, И. Е. Мошков . . . . . 212
3.3. Вестерн-блот-гибридизация
Е. С. Пожидаева . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228
3.4. Экспрессия целевых (рекомбинантных) белков
в бактериях
Е. С. Пожидаева . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
3.5. Гистохимическая (in situ) локализация активности
ферментов углеводного метаболизма
в растительных тканях
Л. И. Сергеева . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
3.6. Гистохимические методы определения локализации
тяжелых металлов и стронция
в тканях высших растений
И. В. Серегин, А. Д. Кожевникова . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
486
ОГЛАВЛЕНИЕ
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
И ТРАНСДУКЦИИ СИГНАЛОВ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281
4.1. Количественное определение в растениях ИУК, цитокининов, абсцизовой кислоты и гиббереллинов
иммуноферментным методом (ELISA)
Л. М. Котова, А. А. Котов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281
4.2. Количественное определение индолил-3-уксусной кислоты,
абсцизовой кислоты и галоидфеноксикислот
в одном образце растительной ткани
В. В. Карягин, В. Ю. Ракитин, В. Л. Садовская . . . . . . . . 316
4.3. Определение выделения и содержания этилена
в растениях
В. Ю. Ракитин, Т. Я. Ракитина . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
4.4. Определение свободных и связанных полиаминов
в растениях методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии
В. Ю. Ракитин, О. Н. Прудникова,
Л. А. Стеценко, Н. И. Шевякова . . . . . . . . . . . . . . . . . . 337
4.5. Методы оценки содержания
активных форм кислорода,
низкомолекулярных антиоксидантов
и активностей основных антиоксидантных ферментов
Н. Л. Радюкина, Ю. В. Иванов, Н. И. Шевякова . . . . . . . 347
4.6. Анализ гормон-рецепторного взаимодействия
радиолигандным методом
С. Н. Ломин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365
4.7. Применение трансгенных бактерий
для изучения мембранных рецепторов
Г. А. Романов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377
ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ
И АНАЛИЗА СУБКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР. . . . . . . . . . . . . 386
5.1. Методы оценки и характеристики
роста культур клеток высших растений
А. М. Носов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386
5.2. Протопласты клеток растений
как объект для физиологических, биохимических,
молекулярных и генетических исследований
А. В. Носов, Т. А. Шевырёва, М. С. Трофимова,
О. И. Соколов, Е. Б. Глоба, А. А. Фоменков,
И. Н. Смоленская . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403
ОГЛАВЛЕНИЕ
487
5.3. Определение параметров водного статуса
растительных клеток
с помощью внутриклеточного зонда давления
А. Б. Мещеряков, В. П. Холодова . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424
5.4. Определение основных характеристик
водного баланса растений —
водного и осмотического потенциала и тургора —
методом термопарной изопиестической психрометрии
А. А. Котов, Л. М. Котова . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433
5.5. Методы выделения митохондрий растений
и определения их интактности
А. Г. Шугаев, Д. А. Лаштабега, Н. С. Белозерова,
И. П. Генерозова . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 448
5.6. Получение плазмалеммы
методом разделения микросомальных мембран
в водной двухфазной полимерной системе
М. С. Трофимова, Т. А. Шевырева, И. М. Жесткова,
С. Н. Ломин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 456
5.7. Количественная экстракция полярных липидов
из растительного материала
В. Д. Цыдендамбаев, А. Г. Верещагин. . . . . . . . . . . . . . . 466
Предисловие
За последние 2–3 десятка лет экспериментальная биология растений достигла впечатляющих успехов. Получены принципиально
новые знания о механизмах регуляции интегральных физиологических процессов у растений, таких как водный статус, транспирация, фотосинтез, рост, морфогенез, стресс, адаптация и выживание
растений в неблагоприятных условиях. Расшифрована природа сигналов цветения, идентифицированы рецепторы основных классов
фитогормонов, достигнуты крупные успехи в понимании принципов функционирования внутриклеточных сигнальных сетей и дифференциальной регуляции экспрессии генома. Одним из первых высших организмов, геном которого был полностью секвенирован, оказалось модельное растение Arabidopsis thaliana.
Все эти успехи во многом стали возможны благодаря активному
использованию в биологии растений идеологии и методов физико-химического анализа. Физиологи растений сделали существенный шаг
по пути освоения языка молекулярной и физико-химической биологии и активного использования методического арсенала этих наук
для исследования разнообразных биологических проблем. Одновременно возрос интерес молекулярных биологов к современным проблемам физиологии растений. В настоящее время невозможно представить добротную экспериментальную работу, выполненную без
создания трансгенных растений и их анализа, без использования
методов молекулярной генетики и генной инженерии, которые все
более и более превращаются в рутинные методы экспериментальной
биологии растений.
В этих условиях остро стоит вопрос об издании необходимых
пособий с изложением методов физико-химической биологии, адаптированных к растительным объектам. К сожалению, следует констатировать, что монографий, охватывающих широкий спектр молекулярно-генетических и биохимических методов, применяемых в
современной биологии растений и написанных крупными специалистами, работающими в данной области исследований, пока в России нет, несмотря на то, что потребность в такого рода методической
книге чрезвычайно высока.
Авторы данного сборника — квалифицированные специалисты
Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской
академии наук и некоторых других институтов РАН, хорошо знающие описываемые методы и применяющие их в своей практической
работе, что придает данной монографии особую ценность. Ряд мето-
4
ПРЕДИСЛОВИЕ
дов был разработан или модифицирован самими авторами статей.
Так, например, авторами разработан метод применения трансгенных
бактерий для изучения мембранных рецепторов растений; совместно
с Институтом молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН
предложен метод идентификации трансгенов с помощью биочипа;
адаптирован метод run-on транскрипции для изучения регуляции
экспрессии пластидного и митохондриального геномов; оптимизирован метод получения и культивирования изолированных генно-модифицированных корней растений; предложен новый подход
для трансформации растений с использованием агробактериального
газона; разработаны методы культивирования изолированных клеток растений; созданы гистохимические методы определения локализации тяжелых металлов и активности ферментов углеводного
обмена в тканях высших растений; предложен метод термопарной
изопиестической психрометрии для определения основных характеристик водного баланса растений и др.
Предлагаемое вниманию читателя издание есть ни что иное, как
попытка его авторов поделиться своими знаниями и накопленным
методическим опытом, который может оказаться полезным не только молодым исследователям, но и маститым ученым. Сборник содержит большой набор основных методов исследования, написанных по единому плану и с подробными комментариями, что дает
возможность их самостоятельного воспроизведения в любой современной лаборатории физиологии и биохимии растений. В каждом
случае даются теоретические основы описываемых методов, что позволяет рассматривать данную книгу в качестве фундаментального
научного труда. Структура и способ изложения материала организованы так, чтобы максимально облегчить задачу исследователям в
освоении того или иного нового метода, помочь им избежать ошибок
в ходе эксперимента и корректно интерпретировать полученные результаты. Многие описанные здесь методы дают возможность их
широкого применения, как при изучении растительных объектов,
так и других объектов живой природы.
Данный методический сборник будет способствовать активному
использованию наиболее современных методов физико-химической
биологии и физиологии растений для решения крупных фундаментальных проблем. Он может быть полезен для самого широкого круга исследователей, использующих или планирующих использовать
в своей работе методы генной инженерии и биоинформатики, молекулярной биологии и функциональной геномики, методы белковой
химии и гистохимии, методы изучения биологически активных
соединений и трансдукции сигналов, методы биологии клетки и
анализа субклеточных структур.
Член-корр. РАН Вл. В. Кузнецов
Глава 1
МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ
И БИОИНФОРМАТИКИ
1.1. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ
МЕТОДОМ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ
ТРАНСФОРМАЦИИ
Г. Н. Ралдугина, С. А. Данилова, Н. О. Юрьева
Введение
Трансгенные растения широко используются в фундаментальных
исследованиях по биологии, особенно в молекулярной биологии и
молекулярной генетике. Генно-модифицированные растения нашли
широкое применение в сельском хозяйстве, медицине и других областях. При создании трансгенных растений встречается ряд трудностей, которые ограничивают генетическую модификацию многих
видов растений, поэтому биотехнологи постоянно работают над усовершенствованием методов получения трансгенных растений.
Одним из важных свойств растений является способность к регенерации in vitro из недифференцированных соматических тканей с
получением нормальных, фертильных организмов. Это свойство
(тотипотентность) позволяет получать генно-модифицированные
(трансгенные) растения через культуру тканей.
Получение стабильно трансформированных растений состоит из
нескольких этапов.
I. Выбор генов, которые будут вводиться в геном, и подготовка
вектора для их переноса в геном растения.
II. Введение вектора в растительные клетки методом, наиболее
подходящим для определенного вида растения или выбранного
экспланта.
III. Отбор трансформантов, а также подтверждение наличия и экспрессии введенных генов в геноме растения.
IV. Проверка наследуемости встроенного гена.
6
ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Получение генов и подбор вектора
Ген, который хотят ввести в растение, чтобы придать последнему
новые свойства, носит название целевого гена, или гена интереса. В
растение можно встроить практически любой ген, который можно
получить из ДНК любого организма. Встроенный чужеродный ген
называется трансгеном. Ген можно синтезировать, зная первичную
структуру ДНК или белка, или получить кДНК на основе выделенной мРНК с помощью реакции обратной транскрипции.
Для того чтобы ввести в клетку-реципиент требуемую ДНК,
встроить ее в геном, провести идентификацию трансформированных клеток и обеспечить стабильную экспрессию введенного гена,
используют векторы.
Вектор — кольцевая молекула ДНК небольшого размера, способная к автономной репликации (в бактериях) и служащая для переноса и клонирования чужеродного гена. Векторы должны иметь
область (полилинкер), чувствительную к определенным рестрикционным эндонуклеазам. Они расщепляют вектор только в одном
участке, превращая его из кольцевой формы в линейную, к которой
с помощью ферментов-лигаз можно присоединять ген или гены. В
составе вектора должен быть маркерный ген, который, как правило, придает устойчивость к селективному агенту (антибиотик, гербицид) и позволяет выращивать трансформированные клетки на
селективной среде, что указывает на успешность трансформации.
Целевые и маркерные гены из векторной молекулы должны экспрессироваться в клетках трансформируемых организмов, поэтому
в векторную молекулу должны быть встроены регуляторные последовательности, отвечающие за экспрессию генов: промоторы, терминаторы и, возможно, энхансеры (см. рис. 1.1.1).
Промоторы — последовательности нуклеотидов ДНК, расположенные обычно перед началом структурного гена, узнаваемые ферментом РНК-полимеразой и являющиеся стартовой площадкой для
начала транскрипции. Для растений часто используют промоторы
от растительных вирусов, которые эволюционно приспособлены к
функционированию в растительной клетке.
Промоторы могут быть:
1) конститутивными, действующими во всех тканях в течение
всей жизни растения. К наиболее сильным и широко используемым конститутивным промоторам, функционирующим в растениях, относятся 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты
(p35S CaMV) и промотор гена нопалинсинтазы из Agrobacterium
tumefaciens (nos). Применяют также модификации промотора
35S, включая конфигурацию с двумя тандемными 35S-промото-
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
7
Рис. 1.1.1. Схема бинарного вектора. pNOS — промотор гена октопинсинтазы; p35S — промотор из вируса мозаики цветной капусты; NOS, OCS —
терминаторы; Т-ДНК — переносимая ДНК; LB, RB — левая и правая границы Т-ДНК; Ori — сайт инициации репликации
рами, что позволяет достичь более высоких уровней генной экспрессии по сравнению с единичной копией 35S-промотора. Для
трансформации однодольных растений часто используют промоторы генов, выделенных из генома злаков, например промотор гена актина 1 риса (Асt1) или промотор гена убиквитина кукурузы (Ubi-1);
2) специфическими, действующими в определенных тканях, например промотор гена пататина картофеля, который работает в
основном только в клубнях. Имеются также промоторы, активность которых проявляется в листьях, корнях, меристемах или
других местах специфической локализации. Другие промоторы
активны в клетках на определенных стадиях роста и развития
растения;
3) индуцибельными, работающими при определенных условиях
(температуры, освещения, концентрации фитогормонов или
других соединений). Такие промоторы используют в случаях,
если исследователь ставит задачи достичь более тонкой регуляции активности трансгенов в пространстве (в определенных тканях) и времени (в определенный период развития). Многие из
таких промоторов достаточно универсальны, например некоторые промоторы генов теплового шока. В частности, промотор
гена hsp70 из дрозофилы эффективно работает и в клетках растений. Особый интерес представляют промоторы, индуцируемые низкомолекулярными химическими эффекторами, часто
не свойственными растениям. Эти промоторы очень важны для
8
ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
фундаментальных исследований с помощью трансгенных растений, позволяя четко дифференцировать первичные и вторичные эффекты изучаемого гена. Они перспективны также для биотехнологии, т. к. позволяют вызвать экспрессию гена в заданный период, когда она уже либо не препятствует нормальному
росту и развитию растения, либо не вызывает иных отрицательных последствий. Регулируемые извне индуцибельные промоторы, контролирующие соответствующие гены, могут способствовать одновременному прохождению растениями основных
стадий онтогенеза (переход к цветению, опадение листьев и др.).
Существуют промоторы, индуцирующиеся при поранении или
при обработке растения элиситорами.
Терминатор — нуклеотидная последовательность, расположенная на 3¢-конце гена и являющаяся сигналом завершения транскрипции. Терминатор предотвращает транскрипцию РНК-полимеразой генов, расположенных вслед за трансгеном. При трансформации растений часто используют терминаторную последовательность
гена нопалинсинтазы из Agrobacterium tumefaciens.
Экспрессию чужеродных генов могут усиливать другие элементы ДНК, например модуляторы, а также энхансерные последовательности, действующие независимо от своей ориентации относительно кодирующей части гена и расстояния от сайта инициации
транскрипции.
Векторы для трансформации растений
Удобный способ доставки чужих генов в геном был подсказан самой
природой — трансформация растений с помощью Agrobacterium
tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes. Это почвенные бактерии,
имеющие плазмиды1, так называемые Ti-плазмиды (от англ.
tumor-inducing — опухолеобразующие), найденные в Agrobacterium
tumefaciens, или Ri-плазмиды (от англ. root-inducing — корнеобразующие), найденные в Agrobacterium rhizogenes (см. раздел 1.3).
Эти плазмиды оказались лучшим инструментом для генной инженерии, так как они способны встраивать в растительный геном свои
гены.
В геноме Agrobacterium находится несколько генетических локусов, необходимых для трансформации растительной клетки. При
этом один локализован на агробактериальной хромосоме — это система Chv-генов, которые индуцируются первыми, обеспечивая функ1
Плазмиды — бактериальные внехромосомные автономно реплицирующиеся
двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК.
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
9
ционирование других систем. На Тi- или Ri-плазмиде находятся три
других локуса. Это vir1-система, кодирующая гены, контролирующие синтез и перенос Т-ДНК (от англ. transferred DNA — переносимая ДНК) в растение. Vir-гены находятся на основной части
плазмиды и обычно не переносятся в растительную клетку, а экспрессируются под воздействием сигнальных молекул, образуя белки,
которые обеспечивают отделение переносимой в растение Т-ДНК от
Ti- или Ri-плазмид. Индукция vir-генов обратима, и каскад реакций может быть прерван, что важно для патогена: в случае, если хозяин маложизнеспособен, перенос Т-ДНК в его клетки не происходит. После активации vir-генов в оболочке бактерии образуется разрыв, через который Т-ДНК проникает в растительную клетку. Другие
два генетических локуса находятся на самой Т-ДНК: гены синтеза
ферментов, вызывающие формирование опухолей на растении2 (онкогенов), а также гены синтеза опинов. Т-ДНК после встраивания не
может переноситься вторично, так как не имеет генов, ответственных за перенос.
Т-ДНК ограничена двумя прямыми повторами из 25 нуклеотидов, которые важны для переноса этой последовательности в геном
клетки. Правый конец Т-ДНК обозначается RB (от англ. right border),
левый соответственно LB (от англ. left border) (рис. 1.1.1). Максимальный размер фрагмента ДНК, который может быть перенесен,
достигает 150 тыс. п.н. и более.
После переноса в ядро растительной клетки Т-ДНК встраивается в геном в виде одной или нескольких копий. В ходе переноса одна
из нитей плазмидной ДНК деградирует, а другая за счет незаконной
рекомбинации с участком ДНК клетки-хозяина может включиться
в хромосому или внехромосомную единицу.
В начале 1980-х годов Ti-плазмиды были модифицированы
(«обезоружены») путем удаления онкогенов из Т-ДНК и фрагментов
ДНК, ненужных для клонирования. При этом был добавлен сайт
инициации репликации, вырезанный из плазмиды кишечной палочки E. coli, чтобы можно было наращивать плазмиды (клонировать) в этой бактерии (о клонировании см. раздел 3.4). Модифицированные плазмиды (векторы) не содержали каких-либо онкогенных
последовательностей, и поэтому после переноса с их помощью ДНК
в ядро растительной клетки опухолевого перерождения клеток не
происходило. В данные векторы можно вставить нужные гены: один
1
2
vir — virulence inducing region.
Так, Agrobacterium tumefaciens вызывает образование опухолей в виде тератом
или «корончатых галлов», а A. rhizogenes — в виде пучка корней — «hairy root»
или так называемые «бородатые корни».
10
ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
или несколько целевых (в Т-ДНК) и не менее двух маркерных, которые позволяют отобрать сначала бактериальные клетки с рекомбинантной плазмидой, а потом растительные клетки, в которые перенос генов прошел удачно.
Перенос ДНК в клетки растений
При агробактериальных методах переноса используется, как правило, метод совместного культивирования эксплантов в течение некоторого времени (от 2–3 ч до 2–3 суток) с суспензией агробактерии
(co-cultivation). Затем экспланты переносят для регенерации каллуса или прямого побегообразования на среду, содержащую антибиотики для подавления роста бактерий. Этот метод достаточно универсален и пригоден для трансформации многих видов растений, хорошо
образующих регенеранты. Таким способом к настоящему времени
было получено большинство трансгенных растений различных генотипов. Однако успех получения трансгенных растений зависит от
многих факторов, например от наличия систем культуры тканей и
регенерации растений, от подбора соответствующего штамма агробактерии. В каждом конкретном случае приходится подбирать строго
индивидуальные условия для каждого генотипа растения (детальные протоколы приведены ниже).
Отбор трансформированных растений
Важное значение при получении трансгенных растений имеет отбор
их из образовавшихся регенерантов. Для этого обычно используются
селективные гены. Наиболее распространенными являются гены
устойчивости к антибиотикам1 или гены, делающие растения устойчивыми к гербицидам2. При помещении эксплантов на среды, в которых присутствует селективный агент, образовавшиеся из трансформированных клеток побеги остаются живыми, а остальные погибают.
Для отбора используют также репортерные гены, обусловливающие легко тестируемую энзиматическую активность (GUS, CAT,
NOS и др.), или гены (GUS, GFP и др.) для визуального тестирования in situ (см. раздел 1.4).
1
2
Ген неомицинфосфотрансферазы nptll, придающий трансгенным растениям
устойчивость к канамицину, или hpt ген — устойчивость к гигромицину.
bar — устойчивость к биалафосу; dhfr — к метотрексату; epsps — к Раундапу.
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
11
Доказательство трансгенности трансформированных
растений, т. е. наличия в их геноме трансгена
После первоначального отбора трансформированных растений или
тканей с помощью маркерных или селективных генов проводят тестирование на присутствие вводимого целевого гена с использованием молекулярных методов, в первую очередь методов анализа ДНК.
Наиболее употребительными являются методы полимеразной цепной
реакции (ПЦР) (см. раздел 1.6), ДНК-гибридизации (Саузерн-блоттинга, см. раздел 2.1), ПЦР реального времени (см. раздел 2.7) и
ДНК-гибридизации на микрочипах (см. раздел 2.2).
Экспрессия интродуцированных генов
Доказав трансгенность полученных после трансформации регенерантов, необходимо показать экспрессию встроенных целевых генов, так как их экспрессия является конечной целью трансформации растения.
Для выявления активности гена используют также молекулярные методы. Основные из них — дот-блот анализ (dot-blot analysis) и
нозерн-блоттинг (см. раздел 2.3), позволяющие оценить уровень
экспрессии введенных генов по наличию и количеству специфических транскриптов. Однако в ряде случаев экспрессию гена проще и
надежнее контролировать по конечному белковому продукту (Вестерн-блоттинг, см. раздел 3.3) или тому эффекту, который этот белок вызывает.
Активность трансгенов может зависеть от того, в какую область
ядерного генома попал введенный ген, что связано со случайным характером вставки трансгенов в геном. Это явление получило название «эффект положения трансгена». Экспрессия трансгена, как правило, высока при его попадании в область активного хроматина, но
низка в составе гетерохроматина. Экспрессия часто снижена и в случае многокопийности трансгена. Снижение экспрессии может происходить из-за существенных изменений ДНК при встраивании
генетической конструкции в ядерный геном (перестройки, дупликации, инверсии и т. д.). Генотипы с несколькими копиями трансгенов или те, в которых встраивание прошло с изменениями, не обладают требуемыми признаками и обычно выбраковываются в ходе
селекционного процесса.
Наиболее ценны те трансформанты, у которых достаточно высок
уровень экспрессии трансгена и при этом не наблюдаются изъяны,
индуцированные вставкой чужеродной ДНК. Для создания таких
растений обычно получают большое количество (до тысячи) первичных трансформантов, из которых в дальнейшем отбирают жела-
12
ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
тельные генотипы. Нивелировать эффект положения трансгена можно и с помощью чисто генно-инженерных подходов: путем введения
в трансгенные конструкции так называемых MARs (от англ. matrix
attached regions) — специальных последовательностей, позволяющих образовать независимую петлю хроматина или включиться в
состав транскрибируемого эухроматина.
Наследование трансгенов
Наследуемость встроенного гена наряду с данными молекулярного
анализа о присутствии в геноме чужеродной ДНК является доказательством трансгенности полученных после трансформации растений. Присутствие введенного гена у потомков изучают теми же методами, которыми первоначально тестируют исходные трансформанты: а) выявляя наличие целевого гена в геномной ДНК трансгенного
организма; б) оценивая уровень транскрипции введенного гена;
в) контролируя экспрессию гена по конечному белковому продукту
или эффекту. Использование разных методов для доказательства
истинной трансгенности данного растения необходимо для того,
чтобы исключить «псевдотрансгенные» черты, вызванные сомаклональной (эпигенетической) изменчивостью, химерностью или неполной элиминацией агробактерий.
Перенесенные в ядерный геном чужеродные ДНК, как правило,
наследуются в соответствии с законами Менделя. Если трансгены в
потомстве самоопыленных трансгенных растений наследуются как
единый менделевский признак, сегрегируя в отношении 3:1 (1:2:1),
значит, произошла единичная вставка гена, т. е. чужеродная ДНК
ведет себя как любая эндогенная мутация. При проведении скрещивания такого трансформанта с нетрансформированным растением
соотношение мутация:норма в Т1-поколении должно быть примерно 1:1. Если произошло встраивание двух или более вставок ДНК в
разные хромосомы, то наследуемый трансген будет распределяться
в потомстве самоопыленных растений с частотой не 3:1, а, например, 15:1 в случае 2 вставок.
При изучении наследования трансгенов надо иметь в виду, что
комбинированная вставка ДНК, составленная из нескольких генов
(например, последовательностей целевого и селективного гена), может сегрегировать в Т1-поколении, приводя к экспрессии только одного из генов. Это явление может быть следствием мейотической рекомбинации хромосом. В некоторых случаях у растений-потомков
наблюдается значительное снижение экспрессии трансгена или даже
полное «замолкание» его. Чтобы снизить вероятность такого замолкания, следует выполнять определенные практические рекоменда-
[...]
Книга содержит изложение более 30 методов современной экспериментальной биологии, активно используемых при исследовании растений. Подробно рассмотрены методы генной инженерии
и биоинформатики, функциональной геномики, белковой химии и
гистохимии, методы изучения биологически активных соединений
и трансдукции сигналов, методы биологии клетки и анализа субклеточных структур. Ряд методов был разработан или модифицирован
самими авторами статей, специалистами Института физиологии
растений и других институтов РАН. Структура и способ изложения
материала максимально облегчают задачу освоения того или иного метода, помогают избежать ошибок в ходе эксперимента и корректно интерпретировать полученные результаты. Многие описанные методы широко применяются как при изучении растительных
объектов, так и объектов других царств живых организмов. Данный
методический сборник будет способствовать грамотному использованию наиболее современных методов исследования в практике
отечественной биологической науки.
Для студентов, аспирантов, научных сотрудников, проводящих фундаментальные или прикладные исследования в области биологии
растений и сельского хозяйства